RU2491090C2 - Комбинированный препарат для увеличения иммуногенности вакцины (варианты) - Google Patents

Комбинированный препарат для увеличения иммуногенности вакцины (варианты) Download PDF

Info

Publication number
RU2491090C2
RU2491090C2 RU2010111766/10A RU2010111766A RU2491090C2 RU 2491090 C2 RU2491090 C2 RU 2491090C2 RU 2010111766/10 A RU2010111766/10 A RU 2010111766/10A RU 2010111766 A RU2010111766 A RU 2010111766A RU 2491090 C2 RU2491090 C2 RU 2491090C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
pbs
cells
ova
antigen
mice
Prior art date
Application number
RU2010111766/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2010111766A (ru
Inventor
Винсент СЕРРА
Original Assignee
Виттисель
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Виттисель filed Critical Виттисель
Publication of RU2010111766A publication Critical patent/RU2010111766A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2491090C2 publication Critical patent/RU2491090C2/ru

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Изобретение раскрывает комбинированный препарат для увеличения иммуногенности вакцин, содержащих антиген. Препарат содержит синтетический гликолипид PBS-57 и вакцину. Компоненты, входящие в комбинированный препарат, можно применять как совместно так и последовательно. Препарат по изобретению вводят внутривенно, внутрикожно, подкожно и другими известными способами. Препарат при введении стимулирует гуморальный иммунный ответ на антиген вакцины у субъекта, в частности способствует увеличению продукции IgG, IgA и/или IgM антител, активирует CD4+ Т-лимфоцитов и CD8+цитотоксических Т-лимфоцитов у субъекта. Гликолипид PBS-57 является адъювантом со сниженным числом побочных действий и в то же время способствующим выработке продолжительного защитного иммунитета. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 16 ил., 13 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области иммунологии и касается увеличения иммуногенности вакцин путем совместного введения синтетического гликолипида, обозначенного PBS-57, вместе с вакциной. PBS-57 обладает способностью стимулировать как опосредованный клетками, так и гуморальный иммунный ответ.
Уровень техники
Главным назначением вакцины является обеспечение длительного иммунитета против патологического состояния. В идеале, вакцины предоставляют функционально активные антитела, вырабатывают опосредованный клетками иммунитет и активируют Т- и В-лимфоциты с высокоспецифичной реактивностью, а также «память» для обеспечения защиты во время последующих столкновений с патогенном.
Адъюванты являются вспомогательными веществами вакцин, которые неспецифическим образом усиливают иммунный ответ. Механизмы, посредством которых адъюванты усиливают иммунную систему, варьируют в широких приделах. Адъюванты можно классифицировать как «иммуномодуляторные» агенты или «системы доставки ангигена». Иммуномодуляторные адъюванты запускают иммунную систему путем регуляции иммунных клеток посредством изменения продукции лимфокинов. Система доставки антигена, с другой стороны, функционирует для доставки антигена к соответствующей иммунной клетке. Дополнительно, адъюванты могут увеличивать скорость или продолжительность иммунного ответа, модулировать авидность антител, специфичность, распределение по изотипам или подклассам, стимулировать опосредованный клетками иммунитет, способствовать иммунитету слизистой оболочки или усиливать иммунные ответы у иммунологически незрелых или стареющих индивидуумов. Адъюванты могут воздействовать на гуморальный или опосредованный клетками иммунный ответ, или на их комбинацию.
Иммуномодуляция означает способность адъюванта изменять ответ лимфокинов путем активации характерных подмножеств иммунных клеток. Два основных подмножества CD4+ Т-лимфоцитов, Th1 и Th2, играют основную роль в определении иммунного ответа. Ответы ТЫ обычно индуцируют антитела, фиксирующие комплемент, и сильные реакции гиперчувствительности замедленного типа (DTH) и связаны с γ-IFN, IL-2 и IL-12, тогда как ответы Th2 приводят к высоким уровням циркулирующих и секреторных антител и связаны с цитокинами IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10. Активация Th1 клеток регулирует также клеточный иммунный ответ путем активации пролиферации цитотоксических CD8+ Т-клеток и усиления цитолиза клеток-мишеней.
Исследованы адъювантные свойства разных видов липидов. В отличие от пептидных антигенов, липиды процессируются и представляются иммунной системе с помощью CD1 семейства связанных с β2 микроглобулинами молекул. Молекулы CD1 вовлечены в процесс захвата и переработки как чужеродных, так и собственных липидных антигенов для представления их конкретному подмножеству Т-клеток. Путь представления (презентации) с участием CD1 запускает как врожденный, так и приобретенный иммунные ответы путем активации двух комплементарных ограниченных CD1 подмножеств Т-клеток; Т-клеток природных убийц (NKT), которые осуществляют адъювантные действия, и не-NKT Т-клеток, способных к хелперной или цитолитической функции. NKT клетки экспрессируют как поверхностные маркеры природных убийц (NK), так и консервативные полу-инвариантные рецепторы Т-клеток (TCR), Vα24-Jα18/Vβ8 у мышей и Vα24-Jα18/Vβ11 у человека. Соответственно, NKT клетки играют важную роль в большом числе иммунных функций, включая противомикробные ответы, противоопухолевые ответы и регуляцию равновесия между толерантностью и аутоиммунитетом.
Большое число природных и синтетических липидных молекул обрабатывается антиген-представляющими клетками и представляется CD1 молекулами для NKT клеток. Соединениями-прототипами, применяемым для изучения активации NKT клеток in vitro и in vivo, являются KRN7000 и α-галактозилцерамид (αGalCer), полученные из морской губки Agelas mauritianus. Дополнительные соединения, идентифицированные недавно, включают изоглоботригексозилкерамид (iGB3), являющийся эндогенным гликолипидом, и PBS-57, модифицированный «амино 6» дезоксигалактозилцерамид, как описано в заявке PCT/US07/66250, раскрытие которой включено сюда посредством ссылки. Эти соединения активируют NKT клетки и регулируют на повышение ответы цитокинов in vitro. Однако, в контексте вакцинации in vivo немногое известно относительно эффективности адъювантного действия этих липидных соединений.
Немного адъювантов одобрено для применения в вакцинах для человека из-за их токсических побочных действий. Наиболее распространенные адъюванты представляют собой алюминий и масляные адъюванты, но известно, что они вызывают такие побочные действия, как лихорадка/жар, головная боль, мышечные боли и боли или сыпь. Другие недостатки включают сильную местную стимуляцию иммунной системы, приводящую к боли, покраснению, отеку или небольшому вздутию на месте инъекции. Адъюванты также предполагают сложные способы приготовления вакцин и могут не справляться с повышением иммуногенности в случае слабых антигенов. В настоящее время выбор адъювантов в вакцинах для человека отражает компромисс между необходимостью адъювантного действия и приемлемым уровнем побочных эффектов. Есть потребность в новых адъювантах с меньшим числом побочными действий и в то же время способствующими выработке продолжительного защитного иммунитета.
Раскрытие изобретения
Авторы изобретения открыли, что добавление синтетического гликолипида, называемого PBS-57, к препарату вакцины, вводимой субъекту, активирует как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ при введении субъекту. Соответственно, изобретение касается продукта для увеличения иммуногенности вакцины, стимуляции гуморального иммунного ответа, стимуляции ответа CD4+ Т-клеток и стимуляции ответа CD8+ цитотоксических Т-клеток у субъекта при совместном введении субъекту PBS-57 и вакцины.
Краткое описание фигур
Фигура 1 представляет собой график, показывающий процент NKT клеток на 7-ой день в популяции CD3+ Т-клеток культивированных лимфоцитов периферической крови (PBL), обработанных разными количествами адъювантных гликолипидов αGalCer, PBS-20, PBS-25 и PBS-57.
Фигура 2 представляет собой график, показывающий процент NKT клеток на 7-ой день в популяции CD3+ Т-клеток культивированных PBL, обработанных разными количествами αGalCer, PBS-25, PBS-57 и PBS-83.
Фигура 3 представляет собой график, показывающий увеличение NKT клеток в культурах in vitro PBL, полученных от добровольцев и обработанных αGalCer, PBS-20, PBS-25, PBS-57 и PBS-83. Медианное значение приведено над графиком.
Фигура 4А представляет собой график, показывающий процент TCRαβ клеток в селезенке мышей через 24 часа после введения αGalCer, PBS-57 и PBS-83. Фигура 4В представляет собой график, показывающий процент NKT клеток в популяции TCRαβ клеток в селезенке мышей через 24 часа после введения адъювантных гликолипидов. Значения р на основе двустороннего теста рассчитаны для каждого адъюванта по сравнению с контролем.
Фигура 5А представляет собой график, показывающий процент CD40+ клеток в популяции CD11c+CD8α - клеток из селезенки мышей через 24 часа после внутривенного введения адъювантных гликолипидов. Фигура 5В представляет собой график, показывающий процент CD40+ клеток в популяции CD11c+CD8α+клеток из селезенки мышей через 24 часа после внутривенного введения адъювантных гликолипидов. Фигура 5С представляет собой график, показывающий процент CD80+ клеток в популяции CD11c+CD8α- клеток из селезенки мышей через 24 часа после внутривенного введения адъювантных гликолипидов. Фигура 5D представляет собой график, показывающий процент CD80+ клеток в популяции CD11c+CD8α+ клеток из селезенки мышей через 24 часа после внутривенного введения адъювантных гликолипидов. Фигура 5Е представляет собой график, показывающий процент CD86+ клеток в популяции CD11c+CD8α - клеток из селезенки мышей через 24 часа после внутривенного введения адъювантных гликолипидов. Фигура 5F представляет собой график, показывающий процент CD86+ клеток в популяции CD11c+CD8α+клеток из селезенки мышей через 24 часа после внутривенного введения адъювантных гликолипидов.
Фигура 6 представляет собой график и гистограмму результатов проточной цитометрии с окрашиванием CFSE согласно анализу для определения специфического лизиса представляющих антиген клеток у мышей, иммунизированных овальбумином (Ova) самим по себе или Ova и αGalCer.
Фигура 7 представляет собой график, показывающий процент специфического лизиса Ova-специфичных клеток-мишеней в селезенке мышей, иммунизированных адъювантом вместе с Ova или без него.
Фигура 8 представляет собой график, показывающий процент специфического лизиса Ova-специфичных клеток-мишеней в крови мышей, которым внутривенно ("IV") ввели Ova в комбинации с различными концентрациями αGalCer.
Фигура 9 представляет собой график, показывающий процент специфического лизиса Ova-специфичных клеток-мишеней в крови мышей, которым внутривенно ввели Ova в комбинации с различными концентрациями PBS-57.
Фигура 10 представляет собой график, показывающий процент специфического лизиса Ova-специфичных клеток-мишеней в крови мышей, которым внутривенно ввели PBS-57 в комбинации с различными концентрациями Ova.
Фигура 11 представляет собой график, показывающий процент специфического лизиса Ova-специфичных клеток-мишеней в крови мышей, которым внутримышечно (IM) ввели Ova в комбинации с различными концентрациями αGalCer.
Фигура 12 представляет собой график, показывающий процент специфического лизиса Ova-специфичных клеток-мишеней в крови мышей, которым внутримышечно ввели Ova в комбинации с различными концентрациями PBS-57.
Фигура 13 представляет собой график, показывающий процент специфического лизиса Ova-специфичных клеток-мишеней в крови мышей, которым внутривенно или внутримышечно ввели различные комбинации Ova и адъювантов.
Фигура 14 представляет собой график, показывающий усиленную продукцию антител у мышей, иммунизированных композицией вакцины с анатоксином столбняка (ТТ), содержащей PBS-57.
Фигура 15 представляет собой график, показывающий увеличенную реактивность CD8+ Т-клеток у мышей, иммунизированных внутримышечно овальбумином (Ova) в комбинации с PBS-57.
Фигура 16 представляет собой график, показывающий увеличенную реактивность CD8+ Т-клеток у мышей, иммунизированных подкожно Ova в комбинации с PBS-57.
Осуществление изобретения
Адъюванты усиливают иммуногенность антигенов в препаратах вакцин различными способами. В случае токсинов необходим хороший гуморальный иммунный ответ. В случае внутриклеточных бактерий важным является опосредованный клетками ответ, опосредованный в основном цитотоксическими Т-клетками и Th1 клетками. В случае вирусных инфекций как гуморальный, так и клеточный ответы важны для борьбы с инфекцией. Способность адъюванта усиливать не только гуморальный, но также опосредованный клетками иммунный ответ увеличивает вероятность развития продолжительного иммунитета. Эффективный адъювант был бы применим для комбинации с большим разнообразием антигенов. Авторы обнаружили, что гликосфинголипид, PBS-57, обладает способностью стимулировать как опосредованный клетками, так и гуморальный иммунный ответ in vivo. Дополнительно, PBS-57 способен стимулировать иммунный ответ на слабый незначительный антиген для продукции антител и одновременно обеспечивать опосредованный клетками лизис клеток, экспрессирующих специфические поверхностные антигены.
В одном осуществлении изобретение предоставляет способ усиления иммуногенности вакцины у субъекта путем совместного введения PBS-57 и вакцины. Как применяется здесь, «субъект» представляет собой млекопитающее, например, мышь, более предпочтительно, человека. «Усиление иммуногенности вакцины» означает способность PBS-57 усиливать гуморальный и/или опосредованный клетками иммунный ответ субъекта на вакцину относительно соответствующего контроля. С целью определения того, усилена ли иммуногенность относительно контроля, можно проводить количественное сравнение сигнала в образце, полученном от субъекта, вакцинированного антигеном и PBS-57, с сигналом в образце, полученном от субъекта, вакцинированного одним антигеном. Как применяется здесь, иммуногенность можно измерять с помощью любого подхода, применяемого специалистом в данной области техники для измерения гуморального или опосредованного клетками иммунного ответа. Например, иммуногенность можно измерять с помощью ELISA для различных уровней цитокинов, что является рутинным приемом для специалиста в данной области техники.
В конкретных осуществлениях иммунные ответы усилены по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 150%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 400% относительно соответствующего контроля. Соответствующим контролем может быть субъект, получивший композицию вакцины без PBS-57. Процент усиления можно рассчитывать с применением следующей формулы:
[(значение, представляющее иммунный ответ субъекта после введения композиции, содержащей PBS-57) - (значение, представляющее иммунный ответ в контроле)/(значение, представляющее иммунный ответ субъекта после введения композиции, содержащей PBS-57)]×100
Как применяется здесь, термин «совместное введение» означает введение по меньшей мере адъюванта и вакцины одновременно, т.е. в одно и то же время, или последовательно, например, введение адъюванта с последующим введением вакцины. При этом после введения адъюванта вакцину можно вводить практически сразу после адъюванта или вакцину можно вводить через эффективный период времени после адъюванта; эффективный период времени представляет собой время, необходимое для проявления максимального преимущества от введения адъюванта. Альтернативно, адъювант и вакцина могут входить в один и тот же состав.
Композиции вакцин при необходимости составлены так, чтобы включать PBS-57. Термин «вакцина» относится к композиции, которая при введении субъекту индуцирует гуморальные иммунные ответы, как описано здесь. Композиции вакцин могут включать антиген или комбинацию антигенов; антиген может быть полипептидом или углеводородом или их сочетанием, например, гликопротеином. Антиген соответствующим образом получают из инфекционных агентов (например, патогенного микроорганизма), опухоли, эндогенной молекулы (например, «собственной» молекулы) или, с целью исследования, применяется ограниченный антиген, такой как овальбумин (называемый здесь «Ova»). Композиции вакцин могут также включать убитые или ослабленные инфекционные агенты. Композиции вакцин, применяемые согласно изобретению, при необходимости включают PBS-57 и антиген. Структура PBS-57 показана ниже:
Figure 00000001
PBS-57 активирует NKT клетки in vitro и in vivo. PBS-57 содержит амидную группу в положении С6 галактозы и цис-двойную связь в ацильной цепи церамидного звена. Без привязки к теории, считается, что двойная связь в церамидной боковой цепочке облегчает связывание с выемкой молекулы CD1d иувеличивает растворимость гликосфинголипида. Показано также, что PBS-57 индуцирует высвобождение INFγ и IL-4 in vitro.
Композиции вакцин, включающие PBS-57, можно составлять с применением разнообразных препаративных способов и инактивированные ингредиенты известны специалисту в данной области техники. См. Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (2000), включенный сюда посредством ссылки. Вакцина может также содержать необходимую систему доставки антигена в иммунную клетку. Подходящие системы доставки антигенов известны в данной области техники и включают, не ограничиваясь этим, MVA (модифицированный вирус Анкары), аденовирус, лентивирус, перемещенную (translocated) субъединицу токсина коклюша или токсина дизентерии, или антиген, заключенный в липосомы. Подходящая эффективная доза PBS-57 в композициях вакцин может быть определена специалистом в данной области техники, но обычно находится в интервале от примерно 1 мкг до примерно 10000 мкг на кг веса тела, обычно составляет примерно 1000 мкг или меньше на кг веса тела. В отдельных осуществлениях эффективные дозы находятся в интервале от примерно 10 до примерно 5000 мкг на кг веса тела. В другом осуществлении эффективная доза находится в интервале от примерно 50 до примерно 1000 мкг на кг веса тела. В другом осуществлении эффективная доза находится в интервале от примерно 75 до примерно 500 мкг на кг веса тела. В исследованиях необходимая доза для мышей составляет 1 мкг PBS-57 на 100 мкл доз. Композицию PBS-57 можно вводить в виде однократной дозы или в виде нескольких доз в течение недель или месяцев.
В композицию с PBS-57 можно включать один или более антиген, или их можно включать в независимые составы. Как применяется здесь, антиген относится к молекуле, которая стимулирует иммунный ответ. Понятно, что доза антигена будет зависеть от конкретного антигена, возраста и иммунного статуса субъекта, а также от других релевантных факторов, которые может определить специалист в данной области техники.
При необходимости, антигены получают из ослабленных или убитых инфекционных агентов. Можно применять целые микроорганизмы или их части (например, мембранные тени, грубые мембранные препараты, лизаты и другие препараты микроорганизмов). Подходящие инфекционные агенты, из которых можно получать антиген, включают, не ограничиваясь этим, патогены и микроорганизмы, такие как бактерии, паразиты и вирусы. В конкретном контексте нужные антигены получают или производят из вирусного патогенна, связанного с заболеванием человека, включая, но не ограничиваясь этим, ВИЧ HIV/AIDS (Retroviridae, например, gp120 молекулы, выделенные из HIV-1 и HIV-2, HTLV-I, HTLV-11), вирусы гриппа Orthomyxoviridae, например, типов А, В и С), вирус герпеса (например, вирус простого герпеса, HSV-1 и HSV-2 гликопротеины gB gD и gH), ротавирусные инфекции (Reoviridae), инфекции дыхательных путей (парагрипп и синцитиальные дыхательные вирусы), полиомиелит (Picornaviridae, например, полиовирусы, риновирусы), корь и свинка (Paramixoviridae), краснуха (Togaviridae, например, вирус краснухи), гепатит (например, вирус гепатита типа А, В, С, D, Е и/или G), цитомегаловирус (например, gB и gH), гастроэнтерит (Caliciviridae), желтая лихорадка и лихорадка западного Нила (Flaviviridae), бешенство (Rhabdoviridae), Корейская геморрагическая лихорадка (Bunyaviridae), Венесуэльская лихорадка (Arenaviridae), бородавки (Papillomavirus), вирус иммунодефицита обезьян, вирус энцефалита, вирус ветряной оспы, вирус Эпштейн-Барра и другие семейства вирусов, включая Coronaviridae, Birnaviridae и Filoviridae.
Применимые бактериальные и паразитарные антигены можно также получать или выделять из известных агентов, ответственных за заболевания, включая, но не ограничиваясь этим, дифтерит, коклюш, столбняк, туберкулез, пневмония бактериальной ил грибковой этиологии, средний отит, гонорею, холеру, брюшной тиф, менингит, мононуклеоз, чуму, бактериальную дизентерию или салмонеллез, болезнь легионеров, болезнь Лайма, проказу, малярию, анкилостомоз, онхоцеркоз, шистозомоз, трипанозомоз, лейшманиоз, жиардиаз, амебиаз, филяриатоз, бореллию и трихиноз. Дополнительные антигены можно получать или выделять из нетрадиционных патогенов, таких как агенты, вызывающие куру, болезнь Якоба-Крейтцфельдта (CJD), скрепи, инфекционную энцефалопатию норки и хронические изнурительные болезни или из белковых инфекционных частиц, таких как прионы, связанные с болезнью Якоба-Крейтцфельдта.
Дополнительные конкретные патогены, из которых можно получать антигены, включают M.tuberculosis, Chlamydia, N.gonorrhoeae, Shigella, Salmonella, Vibrio cholerae, Treponema pallidum, Pseudomonas, Bordetella pertussis, Brucella, Fracisella tularensis, Helicobacter pylori, Leptospira interrogans, Legionella pneumophila, Yersinia pestis, Streptococcus (типы А и В), пневмококк, менингококк, Haemophilus influenza (тип b), Toxoplasma gondii, Moraxella catarrhalis, венерическая гранулема и актиномикоз;
грибковые патогены включают кандидоз и аспергиллез; паразитарные патогены включают Таета, трематоду, нематоду, амебиаз, жиардиаз, Cryptosporidium, Schistosoma, Pneumocystis carinii, трихомоноз и трихиноз. Настоящее изобретение можно также применять для предоставления соответсвующего иммунного ответа против многих ветеринарных заболеваний, таких как ящур, коронавирус, Pasteurella muldocida, Helicobacter, Strongylus vulgaris, Actinobaccillus pleuropneumonia, вирус диареи коров (BVDV), Klebsiella pneumoniae, E.Coli и Bordetella pertussis, паракоклюш и brochiseptica.
В других осуществлениях антигены для включения в композиции вакцин, которые можно применять согласно настоящим способам, являются производными опухолевых антигенов или аутологическими или аллогенными целой опухолевой клетке. Соответственно, опухолевый антиген представляет собой специфичный для опухоли антиген (TSA) или связанный с опухолью антиген (ТАА). Ряд опухолевых антигенов и способы их экспрессии известны в данной области техники и могут выбираться на основе типа опухоли, от которой надо лечить. Неограничивающие примеры опухолевых антигенов включают cdk4 (меланома), β-катенин (меланома), каспазу-8 (чешуйчатоклеточная карцинома), MAGE-1 и MAGE-3 (меланома, рак груди, глиома), тирозиназу (меланома) поверхностный IgG идиотип (например, BCR) (лимфома), Her-2/neu (рак груди, яичников), MUC-1 (рак груди, поджелудочной железы) и HPV Е6 и Е7 (карцинома шейки матки). Дополнительные применимые опухолевые антигены включают специфический антиген рака простаты (PSA), сиалил Tn (STn), белки теплового шока и связанные с опухолями пептиды (например, gp96) молекулы ганглиозидов (например, GM2, GD2 и Gd3), онкофетальный антиген (СЕА) и MART-1.
Как понятно специалистам в данной области техники, вакцины являются соответствующим образом составленными, чтобы быть совместимыми с предполагаемым путем введения. Примеры применимых путей введения включают парентеральное, например, внутривенное, внутрикожное, подкожное, внутримышечное, оральное (например, ингаляцию), чрезкожное (топикальное), интраназальное, внутрибрюшинное, трансмукозальное и ректальное введение. Вакцина может также включать физиологически приемлемое средство доставки (носитель). «Физиологически приемлемое» средство доставки означает любое средство доставки, которое подходит для введения in vivo (например, орального, трансдермального или парентерального введения) или применения in vitro, например, в клеточной культуре. Применимые физиологически приемлемые средства доставки для введения in vivo включают среди прочих воду, буферные растворы и растворы глюкозы. Дополнительные компоненты композиций могут при необходимости включать наполнители, такие как стабилизаторы, консерванты, растворители, эмульгаторы или лубриканты в дополнение к физиологически приемлемому средству доставки и антигену. Конкретно, применимые наполнители включают, не ограничиваясь этим, Твин 20, ДМСО, сахарозу, L-гистидин, полисорбат 20 и сыворотку.
Другое осуществление изобретения представляет собой способ стимуляции гуморального иммунного ответа на антиген. Способ включает совместное введение субъекту PBS-57 и антигена, как описано выше. Как применяется здесь, «гуморальный иммунный ответ» представляет собой продукцию антител В-клетками и вспомогательный процесс, сопровождающий это, включая, но не ограничиваясь этим, активацию Th2 и продукцию цитокинов, образование центра размножения и переключение изотипов, созревание сродства и генерацию клеточной памяти. С целью определения того, активирован ли гуморальный иммунный ответ, можно проводить количественное сравнение сигнала в образце от субъекта, вакцинированного антигеном и PBS-57, с образцом от субъекта, вакцинированного одним антигеном. Гуморальный иммунный ответ можно оценивать по эффекторным функциям антител, включая нейтрализацию патогенна или токсина, классическую активацию комплемента и опсоническое облегчение фагоцитоза и уничтожение патогена. Антитела, произведенные в ответ на совместное введение PBS-57 и антигена, могут принадлежать к любому типу, например, IgM, IgA и IgG. Гуморальный иммунный ответ можно измерять с помощью любого известного в данной области техники способа, например, с помощью ELISA, анализа одиночной радиальной иммунодиффузии (SRID), ферментативного иммуноанализа (EIA) или анализа ингибирования гемагглютинации (HAI).
Дополнительным осуществлением изобретения является способ активации CD4+ Т-лимфоцитов у субъекта. Как известно в данной области техники, CD4+ Т-клетки, или «Т-хелперные клетки» представляют собой клетки, которые узнают антигены, представленные классом II основных маркеров тканевой совместимости (МНС) на поверхности представляющих антиген клеток, и секретируют лимфокины для стимуляции как опосредованного клетками, так и опосредованного антителами ответа иммунной системы. Активация CD4+ Т-клеток способствует секреции лимфокинов, переключению изотипов иммуноглобулинов, созреванию сродства ответа антител, активации макрофагов и усилению активности природных убийц (NK) и цитотоксических Т-клеток (CTL). Лимфокины являются белками, секретируемыми лимфоцитами, которые воздействуют на их собственную активность и/или активность других клеток. Лимфокины включают, не ограничиваясь этим, интерлейкины и цитокины, например, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 или INFγ. Для определения того, активированы ли CD4+ Т лимфоциты, можно проводить количественное сравнение сигнала в образце от субъекта, вакцинированного антигеном и PBS-57, с образцом от субъекта, вакцинированного одним антигеном. Способы измерения активации CD4+ Т-клеток известны в данной области техники.
Другое осуществление изобретения представляет собой способ активации CD8+ Т лимфоцитов у субъекта. CD8+ Т лимфоциты узнают антигены, представленные классом I МНС молекул (присутствующие на всех ядерных клетках). Участие пептидного комплекса МНС класса I приводит к доставке литических гранул в клетку мишень, вызывая лизис клетки мишени. Способы измерения активации CD8+ Т-клеток известны в данной области техники и включают, не ограничиваясь этим, ELISPOT, ELISA и анализ цитотоксичности. Как применяется здесь, модель на мышах применена для отслеживания активации CD8+ Т-клеток с применением флуоресцентного анализа для измерения опосредованной клетками цитотоксичности, как описано в Hermans et al, 2004, J.Immunol. Methods, 285:25-40, включенном посредством ссылки полностью. В этом анализе мышей иммунизируют в 0-вой день вакциной, содержащей или не содержащей PBS-57. Сингенные клетки мишени создают путем выделения клеток селезенки у второго набора мышей и мечения клеток двумя отдельными флуоресцентными красителями или высокой и низкой концентрациями одного и того же флуоресцентного красителя, например, CFSE или CMTMR. Один набор клеток мишеней нагружают антиген-специфичным пептидом, тогда как второй набор клеток мишеней нагружают иррелевантым пептидом. Две популяции клеток мишеней смешивают в равных количествах и инъецируют иммунизированным мышам. Через 24 часа мышей забивают и получают клетки селезенки и образцы крови. Уровни каждого набора клеток мишеней анализируют с помощью проточной цитометрии. Активацию CD8+ лимфоцитов определяют путем сравнения числа клеток мишеней в образце от субъекта, вакцинированного антигеном и PBS-57, с числом клеток мишеней в образце от субъекта, вакцинированного только антигеном.
Другие аспекты изобретения станут понятными при рассмотрении нижеследующих примеров, не предназначенных для ограничения области притязаний изобретения, и приложенных фигур.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Активация NKT клеток in vitro с помощью PBS-57 Для определения того, способен ли PBS-57 стимулировать NKT клетки в культуре, измеряют распространение NKT клеток в культуре лимфоцитов периферической крови (PBL). Клетки PBL получают от двух здоровых доноров и выращивают на RPMI среде для клеточных культур с 5% АВ сывороткой. Клетки рассевают на 12-луночных планшетах в количестве 2×106 PBL на лунку на 2 мл. Лунки обрабатывают носителем для отрицательного контроля (0,05% Твин 20 и 1% ДМСО в PBS или 0,05% Твин20 и 10% ДМСО в PBS) или тестируемыми адъювантами (αGalCer, PBS-20, PBS-25 или PBS-57) в конечной концентрации 10 нг/мл, 100 нг/мл или 1 мкг/мл. Химические структуры контрольных соединений αGalCer, PBS-20 и PBS-25 приведены ниже:
Figure 00000002
Figure 00000003
Figure 00000004
Ко всем культурам добавляют рекомбинантный человеческий IL2 (rhIL-2) до получения конечной концентрации 100 UI/мл к 1-му дню. Все клетки культивируют в течение 10 дней при 37°С при 5% CO2. На 7-ой день половину культуральной среды (1 мл) отбирают для NKT анализа. Процент NKT клеток в CD3+ популяции детектируют с помощью проточной цитометрии с применением CD1 тетрамеров с флуоресцентной меткой или антител с флуоресцентной меткой (анти-CD3, анти-Vβ11 и анти-NKT). Популяцию NKT идентифицируют с помощью проточной цитометрии как Vp11+, тетрамер+ и TCRαβ+ популяцию. Процент NKT клеток рассчитывают в каждом образце путем вычитания числа (процента ?) клеток Vβ11+PBS-57-тетрамер + TCRαβ+ из числа (процента ?) клеток Vβ11 + пустой-тетрамер + TCRαβ+. На фигуре 1 показано увеличение NKT клеток после обработки PBS-57, αGalCer, PBS-25 и PBS-20. Как показано, обработка PBL с помощью PBS-57 или αGalCer приводит к распространению (увеличению числа) NKT клеток.
В отдельном эксперименте измеряют способность PBS-57 по сравнению с другими кандидатами гликолипидами индуцировать распространение NKT клеток in vitro. Лимфоциты периферической крови получают от двух здоровых доноров и культивируют на RPMI среде для клеточных культур с 5% АВ сывороткой. Клетки рассевают на 12-луночных планшетах в количестве 2×106 клеток на лунку на 2 мл среды. В одну лунку добавляют носитель (0,05% Твин 20 и 1% ДМСО в PBS) в качестве отрицательного контроля, в лунки для тестирования добавляют αGalCer, PBS-25, PBS-57 или PBS-83 в конечной концентрации 1 нг/мл, 10 нг/мл или 100 нг/мл. Структура PBS-83 приведена ниже:
Figure 00000005
Все культуры дополняют rhIL-2 до получения конечной концентрации 100 UI/мл к 1-му дню и культивируют в течение 7 дней при 37°С при 5% CO2. На 7-ой день определяют процент NKT клеток с помощью проточной цитометрии. На фигуре 2 показан процент NKT клеток на 7-ой день в случае обработки различными гликолипидами. Обработка PBS-57 приводит по меньшей мере к двукратному увеличению числа NKT клеток по сравнению с обработкой клеток αGalCer.
Пример 2. Распространение NKT клеток в культурах, обработанных PBS-57
Проводят окрашивание NKT на панели из 14-ти образцов здоровых донорских лимфоцитов периферической крови (PBL) или моноцитов периферической крови (РВМС). Клетки PBL получают от 12 субъектов, клетки РВМС получают от 2 субъектов. Каждый образец выделенных клеток разделяют на два образца. Первый образец от каждого донора окрашивают 10 мкл анти-Vβ11 FITC (Beckman Coulter), 10 мкл анти-TCRαβ-РС5 (Beckman Coulter) и 2 мкл РЕ-меченых PBS-57-CD1d-тетрамеров. Второй образец от каждого донора окрашивают с помощью 10 мкл анти-Vβ11, 10 мкл анти-TCRαβ-FITC и 2 мкл РЕ-меченых пустых-CD1d-тетрамеров.
Для определения процента увеличения NKT клеток количество NKT клеток на 7-ой день делят на количество NKT клеток на день 0. Как показано на фигуре 3, инкубация с PBS-57 приводит к значительному увеличению NKT клеток в культурах PBL от людей добровольцев.
Пример 3. Анализ популяций клеток TCRαβ, NKT и созревания дендритных клеток у мышей, получавших PBS-57
Для тестирования адъювантной активности PBS-57 in vivo, мышей инъецируют тестируемыми соединениями и анализируют активацию и увеличение числа клеток через 24 часа. В четырех группах из пяти C57B 1/6J мышей каждой мыши внутривенно вводят физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) с носителем (ДМСО), 0,97 мкг αGalCer, 1,3 мкг PBS-57 или 0,97 мкг PBS-83 в общем объеме 100 мкл PBS. Через 24 часа после введения тестируемого соединения мышей забивают и изолируют образцы крови и клетки селезенки по стандартным способам. Процент NKT клеток в селезенке оценивают с помощью проточной цитометрии с окрашиванием с применением анти-TCRαβ-FITC и РЕ-меченых CD1d-тетрамеров, нагруженных PBS-57 (PBS-57-тетрамер) или без липида (пустой тетрамер). На фигуре 4А показано увеличение процента TCRαβ клеток у мышей, получавших αGalCer или PBS-57, по сравнению с контрольными мышами, получавшими PBS и носитель. Процент NKT клеток определяют путем вычитания процента PBS-57-тетрамер + клеток из процента пустой-тетрамер+клеток в популяции TCRαβ. На фигуре 4В показано уменьшение процента NKT клеток в селезенке мышей, получавших PBS-57 или αGalCer, по сравнению с контролем. Результаты, приведенные на фигурах 4А и 4В, все вместе показывают, что PBS-57 приводит к увеличению числа TCRαβ клеток в селезенке мышей с такой же эффективностью, как αGalCer. Утрата NKT клеток у мышей, которым вводят αGalCer или PBS-57, по отношению к контролю показывает понижение экспрессии TCR на поверхности NKT клеток.
Дендритные клетки (DC) определяют среди клеток селезенки с помощью проточной цитометрии путем окрашивания анти-CD11c R-PE (BD Pharmingen) и анти-CD8α FITC (Beckman Coulter). Далее анализируют два подмножества дендритных клеток, популяции CD11c+CD8α- и CD11c+CD8α+. Уменьшение на 50% обоих подмножеств DC наблюдается у мышей, получавших адъюванты PBS-57 или αGalCer, по сравнению с контролем. Для определения того, индуцирует ли введение гликолипидов созревание обоих подмножеств дендритных клеток, клетки окрашивают с помощью антител анти-CD40 Biotin/Stepta APC (BD Bioscience), анти-CD80 Biotin (BD Pharmmgen)/Stepta APC (BD Bioscience) и анти-CD86 Biotin (BD Pharmmgen)/Stepta APC (BD Biocsience) и анализируют с помощью проточной цитометрии. На фигурах 5А и 5В показан процент положительных по CD40 клеток среди CD11c+CD8α- и среди CD11c+CD8α+ клеток, соответственно. На фигурах 5С и 5D показан процент положительных по CD80 клеток в обеих популяциях CD11c+CD8α- и CD11c+CD8α+ клеток, соответственно. На фигурах 5Е и 5F показан процент положительных по CD86 клеток в обеих популяциях CD11c+CD8α- и CD11c+CD8α+ клеток, соответственно. Горизонтальные линии представляют средние значения. Все вместе данные показывают, что PBS-57 и aGalCer значительно увеличивают процент клеток, экспрессирующих CD40+, CD80+ и CD86+, в обеих популяциях CD11c+CD8α- и CD11c+CD8α+ клеток.
Пример 4. Протокол для тестирования адъювантных свойств PBS-57 в модели на мышах
Модель на мышах применяют для тестирования in vivo специфического цитотоксического ответа Т-клеток (CD8+), вызываемого PBS-57 в комбинации с антигеном. Самок мышей C57B 1/6J CD45.2 иммунизируют на день 0 антигеном (овальбумином. Ova, grade VII, Sigma St.Louis, МО) вместе с адъювантом или без него, только адъювантом или только носителем (контроль) в общем объеме 100 мкл PBS. Тестируемые соединения представляют собой 1 мкг PBS-57, 1 мкг aGalCer, 1 мкг PBS-83 вместе с 50 мкг Ova или без него. Сингенные клетки мишени получают путем выделения клеток селезенки из второго подмножества самок мышей C57B 1/6J CD45.2 и мечения клеток низкой концентрацией (0,6 мкМ в течение 10 мин при 37°С) или высокой концентрацией (6 мкМ в течение 10 мин при 37°С) CFSE (флуоресцентного красителя). Популяцию, меченую высокой концентрацией CFSE, предварительно нагружают 5 мкМ пептидом SIINFEKL (Ova-специфичного пептида, NeoMPS, Inc, San Diego, CA) в течение 60 мин при 37°С. Популяцию, меченую низкими концентрациями CFSE, предварительно нагружают 5 мкл пептида LCMV gp33-41 (не-Ova пептид, NeoMPS, Inc, San Diego, CA) в течение 60 мин при 37°С. Равные количества обеих популяций клеток мишеней смешивают (1×107 клеток, обработанных низкой или высокой концентрацией CFSE, 2×107 всего на 100 мкл) и вводят внутривенно каждой иммунизированной мыши на день 10. Мышей забивают на день 11 и отбирают клети селезенки и образцы крови из глазной пазухи (orbital sinus). Средний процент выживания получивших пептид клеток мишеней (меченых CFSE) рассчитывают относительно контрольной популяции с помощью анализа с проточной цитометрией. На фигуре 6В показаны типичные данные проточной цитометрии, демонстрирующие потерю клеток мишеней, нагруженных Ova-специфичным пептидом. Цитотоксическую активность выражают как процент специфического лизиса, рассчитанный путем вычитания среднего процента выживаемости Ova-специфичных клеток мишеней из 100. На фигуре 7 приведен процент специфического лизиса клеток мишеней в селезенке иммунизированных мышей. Только сочетание Ova и PBS-57 вызывает цитотоксический лизис Ova-специфичных клеток мишеней в селезенке.
Пример 5. Цитотоксический ответ после иммунизации Ova с различными концентрациями αGalCer
Цитотоксичность in vivo, индуцированную ответом CD8+ Т-клеток на клетки мишени, нагруженные Ova-пептидом, оценивают, как описано в примере 4, для различных концентраций αGalCer. Мышей из 11 групп по три мыши внутривенно иммунизируют с применением 100 мкл в общем PBS только, 50 мкг Ova только, 1 мкг αGalCer только, 50 мкг Ova вместе с 1 мкг, 100 нг, 10 нг, 1000 пг, 100 пг, 10 пг или 0,1 пг αGalCer. На 10-ый день мышам внутривенно вводят меченые CFSE клетки мишени. На 11 день отбирают образцы крови из глазной пазухи каждой мыши. Средний процент выживаемости и цитотоксическую активность определяют, как описано выше. На фигуре 8 приведен процент специфического лизиса для каждой группы мышей для конкретных доз αGalCer. Результаты показывают, что αGalCer с антигеном способен генерировать зависимое от дозы специфическое цитотоксическое действие при внутривенном введении.
Пример 6. Цитотоксический ответ после внутривенной иммунизации с применением Ova с различными концентрациями PBS-57
Цитотоксичность in vivo, индуцированную ответом CD8+ Т-клеток, стимулированных различными концентрациями PBS-57, на клетки мишени, нагруженные Ova-пептидом и меченые CFSE, оценивают, как описано в примере 4. Мышей из 11 групп по три мыши внутривенно иммунизируют с применением 100 мкл в общем PBS только, 50 мкг Ova только, 50 мкг Ova вместе с 10 мкг PBS-57, 1 мг PBS-57, 100 нг PBS-57, 10 нг PBS-57, 1 нг PBS-57, 100 пг PBS-57, 10 пг PBS-57, 1 пг PBS-57 или 0,1 пг PBS-57. На 10-ый день мышам внутривенно вводят клетки мишени и на 11 день отбирают образцы крови из глазных пазух. Средний процент выживаемости и цитотоксическую активность определяют, как описано выше. На фигуре 9 приведен процент специфического лизиса в крови для каждой группы мышей, иммунизированных каждой дозой PBS-57. Результаты показывают, что PBS-57 в комбинации с Ova способен индуцировать зависимое от дозы специфическое цитотоксическое действие при внутривенном введении.
Пример 7. Цитотоксические ответы после внутривенной иммунизации PBS-57 с различными концентрациями Ova
Цитотоксический ответ CD8+ клеток на различные концентрации овальбумина при постоянной концентрации PBS-57 оценивают, как описано в примере 4. Мышам из 10 групп по три мыши внутривенно вводят на день 0 в 100 мкл PBS 50 мкг Ova только, 1 мкг PBS-57 только, 1 мкг PBS-57 вместе с 50 мкг Ova, с 10 мкг Ova, 1 мкг Ova, 100 нг Ova, 10 нг Ova, 1 нг Ova, 100 пг Ova или 10 пг Ova. На 10-ый день мышам внутривенно вводят клетки мишени и на 11 день мышей забивают и отбирают образцы крови из глазной пазухи и выделяют клетки селезенки. Средний процент выживаемости и цитотоксическую активность определяют, как описано выше. На фигуре 10 приведен процент специфического лизиса для каждой группы мышей, иммунизированных каждой дозой Ova. Результаты показывают, что цитотоксический ответ на вакцинацию антигеном и PBS-57 зависит от концентрации антигена.
Пример 8. Цитотоксический ответ после внутримышечной иммунизации αGalCer с различными концентрациями Ova
Цитотоксический ответ CD8+клеток на различные концентрации овальбумина при постоянной концентрации αGalCer, введенных внутримышечно, оценивают, как описано в примере 4. Мышам из 14 групп по три мыши внутримышечно вводят в левую заднюю лапу на день 0 в 100 мкл PBS 400 мкг Ova только, 1 мкг αGalCer только или 400 мкг Ova совместно с 1 мкг αGalCer, 0,5 мкг αGalCer, 0,1 мкг αGalCer, 50 нг αGalCer, 10 нг αGalCer, 5 нг αGalCer,, 1 нг αGalCer, 500 пг αGalCer, 100 пг αGalCer, 50 пг αGalCer или 10 пг αGalCer. На 10-ый день мышам внутривенно вводят меченые CFSE клетки мишени и на 11 день мышей забивают и отбирают образцы крови из глазной пазухи. Специфический лизис нагруженных SIINFEKL клеток мишеней измеряют с помощью проточной цитометрии. Средний процент выживаемости и цитотоксическую активность рассчитывают, как описано в примере 4. На фигуре 11 приведен процент специфического лизиса в крови для каждой группы мышей, иммунизированной каждой дозой αGalCer. Результаты показывают, что αGalCer не способен вызывать специфический цитотоксический ответ Т-клеток при внутримышечном введении антигена Ova, что продемонстрировано очень низким специфическим лизисом в широком диапазоне концентраций αGalCer от 1 мкг до 100 пг. Эти концентрации αGalCer вызывают цитотоксический ответ при внутривенном введении в интервале от 1 мкг до 10 пг, но не вызывают цитотоксического ответа при внутримышечном введении.
Пример 9. Цитотоксический ответ после внутримышечной иммунизации PBS-57 с различными концентрациями Ova
Цитотоксический ответ CD8+ клеток при внутримышечном введении PBS-57 оценивают, как описано в примере 4. Мышам из 14 групп по три мыши внутримышечно вводят в левую заднюю лапу на день 0 в 100 мкл PBS только PBS, 400 мкг Ova только, 1 мкг PBS-57 только или 400 мкг Ova совместно с 1 мкг PBS-57, 0,5 мкг PBS-57, 0,1 мкг PBS-57, 50 нг PBS-57, 10 нг PBS-57, 5 нг PBS-57, 1 нг PBS-57, 500 пг PBS-57, 100 пг PBS-57, 50 пг PBS-57 или 10 пг PBS-57. На 10-ый день мышам внутривенно вводят меченые CFSE клетки мишени и на 11 день мышей забивают и отбирают образцы крови из глазной пазухи. Средний процент выживаемости и цитотоксическую активность определяют, как описано в примере 4. На фигуре 12 показана кривая зависимости специфического лизиса от дозы у мышей, иммунизированных внутримышечно PBS-57 и Ova. Результаты показывают, что PBS-57 способен вызвать цитотоксический ответ как внутривенном, так и при внутримышечном введении в отличие от αGalCer, который вызывает цитотоксический ответ только при внутривенном введении.
Пример 10. Сравнение цитотоксических ответов после внутримышечной или внутривенной иммунизации Ova и PBS-57 или αGalCer
Цитотоксический ответ на Ova с PBS-57 или Ova с αGalCer при внутривенном или внутримышечном введении оценивают, как описано в примере 4. Мышей из восьми групп инъецируют на день 0 нижеследующим образом:
1) 3 мышам вводят внутримышечно 400 мкг Ova в 50 мкл PBS;
2) 3 мышам вводят внутривенно 400 мкг Ova в 50 мкл PBS;
3) 6 мышам вводят внутримышечно 400 мкг Ova и 1 мкг αGalCer в 50 мкл PBS;
4) 3 мышам вводят внутривенно 400 мкг Ova и 1 мкг αGalCer в 50 мкл PBS;
5) 6 мышам вводят внутримышечно 400 мкг Ova и 1 мкг αGalCer в 50 мкл PBS;
6) 3 мышам вводят внутривенно 400 мкг Ova и 1 мкг αGalCer в 50 мкл PBS;
7) 6 мышам вводят внутримышечно 400 мкг Ova и 1 мкг PBS-57 в 50 мкл PBS;
8) 3 мышам вводят внутривенно 400 мкг Ova и 1 мкг PBS-57 в 50 мкл PBS.
Мышам вводят меченые CFSE клетки мишени на день 10. Мышей забивают на день 11 и отбирают образцы крови. Средний процент выживаемости и цитотоксическую активность определяют, как описано в примере 4. На фигуре 13 приведен процент специфического лизиса при применении различных путей введения. Результаты подтверждают, что αGalCer не вызывает цитотоксический ответ при внутримышечном введении, тогда как PBS-57 вызывает цитотоксический ответ независимо от пути введения.
Пример 11. PBS-57 усиливает образование антител на анатоксин столбняка in vivo.
Для определения того, приводит ли добавление PBS-57 к анатоксину столбняка при иммунизации к усилению иммунного ответа, группу из 6 мышей иммунизируют внутримышечно в день 0 и в день 15 с помощью 10 мкг анатоксина столбняка (ТТ) или 10 мкг анатоксина столбняка вместе с 1 мкг PBS-57. Титр IgG определяют с помощью стандартных способов в образцах крови, отобранных на день 0, 15 и 30. Титр антител определяют с помощью специфического к анатоксину столбняка ELISA. Как показано на фигуре 14, PBS-57 усиливает ответ с образованием антител к ТТ.
Пример 12. Сравнение ответа CD8+ Т-клеток после внутримышечной иммунизации Ova самим по себе или в сочетании с PBS-57
Модель на мышах применяют для тестирования in vivo специфического ответа Т-клеток (CD8+), вызванного PBS-57 в комбинации с антигеном. Самок мышей C57B 1/6J CD45.2 иммунизируют внутримышечно в день 0 и 14 антигеном (овальбумин, Ova, grade VII, Sigma St.Louis, МО) вместе с адъювантом или без него, только адъювантом или только носителем (контроль) в общем объеме 100 мкл PBS. Тестируемый адъювант представляет собой 1 мкг PBS-57 вместе с 50 мкг Ova или без него. Каждая группа включает по меньшей мере три мыши. Кровь отбирают у каждой мыши на день 21 и выделенные клетки подвергают окрашиванию пентамерами H2Kb-SIINFEKL после блокирования Fc рецептора. Проводят FACS анализ включая только CD8+клетки в анализ (CD19+ клетки исключают из анализа для исключения любых В клеток). На фигуре 15 приведены данные проточной цитометрии, показывающие увеличение Ova-специфичных CD8+Т-клеток после внутримышечной инъекции PBS-57 и Ova по сравнению с Ova самим по себе. Результаты представлены в виде среднего +/- стандартное отклонение H2Kb-SIINFEKL специфичных CD8+Т-клеток в крови.
Пример 13. Сравнение ответа CD8+ Т-клеток после подкожной иммунизации Ova самим по себе или в сочетании с PBS-57 или αGalCer
Модель на мышах применяют для тестирования in vivo специфического ответа Т-клеток (CD8+), вызванного PBS-57 в комбинации с антигеном по сравнению с ответом на αGalCer. Самок мышей C57B 1/6J CD45.2 иммунизируют подкожно на день 0 и 14 антигеном (овальбумин. Ova, grade VII, Sigma St.Louis, МО) вместе с адъювантом или без него, только адъювантом или только носителем (контроль) в общем объеме 100 мкл PBS (носителя). Тестируемый адъювант представляет собой 1 мкг PBS-57 или αGalCer вместе с 50 мкг Ova или без него. Каждая группа включает по меньшей мере три мыши. Кровь отбирают у каждой мыши на 21 день и выделенные клетки подвергают окрашиванию пентамерами H2Kb-SIINFEKL после блокирования Fc рецептора. Проводят FACS анализ, включая в него только CD8+ клетки (CD19+ клетки исключают из анализа с целью исключения В клеток). На фигуре 16 приведены типичные данные проточной цитометрии, показывающие увеличение Ova-специфичных CD8+ Т-клеток после внутримышечной инъекции PBS-57 и Ova по сравнению с ведением только Ova или по сравнению с иммунизацией αGalCer и Ova. Результаты представлены в виде среднего значения +/- стандартное отклонение H2Kb-SIINFEKL специфичных CD8+Т-клеток в крови.
Хотя композиции и способы изобретения описаны в терминах примеров осуществлений, специалисту в данной области техники понятно, что можно применять вариации композиций и способов на отдельном этапе или в последовательности этапов осуществления способов, описанных здесь, не выходя за рамки концепции и области притязаний изобретения. Более конкретно, понятно, что определенными агентами, близкими как химически так и физиологически, можно заместить агенты, описанные здесь, при этом будут достигнуты такие же или близкие результаты. Все такие близкие заместители и модификации, понятные специалисту в данной области техники, включены в область притязаний и концепцию изобретения. Дополнительно, все патенты и публикации, перечисленные здесь, включены полностью посредством ссылки.
Как применяется в данной спецификации и приложенной формуле изобретения, то, формы единственного числа и множественного числа взаимозаменяемы, если специально не оговорено противное. Так, например, ссылка на композицию, содержащую «полинуклеотид», включает смесь двух или более полинуклеотидов. Следует также заметить, что термин «или» обычно применяется в смысле «и/или», если специально не оговорено противное. Все публикации, патенты и патентные заявки, на которые ссылается данная спецификация, предназначены для уровня обычного специалиста в данной области техники, к которому данное изобретение и обращено. Все упомянутые публикации, патенты и патентные заявки таким образом полностью включены посредством ссылки в той же степени, как если бы ссылка конкретно указывала на каждую индивидуальную публикацию или патентную заявку. В случае конфликта между настоящим раскрытием и включенными патентами, публикациями и ссылками, настоящее раскрытие должно быть главным.
Следует также конкретно понимать, что любые численные значения, упомянутые здесь, включают все значения от нижней величины до верхней величины, т.е. все возможные комбинации численных значений между наименьшим значением и наибольшим значением считаются конкретно присутствующими в заявке.

Claims (10)

1. Комбинированный препарат для увеличения иммуногенности вакцины при введении субъекту, содержащий синтетический гликолипид PBS-57 и вакцину, при этом компоненты препарата могут применяться как совместно, так и последовательно.
2. Комбинированный препарат по п.1, который вводят внутривенно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, орально, трансдермально, интраназально, внутрибрюшинно, трансмукозально или ректально.
3. Комбинированный препарат для стимуляции гуморального иммунного ответа на антиген вакцины у субъекта, включающий синтетический гликолипид PBS-57 и вакцину, содержащую антиген, при этом компоненты препарата могут быть введены субъекту как совместно, так и последовательно.
4. Комбинированный препарат по п.3, где гуморальный иммунный ответ включает продукцию IgG антител, IgA антител и/или IgM антител.
5. Комбинированный препарат для активации CD4+ Т-лимфоцитов у субъекта, включающий синтетический гликолипид PBS-57 и вакцину, содержащую антиген, при этом компоненты препарата могут быть введены субъекту как совместно, так и последовательно.
6. Комбинированный препарат по п.5, где активация CD4+ Т-лимфоцитов включает увеличение иммунного ответа Th1.
7. Комбинированный препарат по п.5, где активация CD4+ Т-лимфоцитов включает увеличение иммунного ответа Th2.
8. Комбинированный препарат по п.5, где активация CD4+ Т-лимфоцитов включает увеличение иммунного ответа Th1 и Th2.
9. Комбинированный препарат для активации CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов у субъекта, включающий синтетический гликолипид PBS-57 и вакцину, содержащую антиген, при этом компоненты препарата могут применяться как совместно, так и последовательно.
10. Комбинированный препарат по п.9, который вводят внутривенно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно, орально, трансдермально, интраназально, внутрибрюшинно, трансмукозально или ректально.
RU2010111766/10A 2007-08-29 2008-08-29 Комбинированный препарат для увеличения иммуногенности вакцины (варианты) RU2491090C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US96873107P 2007-08-29 2007-08-29
US60/968,731 2007-08-29
PCT/IB2008/003016 WO2010023498A1 (en) 2007-08-29 2008-08-29 Methods of enhancing adjuvanticity of vaccine compositions

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2010111766A RU2010111766A (ru) 2011-10-10
RU2491090C2 true RU2491090C2 (ru) 2013-08-27

Family

ID=42061962

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2010111766/10A RU2491090C2 (ru) 2007-08-29 2008-08-29 Комбинированный препарат для увеличения иммуногенности вакцины (варианты)

Country Status (14)

Country Link
US (1) US8916164B2 (ru)
EP (1) EP2190475B1 (ru)
JP (1) JP5539890B2 (ru)
KR (1) KR101540081B1 (ru)
CN (1) CN101820909A (ru)
AU (1) AU2008360937B9 (ru)
BR (1) BRPI0815846A2 (ru)
ES (1) ES2558157T3 (ru)
HR (1) HRP20151356T1 (ru)
PL (1) PL2190475T3 (ru)
PT (1) PT2190475E (ru)
RU (1) RU2491090C2 (ru)
WO (1) WO2010023498A1 (ru)
ZA (1) ZA201001477B (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0820960B8 (pt) 2007-12-05 2021-05-25 Abivax composição, composição farmacêutica, e uso da composição
EP2842961B1 (en) 2012-04-26 2016-12-14 Riken New carbamate glycolipid and use thereof
AU2022228420A1 (en) 2021-03-01 2023-10-05 Deciduous Therapeutics, Inc. Compounds for activating invariant natural killer t-cells and methods of use in eliminating inflammatory senescent cells

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2174013C2 (ru) * 1993-01-22 2001-09-27 Слоан-Кеттеринг Институт фор Кансер Рисерч Композиция для стимулирования или повышения продуцирования антител, которые распознают ганглиозид
EP1150713B1 (en) * 1999-02-12 2005-04-27 Eurocine AB Vaccine formulation comprising monoglycerides or fatty acids as adjuvant
US20050192248A1 (en) * 2003-10-08 2005-09-01 Nyu Medical Center Use of synthetic glycolipids as universal adjuvants for vaccines against cancer and infectious diseases
EP1587538A1 (en) * 2003-01-30 2005-10-26 Chiron SRL Mucosal meningococcal vaccines
RU2006101394A (ru) * 2003-06-19 2006-06-10 Бестевил Холдинг Б.В. (Nl) Функционально реконструированные вирусные мембраны, содержащие адъювант
WO2007007946A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Seoul National University Industry Foundation A vaccine composition comprising alpha-galactosylceramide as an adjuvatnt for intranasal administration
RU2360699C2 (ru) * 2001-10-03 2009-07-10 Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс Инк. Композиции менингококковых вакцин с адъювантами

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5242800A (en) * 1990-01-30 1993-09-07 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Receptor for pathogenic fungi
US5936076A (en) * 1991-08-29 1999-08-10 Kirin Beer Kabushiki Kaisha αgalactosylceramide derivatives
TW261533B (ru) * 1992-07-16 1995-11-01 Kirin Brewery
EP0666268B1 (en) * 1992-10-22 2000-04-19 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Novel sphingoglycolipid and use thereof
EP0694558B1 (en) * 1993-04-15 1999-01-27 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Novel sphingoglycolipid and use thereof
EP0698031A4 (en) * 1993-05-14 1997-07-09 Cytel Corp SIALYL LEx ANALOGS AS INHIBITORS OF CELLULAR ADHESION
US6054433A (en) * 1994-11-03 2000-04-25 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for stimulating tissue growth and epithelial moisturization
US5785975A (en) * 1995-06-26 1998-07-28 Research Triangle Pharmaceuticals Adjuvant compositions and vaccine formulations comprising same
EP0821068A3 (en) * 1996-03-29 1999-06-02 Rohm And Haas Company Novel sphingolipids and a process thereto
US6417167B1 (en) * 1997-02-05 2002-07-09 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Lyophilized compositions containing shingoglycolipid and process for preparing them
CA2280130C (en) 1997-02-05 2007-12-18 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Lyophilized compositions containing sphingoglycolipid and process for preparing them
KR100527950B1 (ko) * 1997-04-10 2005-11-09 기린 비루 가부시키가이샤 알파-글리코실세라미드를 함유하는 엔케이티 세포활성화제
CA2316041A1 (en) 1997-12-30 1999-07-08 Pam Fredman Galactosylceramide, glucosylceramide, lactosylceramide, and specific catchers therefor for use in the prophylaxis or therapy of prediabetes, diabetes and/or associated complications
DE69943314D1 (de) * 1998-02-12 2011-05-12 Kapil N Bhalla Sphingolipid-derivate und verfahren zu deren verwendung
CA2389652A1 (en) * 1999-10-12 2001-04-19 National Research Council Of Canada Archaeosomes as immunomodulating carriers for acellular vaccines to induce cytotoxic t lymphocyte(ctl) responses and protect the vaccinated host against intracellular pathogens and cancer
US20030157113A1 (en) 1999-12-28 2003-08-21 Terman David S. Compositions and methods for treatment of neoplastic disease
EP1277472A4 (en) * 2000-04-28 2005-06-08 Orient Cancer Therapy Co Ltd REMEDIES AGAINST CANCER
JP4410913B2 (ja) * 2000-06-12 2010-02-10 壽製薬株式会社 新規糖脂質誘導体の製造方法
US20020115624A1 (en) * 2000-06-22 2002-08-22 Behar Samuel M. Alpha gylcosylceramides for treating bacterial and fungal infections
AR034413A1 (es) * 2000-08-25 2004-02-25 Nestor Abel Chamoles Metodo para determinar la actividad de las enzimas lisosomales
EP1434859A2 (en) 2001-07-25 2004-07-07 New York University Use of glycosylceramides as adjuvants for vaccines against infections and cancer
KR100549866B1 (ko) 2001-08-22 2006-02-08 고려대학교 산학협력단 암치료 및 예방 제제
CA2469406A1 (en) * 2001-11-06 2003-05-15 Orient Cancer Therapy Co., Ltd. Anticancer compositions
US7273853B2 (en) * 2002-05-13 2007-09-25 Enanta Pharmaceuticals, Inc. 6-11 bicyclic ketolide derivatives
WO2003105769A2 (en) * 2002-06-13 2003-12-24 New York University Synthetic c-glycolipid and its use for treating cancer infectious diseases and autoimmune diseases
AU2003225891A1 (en) 2003-03-20 2004-11-19 Brigham Young University 6"-amino-6"-deoxygalactosylceramides
US7645873B2 (en) * 2003-03-20 2010-01-12 The Scripps Research Institute 6″-amino-6″-deoxygalactosylceramides
GB0314682D0 (en) 2003-06-24 2003-07-30 Isis Innovation Materials and methods relating to the modulation of T cell response to soluble antigen
AU2005235080A1 (en) 2004-03-31 2005-11-03 New York University Novel synthetic C-glycolipids, their synthesis and use to treat infections, cancer and autoimmune diseases
AU2005280163B2 (en) 2004-08-27 2011-11-24 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Ceramide derivatives as modulators of immunity and autoimmunity
DE602005020643D1 (de) * 2004-09-03 2010-05-27 Univ Chicago Verfahren zur aktivierung von nkt-zellen
JP5090928B2 (ja) * 2004-12-28 2012-12-05 ザ ロックフェラー ユニバーシティ Ｎｋｔ細胞に対する抗原としての糖脂質及びその類似体
DK1848813T3 (da) 2005-01-28 2013-07-15 Univ Brigham Young Aktivering af bakterielt glycolipid fra CD1D-begrænsede NKT-celler
CA2626997C (en) 2005-10-25 2014-12-23 Ludwig Institute For Cancer Research Analogs of alpha galactosylceramide and uses thereof
US8227581B2 (en) 2006-04-07 2012-07-24 The Scripps Research Institute Modified α-galactosyl ceramides for staining and stimulating natural killer T cells
CN101426523B (zh) 2006-04-27 2013-03-27 财团法人首尔大学校产学协力财团 基于负载了天然杀伤t细胞的配体、和抗原的b细胞的疫苗
WO2008005824A1 (en) 2006-06-30 2008-01-10 The Scripps Research Institute Adjuvants and methods of use
EP1938836A1 (en) 2006-12-28 2008-07-02 Universite Rene Descartes (Paris V) Compositions comprising a B subunit of shiga toxin and a means stimulating NKT cells
KR100868959B1 (ko) 2006-12-30 2008-11-17 재단법인서울대학교산학협력재단 알파-갈락토실세라마이드 유도체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는면역보조용 약학적 조성물
EP2058011A1 (en) * 2007-11-07 2009-05-13 Wittycell Nkt cell activating gycolipids covalently bound antigens and/or drug
BRPI0820960B8 (pt) * 2007-12-05 2021-05-25 Abivax composição, composição farmacêutica, e uso da composição
US9220767B2 (en) 2008-10-08 2015-12-29 Abivax Vaccine composition for use against influenza

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2174013C2 (ru) * 1993-01-22 2001-09-27 Слоан-Кеттеринг Институт фор Кансер Рисерч Композиция для стимулирования или повышения продуцирования антител, которые распознают ганглиозид
EP1150713B1 (en) * 1999-02-12 2005-04-27 Eurocine AB Vaccine formulation comprising monoglycerides or fatty acids as adjuvant
RU2360699C2 (ru) * 2001-10-03 2009-07-10 Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс Инк. Композиции менингококковых вакцин с адъювантами
EP1587538A1 (en) * 2003-01-30 2005-10-26 Chiron SRL Mucosal meningococcal vaccines
RU2006101394A (ru) * 2003-06-19 2006-06-10 Бестевил Холдинг Б.В. (Nl) Функционально реконструированные вирусные мембраны, содержащие адъювант
US20050192248A1 (en) * 2003-10-08 2005-09-01 Nyu Medical Center Use of synthetic glycolipids as universal adjuvants for vaccines against cancer and infectious diseases
WO2007007946A1 (en) * 2005-07-13 2007-01-18 Seoul National University Industry Foundation A vaccine composition comprising alpha-galactosylceramide as an adjuvatnt for intranasal administration

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20151356T1 (hr) 2016-01-01
PT2190475E (pt) 2016-02-11
KR20100072211A (ko) 2010-06-30
ZA201001477B (en) 2010-12-29
RU2010111766A (ru) 2011-10-10
AU2008360937B9 (en) 2014-02-13
US20100285042A1 (en) 2010-11-11
WO2010023498A8 (en) 2010-04-15
JP5539890B2 (ja) 2014-07-02
BRPI0815846A2 (pt) 2017-05-30
AU2008360937A1 (en) 2010-03-04
WO2010023498A1 (en) 2010-03-04
JP2011518760A (ja) 2011-06-30
KR101540081B1 (ko) 2015-07-29
PL2190475T3 (pl) 2016-04-29
EP2190475B1 (en) 2015-10-28
CN101820909A (zh) 2010-09-01
AU2008360937A2 (en) 2010-04-29
ES2558157T3 (es) 2016-02-02
AU2008360937B2 (en) 2014-01-16
EP2190475A1 (en) 2010-06-02
US8916164B2 (en) 2014-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2537188C2 (ru) Композиции и способы для усиления имунного ответа на антигены
JP4713638B2 (ja) ナチュラルキラーｔ細胞のリガンドと抗原を積載したｂ細胞を媒介とするワクチン
RU2548685C2 (ru) Усиление иммунного ответа и направленности на мишень с помощью антигенов и/или лекарства
RU2491090C2 (ru) Комбинированный препарат для увеличения иммуногенности вакцины (варианты)
DK2190475T3 (en) PROCEDURES FOR IMPROVING ADJUSTABILITY IN VACCINE COMPOSITIONS
JP2011102320A (ja) ナチュラルキラーｔ細胞のリガンドと抗原を積載したｂ細胞を媒介とするワクチン
Nitcheu et al. Preclinical and Clinical Development of Synthetic i NKT-Cell Glycolipid Agonists as Vaccine Adjuvants

Legal Events

Date Code Title Description
PC43 Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions

Effective date: 20150724

MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20160830