KR20100025514A - Ｎｋｔ 활성화제，ｃｄ40 효능제 및 임의의 항원의 애주번트 조합물 및 상승적인 세포 면역성의 유도에 의한 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 NKT 활성화제, 예컨대 알파-갈락토실세라마이드(α-Gal-Cer) 또는 iGb3, CD40 효능제 및 임의로 항원을 포함하는 애주번트 조합물에 관한 것이다. 암과 같은 다양한 만성 질환을 치료하기 위한 이러한 면역 애주번트의 용도도 제공된다.

Description

ＮＫＴ 활성화제，ＣＤ40 효능제 및 임의의 항원의 애주번트 조합물 및 상승적인 세포 면역성의 유도에 의한 용도{ADJUVANT COMBINATIONS OF ＮＫＴ ACTIVATOR，ＣＤ40 AGONIST, AND OPTIONAL ANTIGEN, THE USE THROUGH INDUCING SYNERGISTIC CELLULAR IMMUNITY}
본 발명은 일반적으로 면역 세포상에서 CD70 발현을 상향조절하고 항원 특이적 세포 면역성을 증진시키는 상승적인 애주번트 조합물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 천연 킬러 T 세포(NKT) 활성화제, 예컨대 알파-갈락토실세라마이드 (α-Gal-Cer) 또는 iGb3, 및 CD40 효능제, 예컨대 효능성 항-CD40 항체 또는 CD40L 폴리펩티드 또는 컨주게이트를 포함하고, 임의로 표적 항원을 추가로 포함하는 특이적인 상승적 조합물에 관한 것이다. 또한 추가로 본 발명은 이러한 상승적인 애주번트 조합물 또는 단백질 컨주게이트를 투여하여 항원 특이적 세포 면역성, 즉 CD8+ 면역성을 개선시키는 것을 포함하는 신규한 면역 치료법을 제공한다. 구체적으로, 암, 감염성 질환, 자가면역 질환, 알레르기 및 염증 질환을 포함하는 다양한 만성 질환을 치료하기 위한 면역 애주번트로서 이러한 애주번트 조합물 및/또는 폴리펩티드 컨주게이트를 포함하는 조성물의 용도도 교시된다.
미생물에 대한 신체 방어 시스템 및 세포 증식에 영향을 미치는 것들과 같은 다른 만성 질환에 대한 신체 방어는 선천 면역 시스템의 조기 반응 및 적응 면역 시스템의 후기 반응에 의해 매개된다. 선천 면역은, 예를 들어 미생물 병원체의 특징이며 포유동물 세포에는 존재하지 않는 구조를 인식하는 메카니즘을 포함한다. 이러한 구조의 예로는 세균 리포사카라이드(LPS), 바이러스 이중 가닥 DNA 및 메틸화되지 않은 CpG DNA 누클레오티드가 있다. 선천 면역 반응 시스템의 이펙터(effector) 세포는 호중구, 대식세포, 및 천연 킬러 세포(NK 세포)를 포함한다. 포유동물을 포함하는 척추동물은 선천 면역 이외에 감염성 제제로의 노출에 의해 자극되고 특정 항원에 대한 연속적인 각각의 노출로 크기 및 유효성이 증가되는 면역학적 방어 시스템을 발전시켜 왔다. 특정 감염 또는 항원 손상에 적응하기 위한 능력으로 인해, 이러한 면역 방어 메카니즘은 적응 면역으로서 개시되고 있다. B 림프구에 의해 생성된 항체를 수반하는 체액 면역성, 및 T 림프구에 의해 매개된 세포-매개된 면역성이라고 불리는 두 유형의 적응 면역 반응이 존재한다.
CD8+ 세포독성 림프구(CTL)와 CD4 헬퍼 세포(Th 세포)의 두 유형의 주요 T 림프구가 개시되었다. CD8+ T 세포는 T 세포 수용체(TCR)를 통해 예를 들어 바이러스 또는 세균 감염된 세포 상에서 클래스 I MHC 분자에 의해 제시된 외래 항원을 인식하는 이펙터 세포이다. 외래 항원을 인식하면, CD8+ 세포는 활성화되고, 성숙되며 증식 과정을 거친다. 이러한 증식 과정은 외래 항원을 디스플레이하는 표적 세포를 파괴하는 능력을 지닌 CTL 클론을 야기한다. 다른 한편으로 T 헬퍼 세포는 이펙터 면역 반응의 체액성 및 세포-매개된 형태 둘 모두에 수반된다. 체액성 또는 항체 면역 반응과 관련하여, 항체는 Th 세포와의 상호작용을 통해 B 림프구에 의해 생성된다. 구체적으로, 세포외 항원, 예컨대 순환 미생물은 분화된(specialized) 항원-제시 세포(APC)에 의해 채택되고, 가공되고, 클래스 II 주조직적합 복합체(MHC) 분자와 공동으로 CD4+ Th 세포에 제시된다. 이러한 Th 세포는 차례로 B 림프구를 활성화시켜 항체 생성을 초래한다. 대조적으로, 세포-매개된 또는 세포의 면역 반응은 예컨대 표적 세포의 성공적인 감염 후에 세포내 위치에 존재하는 미생물을 중화시키도록 기능한다. 예를 들어 미생물 항원과 같은 외래 항원은 감염된 세포 내에서 합성되고 이러한 세포의 표면 위에서 클래스 I MHC 분자와 공동으로 다시 보내진다. 이러한 에피토프의 제시는 상기-개시된 CD8+CTL의 자극을 초래하고, 이것은 바꾸어 말해 CD4+ Th에 의해 자극되는 공정이다. 세포는 Th1 및 Th2 세포라 불리는 2개 이상의 별개의 아집단(subpopulation)으로 구성된다. Th1 및 Th2 아형(subtype)은 항원으로의 노출 후 공통의 전구체로부터 분화되는 Th 세포의 분극된 집단을 나타낸다.
각 T 헬퍼 세포 아형은 서로 반대되고 서로의 확장 및 기능을 교차-조절하는 별개의 면역학적 효과를 촉진하는 시토킨을 분비한다. Th1 세포는 인터페론(IFN) 감마, 종양 괴사 인자-알파(TNF-알파), 인터루킨-2(IL-2), 및 IL-12와 같은 높은 양의 시토킨과 적은 양의 IL-4를 분비한다. Th1 관련된 시토킨은 CD8+ 세포독성 T 림프구 T 림프구 (CTL) 활성을 증진시키고, 세포내 병원체에 대한 세포-매개된 면역 반응과 가장 빈번하게 관련된다. 대조적으로, Th2 세포는 IL-4, IL-13, 및 IL-10과 같은 높은 양의 시토킨을 분비하나 IFN-감마의 양은 적고, 이는 항체 반응을 증진시킨다. Th2 반응은 탄저병으로부터의 보호와 같은 체액 반응 및 연충 감염의 제거에 특히 적절하다.
생성된 면역 반응이 Th1 또는 Th2-유도되는 지는 수반되는 병원체 및 시토킨과 같은 세포 환경의 인자에 의해 좌우된다. T 헬퍼 반응 또는 올바른 T 헬퍼 서브셋 활성화의 실패는 특정 병원체와 싸우기 위한 충분한 반응을 얻기에 무능력할 뿐만 아니라 재감염에 대해 불충분한 면역성을 생성할 수 있다. 수많은 감염성 제제는 Th1 면역성에 의해 예시되는 바와 같이 세포-매개된 반응이 보호 및/또는 치료에 있어서 중요한 역할을 담당할 것으로 예상되는 세포내 병원체이다. 더욱이, 이러한 감염 중 다수에서, 부적절한 Th2 반응의 유도가 질병 성과에 부정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 예로는 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis), 에스. 만소니(S. mansoni) 및 또한 역효과의 Th2-유사 지배된 면역 반응이 있다. 나병종나병도 널리 보급되어 있으나 부적절한 Th2-유사 반응의 특징인 것으로 보인다. HIV 감염은 또 다른 예를 나타낸다. 여기에서, 다른 Th 세포 집단에 대한 Th1-유사 세포의 비율을 낮추는 것이 질병 징후로의 진행에서 중요한 역할을 할 수 있음이 제안되었다.
감염성 제제에 대한 보호 수단으로서, 일부 미생물로부터의 보호를 위한 백신화 프로토콜이 개발되어 왔다. 감염성 병원체에 대한 백신화 프로토콜은 종종 불충분한 백신 면역원성, 부적절한 유형의 반응 (항체 대 세포-매개된 면역성), 장기간 면역학적 기억을 유도하는 능력의 부족, 및/또는 주어진 병원체의 상이한 혈청형에 대한 면역성 생성의 실패에 의해 방해된다. 현재의 백신화 전략은 주어진 혈청형 및 다수의 일반적인 병원체, 예를 들어 바이러스 혈청형 또는 병원체에 특 이적인 항체의 유도를 목표로 한다. 혈청형이 세계적으로 유행하는지를 모니터링하기 위해 순환 근거에 대한 노력이 이루어져야 한다. 이의 예로는 주요 감염성 균주로 예상되는 새로운 인플루엔자 A 혈청형의 연례 모니터링이 있다.
백신화 프로토콜을 뒷받침하기 위해, 특정 감염성 질환에 대한 면역 반응의 생성을 지지할 애주번트가 추가로 개발되어 왔다. 예를 들어, 알루미늄 염은 비교적 안전하고 효과적인 백신 애주번트로서 특정 병원체에 대한 항체 반응을 개선시키기 위해 이용되고 있다. 이러한 애주번트의 단점 중 하나는 이들이 세포-매개된 면역 반응을 자극하고 크게 Th2 바이어싱된(biased) 면역 반응을 생성하는데 비교적 효과가 없다는 것이다.
보호 면역성의 생성이 항원으로의 노출 뿐만 아니라 항원이 만나는 상황에 좌우된다는 것이 이제 널리 인식된다. 비염증 상황에서 신규한 항원의 숙주로의 도입이 장기간 면역성이라기 보다 면역학적 허용성(tolerance)을 생성하는 반면 염증제(애주번트)의 존재하에 항원에의 노출이 면역성을 유도하는 수많은 예가 존재한다 (Mondino et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93:2245 (1996); Pulendran et al., J. Exp. Med. 188:2075 (1998); Jenkins et al., Immunity 1:443 (1994); and Kearney et al., Immunity 1:327 (1994)).
적응 면역성을 조절하는 것으로 공지된 천연 발생 분자는 CD40이다. CD40은 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이고 세포-매개된 면역 반응의 스펙트럼에 필수적이며 T 세포 의존성 체액 면역성의 발생에 요구된다 (Aruffo et al., Cell 72:291 (1993); Farrington et al., Proc Natl Acad Sci., USA 91:1099 (1994); Renshaw et al., J Exp Med 180:1889 (1994)). 이의 타고난 역할에서, CD4+ T 세포 상에서 발현된 CD40-리간드는 DC 또는 B 세포 상에서 발현된 CD40과 상호작용하여 APC의 증가된 활성화를 증진시키는 동시에 T 세포를 추가로 활성화시킨다 (Liu et al Semin Immunol 9:235 (1994); Bishop et al., Cytokine Growth Factor Rev 14:297 (2003)). DC의 경우, CD40 라이게이션(ligation)이 활성화 마커 상향조절 및 염증 시토킨 생성과 같은 TLR을 통한 자극과 유사한 반응을 전통적으로 초래한다 (Quezada et al. Annu Rev Immunol 22:307 (2004); O'Sullivan B and Thomas R Crit Rev Immunol 22:83 (2003)). CD8 반응에서의 이의 중요성은 CD40을 통한 APC의 자극이 CD4 세포의 부재하에 CD4-의존성 CD8+ T 세포 반응을 보호함을 나타내는 연구에 의해 입증되었다 (Lefrancois et al., J Immunol. 164:725 (2000); Bennett et al., Nature 393:478 (1998); Ridge et al., Nature 393:474 (1998); Schoenberger et al., Nature 393:474 (1998). 이러한 발견은 CD40 효능제가 단독으로 일부 질환 환경에서 약해지는 CD8+ T 세포 반응을 잠재적으로 보호할 수 있었다는 결론을 크게 유발시킨다.
그러나, 다른 연구는 CD40 자극만으로는 장기간 면역성이 불충분하게 증진됨을 입증하였다. 일부 모델 시스템에서, 항-CD40 치료만으로는 장기간 면역성이 불충분하게 증진되었다. 일부 모델 시스템에서, 단독의 항-CD40 치료는 효과 없는 염증 시토킨 생성, 항원-특이적 T 세포의 결실 (Mauri et al. Nat Med 6:673 (2001); Kedl et al. Proc Natl Acad Sci., USA 98:10811 (2001)) 및 B 세포 반응의 종료 (Erickson et al., J Clin Invest 109:613 (2002))를 초래할 수 있다. 또 한, 가용성 삼합 CD40 리간드를 CD40 경로에 대한 효능제로서 임상에 이용하였고 조금 보고된 바에 따르면 이는 CD40의 자극만으로는 장기간 CD8+ T 세포 면역성에 대한 모든 필요한 시그널을 재구성하는데 실패한다는 결론과 일치한다 (Vonderheide et al., J Clin Oncol 19:3280 (2001)).
다양한 효능성 항체가 상이한 그룹에 의해 보고되었다. 예를 들어, 하나의 mAb CD40.4 (5c3) (PharMingen, San Diego California)가 CD40 및 CD40L간의 활성화를 대략 30-40%만큼 증가시키는 것이 보고되었다 (Schlossman et al., Leukocyte Typing, 1995, 1 :547-556). 또한, 시애틀 제네틱스는 미국특허 제 6,843,989호에서 효능성 항-인간 CD40 항체를 이용하여 인간의 암을 치료하는 방법을 제공한다고 주장한다. 이들의 항체는 자극 시그널을 전달하는 것으로 주장되며, 이는 CD40 및 CD40L의 상호작용을 적어도 45%만큼 개선시키고 CD40L-매개된 자극을 개선시키며 생체내 신생물 활성을 소유한다. 이들은 강한 성장-증진 시그널을 B 림프구에 전달하는 것으로 이전에 지적된 효능성 항-인간 CD40 항체인 S2C6으로부터 항체를 수득한다 (Paulie et al., 1989, J. Immunol. 142:590-595).
선천 및 적응 면역 반응에서의 CD40의 활성으로 인해, 다양한 CD40 효능제가 백신 애주번트로서 그리고 개선된 세포 면역성이 요망되는 요법에서의 사용을 위해 연구되어 왔다. 최근에, 일부 TLR 효능제 및 항-CD40 치료와 함께 항원을 이용한 면역화가 (조합된 TLR/CD40 효능제 면역화) 효능 있는 CD8+ T 세포 팽창을 유도하고, 어느 효능제 단독으로의 면역화보다 10-20배 더 높은 반응을 유도함이 입증되었다 (Ahonen et al., J Exp Med 199:775 (2004)). 이것은 효능 있는 CD8+ T 세포 반응이 바이러스제 또는 미생물제로의 감염 없이 생성될 수 있다는 첫 번째 입증이었다. 조합된 TLR/CD40 효능제 면역화에 의해 유도된 항원 특이적 CD8+ T 세포는 세포용해 기능, 감마 인터페론 생성, 및 항원성 챌린지(challenge)에 대한 개선된 이차 반응을 입증한다. CD8+ T 세포 팽창의 유도에서 항-CD40을 이용한 상승적인 활성은 TLR1/6, 2/6, 3, 4, 5, 7 및 9의 효능제로 설명되었다. 이는 조합된 TLR/CD40 효능제 면역화가 충분히 후천적인 세포-매개된 면역성을 유도하는데 요구되는 모든 시그널을 재구성할 수 있음을 시사한다.
NKT 세포는 비-다형성 CD1d 항원 제시 분자에 의해 제한되는 T 세포 수용체를 발현하는 면역자극성 T-림프구로 공지되어 있다. NKT 세포는 CD1d-제시된 당지질, 알파-갈락토실세라마이드(α-Gal-Cer)를 인식한다. α-Gal-Cer를 인식하면, NKT 세포는 활성화되어 IL-4, IL-10, IL-13 및 IFN-γ를 포함하는 시토킨을 생성하고, 이와 같이 이들은 면역 조절 시토킨의 분비를 증진시킴에 의해 면역 반응을 상항조절하거나 하향조절할 수 있다. NKT 세포가 결여된 마우스는 세균 감염에 더욱 민감하고 일부 종양에 내성인데, 이는 숙주 방어에서 NKT 세포의 중요한 역할을 입증한다. 단일요법으로서 마우스에게 α-Gal-Cer를 투여함에 의해 NKT 세포를 활성화시키는 것이 또한 종양에 대한 면역성을 개선시키는데 제한된 성공을 거둘 수 있는 것으로 나타났다 (Matsuyoshi, H., S. Hirata, Y. Yoshitake, Y. Motomura, D. Fukuma, A. Kurisaki, T. Nakatsura, Y. Nishimura, and S. Senju. 2005. Therapeutic effect of alpha-galactosylceramide-loaded dendritic cells genetically engineered to express SLC/CCL21 along with tumor antigen against peritoneally disseminated tumor cells. Cancer Sci. 96:889-896; Crowe, N.Y., J.M. Coquet, S.P. Berzins, K. Kyparissoudis, R. Keating, D.G. Pellicci, Y. Hayakawa, D.I. Godfrey, and MJ. Smyth. 2005. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. J. Exp. Med. 202:1279-1288; Smyth, M.J., N. Y. Crowe, Y. Hayakawa, K. Takeda, H. Yagita, and D.I. Godfrey. 2002. NKT cells - conductors of tumor immunity? Curr. Opin. Immunol. 14:165-171).
따라서, 예컨대 백신화 프로토콜 또는 미생물 감염 동안, 적응 면역 반응의 유효성을 증가시키기 위해, 신규하고 더욱 효과적인 백신 애주번트를 개발하는 것이 중요하다. 본 발명은 이러한 요구를 만족시키며 다른 이점도 제공한다. 앞서, 본 발명자들은 톨(toll) 유사 수용체(TLR) 효능제 및 CD40 효능제의 조합물을 포함하는 신규한 상승적인 애주번트를 보고하였다. 조합물에서의 이러한 효능제는 세포 면역성에 대해 상승적인 효과를 유도한다. 이러한 상승적인 애주번트 및 이의 예방적 및 치료적 용도가 2004년 7월 22일 공개된 미국 공개특허 출원 US20040141950호에 개시되며, 이 특허 출원은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 본 발명은 또 다른 상승적인 애주번트 조합물의 발견 및 치료적 또는 예방적 면역 증강 조합물로서 이의 용도에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 (i) 하나 이상의 NKT 활성화제, 예컨대 알파-갈락토실세라마이드 (α-GalCer) 또는 iGb3; 및 (ii) 하나 이상의 CD40 효능제, 예컨대 CD40 효능성 항체 또는 이의 단편 또는 CD40L 폴리펩티드, 예컨대 단위체(monomelic) 또는 다합체 (삼합체) CD40L 단백질, CD40L 단백질 단편, 또는 CD40L을 함유하는 컨주게이트 및 (iii) 임의로 세포 면역 반응이 요망대로 유도되는 항원의 조합물을 포함하는 상승적인 면역 애주번트에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 면역 애주번트로서 상기 조합물의 용도 및 T 세포 면역성이 요망에 따라 개선되는 질환을 치료하기 위한 용도에 관한 것이다.
하기 상세하게 개시되는 대로, 이러한 면역 조합물은 하기의 수단으로서 이러한 치료가 필요한 숙주에게 투여될 수 있다:
(i) CD40 효능제 또는 NKT 활성화제만을 투여하는 것에 비해 더 높은 빈도의 항원-특이적 CD8+ T 세포의 유도;
(ii) CD40 효능제 또는 NKT 활성화제만을 투여하는 것에 비해 더 많은 양의 항원-특이적 CD8+ T 세포의 유도; 및
(iii) CD40 효능제 또는 NKT 활성화제만을 투여하는 것에 비해 종양 면역성의 개선.
항원을 추가로 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 이러한 면역 애주번트 조합물은 상기-언급된 개선된 세포 면역 반응이 치료적으로 요망되는 임의의 질병 또는 질환, 특히 감염성 질환, 증식성 질병, 예컨대 암, 알레르기, 자가면역 질병, 염증 질병, 및 개선된 세포 면역성이 요망되는 치료적 성과인 다른 만성 질환을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 적용은 암과 같은 만성 질환의 치료를 특히 포함한다.
도면의 간단한 설명
도 1은 항-CD40 및 α-GalCer의 조합된 투여 효과를 나타내는 실험을 포함하고, 이러한 투여는 생체내에서 항원-특이적 T 세포의 팽창을 상승적으로 개선시킨다.
도 2는 조합된 항-CD40 및 α-GalCer의 면역화의 결과인 면역 반응을 정량하는 실험을 포함한다.
도 3은 CD40/TLR* 백신화가 전신 흑색종에 치료적으로 개입하는 것을 나타내는 흑색종 세포로 면역된 마우스에서의 실험을 포함한다.
도 4는 항-CD40 및 α-GalCer의 투여가 생체내에서 DC 상에 CD70 발현을 유도하는 것을 나타내는 실험을 포함한다 (이 실험에서, 마우스에게 하기 조합물을 주사하였다: 2㎍ α-GalCer, 50㎍ polyIC, 및/또는 50㎍ 항-CD40 i.p. 비장을 주사한 지 18-20 시간 후에 취하였다).
도 5는 α-GalCer/CD40 면역화가 STAT4, IFNγ 및 IFNab에 독립적이나 STATl 및 T-bet에 의존적인 효능 있는 CD8+ 세포 반응을 유도하는 것을 나타내는 실험을 포함한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 상승적으로 유효한 양의 (i) 하나 이상의 천연 킬러-T 세포 (NKT) 활성화제, 예컨대 알파-갈락토실세라마이드 (α-GalCer) 또는 또 다른 NKT 세포 활성화제; (ii) 하나 이상의 CD40 효능제 및 (ii) 임의로 하나 이상의 항원을 포함하는 상승적인 면역 애주번트 조합물의 용도에 관한 것이다. 이러한 애주번트는 (i) 항원-특이적인 이펙터 CD8 T 세포를 팽창시키고/거나 (ii) 면역 반응을 개선시키는데 이용될 수 있다. 이에 기초하여, 이러한 상승적인 애주번트는 개선된 세포 면역성이 요망되는 질환, 예컨대 암 및 다른 증식성 질병, 바이러스 및 기타 감염, 자가면역성, 염증 질환 및 알레르기 질병에 걸린 개체를 예방적으로 및 치료적으로 처치하는데 이용될 수 있다. 구체적으로, 당해 상승적인 애주번트는 백신 애주번트로서 사용될 수 있다. 상기 백신 애주번트의 기본적인 성분들은 따라서 NKT 세포 활성화제, CD40 효능제일 것이고 보증되는 경우 종양 또는 감염성 질환 항원이 첨가될 것이다. 본 발명은 암 또는 감염성 질환과 같이 면역 반응을 개선시키고 자가면역성에서와 같이 면역 반응을 변형시키고자 하는 임의의 상황에 유용할 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은 NKT 활성화제, 예컨대 알파-갈락토실세라마이드 (α-Gal-Cer) 또는 iGb3 및 CD40 효능제 (예를 들어, CD40L 단백질 또는 단편이나 이의 유도체 또는 다합체 또는 CD40, 바람직하게는 인간 CD40에 결합되는 효능성 항체 또는 항체 단편) 및 임의로 항원을 포함하는 신규한 상승적인 효능성 조합물을 제공한다. 이러한 애주번트 조합물은 숙주 또는 바람직하게는 인간에게 투여될 때 개선된 항원 특이적인 세포 면역 반응을 생성하도록 이용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, NKT 활성화제는 알파-갈락토실세라마이드 (α-Gal-Cer), 이소글로보트리헥소실세라마이드 (iGb3) 또는 NKT를 자극할 수 있는 임의의 다른 분자, 예컨대 CD1d 항원-제시 분자에 의해 제시된 다른 당지질이다.
또한, 본 발명은 상기 상승적인 애주번트 조합물 및 비히클을 이용하는 방법으로서, 항원 특이적 면역 반응이 요망에 따라 유도되는 숙주, 예를 들어 암이나 감염성 또는 알레르기 질환과 같은 만성 질환에 걸린 사람에게 함유시켜 상기 구성을 생성하는 방법을 제공한다.
여전히 추가로 본 발명은 개선된 항원-특이적 세포 면역 반응을 유도하기 위해 숙주에게 투여하기 적합한 상기 신규한 상승적인 NKT 활성화제/CD40 효능제 조합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
특히, 본 발명은 개선된 항원 특이적 세포 면역 반응을 유도하기 위해 치료가 필요한 숙주에게 상기 신규한 상승적인 애주번트 조합물을 투여하는 것을 포함하는 신규한 면역요법을 제공한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 조성물 및 컨주게이트는 암, 감염, 특히 바이러스, 세균 또는 기생충과 관련된 만성 감염성 질환; 또는 자가면역, 염증 또는 알레르기 질환을 지닌 개체 또는 발생될 위험이 있는 개체에게 투여될 것이다. 구체적으로, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 흑색종에 대한 항원 특이적 세포 면역 반응을 유도하기 위해 이용될 수 있다.
따라서, 본 발명은 암 및 다른 증식성 질환, 예컨대 자가면역 질환, 알레르기 질병 및 염증 질환 뿐만 아니라 바이러스, 세균, 균류 또는 기생충과 관련된 만성 감염성 질환에 대한 효능 있는 백신의 개발을 제공하며, 여기서 효과적인 치료는 조합된 NKT 활성화제/CD40 효능제 면역화가 발생할 수 있는 세포 면역성의 양 또는 특성을 요구한다.
본 발명의 적용
본 발명은 하나 이상의 NKT 활성화제, 하나 이상의 CD40 효능제 및 임의로 항원을 포함하는 신규한 애주번트 조합물을 제공한다. 본 발명은 개선된 세포 면역 반응이 치료적으로 요망되는 당해 NKT 활성화제 및 CD40 효능제와 함께 임의의 항원의 사용을 포함한다. 일부 구체예에서, 항원은 NKT 활성화제와 따로 투여될 수 있거나, 숙주가 자연적으로 항원에 노출될 수 있다. 일부 구체예에서, 세 부분 모두는, 즉 항-CD40 항체와 같은 CD40 효능제, NKT 활성화제 및 항원은 동시에 투여될 수 있다. 추가로, 일부 구체예에서, 세 부분 모두는, 즉 항-CD40 항체와 같은 CD40 효능제, NKT 활성화제 및 항원은 따로따로 별개의 실체들로 공동-투여될 수 있다. 바람직하게는 이러한 부분들 모두가 실질적으로 공동으로 투여되어 세포 면역성에 있어서 요망되는 상승적인 개선을 달성한다. 이러한 부분들은 임의의 순서로 투여될 수 있다.
예시적인 항원으로는 이로 제한되는 것은 아니나 세균, 바이러스, 기생충, 알레르겐, 자가항원 및 종양 관련 항원이 있다. 구체적으로, 항원은 단백질 항원, 펩티드, 전(whole) 비활성화된 유기체 등을 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는 항원의 특정 예로는 A형, B형, C형 또는 D형 간염, 인플루엔자 바이러스, 리스테리아(Listeria), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 투베르쿨로시스(tuberculosis), 툴라레미아(tularemia), 바리올라 메이저(Variola major)(smallpox), 바이러스 출혈열, 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis)(plague), HIV, 헤르페스, 파필로마 바이러서, 및 감염성 제제와 관련된 기타 항원으로부터의 항원이 있다. 다른 항원은 종양 세포와 관련된 항원, 자가면역 질환, 알레르기 및 천식과 관련된 항원을 포함한다. 해당 효능제 조합물 플라젤린 및 항-CD40 항체와 함께 이러한 항원의 투여는 상기 질환 상태에 대해 면역성을 부여하기 위한 치료적 또는 예방적 백신에 사용될 우 있다.
일부 구체예에서, 방법 및 조성물은 감염성 제제로부터의 항원을 포함함에 의해 감염될 위험이 있는 개체 또는 감염된 개체를 치료하는데 이용될 수 있다. 감염은 숙주 내에서 재생되는 외래 유기체 또는 제제의 숙주내 존재에 기인한 질병 또는 질환을 언급한다. 감염될 위험이 있는 피검체는 감염이 발생하기 쉬운 피검체이다. 이러한 개체는 예를 들어 감염성 유기체 또는 제제에 노출된 것이 공지되어 있거나 노출된 것으로 의심되는 피검체를 포함할 수 있다. 감염될 위험이 있는 피검체는 감염성 제제 또는 유기체에 대한 면역 반응을 일으키는 손상된 능력과 관련된 질환에 걸린 피검체도 포함할 수 있고, 예를 들어 선천적이거나 후천적인 면역결핍증 피검체, 방사선 또는 화학요법을 받고 있는 피검체, 화상 상해를 입은 피검체, 외상 상해를 입은 피검체, 수술 또는 다른 침습성 의학적 또는 치의학적 절차를 받고 있는 피검체, 또는 유사하게 면역약화된 피검체가 있다.
본 발명의 백신 조성물로 치료되거나 예방될 수 있는 감염으로는 세균, 바이러스, 진균 및 기생충 감염이 있다. 덜 일반적인 유형의 다른 감염으로는 리케치아(rickettsiae), 미코플라슴(mycoplasm), 및 면양떨림병, 소 해면뇌병증(BSE) 및 프리온 질병을 야기하는 제제 (예를 들어, 쿠루 및 크로츠펠트-자콥병)가 있다. 인간을 감염시키는 세균, 바이러스, 균류 및 기생충은 널리 공지되어 있다. 감염은 급성, 아급성, 만성 또는 잠재적일 수 있고, 국소화되거나 전신적일 수 있다. 더욱이, 감염은 숙주에서 감염성 유기체 제제의 라이프 사이클 중 하나 이상의 기 동안 우세하게 세포내성(intracellular)이거나 세포외성(extracellular)일 수 있다.
해당 백신 또는 방법이 사용될 수 있는 세균 감염은 그램 음성 및 그램 양성 세균 둘 모두를 포함한다. 그램 양성 세균의 예로는 이로 제한되는 것은 아니나 파스퇴렐라 종(Pasteurella species), 스타필로코카이 종(Staphylococci species), 및 스트렙토코카이 종(Streptococci species)이 있다. 그램 음성 세균의 예로는 이로 제한되는 것은 아니나 에스체리치아 콜라이(Escherichia coli), 슈노모나스 종(Pseudomonas species) 및 살모넬라 종(Salmonella species)이 있다. 감염성 세균의 특정 예로는 이로 제한되는 것은 아니나 헬리코박터 파일로리(Heliobacter pyloris), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 미코박테리아 종(Mycobacteria spp.) (예를 들어, 엠. 투베르쿨로시스(M. tuberculosis), 엠, 아비움(M. avium), 엠. 인트라셀리라레(M. intracellilare), 엠. 카나사이(M. kansaii), 엠. 고르도내(M. gordonae)), 스타필로코커스 아루레우스(Staphylococcus aureus), 네이세리아 고노르호에아(Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노시토게너스(Listeria monocytogeners), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), (그룹 A 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 아갈라티애(Streptococcus agalactiae) (그룹 B 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 (비리단스(viridans) 그룹), 스트렙토코커스 패칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스(streptococcus bovis), 스트렙토코커스 (혐기성 종), 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 병원성 캄필로박터 종(Campylobacter spp.), 엔테로코커스 종(Enterococcus spp.), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diptheriae), 코리네박테리움 종(Corynebacterium spp.), 에리시펠로트릭스 류시오파티에(Erysipelothrix rhusiopathie), 클로스트리디움 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 에어로게네스(Enterobacter aerogenes), 클레브시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 박테로이즈 종(Bacteroides spp.), 푸소박테리움 누클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 트레포네마 퍼테뉴(Treponema pertenue), 렙토스피라(Leptospira), 리케치아(Rickettsia), 및 악티노마이세스 이스라엘리이(Actinomyces israelii)가 있다.
인간에서 감염을 야기하는 바이러스의 예로는 이로 제한되는 것은 아니나 레트로비리대(Retroviridae) (예를 들어, 인간 결핍바이러스, 예컨대 HIV-I (HTLV-III로서도 언급됨), HIV-II, LAC 또는 IDLV-III/LAV 또는 HIV-III 및 HIV-LP와 같은 기타 단리물), 피코르나비리대(Picornaviridae) (예를 들어, 폴리오바이러스, A형 간염, 엔테로바이러스, 인간 콕사키에 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스), 칼시비리대(Calciviridae) (예를 들어, 위장염을 일으키는 균주), 토가비리대(Togaviridae) (예를 들어, 말 뇌염 바이러스, 루벨라 바이러스), 플라비비리대(Flaviviridae) (예를 들어, 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열병 바이러스), 코로나비리대(Coronaviridae) (예를 들어, 코로나바이러스), 라브도비리대(Rhabdoviridae) (예를 들어, 물집입안염 바이러스, 광견병 바이러스), 필로비리대(Filoviridae) (예를 들어, 에볼라 바이러스), 파라믹소비리대(Paramyxoviridae) (예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 융합세포 바이러스), 오르토믹소비리대(Orthomyxoviridae) (예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 분가비리대(Bungaviridae) (예를 들어, 하탄(Hataan) 바이러스, 분가 바이러스, 플레오보바이러스, 및 나이로 바이러스), 아레나 비리대(Arena viridae) (출혈열 바이러스), 레오비리대(Reoviridae) (예를 들어, 레오바이러스, 오르비바이러스, 로타바이러스), 비마비리대(Bimaviridae), 헤파드나비리대 (Hepadnaviridae) (B형 간염 바이러스), 파르보비리대(Parvoviridae) (파르보바이러스), 파포바비리대(Papovaviridae) (파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스), 아데노비리대(Adenoviridae) (아데노바이러스), 헤르페비리대(Herpeviridae) (예를 들어, 단순포진 바이러스(HSV) I 및 II, 바리셀라 조스터 바이러스, 폭스 바이러스) 및 이리도비리대(Iridoviridae) (예를 들어, 아프리카 돼지열 바이러스) 및 미분류된 바이러스 (예를 들어, 해면뇌병증의 원인체, 델타 간염의 제제, 비-A형, 비-B형 간염의 제제 (창자로 전달되는 클래스 1; 비경구로 전달되는 클래스 2, 예컨대 C형 간염); 노르워크(Norwalk) 및 관련 바이러스 및 아스트로바이러스가 있다.
균류의 예로는 아스퍼질러스 종(Aspergillus spp.), 코카이도이즈 이미티스(Coccidoides immitis), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 및 기타 캔디다 종(Candida spp.), 블라스토마이세스 더마티디스(Blastomyces dermatidis), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 노카르디아 종(Nocardia spp.), 및 뉴모사이티스 카리니이(Pneumocytis carinii)가 있다.
기생충으로는 이로 제한되는 것은 아니나 혈액-매개 및/또는 조직 기생충, 예컨대 바베시아 미크로티(Babesia microti), 바베시 디베르간스(Babesi divergans), 엔토모에바 히스톨리티카(Entomoeba histolytica), 지아르다 람블리아(Giarda lamblia), 레이슈마니아 트로피카(Leishmania tropica), 레이슈마니아 종(Leishmania spp.), 레이슈마니아 브라질리엔시스(Leishmania braziliensis), 레이슈마니아 도노브드니(Leishmania donovdni), 플라스모디움 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모디움 말라리아(Plasmodium malariae), 플라스모디움 오발레(Plasmodium ovale), 플라스모디움 비박스(Plasmodium vivax), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 트리파노소마 잠비엔세(Trypanosoma gambiense) 및 트리파노소마 로데시엔세(Trypanosoma rhodesiense) (파동편모충증), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi) (차구스병(Chagus' disease)) 및 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 편형동물 및 회충이 있다.
지적된 대로 본 발명은 암과 같은 증식성 질환을 치료, 및 바람직한 구체예에서, 흑색종을 치료하는데 있어서 당해 컨주게이트의 용도를 추가로 포함한다. 암은 신체의 기관 및 시스템의 정상 기능을 방해하는 세포의 제어되지 않은 성장의 질환이다. 암에 걸린 피검체는 피검체의 신체에 존재하는 객관적으로 측정할 수 있는 암 세포를 지니는 개체이다. 암이 발생할 위험이 있는 피검체는 예를 들어 가족력, 유전적 소인, 방사선 또는 다른 암-유발제에 노출된 피검체에 기초하여, 암이 발생하기 쉬운 개체이다. 이들의 원위치에서 이동하여 중추 기관에 퍼진 암은 결국 감염된 기관의 기능성 저하를 통해 개체를 사망에 이르게 할 수 있다. 백혈병과 같은 조혈암은 피검체에서 정상적인 조혈 구획과 초-경쟁(out-compete)할 수 있어서 조혈 실패를 야기하고 (빈혈증, 저혈소판증 및 호중성백혈구감소증), 결국 사망을 야기한다.
전이는 일차 종양으로부터의 신체의 다른 부분으로 암 세포가 퍼짐에 의해 초래된 일차 종양 위치와 별개인 암세포 부위이다. 일차 종양 덩어리의 진단시에, 피검체는 전이의 존재에 대해 모니터링될 수 있다. 전이는 종종 특이적 징후의 모니터링에 추가하여 자기 공명 영상(MRI), 컴퓨터 단층촬영법(CT), 스캔, 혈액 및 혈소판 계수, 간기능 연구, 흉부-X-선 및 뼈 스캔을 단독으로 또는 조합하여 사용함에 의해 검출된다.
본 발명에 따른 애주번트 조합물 및 이를 함유하는 조성물은 종양-관련-항원 (TAA)의 포함이나 DNA 엔코딩에 의해 다양한 암 또는 암이 발생할 위험이 있는 개체를 치료하는데 이용될 수 있다. 이것은 종양 세포에서 발현된 항원이다. 이러한 암의 예로는 유방암, 전립선암, 결장암, 백혈병과 같은 혈액암, 만성 림프구 백혈병 등이 있다. 본 발명의 백신화 방법을 이용하여 종양 세포의 성장을 억제하거나 늦추거나 종양 크기를 감소시킴에 의해 종양을 치료하기 위해 면역 반응을 자극할 수 있다. 종양 관련된 항원은 종양 세포에 의해 우세하게 발현되나 배타적이지 않은 항원일 수도 있다.
추가의 암으로는 이로 제한되는 것은 아니나 기저세포 암종, 담관암, 방광암, 뼈암, 뇌 및 중추신경계(CNS) 암, 자궁암, 융모막암종, 직장결장암, 결합 조직암, 소화계의 암, 자궁내막암, 식도암, 눈암, 두경부암, 위암, 상피내 신생물, 신장암, 후두암, 간암, 폐암 (소세포, 큰세포), 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종을 포함하는 림프종; 신경모세포종; 경구암 (예를 들어, 입술, 혀, 입 및 인두); 난소암; 췌장암; 망막모세포종; 횡문근육종; 직장암; 호흡기암; 육종; 피부암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁암; 비뇨계암; 뿐만 아니라 기타 암종 및 육종이 있다.
본 발명에 따른 애주번트 조합물 및 이를 함유하는 조성물은 또한 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 타입 1 당뇨병, 건선 또는 다른 자가면역 질병과 같은 자가면역 질환을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 백신 및 면역 애주번트로 잠재적으로 치료될 수 있는 기타 자가면역 질환으로는 크론병 및 기타 염증성 장 질환, 예컨대 궤양결장염, 전신 홍반 루푸스(SLE), 자가면역 뇌척수염, 중증근육무력증(MG), 하시모토 갑상샘염, 굿패스쳐(Goodpasture's) 증후군, 천포창, 그레이브병, 자가면역 용혈빈혈, 자가면역 혈소판감소자색반, 항-콜라겐 항체를 지니는 피부경화증, 혼합된 결합조직병, 다발근육염, 악성빈혈, 특발 애디슨병, 자가면역 관련된 불임증, 사구체신염 (예를 들어, 반월상 사구체신염, 증식성 사구체신염), 물집 유사천포창, 쇼그렌 증후군, 건선 관절염, 인슐린 내성, 자가면역 당뇨병 (타입 1 당뇨병; 인슐린 의존성 당뇨병), 자가면역 간염, 자가면역 혈우병, 자가면역 림프증식 증후군 (ALPS), 자가면역 포도막염 및 길리안-베어 증후군(Guillain-Bare syndrome)이 있다. 최근에, 동맥경화증 및 알츠하이머병이 자가면역 질환으로서 인식되었다. 따라서, 본 발명의 이러한 구체예에서, 항원은 숙주가 조직 파괴 및 정상 세포의 손상에 기여하는 원치 않는 면역 반응을 유도하는 자가-항원일 것이다
본 발명에 따른 애주번트 조합물 및 이를 함유하는 조성물은 또한 천식 및 알레르기 및 염증 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 천식은 염증과 좁아진 기도 및 흡입된 제제에 대한 기도의 증가된 반응성을 특징으로 하는 호흡 계통의 질병이다. 천식은 배타적인 것은 아니나 아토피(atopic) 또는 알레르기 증상과 종종 관련된다. 알레르기는 물질(알레르겐)에 대한 후천적인 과민감성이다. 알레르기 질환으로는 습진, 알레르기 비염, 또는 코감기, 건초열, 기관지 천식, 두드러기, 및 음식 알레르기 및 기타 아토피 질환이 있다. 알레르겐은 민감할 수 있는 개체에서 알레르기 또는 천식 반응을 유도할 수 있는 물질이다. 꽃가루, 곤충독, 동물 비듬, 먼지, 균류 포자, 및 약물을 포함하는 수많은 알레르겐이 존재한다.
천연 및 식물 알레르겐의 예는 하기 속들에 특이적인 단백질을 포함한다: 개, 먼지진드기, 고양이, 암브로시아(Ambrosia), 로티움(Lotium), 크립토메리아(Cryptomeria), 알테나리아(Alternaria), 알더(Alder), 알리너스(Alinus), 베툴라(Betula), 케르커스(Quercus), 올레아(Olea), 아르테미시아(Artemisia), 플란타고(Plantago), 파리에타리아(Parietaria), 블라텔라(Blatella), 아피스(Apis), 쿠프레서스(Cupressus), 쥬니퍼루스(Juniperus), 튜야(Thuya), 카마에시파리스(Chamaecyparis), 페리플래닛(Periplanet), 아고피론(Agopyron), 세케일(Secale), 트리티쿰(Triticum), 닥틸리스(Dactylis), 페스투카(Festuca), 포아(Poa), 아베나(Avena), 홀커스(Holcus), 안토크산툼(Anthoxanthum), 아르헤나테룸(Arrhenatherum), 아그로스티스(Agrostis), 플레움(Phleum), 팔라리스(Phalaris), 파스팔룸(Paspalum), 소르굼(Sorghum), 및 브로미스(Bromis).
본 발명에 따른 애주번트 조합물 및 이를 함유하는 조성물은 감염성 질환, 암 또는 자가면역 질환과 같은 특정 질환을 치료하기 위해 다른 치료법과 조합될 수 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 암의 경우, 본 발명의 방법은 화학요법 또는 방사선요법과 병용될 수 있다.
조성물을 백신으로서 제조하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. NKT 활성화제, CD40 효능제 및 임의로 항원의 유효량은 경험적으로 결정될 수 있으나, 동물 모델에서의 면역학적으로 유효한 양에 기초할 수 있다. 고려되어야 하는 인자로는 항원성, 제형, 투여 경로, 투여되어야 하는 면역화 투여량의 회수, 신체 조건, 체중 및 개체의 연령 등이 있다. 이러한 인자들은 당업자에게 널리 공지되어 있고 당업자에 의해 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Paoletti and McInnes, eds., Vaccines, from Concept to Clinic: A Guide to the Development and Clinical Testing of Vaccines for Human Use CRC Press (1999)] 참조). 본원에 개시된 대로, 당해 DNA 또는 단백질 컨주게이트는 단독으로 또는 다른 애주번트와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 애주번트는 근내, 정맥내, 진피내, 피하, 복막내, 비내, 경구 또는 다른 점막 경로를 포함하나 이로 제한되지 않는 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 추가의 경로는 두개내 (예를 들어, 수조내 또는 뇌실내), 안와내, 눈, 피막내, 척추관내, 및 국소 투여를 포함한다. 본 발명의 애주번트 및 백신 조성물은 적합한 무독성 약제학적 담체에서 투여되거나 미세캡슐 또는 서방성 임플란트로 제형화될 수 있다. 본 발명의 면역원성 조성물은 요망되는 경우, 요망되는 세포 면역 반응을 유지하기 위해 여러 번 투여될 수 있다. 적합한 경로, 제형, 및 면역화 스케쥴은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 방법에서, 일부 경우에 항원 및 NKT 활성화제/CD40 효능제 컨주게이트가 따로따로 투여되거나 동일한 제형으로 조합될 수 있다. 일부 경우에, 여러 항원을 포함하는 것이 유용할 수 있다. 이러한 조성물은 세포 면역성의 요망되는 상승적인 개선을 달성하는 임의의 순서로 별개로 또는 조합하여 투여될 수 있다. 통상적으로, 이러한 조성물들은 서로 단시간 내에, 즉 서로 약 수 시간 내에, 보다 바람직하게는 약 30분 내에 투여된다. 일부 구체예에서, 이들은 서로 약 24-48시간 내에 공동-투여될 수 있다.
일부 경우에, 친화력 정제를 촉진시키는 부분을 애주번트에 포함하는 것이 이로울 수 있다. 이러한 부분들은 애주번트 조합물의 기능을 방해하지 않는 비교적 작은 부분을 포함한다. 대안적으로, 태그는 절단에 의해 제거될 수 있다. 이러한 태그의 예로는 폴리-히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, 말타아제 결합 단백질, 렉틴, 글루타치온-S 트랜스퍼라아제, 아비딘 등이 있다. 다른 적합한 친화력 태그로는 FLAG, 그린 형광성 단백질 (GFP), myc 등이 있다.
당해 애주번트 조합물은 생리적 염수와 같은 생리학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있다. 조성물은 완충액, 예컨대 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트 및 비카르보네이트, 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 에틸렌디아민 테트라아세트산, 염화나트륨 또는 기타 염, 리포좀, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 등과 같은 또 다른 담체나 부형제도 포함할 수 있다. 본 발명의 애주번트는 상응하는 투여 경로에 따라 다양한 방식으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 액체 제형은 섭취 또는 주입을 위해 제조될 수 있고, 겔 또는 절차(procedures)는 섭취, 흡입 또는 국소 적용을 위해 제조될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 방법은 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences," 18th Ed., Mack Publishing Company, Easton Pa]을 참조할 수 있다.
본 발명은 또한 DNA 기재 백신을 포함한다. 요망되는 항원 및/또는 CD40 애주번트를 엔코딩할 수 있는 이러한 DNA는 네이키드(naked) DNA로서 투여될 수 있거나 발현 벡터에 포함될 수 있다. 더욱이, 당해 핵산 서열은 이식편을 이식하기 전에 이식편의 세포로 도입될 수 있다. 이러한 DNA는 인간 개체에서의 발현을 촉진하기 위해 인간화되는 것이 바람직할 것이다.
당해 애주번트 조합물은 "마커" 또는 "리포터(reporter)"를 추가로 포함할 수 있다. 마커 또는 리포터 분자의 예로는 베타 락타마아제, 클로르암페니콜, 아세틸트랜스퍼라아제, 아데노신 데아미나아제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제, 디히드로폴레이트 리덕타아제, 하이그로마이신 B-포스포트랜스퍼라아제, 티미딘 키나아제, lacZ, 및 크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 등이 있다.
당해 애주번트 또는 항원의 발현을 촉진하는데 사용될 수 있는 원핵 또는 진핵 세포는 예로서 미생물, 식물 및 동물 세포, 예컨대 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등과 같은 원핵생물, Sf21 세포와 같은 곤충 세포, 사카로마이세스, 캔디다, 클루이베로마이세스, 스키조사카로마이세스 및 피치아 등과 같은 효모, 및 COS, HEK293, CHO, BHK, NIH 3T3, HeLa 등과 같은 포유동물 세포를 포함한다. 당업자는 요망되는 세포 또는 유기체에 적합한 특정 발현 시스템을 위해 발현 벡터, 프로모터, 선택가능한 마커 등을 포함하는 적합한 성분들을 용이하게 선택할 수 있다. 다양한 발현 시스템의 선택 및 사용에 대해서는 예를 들어 문헌[Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, N. Y. (1993); and Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual":, 1985 Suppl. (1987)]을 참조할 수 있다. 또한 당해 DNA 작제물을 함유하고 발현시키는 진핵 세포가 제공된다.
세포 이식체의 경우, 세포는 이식 절차에 의해서나 혈관벽을 통한 카테터-매개된 주입 절차를 이용하여 투여될 수 있다. 일부 경우에, 세포는 혈관구조로의 방출에 의해 투여될 수 있고, 후속하여 세포가 이로부터 혈류에 의해 분배되고/거나 주위 조직으로 이동한다.
본 발명에서 유용한 "NKT 활성화제 또는 효능제"는 당 분야에 일반적으로 공지된 NKT 세포의 모든 활성화제 또는 효능제를 포함한다. NKT 활성화제 또는 효능제의 예로는 세라마이드 및 예를 들어 US20060211856 및 US20060052316에 개시된 다른 당지질 화합물이 있고, 공개된 두 특허 출원 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된다. 예를 들어, 이것은 알파-갈락토실 세라마이드, 알파-글루코실 세라마이드, 포스파티딜이니시톨 및 글리코실포스파티딜이니시톨, 및 인용된 특허에 NKT 활성화제로서 개시되고 당 분야에 공지된 다양한 다른 당지질 화합물 및 유도체를 포함한다. 문헌[Parekh et al., Crit. Rev. Immunol. 25)3): 183-213 (2005); and Parekh et al., J Immunol. 173(l):3693-706 (2006), 두 참조문헌 모두는 그 전체 내용이 본원에 참조로서 포함된다]을 참조한다.
바람직하게 지시된 대로 본 발명에 유용한 "CD40 효능제"는 CD40, 바람직하게는 뮤린 또는 인간 CD40 또는 CD40L 단백질, 유도체, 다합체, 예컨대 삼합 CD40L 컨주게이트에 특이적으로 결합되는 효능성 항-CD40 항체 또는 이의 단편을 포함한다. 본원에서 사용된 "항체"라는 용어는 폴리클로날 및 모노클로날 항체 뿐만 아니라 이의 항원 결합 단편을 포함하는 가장 넓은 의미로 이용된다. 이것은 Fab, F(ab')2, Fd 및 Fv 단편을 포함한다.
또한 "항체"라는 용어는 천연 항체 뿐만 아니라 단쇄 항체, 키메라 항체, 이작용성 및 인간화된 항체와 같은 비-천연 발생 항체를 포함한다. 키메라, 인간화된 및 완전한 인간 항체가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 키메라, 인간화된, CDR-그래프팅, 단쇄 및 이작용성 항체의 합성 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 또한, CD40에 특이적인 항체는 널리 공지되어 있고 이용가능하며 적합한 숙주를 CD40 항원, 바람직하게는 인간 CD40으로 면역화시킴에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 다양한 구체예의 활성에 실질적으로 영향을 주지 않는 변형이 본원에 제공된 본 발명의 정의 내에서 또한 제공됨이 이해된다.
항원-특이적 CD8 반응을 유도함에 있어서 CD40 효능제와 α- GalCer 의 상승작용
하기 실험은 NKT 알파-갈락토실세라마이드 (α-GalCer)가 용해 기능을 지닌 CD8 세포를 팽창시킴에 있어서 항-CD40 항체와 상승작용함을 나타내고, 이것은 TLR 효능제에서 이전에 관찰된 것과 유사하다. CD40 효능제와 α-GalCer의 조합된 투여는 높은 수준의 세포-매개된 면역성을 유도하였다.
실시예 1:
항- CD40 과 α- GalCer 의 조합된 투여는 생체내에서 항원-특이적 T 세포의 팽창을 상승적으로 개선시킨다 .
본 실시예는 도 1에 도시된 실험에 관한 것이다. 여기서 마우스에게 500 ㎍ 오브알부민, 100 ㎍ 항-CD40, 100 ㎍ S-27609 (TLR7 효능제), 4 ㎍ α- GalCer을 도면에 지시된 조합물로 i.v. 투여하였다. 5일 후, Siinfekl 펄싱된(pulsed) 표적을 이용한 표준 CTL 검정을 앞서 개시된 대로 수행하였다. 지시된 시약을 투여한 지 6일째 되는 날, OVA-특이적인 CD8+ T 세포의 수를 이전에 개시된 대로 사합체 염색에 의해 결정하였고, 또한 시험관내에서 재자극 후 IFNγ를 생성하는 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 수를 측정하였다.
도 1의 결과는 놀랍게도 CD40 효능제 (항-CD40) 및 TLR 효능제 (S-27609)와 조합된 신생항원(OVA) 또는 α-GalCer과 함께 항-CD40의 투여가 높은 수준의 OVA-특이적인 CD8+ T 세포를 유도하고 (OVA-H-2b 사합체를 이용한 사합체 염색에 의해 측정됨) OVA-특이적인 CD8+ T 세포의 반응을 상기시켜 IFN-α를 생성함을 입증한다.
실시예 2:
조합된 항- C40 및 α- GalCer 을 이용한 면역화 결과로서의 면역 반응의 정량 (도 1의 데이터에 기초함) 및 보호성 항-종양 면역성을 유도함에 있어서 CD40 효능제와 α- GalCer 의 상승작용의 입증.
항-CD40/α-GalCer/OVA 또는 항-CD40/609/OVA의 투여가 단일요법으로서의 제제만의 이용에 비해 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 총 수를 개선시키는데 보다 더욱 효과적이므로, 조합 요법을 흑색종의 뮤린 모델에서 치료적 면역성을 유도하기 위한 효과적인 수단으로서 시험하였다. 항-CD40 및 TLR* 또는 α-GalCer를 이용한 초기 연구는, 활성화제와 함께 펩티드 또는 전(whole) 단백질의 이러한 조합물의 투여가 항원-특이적인 세포독성 T 세포의 극히 높은 (CD8+ T 세포의 사합체+ T 세포 >5%) 빈도를 유도하였음을 입증하였다. 이후 본 발명자들은 "자가-반응성 또는 종양-반응성" T 세포의 높은 빈도가 동계(syngeneic) 종양에 대한 보호를 유도할 수 있었는지를 조사하고자 하였다. 티로시나아제-관련 단백질-2 (TRP-2)는 멜라닌 합성에 관여하는 단백질이고 면역요법을 위해 흑색종-관련 항원으로서 이용되어 왔다. TRP-2는 정상 멜라닌세포 및 흑색종에서 발현되고 CTL에 의해 인식되는 인간 종양 항원으로서 동정된 이후 B16 흑색종에 대한 종양 거부 항원으로서 동정되었 다. CD8+ T 세포 펩티드 에피토프는 인간 및 마우스 둘 모두에 대해 기술되었다. 항-자가-반응성 CD8+ T 세포가 CD40/TLR 플랫폼을 이용하여 유도될 수 있었는지를 시험하기 위해, B16 흑색종이 제공된 (4일 전) 마우스를 50 ㎍의 헤테로시클릭 버젼의 TRP-2 (ΔV 펩티드; TRP-2 (SVYDFFVWL), 항-CD40 및 TLR7* 또는 항-CD40 및 α-GalCer (및 각각의 단일요법))로 i.p. 면역시켰다.
도 2의 결과는 가장 효과적인 치료적 보호가 항-CD40/TLR/ΔV 또는 항-CD40/α-GalCer/ΔV의 조합된 사용에 의해 제공되었음을 나타내고, 이는 종양 투여 21일 후 폐 전이의 수에 의해 판단된다. 일부 예방적인 보호가 α-GalCer 및 ΔV에 의해 제공되었다. 그러나, 다른 요법에서의 경험상, 항-CD40/α-GalCer/ΔV의 이용은 α-GalCer/ΔV 치료를 받은 마우스에 비해 마우스의 생존을 개선시킬 것이다.
생체내 치사 검정도 조합 요법 (OVA/항-CD40/α-GalCer)이 시험된 임의의 단일요법 (항-CD40/OVA 또는 α-GalCer/OVA 또는 TLR/OVA)보다 더욱 효과적이었음을 나타낸다 (도 2 참조).
실시예 3:
CD40 / TLR * 백신화는 전신 흑색종에 치료적으로 개입한다.
본 실시예는 도 3에 도시된 실험에 관한 것이다. 도 3에 도시된 실험에서, B6 마우스 (4마리/그룹)를 1OOK B16-F10 종양 세포를 i.v. 주입한 지 4일 후에 면역시켰다. 구체적으로, 마우스를 하기 지시된 제제들의 조합물로 면역시켰다: 항-CD40 (100 ㎍/마우스, i.p.), S27609 (TLR7*) 100 ㎍), ΔV-펩티드 (100 ㎍), 또는 α-GalCer (4 ㎍), i.v. 종양을 투여한 지 20일 후에 (Day(일) +4 개입 설계 이 용), 폐를 제거하고 (대표 사진 참조; 도 3의 상부) 폐 전이의 수를 시각적인 계수로 정량하였다 (도 3의 하단 패널 참조).
실시예 4:
항- CD40 항체 및 α- GalCer 은 생체내에서 DC 상에 CD70 발현을 유도한다.
도 4에 도시된 실험에서, 마우스에게 하기의 조합물을 주입하였다: 2 ㎍ α-GalCer, 50 ㎍ polyIC, 및/또는 50 ㎍ 항-CD40 i.p. 이후, 주입 18-20시간 후에 비장을 취하였다. 비장을 콜라게나아제 소화시키고, CDllc+로 염색하고, CD8+ 및 CD8- (CD11b+) DC에 의해 분석하였다.
상기 도면의 결과는 CD70의 발현만이 CD40 효능제와 α-GalCer의 조합물을 투여한 마우스로부터 수득된 가지돌기 세포 상에서 유도되었음을 나타내며, 이는 예상치 못한 것이다.
본 발명자들은 이전에 항-CD40 및 TLR 효능제 둘 모두를 조합하여 투여했을 때만 생체내 가지돌기 세포의 표면 위에서 CD70 발현이 증가되었다고 보고한 바 있다. 또한, 본 발명자들은 CD70의 발현이 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 후속적인 팽창에 필수적인 것임을 지적하였다.
전혀 예기치 못하게, 유사한 결과가 당해 신규한 상승적인 애주번트 조합물의 투여시에도 관찰되었다. 특히 TLR 및 CD40 효능제에서 보여진 상승작용과 유사하게, DC에 대한 CD70의 상향조절이 항-C40 및 α-GalCer의 조합된 투여에 의해 관찰되었다. 도 4에 도시된 대로, 항-C40 및 TLR 효능제 (polyIC) 또는 항-CD40 및 α-GalCer을 투여했을 때만 CD8+ 및 CD8-, CD11c+ DC 상에서 CD70의 증가된 발현이 현저하게 관찰되었다.
실시예 5
α- GalCer / CD40 면역화는 STAT4 , IFN γ 및 IFNab 독립적이나 STAT1 및 T-bet 의존적인 효능 있는 CD8 + T 세포 반응을 유도한다.
시그널 트랜스듀서 및 전사 활성화제 (STAT) 단백질은 세포 성장의 여러 측면을 조절한다. STAT1은 타입 I 또는 타입 II 인터페론에 의한 시그널로 인해 유전자를 상향조절하는데 관여한다. IFN-γ 자극에 반응하여, STAT1은 GAS (인터페론-감마 활성화된 서열) 프로모터 엘리먼트에 결합되는 STAT3과 동종이합체 또는 이종이합체를 형성하고; IFN-α 또는 IFN-β 자극에 반응하여, STAT1은 ISRE (인터페론 자극된 반응 엘리먼트) 프로모터 엘리먼트에 결합될 수 있는 STAT2와 이종이합체를 형성한다. 세포 면역성에서 IL-12의 역할은 STAT-4 전사 인자에 의해 주로 매개된다. STAT-4는 IL-12 활성에 필수적이다. T-bet은 CD4(TH) 림프구에서 계통 동원(commitment)을 조절하는 전사 인자의 T-박스 패밀리의 구성원이다. 이것은 IFN-γ를 활성화시킴에 의해 일부 수행된다. T-bet은 CD8 세포에서가 아니라 CD4 및 NK 세포에서 IFN-생성을 조절하는데 요구된다.
도 5에 도시된 실험에서, 마우스 (wtB6 또는 wtB6/129Fl's 및 KO)를 50 ㎍ 항-CD40 (FGK45), 2 ㎍ α-GalCer, 및 200 ㎍의 전(whole) 오브알부민으로 i.v. 면역시켰다. 7일 후, 마우스를 치사시키고 PBL 및 비장 세포를 단리시키고 Kb/ova MHC 사합체로 염색하여 앞서 개시된 대로 ova-특이적인 CD8+ T 세포를 동정하였다 (Sanchez et al. 2007 Journal of Immunology). 도시된 도트 플롯을 모든 살아있 는 CD8+ B220- 세포 상에 게이팅하였고(gated) 사합체 + 및 -세포의 표현형을 표면 마커 KLRG1과 관련하여 제시하였다. 제시된 수를 총 CD8+ T 세포 중 사합체+ 퍼센트로 나타내었다. 제시된 도트 플롯은 PBL에 대한 것이나, 비장이 유사한 경향을 반영한다. 본 실험은 α-GalCer/CD40 면역화가 STAT4, IFNγ 및 IFNab에 독립적이나 STAT1 및 T-bet에 의존적인 효능 있는 CD8+ T 세포 반응을 유도함을 나타낸다.
결론
적어도 도 1-5의 실험에서 제시된 결과에 기초하여, CD40 효능제와 함께 NK-T 세포를 촉발시키는 효능제(α-GalCer) 및 항원의 조합된 투여는 이러한 임의의 효능제들을 단독으로 투여하는 것에 비해 증가된 면역성을 유도한다 (면역성에 대한 상승적인 효과 유도). CD40 효능제와 α-GalCer의 조합은 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 더 높은 빈도 및 더 많은 수의 항원-특이적인 CD8+ T 세포를 초래하고, 항원과 함께 또는 항원 없이 임의의 효능제를 단독으로 이용한 것에 비해 항-종양 면역성을 개선시킨다.
따라서, CD40 효능제 및 α-GalCer와 같은 NK-T 세포 활성화제의 조합된 이용은 종양 및 감염성 질환에 대한 보호성 세포-매개된 면역 반응을 유도하는데 있어서 효능 있는 백신 플랫폼으로서 기능할 것이다.
본원에 인용된 다양한 저널, 특허 및 기타 공개문헌에 대한 다양한 언급은 당 분야의 상황을 포함하고 충분히 개시된 대로 참조로서 포함된다.
본 발명은 하기 청구범위에 의해 추가로 정의된다.

Claims (33)

  1. (i) 하나 이상의 CD40의 효능제;
    (ii) 하나 이상의 천연 킬러 T 세포(NKT) 활성화제; 및
    (iii) 임의로 하나 이상의 요망되는 항원을 포함하는 T 세포 면역성에 대한 상승적인 효과를 유도하는 애주번트 조합물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 NKT 활성화제가 알파-갈락토실세라마이드 (α-GalCer) 또는 이소글로보트리헥소실세라마이드(iGb3)인 애주번트 조합물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 CD40 효능제가 항-CD40 항체 또는 항체 단편이거나 CD40L 단백질, 이의 유도체, 단편 또는 다합체이거나 CD40L을 함유하는 컨주게이트인 애주번트 조합물.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 키메라 면역글로불린인 애주번트 조합물.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 인간화된 면역글로불린인 핵산 구성물의 애주번트 조합물.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 인간 면역글로불린인 애주번트 조합물.
  7. 제 3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 단쇄 면역글로불린인 애주번트 조합물.
  8. 제 3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 애주번트 조합물.
  9. 제 3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 구성된 군으로부터 선택되는 애주번트 조합물.
  10. 제 3항에 있어서, 상기 면역글로불린이 면역글로불린 경쇄를 엔코딩하는 핵산 서열과 면역글로불린 중쇄를 엔코딩하는 핵산 서열에 의해 엔코딩되고, 상기 핵산 서열들은 동일한 프로모터에 작동가능하게 결합되어 있는 것인 애주번트 조합물.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 면역글로불린 경쇄 및 상기 면역글로불린 중쇄 서열에 IRES가 개재된 애주번트 조합물.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 항원이 바이러스, 세균, 균류 또는 기생충 항원인 애주번트 조합물.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 항원이 인간 항원인 애주번트 조합물.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 인간 항원이 암 항원, 자가항원, 또는 그 항원의 발현이 만성 인간 질환과 관련되거나 이에 수반되는 다른 인간 항원인 애주번트 조합물.
  15. 제 12항에 있어서, 상기 바이러스 항원이 HIV, 헤르페스, 파필로마바이러스, 에볼라, 피코르나, 장바이러스, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 조류 플루 바이러스, 광견병 바이러스, VSV, 뎅기 바이러스, 간염 바이러스, 리노(rhino)바이러스, 황열병 바이러스, 분가(bunga) 바이러스, 폴리오마 바이러스, 코로나바이러스, 루벨라 바이러스, 에코바이러스, 폭스 바이러스, 바리셀라 조스터, 아프리카 돼지열 바이러스, 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스로 구성된 군으로부터 선택된 바이러스에 특이적인 애주번트 조합물.
  16. 제 12항에 있어서, 상기 세균 항원이 살모넬라, 에스체리치아, 슈도모나스, 바실러스, 비브리오, 캄필로박터, 헬리코박터, 어위니아(Erwinia), 보렐리아, 펠로박터, 클로스트리디움, 세라티아(Serratia), 크사노토모나스(Xanothomonas), 예르 시니아, 버크홀디아(Burkholdia), 리스테리아, 시겔라, 파스퇴렐라, 엔테로박터, 코리네박테리움 및 스트렙토코커스로 구성된 군으로부터 선택된 세균으로부터 유래되는 애주번트 조합물.
  17. 제 12항에 있어서, 상기 기생충 항원이 바베시아, 엔토모에바, 레이슈마니아, 플라스모디움, 트립파노소마, 톡소플라스마, 지아르다, 편형동물 및 회충으로부터 선택된 기생충으로부터 유래된 애주번트 조합물.
  18. 제 12항에 있어서, 상기 균류 항원이 아스퍼질러스, 코카이도이즈(Coccidoides), 크립토코커스, 캔디다, 노카르디아, 뉴모사이스티스 및 클라미디아로 구성된 군으로부터 선택된 균류로부터 유래된 애주번트 조합물.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 항원이 전립선암, 췌장암, 뇌암, 폐암 (소세포 또는 큰세포), 뼈암, 위암, 간암, 유방암, 난소암, 고환암, 피부암, 림프종, 백혈병, 결장암, 갑상선암, 자궁경부암, 두경부암, 육종, 신경아교암, 및 담낭암으로 구성된 군으로부터 선택된 인간 암에 의해 발현된 암 항원인 애주번트 조합물.
  20. 제 1항에 있어서, 상기 항원이 자가면역 질환에 상관하여 발현되는 자가항원인 애주번트 조합물.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 애주번트 조합물을 함유하는 재조합 미생물.
  22. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 애주번트 조합물 또는 상기 애주번트 조합물을 함유하는 조성물을 투여함에 의해 항원 특이적인 세포 면역 반응을 유도하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 투여가 하기 중 하나 이상을 초래하는 방법:
    (i) CD40 효능제 또는 NKT 활성화제만을 투여한 것에 비해 더 높은 빈도의 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 유도;
    (ii) CD40 효능제 또는 NKT 활성화제만을 투여한 것에 비해 더 많은 양의 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 유도;
    (iii) CD40 효능제 또는 NKT 활성화제만을 투여한 것에 비해 종양 면역성 개선.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 항원이 바이러스 항원, 세균 항원, 균류 항원, 자가항원, 알레르겐 및 암 항원으로부터 선택되는 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 항원이 HIV 항원인 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 상기 HIV 항원이 gag 또는 env인 방법.
  27. 제 24항에 있어서, 상기 항원이 인간 종양에 의해 발현된 항원인 방법.
  28. 제 24항에 있어서, 상기 항원이 흑색종에 의해 발현된 항원인 방법.
  29. 제 23항에 있어서, 치료하려는 질환이 암, 알레르기, 염증성 질환, 감염성 질환 및 자가면역 질환으로부터 선택되는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 치료하려는 질환이 흑색종인 방법.
  31. 제 23항에 있어서, 상기 감염성 질환이 바이러스, 세균, 균류 또는 기생충에 의해 야기된 것인 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 바이러스가 HIV인 방법.
  33. 제 30항에 있어서, 상기 투여가 하기 중 하나 이상을 초래하는 방법:
    (i) CD40 효능제 또는 NKT 활성화제 또는 효능제를 단독으로 투여한 것에 비해 실질적으로 개선된 일차 및 기억 CD8+ T 세포 반응의 유도;
    (ii) 항원-특이적인 CD8+ T 세포의 기하급수적인 팽창 유도; 및
    (iii) CD4 결핍 숙주에서 정상 (비-CD4 결핍) 숙주에 필적하는 보호성 면역 반응 생성.
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