KR20110031949A - Ｇｌｏｂｏ ｈ 및 ｓｓｅａ3에 특이적인 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 암 치료에서의 이의 용도 - Google Patents

Abstract

Globo H 또는 이의 단편(예를 들어, SSEA3)에 대한 면역 반응을 이끌어내기 위한, Globo H 또는 이의 단편 및 애주번트, 예를 들어, α-GalCer를 함유하는 면역 조성물 및 암 치료에서의 이의 용도가 개시된다. 또한, 둘 모두 Globo H 생합성에 관여하는 FUT1 및 FUT2 중 하나의 활성을 억제함으로써 암을 치료하는 방법도 개시된다.

Description

ＧＬＯＢＯ Ｈ 및 ＳＳＥＡ3에 특이적인 면역 반응을 유도하기 위한 조성물 및 암 치료에서의 이의 용도{COMPOSITIONS FOR INDUCING IMMUNE RESPONSES SPECIFIC TO GLOBO H AND SSEA3 AND USES THEREOF IN CANCER TREATMENT}

관련 출원

본 출원은 미국 가출원 제61/061,968호(출원일: 2008년 6월 16일)에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 본 명세서에 참고로서 전체가 포함된다.

기술분야

본 발명은 글리칸 및 α-갈락토실-세라미드(α-GalCer)를 포함하는 면역 조성물에 관한 것이다.

Globo H는 다양한 상피암에서 과발현되는 암 항원이다. 이 항원이 암 면역요법에서 표적으로 삼을 수 있음이 제안되었다. Globo H에 대한 항체 반응을 이끌어내기 위한 백신이 개발되었으나, Globo H의 낮은 항원성 때문에, 이들의 항암 효능은 만족스럽지 못하다. Globo H를 표적으로 하는 면역 반응을 높은 수준으로 이끌어낼 수 있는 새로운 백신이 필요하다.

본 발명은 (1) Globo H의 바로 앞단계 전구체(immediate precursor)인 SSEA-3이 유방암 줄기 세포에서 높은 수준으로 발현되어, 유방암 치료에 적합한 표적으로 삼을 수 있고, (2) α-갈락토실-세라미드(α-GalCer)가 항-Globo H 및 항-SSEA-3 항체의 생산을 증진시키는 효과적인 애주번트(adjuvant)라는 예기치 않은 발견을 기초로 한 것이다.

따라서, 본 발명의 일 측면은 Globo H 또는 이의 단편(예를 들어, SSEA3) 및 애주번트(예를 들어, α-GalCer)를 함유하는 면역 조성물을 특징으로 한다. Globo H 또는 이의 단편은 키홀-림펫 헤모시아닌(KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin)과 컨쥬게이트(conjugate)될 수 있다. 대상체(예를 들어, 인간)에게 투여되는 경우, 면역 조성물은 Globo H 또는 이의 단편을 표적으로 하는 면역 반응(예를 들어, 항체 생산)을 이끌어내어, 암(예를 들어, 유방암, 전립선암, 난소암 및 폐암)을 치료하는 데 효과적이다.

본 발명의 또 다른 측면은 비-인간 포유동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 양 또는 말)에게 전술한 면역 조성물을 투여하고, Globo H 또는 이의 단편과 결합하는 항체를 포유동물로부터 단리하는 것에 의한, Globo H 또는 이의 단편에 특이적인 항체의 생성 방법에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 2-푸코실트랜스퍼라제 1(FUT1) 또는 2-푸코실트랜스퍼라제 2(FUT2)의 활성을 억제하는 제1제제를 사용한 암의 치료방법을 특징으로 한다. FUT1 및 FUT2 둘 모두는 Globo H 생합성에 관여한다. 이 제제는 FUT1/FUT2와 이의 기질 사이의 상호작용을 차단하는 항체이거나, FUT1 또는 FUT2의 발현을 억제하는 간섭 RNA(예를 들어, siFUT1 또는 siFUT2)일 수 있다. 임의로, FUT1을 표적으로 하는 제1제제는 FUT2의 활성을 억제하는 제2제제와 조합될 수 있다. 일례에서, 제1제제는 siFUT1이고, 제2제제는 siFUT2이다.

또한, 암의 치료 및 암 치료용 의약의 제조에서의, 면역 조성물 또는 제1 및 제2제제의 용도가 본 발명의 범주 내에 있다.

본 발명의 하나 이상의 실시형태의 상세 사항을 하기 설명에 나타내었다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 하기의 도면과 몇몇 실시예의 상세한 설명, 또한 첨부된 특허청구범위로부터 명백할 것이다.

도 1은 Glogo H(GH)에서의 6당류 에피토프 및 이 에피토프의 단편의 구조를 나타낸 도식으로서, 패널 A: 6당류 에피토프의 구조, 패널 B: 6당류 에피토프 및 이의 7개 단편의 구조;
도 2는 단독의 KLH-컨쥬게이트된 Globo H 및 α-GalCer와 함께 KLH-컨쥬게이트된 Globo H로 면역화된 마우스에서의 항-Globo H 및 항-SSEA3 항체의 수준을 나타내는 도표;
도 3은 유방암 세포의 FUT1 및 FUT2 발현에서의 siFUT1 및 siFUT2의 효과를 나타내는 도표로서, 패널 A: MB157 세포에서 siFUT1에 의한 FUT1 발현의 억제, 패널 B: T-47D 세포에서 각각 siFUT1 및 siFUT2에 의한 FUT1 및 FUT2 발현의 억제;
도 4는 유방암 이종이식편 성장의 억제에서의 siFUT1 및 siFUT2의 효과를 나타내는 도표로서, 패널 a: siFUT1 및 siFUT2가 유방 종양 성장을 억제하는 것을 보여주는 도표, 패널 b: siFUT1 및 siFUT2가 종양 덩어리의 중량을 감소시키는 것을 보여주는 도표.

본 발명자들은 Globo H 및 이의 바로 앞단계 전구체인 SSEA3 둘 모두가 암 치료에서 표적으로 삼을 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명의 일 실시형태는 Globo H 또는 이의 단편(예를 들어, Gb5로도 알려진 SSEA3) 중 하나 및 애주번트를 함유하는 유효량의 면역 조성물을 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것에 의한 암의 치료방법이다. 표적 암 유형에는 유방암(1-4기 포함), 폐암(예컨대 소세포폐암), 간암(예컨대 간세포 암종 및 담관암종), 구강암, 위암(T1-T4 포함), 결장암, 비인두암, 피부암, 신장암, 뇌종양(예컨대 성상세포종, 다형성교모세포종 및 뇌수막종), 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 방광암 및 자궁내막, 횡문근육종, 골육종, 평활근육종 및 위장관 기질 종양이 포함되나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하는"은 암, 암의 징후 또는 암에 대한 소인이 있는 대상체에게, 암, 암의 징후 또는 암에 대한 소인을 구제, 치유, 경감, 완화, 변경, 치료, 개량, 개선, 또는 영향을 줄 목적으로, 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 적용 또는 투여하는 것을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 "유효량"은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 활성제와 병용하여, 대상체에 치료적 효과를 부여하는 데 필요한 각 활성제의 양을 말한다. 유효량은 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 투여 경로, 부형제 사용 및 다른 활성제와의 공동-사용에 따라 달라진다.

전술한 방법에 사용되는 면역 조성물은 Globo H 또는 이의 단편인 글리칸(즉, 당 부분(moiety)을 함유하는 분자) 및 애주번트를 함유할 수 있다. Globo H는 도 1, 패널 A에 나타낸 6당류 에피토프와, 임의로, 비-당 부분을 함유하는 글리칸이다. 이의 단편은 6당류 에피토프의 단편 및 적용가능하다면 비-당 부분을 함유하는 글리칸이다. 6당류 에피토프의 단편은 도 1, 패널 B에 나타내었다. 이들 올리고당류는 통상의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Huang et al., Proc. Natl. Acad. Scl. USA 103:15-20 (2006)]을 참고한다. 필요에 따라, 이들은 비-당 부분에 결합될 수 있다.

전술한 임의의 글리칸은 KLH와 같은 단백질 캐리어(carrier)에 컨쥬게이트될 수 있다. 그 다음, 이들은 통상의 방법을 통해, 애주번트 및 임의로 약제학적으로 허용되는 담체(예를 들어, 인산 완충 염수 또는 바이카보네이트 용액)와 혼합되어, 면역 조성물(예를 들어, 백신)을 형성할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,601,903호; 제4,599,231호; 제4,599,230호; 및 제4,596,792호를 참고한다. 조성물은 주사 가능 물질, 액제, 또는 에멀젼으로서 제조될 수 있으며, 담체는 투여 방식 및 경로뿐 아니라 표준 약제학적 관례에 준하여 선택된다. 적합한 약제학적 담체와 희석제, 및 이들의 이용을 위한 약제학적 필요물질은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]에 기재되어 있다. 면역 조성물은 바람직하게는 α-GalCer를 애주번트로서 함유한다. 애주번트의 다른 예에는 콜레라 독소, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 이열성 엔테로톡신(heat-labile enterotoxin)(LT), 리포좀, 면역 자극 복합체(ISCOM) 또는 면역자극성 서열 올리고데옥시뉴클레오티드(ISS-ODN: immunostimulatory sequences oligodeoxynucleotide)가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 조성물은 또한 생체 내 운반을 용이하게 하는 폴리머를 포함할 수 있다. 문헌[Audran R. et al. Vaccine 21:1250-5, 2003]; 및 문헌[Denis-Mize et al. Cell Immunol., 225:12-20, 2003]을 참고한다. 이는 필요에 따라, Globo H 또는 이의 단편의 당 부분에 대한 면역 반응을 이끌어내는 조성물의 능력을 증진시키기 위하여 소량의 보조 물질, 이를 테면 습윤화제(wetting agent) 또는 에멀젼화제, 또는 pH 완충화제를 추가로 함유할 수 있다.

본 명세서에 기재된 면역 조성물은 비경구로(예를 들어, 정맥내 주사, 피하 주사 또는 근육내 주사) 투여될 수 있다. 대안적으로, 좌약 및 경구 제제를 비롯한 기타 투여 방식이 바람직할 수 있다. 좌약을 위해, 결합제 및 담체는 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트라이글리세리드를 포함할 수 있다. 경구 제제는 예를 들어, 약제학적 등급의 사카린, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 사용되는 인시피언트(incipient)를 포함할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 서방형 제제 또는 분제의 형태를 취하며, 본 명세서에 기재된 면역 조성물을 10-95%로 함유한다.

면역 조성물은 투여 제제와 호환성인 방식으로, 치료적으로 유효하고, 보호적이며, 면역원성인 양으로 투여된다. 투여되는 양은 예를 들어, 개체 면역계의 항체 합성 능력 및 필요에 따라 세포-매개의 면역 반응을 생성하는 능력을 비롯한 치료 대상체에 따라 달라진다. 투여에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 따라 달라진다. 그러나, 적합한 용량 범위가 당업자에 의해 즉시 결정될 수 있다. 또한, 초기 투여 및 부스터(booster) 용량에 적합한 요법이 가변적이나, 초기 투여에 이어서 이후의 투여를 포함할 수 있다. 백신의 용량도 또한 투여 경로에 따라 달라질 수 있으며, 숙주의 크기에 따라 달라진다.

본 발명의 면역 조성물은 또한 암 치료 및 진단 둘 모두에서 사용될 수 있는 항체의 생산을 위한 동물에서 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 양 또는 말)에서의 모노클로널 및 폴리클로널 항체 및 이의 단편의 제조방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참고한다. 용어 "항체"는 그대로의(intact) 면역글로불린 분자뿐 아니라 이의 단편, 이를 테면 Fab, F(ab')₂, Fv, scFv(단일 사슬 항체) 및 dAb(도메인 항체; 문헌[Ward, et. al. (1989) Nature, 341, 544])를 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시형태는 둘 모두가 Globo H 생합성에 관여하는 FUT1 및/또는 FUT2의 활성을 억제하는 것에 의한 암의 치료방법이다. FUT1 및 FUT2는 푸코스 단위를 α1,2 결합을 통해 올리고당류 기질의 환원 말단에 전달하는, 잘 알려져 있는 2-푸코실트랜스퍼라제이다. 예를 들어, NCBI 유전자 번호 2523 및 NCBI 유전자 번호 2524를 참고한다.

일례에서, FUT1/FUT2 및 이들의 기질 사이의 상호작용을 간섭하는 항체, 즉 FUT1/FUT2 또는 이들의 기질에 특이적인 항체의 유효량을 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것에 의하여 앞서 기재된 방법이 수행된다.

일반적으로, 이러한 항체를 생성하기 위하여, FUT1/FUT2, 이의 단편 또는 이의 기질이 캐리어 단백질(예를 들어, KLH)에 커플링(coupled)될 수 있고, 필요에 따라 애주번트와 혼합된 다음, 숙주 동물에 주입된다. 그 다음, 동물에서 생성된 항체는 통상의 방법, 예를 들어 친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 통상적으로 사용되는 숙주 동물에는 토끼, 마우스, 기니 피그(guinea pig) 및 랫트가 포함된다. 면역 반응을 증가시키기 위하여 사용될 수 있는 다양한 애주번트는 숙주 종에 따라 달라지며, 프로인트(Freund's) 애주번트(완전 및 불완전), 미네랄 겔, 이를 테면 수산화알루미늄, CpG, 표면-활성 물질, 이를 테면 리소레시틴, 플루로릭 폴리올(pluronic polyol), 다가음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌 및 다이니트로페놀을 포함한다. 유용한 인간 애주번트에는 BCG(칼메트-게랑 간균) 및 코리네박테리움 파르붐(corynebacterium parvum)이 포함된다.

항체 분자의 이질적인 집단인 폴리클로널 항체는 면역화된 대상체의 혈청에 존재한다. FUT1/FUT2 또는 이들의 기질에 대한 항체의 균질적인 집단인 모노클로널 항체는 표준 하이브리도마(hybridoma) 기술을 사용하여 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Kohler et al. (1975) Nature 256, 495]; 문헌[Kohler et al. (1976) Eur. J. Immunol. 6, 511]; 문헌[Kohler et al. (1976) Eur J Immunol 6, 292]; 및 문헌[Hammerling et al. (1981) Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.]을 참고한다). 특히, 모노클로널 항체는 문헌[Kohler et al. (1975) Nature 256, 495] 및 미국 특허 제4,376,110호에 기재된 바와 같은, 배양물에서의 무한증식성세포주(continuous cell line)에 의한 항체 생성을 위해 제공되는 임의의 기술; 인간 B-세포 하이브리도마 기술(문헌[Kosbor et al. (1983) Immunol Today 4, 72]; 문헌[Cole et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026]) 및 EBV-하이브리도마 기술(문헌[Cole et al. (1983) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96])에 의해 수득될 수 있다. 이들 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 이들의 임의의 하위분류를 비롯한 임의의 면역글로불린 분류의 것일 수 있다. 본 발명의 모노클로널 항체를 생성하는 하이브리도마는 시험관 내 또는 생체 내에서 배양될 수 있다. 생체 내에서 높은 역가의 모노클로널 항체를 생성하는 능력은 이것이 특히 유용한 생성 방법이게 한다. 또한, "키메라 항체(chimeric antibody)"의 생성을 위해 개발된 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851]; 문헌[Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604]; 및 문헌[Takeda et al. (1984) Nature 314:452]을 참고한다. 키메라 항체는 뮤린(murine) 모노클로널 항체로부터 유래된 가변 영역과 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것과 같이, 상이한 부분이 상이한 동물 종으로부터 유래되는 분자이다. 대안적으로, 단일 사슬 항체의 생성을 위해 기재된 기술(미국 특허 제4,946,778호 및 제4,704,692호)은 단일 사슬 Fv 항체의 파지 라이브러리(library)를 생성하기 위해 채용될 수 있다. 단일 사슬 항체는 Fv 영역의 중쇄 및 경쇄 단편을 아미노산 가교(bridge)를 통해 연결시킴으로써 형성된다. 더욱이, 항체 단편은 공지의 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 이들 단편에는 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')₂ 단편 및 F(ab')₂ 단편의 이황화물 가교를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 또한, 항체는 해당 분야에 공지된 방법에 의해 인간화될 수 있다. 예를 들어, 원하는 결합 특이성을 갖는 모노클로널 항체는 상업적으로 인간화될 수 있다(스코틀랜드 소재의 스코트진(Scotgene); 및 캘리포니아주 팰러앨토 소재의 옥스포드 몰레큘러(Oxford Molecular). 트랜스제닉(trangenic) 동물에서 발현되는 것과 같은 완전한 인간 항체도 또한 본 발명의 특징이다. 예를 들어, 문헌[Green et al. (1994) Nature Genetics 7, 13]; 및 미국 특허 제5,545,806호 및 제5,569,825호를 참고한다.

또 다른 예에서, 전술한 방법은 RNA 간섭을 통하여 FUT1 및/또는 FUT2의 발현을 억제하는 하나 이상의 이중-가닥 RNA(dsRNA)의 유효량을 암 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, Globo H의 수준을 감소시키는 것에 의해 수행될 수 있다. RNA 간섭(RNAi)은 dsRNA가 메신저(messenger) RNA의 상동 서열-특이적 절단을 지시하는 과정이다. 포유동물 세포에서, RNAi는 숙주 인터페론 반응을 활성화시키지 않고, 작은 간섭 RNA(siRNA)의 21개-뉴클레오티드 듀플렉스(duplex)에 의해 유발될 수 있다.

dsRNA는 해당 분야에 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Caruthers et al., 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19], 문헌[Wincott et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684], 문헌[Wincott et al., 1997, Methods Mol. Bio. 74, 59], 문헌[Brennan et al, 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45] 및 Brennan의 미국 특허 제6,001,311호를 참고한다. 또한, 이는 표준 기술을 사용하여 발현 백터로부터 전사되고 단리될 수 있다.

전술한 바와 같은 dsRNA 또는 벡터는 문헌[Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio. 2, 139]에 기재된 것과 같은 방법에 의해 암 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, 이는 리포좀, 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐 또는 생접착성 마이크로스피어(microsphere)를 사용하여 세포에 도입될 수 있다. 대안적으로, dsRNA 또는 벡터는 직접 주사에 의해 또는 주입 펌프의 사용에 의해 국부적으로 전달될 수 있다. 다른 접근법에는 예를 들어, 컨쥬게이트 및 생분해성 폴리머의 사용을 통하여, 다양한 수송 수단 및 캐리어 시스템을 사용하는 것이 포함된다.

일례로서, 전술한 dsRNA는 CGCGGACTTGAGAGATCCTTT 또는 이의 상보서열(complement)과 상보적인 제1가닥을 함유한다(예를 들어, 하기 실시예 2에 기재되는 siFUT1). 또다른 예에서, dsRNA는 CTATGTCCATGTCATGCCAAA 또는 이의 상보서열과 상보적인 제1가닥을 함유한다(예를 들어, 하기 실시예 2에 기재되는 siFUT2).

운반을 용이하게 하기 위하여, 전술한 dsRNA 또는 이를 발현하는 DNA 플라스미드가 샤페론 제제(chaperone agent)와 컨쥬게이트될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "컨쥬게이트되는"은 바람직하게는 두 부분 사이의 회합의 치료적 이익이 실현되는 충분한 친화도로, 두 부분이 회합되는 것을 의미한다. 컨쥬게이트에는 공유 결합 또는 비공유 결합뿐 아니라 다른 회합 형태, 이를 테면 다른 부분 상에서 또는 그 내에서의 한 부분의 포획, 또는 제3부분(예를 들어, 미셀(micelle)) 상에서 또는 그 내에서의 두 부분 중 하나 또는 두 부분 모두의 포획이 포함된다.

샤페론 제제는 자연 발생 물질, 이를 테면 단백질(예를 들어, 인간 혈청 알부민, 저밀도 지질단백질 또는 글로불린), 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산) 또는 지질일 수 있다. 또한, 이는 재조합 또는 합성 분자, 이를 테면 합성 폴리아미노산 폴리머(예를 들어, 폴리라이신, 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스타이렌-말레산 무수물 코폴리머, 폴리(L-락타이드-코-글리콜라이드) 코폴리머, 다이비닐 에터-말레산 무수물 코폴리머, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아마이드 코폴리머, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-아이소프로필아크릴아마이드 폴리머 및 폴리포스파진)일 수 있다. 대안적으로, 샤페론 제제는 dsRNA 또는 DNA 플라스미드가 캡슐화된 미셀, 리포좀, 나노입자 또는 마이크로스피어이다.

일례에서, 샤페론 제제는 융합유도제(fusogenic agent), 축합제(condensing agent) 또는 표적화제(targeting agent) 중 하나 이상의 부착을 위한 기질로 소용된다.

융합유도제는 국부 pH에 반응성이다. 예를 들어, 엔도좀 내의 pH 조우시, 융합유도제는 이의 주변 환경에서 물리적 변화를 초래하고(예를 들어, 엔도좀 막의 투과성을 파괴 또는 증가시키는 삼투압 특성에서의 변화), 이에 의해 dsRNA 또는 DNA 플라스미드의 숙주 세포의 세포질로의 방출을 촉진시킬 수 있다. 바람직한 융합유도제는 전하를 변화시키며, 예를 들어 생리학적 범위보다 더 낮은 pH에서(예를 들어, pH 4.5-6.5에서) 양성자화된다. 융합유도제는 특정 pH 범위에 노출되는 경우 전하의 변화(예를 들어, 양성자화)를 겪을 수 있는 아미노기를 함유하는 분자일 수 있다. 이들 융합유도제는 폴리아미노 사슬(예를 들어, 폴리에틸렌이민) 및 막 붕괴제(disruptive agent)(예를 들어, 멜리틴(mellittin))를 함유하는 폴리머를 포함한다. 다른 예에는 폴리히스티딘, 폴리이미다졸, 폴리피리딘, 폴리프로필렌이민, 멜리틴 및 폴리아세탈 물질(예를 들어, 양이온성 폴리아세탈)이 포함된다.

축합제는 dsRNA 또는 DNA 플라스미드와 상호작용(예를 들어, 유인, 유지 또는 이에 결합)하며, 이것이 축합되도록(예를 들어, dsRNA/플라스미드 크기의 감소) 야기하여, dsRNA/플라스미드를 절단에 대해 보호한다. 바람직하게는, 축합제는 예를 들어, 이온성 상호작용을 통하여 dsRNA 또는 DNA 플라스미드와 상호작용하는 부분(예를 들어, 하전된 부분)을 포함한다. 축합제의 예에는 폴리라이신, 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아민 또는 이의 4급 염, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포피린 및 알파 나선 펩티드가 포함된다.

추가의 퇴고 없이, 당업자가 상기 설명에 기초하여 본 발명을 이의 가장 완전한 범위로 사용할 수 있는 것으로 여겨진다. 이에 따라, 하기의 특정 실시형태는 단지 예시적인 것으로 간주되어야 하며, 본 개시물의 나머지를 어떤 방식으로든 제한하는 것이 아니다. 본 명세서에 게시된 모든 공개문헌은 참고로 포함된다.

실시예 1: KLH-컨쥬게이트된 Globo H 및 α-Galcer와 함께 Globo H 및 SSEA3에 특이적인 항체의 유도

Globo H-KLH는 옵티머 파마슈티컬즈(Optimer Pharmaceuticals)로부터 구매하였다. 각 그룹에 2마리씩 있는 3개의 그룹의 6주령 암컷 BALB/b 마우스(바이오라스코(BioLASCO))에 각각 PBS("대조군 마우스"), 0.6 ㎍ KLH-Globo H("Globo H 마우스") 및 2 ㎍ α-GalCer와 병용하여 0.6 ㎍ KLH-Globo H("Globo H-GalCer 마우스")를 3주 동안 매주 1회 주사(피하)하였다. 마지막 주사 후 10일째에 혈청을 각 그룹의 마우스로부터 수집하고, Globo H 및 SSEA3에 특이적인 항체를 문헌[Huang et al., Proc , Natl . Acad . Scl . USA 103:15-20(2006)]에 기재된 방법에 따라 검출하였다. 요약하면, 혈청을 BSA/PBS 완충액으로 1:25로 희석하고, 각 희석된 혈청 50 ㎖을 Globo H 및 SSEA3가 부착된 슬라이드와 함께 가습 챔버 내에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 0.05% PBS/Tween 20(PBST)으로 3회 세정하고, 이후에 동일한 챔버 내에서 100 ㎕ Cy5-컨쥬게이트된 염소 항-마우스 IgG 항체(1:200)와 인큐베이션하였다. 공기 건조시킨 후에, 슬라이드를 PBST와 물로 각각 3회 세정한 다음, 이에 의해 방출된 형광 수준을 마이크로어레이 스캐너(제네픽스(GenePix) 4000B; 몰레큘라 디바이스즈(Molecular Devices))로 측정하였다. 이에 따라 얻은 결과를 제네픽스 프로(Pro) 소프트웨어로 분석하였다.

Globo H 마우스에서, 오직 낮은 수준의 항-Globo H IgG 항체만이 검출되었으며, 항-SSEA IgG 항체의 수준은 검출할 수 없었다. 도 2를 참고한다. 다르게는, Globo H-GalCer 마우스는 항-Globo H 및 항-SSEA3 IgG 항체 둘 모두를 높은 수준으로 나타냈다. 또한, 도 2를 참고한다. 이들 발견은 α-GalCer와 병용한 Globo H-KLH가 항-Globo H 및 항-SSEA3 항체 둘 모두를 유도하는 데 효과적인 백신인 것을 지시한다.

실시예 2: RNA 간섭을 통한 FUT1 및 FUT2의 억제는 Globo H의 수준을 감소시킨다

3가지 유방암 세포주, MCF-7, MB157 및 T-47D에서의 FUT1 및 FUT2 mRNA의 수준을 다음과 같이 정량적 RT-PCR로 결정하였다. 전체(total) RNA를 이들 암 세포로부터 추출하고, RNA를 주형으로 사용하고 올리고(dT)를 프라이머로 사용하는 역전사를 통하여 cDNA를 생성하였다. 50 나노그램의 cDNA를 다음의 프라이머를 사용하여 RT-PCR하였다: L-fut1: CCTGCCAGACTCTGAGTTCC 및 AGGCTTAGCCAATGTCCAGA 뿐 아니라 L-fut2: GGGAGTTACCGGTGCAGATA 및 R-fut2: GTCCCAGTGCCTTTGATGTT. RT-PCR 반응을 ABI Prism 7000 서열 검출 시스템을 사용하여 50℃에서 2분, 95 ℃에서 10분에 이어서 95℃에서 10초 및 60℃에서 1분의 40 사이클의 조건 하에서 수행하고, 이에 따라 얻은 결과를 ABI Prism 7000 SDS 소프트웨어(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 분석하여, 각 세포주에서의 FUT1 및 FUT2의 mRNA 수준에 대한 역치 사이클 수(Ct 값)를 수득하였다. Ct 값을 동일한 세포주에서의 HPRT1의 mRNA 수준에 대하여 정규화시켜, ΔCt 값을 얻었다. MCF-7에서의 FUT1의 ΔCt 값을 각 세포주에서의 FUT1 또는 FUT2 중 하나의 ΔCt 값을 정규화시키는 데 사용하였다. mRNA 수준의 배수 변화를 다음 식에 기초하여 계산하였다: 2^{-[Δ Ct (표적 유전자)-ΔCt( MCF -7에서의 FUT1 )]}. HPRT1 및 GAGDH의 mRNA 수준을 내부 대조군으로 사용하였다.

3가지 유방암 세포주 사이에서 FUT1의 mRNA 수준에는 유의미한 차이가 없었다. 반면, FUT2 mRNA가 MCF-7 및 MB157 세포에서는 거의 검출가능하지 않으나, T47D 세포에서는 FUT2 mRNA의 수준이 다른 두 세포주에서의 mRNA 수준보다 6000배 더 컸다.

FUT1 또는 FUT2의 수준을 RNA 간섭을 통하여 다음과 같이 감소시켰다. siFUT1(CGCGGACTTGAGAGATCCTTT에 상보적인 서열 함유) 및 siFUT2(CTA TGTCCATGTCATGCCAAA에 상보적인 서열 함유)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 VSV-G-슈도타입(pseudotype) 렌티바이러스 벡터에 클로닝(cloned)하였고, 패키징 플라스미드(packaging plasmid) pMD.G 및 pCMVΔR8.91과 함께 293T 세포에 도입하였다. 이에 따라 생성된 렌티바이러스 입자를 트랜스펙션(transfection) 후 48시간 및 72시간에 수집하고, 초원심분리(25,000 rpm, 90 분)로 농축하였다. siFUT1 또는 siFUT2를 발현할 수 있는 이들 바이러스 입자를 8 ㎍/㎖ 폴리브렌(시그마-알드리치 코포레이션(Sigma-Aldrich Corp.))의 존재 하에서 ThT-47D 또는 MB157(6-웰 플레이트에 2×10⁵ 세포/웰로 플레이팅)과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 96시간 후에 수집하고, FUT1 및 FUT2의 mRNA 수준을 전술한 바와 같은 정량적 RT-PCR로 결정하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, siFUT1은 MB157 세포에서 FUT1 mRNA 수준을 성공적으로 감소시켰다(패널 A 참고). 유사하게, siFUT1 및 siFUT2는 각각 T-47D 세포에서 FUT1 및 FUT2의 mRNA 수준을 감소시켰다. 도 3, 패널 B를 참고한다.

MB157 및 T-47D 세포 둘 모두에서의 Globo H의 수준을 다음과 같이 AlexaFluor488-VK-9 항체를 사용하여 유세포 측정기를 통해 결정하였다. 각각 1×10⁵ 세포를 함유하는 세포의 분취물(aliquot)을 먼저 항-GloboH-Alexa488(Vk9; 문헌[Chang et al, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 105:11667-11672(2008)] 참고)과 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 비오티닐화-UEA1(벡터 래보러터리즈(Vector Labotories))과 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 마지막으로 FITC-컨쥬게이트된 스트렙트아비딘(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))과 얼음 위에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 세포를 FACSCanto 유세포 측정기를 사용하여 유세포 측정기로 처리하고, 이에 따라 얻은 데이터를 CellQuest 프로그램(BD 바이오사이언스즈(BD Biosciences))으로 분석하였다. 이 연구로부터 얻은 결과는 MB157 세포에서 RNA 간섭을 통한 FUT1 발현의 억제가 감소된 수준의 Globo H를 야기하며, T-47D 세포에서 FUT2 발현의 억제가 감소된 수준의 Globo H를 야기하는 것을 나타낸다.

실시예 3: SiFUT1 및 SiFUT2의 항암 효과

암 세포 성장 억제

유방암 세포 MB157 및 T-47D를 96-웰 플레이트(코닝(Corning))에 웰당 1×10⁴ 세포로 씨딩(seeding)하였다. 그 다음, 이들을 siFUT1 또는 siFUT2를 발현하는, 상기 실시예 2에 기재된 바이러스 입자와 함께 또는 이것 없이 혼합하고, 회전 감염(spin infection)을 위해 300g에서 5분 동안 원심분리하였다. 24시간 후에, 알라마 블루(alamar blue)(AbD 세로테크(AbD Serotec))를 1:10 희석의 최종 농도로 세포에 첨가한 다음, 세포를 37℃, 5% CO₂에서 3시간 동안 배양하였다. 그 후, 544㎚ 및 590㎚에서의 흡광도를 스펙트라맥스(SpectraMax) M2 판독기(Reader)로 측정하였다. 동일한 조건 하에서 새로운 배지로 세포를 배양하고, 처음 씨딩 과정 후 48시간, 72시간 및 96시간에 544㎚ 및 590㎚에서의 흡광도를 다시 측정하였다. 본 연구로부터 얻은 결과는 바이러스 입자로 감염된 MB157 및 T-47D 세포 둘 모두의 성장 속도가 비-감염 세포에 비해 감소된 것을 보여준다. 이들 데이터는 siRNA에 의한 FUT1 또는 FUT2 발현의 억제가 암 세포 성장의 억제를 야기하는 것을 나타낸다.

맘모스피어 ( mammosphere ) 형성의 억제

siFUT1 또는 siFUT2를 발현하는 바이러스 입자로 감염된 MB157 및 T-47D 세포를 0.4% BSA, 20ng/㎖ EGF, 20ng/㎖ bFGF, 5㎍/㎖ 인슐린, 1μM 하이드로코티손, 4㎍/㎖ 헤파린, 1xB27 보충물 및 1% 메틸 셀룰로오스(시그마-알드리치)가 보충된 DMEM/F12 배지에 1,000 세포/㎖의 농도로 현탁화시켰다. 그 다음, 현탁화된 세포를 울트라 로우 부착 플레이트(ultra low attachment plate)(코스타(Costar)) 상에 씨딩하고, 맘모스피어 형성을 허용하는 적합한 조건 하에서 배양하였다. 이에 따라 형성된 원발성 맘모스피어를 주마다 영양분을 공급하여 배양하였다. 2차 맘모스피어 배양을 위하여, 원발성 맘모스피어를 수집하고, 트립신(Gibco)으로 분산시키고, 펠렛화하고, 전술한 배양 배지에 1,000 세포/㎖로 현탁화시켰다. 그 다음, 현탁화된 세포를 2차 맘모스피어의 형성을 허용하는 전술한 방법에 따라 배양하였다. siFUT1을 발현하는 MB157 및 T-47D 세포 둘 모두에 의해 형성된 맘모스피어의 수는 비-감염 세포에 의해 형성된 맘모스피어의 수의 오직 50%였으며, 이는 siFUT1이 암 세포의 맘모스피어 형성능을 유의미하게 감소시키는 것을 나타낸다. 유사하게, siFUT2를 발현하는 T-47D 세포에 의해 형성된 맘모스피어의 수는 비-감염 세포에 의해 형성된 맘모스피어의 수의 오직 17%였다. 이 결과는 siFUT1과 유사하게, siFUT2도 또한 암 세포의 맘모스피어 형성능을 유의미하게 감소시키는 것을 보여준다.

종양원성의 감소

6주령 balb/c 누드 마우스 및 NOD/SCID 마우스에 17-β-에스트라다이올(1.7㎎/㎖)을 각 마우스의 측부(lateral side)에 피하로 주사하였다. 8주령, 암컷 balb/c 누드 마우스에 모두 0.1㎖의 50% 매트리겔(Matrigel)(BD 바이오사이언스) 및 50% 보충된 RPMI-1640 배지 중에 현탁화시킨 (i) siFUT를 안정하게 발현하는 MB157 세포(1×10⁷), (ii) 비히클(vehicle) 대조군 MB157 세포(1×10⁷), (iii) siFUT1을 안정하게 발현하는 T-47D 세포(5×10⁶), (iv) siFUT2를 안정하게 발현하는 T-7D 세포(5×10⁶) 및 (v) 비히클 대조군 T-47D 세포(5×10⁶)를 이들의 유방 지방 패드에 주사하였다. 이들 처리된 마우스에 형성된 종양의 크기를 길이(l) 및 너비(w)를 측정함으로써, 다양한 시간에 정기적으로 모니터링하였다. 종양 부피는 다음과 같이 계산하였다: V= π/6 ×l×w×[l + w]/2. 마지막으로 동물을 희생시키고, 종양을 절개하고 중량을 재었다.

도 4, 패널 a에 나타낸 바와 같이, 비히클 대조군으로 처리된 마우스에서의 종양은 시간이 지나면서 계속 성장하였으나, siFUT1 또는 siFUT2를 발현하는 세포로 처리된 마우스에서의 종양 성장 속도는 유의미하게 감소하였다. 이들 마우스의 종양 덩어리(mass)의 중량도 또한 비히클 대조군으로 처리된 마우스의 중량보다 유의미하게 더 낮았다. 도 4, 패널 b를 참고한다.

세포 형태 및 부착 능력의 변화

보통의 T-47D 세포는 사각형 형상이나, siFUT1 및 siFUT2 둘 모두를 발현하는 T-47D 세포는 조밀한 무리를 형성하는 작고, 둥근 형상의 세포이다. 유사한 형태 변화가 siFUT1을 발현하는 MB-157 세포에서 관찰되었다.

세포 부착은 RT-CES 장치(리얼 타임 셀 일렉트로닉 센싱(Real Time Cell Electronic Sensing), 아세아바이오(ACEABIO))를 사용하여 결정하였다. 요약하면, 아세아바이오의 96 마이크로타이터(microtiter) 플레이트를 모두 PBS 중에 적절한 배수로 희석된, 피브로넥틴(25㎍/㎖, 시그마), IV형 콜라겐(2㎍/㎖, BD 바이오사이언스즈) 또는 라미닌(5㎍/㎖, 시그마)로 37℃에서 1시간 동안 코팅한 다음, 1% BSA로 37℃에서 1시간 동안 블로킹(blocked)하였다. MB157 및 T-47D 세포를 코팅된 아세아바이오의 96 마이크로타이터 플레이트에서 배양 배지 100㎕당 2.5×10⁴로 씨딩하였다. 세포 부착을 RT-CES를 사용하여 1시간의 기간 동안 매 10분 마다 모니터링하였다. Globo-H 세라미드(무혈청 배지 중에 50㎍/㎖)를 특정 세포에 첨가하여, 이것이 siFUT1 및 siFUT2의 효과를 방해하는 지를 시험하였다. 결과는 siFUT1 및 siFUT2가 폴리스티렌에 대한 세포 부착을 어느 하나의 siRNA도 발현하지 않는 세포에 비해 0.63배 감소시키며, Globo-H 세라미드가 siRNA에 의해 유발된 부착 억제를 구제하는 것으로 나타났다.

세포 이동의 억제

siFUT1 또는 siFUT2를 발현하는 세포의 이동 능력을 먼저 다음과 같은 상처 치유 분석법으로 시험하였다. MB157 및 T-47D 세포를 12-웰 플레이트에 혈청-함유 배지 중에서 이들이 60% 컨플루언스(confluence)에 도달할 때까지 플레이팅하였다. 그 다음, 세포를 상기 실시예 1에 기재된 바이러스 입자로 감염시키거나, 대조군 플라스미드를 도입하였다. 이들 세포는 2일의 배양 기간에 100% 컨플루언스에 도달하였다. 그 다음, 세포를 밤새 굶기고, 세포의 컨플루언트 단층을 20㎕ 플라스틱 파이펫(pipette) 팁(tip)으로 날카롭게 상처를 내었다. 세포를 혈청이 보충된 RPMI 배지로 세정한 후에, RPMI 배지에서 인큐베이션하고, 온도 및 CO₂ 제어부가 장착된 시간차 현미경을 사용하여 시험하였다. 세포의 위상차 이미지를 3일 동안 매 4시간마다 또는 1일 동안 매 2시간 마다 획득하였다. 원하는 기간 동안 세포가 이동한 거리를 측정하는 메타모프(Metamorph) 소프트웨어를 사용하여 세포 이동 속도를 결정하였다. 결과는 siFUT1이 대조군 플라스미드로 트랜스펙션된 세포에 비해, T-47D 세포 및 MB158 세포의 이동을 각각 2.81 및 2.13으로 억제하는 것으로 나타났다. Globo H-세라미드의 외인성 첨가가 siFUT1 또는 siFUT2를 발현하는 세포의 감소된 이동 능력을 구제하였다. 이 데이터는 관찰된 이동 감소가 RNA 간섭을 통한 FUT1 및 FUT2 발현의 억제로부터 야기된 Globo H의 감소된 수준에 의해 야기되는 것을 나타낸다.

취합하여, 상기 결과들은 siFUT1 및 siFUT2가 FUT1 및 FUT2 발현을 억제하고, 결과적으로 Globo H의 수준을 감소시킴으로써 암을 치료하는 데 효과적인 것을 나타낸다.

다른 실시형태

본 상세한 설명에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 상세한 설명에 개시된 각 특성은 동일한, 등가의 또는 유사한 목적을 만족시키는 대안적인 특성으로 교체될 수 있다. 따라서, 명백히 달리 언급되지 않는 한, 개시된 각 특성은 일반적인 등가의 또는 유사한 일련의 특성의 예일 뿐이다.

상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 쉽게 확인할 수 있고, 이의 사상과 범주로부터 벗어남 없이, 다양한 용도 및 조건에 적용하여 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 만들 수 있다. 따라서, 다른 실시형태도 또한 특허청구범위 내에 있다.

Claims (23)

1. 글리칸 및 α-갈락토실-세라미드(α-GalCer)를 포함하되,
   상기 글리칸이 Globo H 또는 이의 단편인 것인 면역 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 글리칸은 Globo H인 것인 면역 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 글리칸은 SSEA3인 것인 면역 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 글리칸 또는 이의 단편은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH: Keyhole Limpet Hemocyanin)과 컨쥬게이트된(conjugated) 것인 면역 조성물.
5. SSEA3 및 애주번트(adjuvant)를 포함하는 면역 조성물.
6. 제1항의 면역 조성물의 유효량을 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 암은 유방암, 전립선암, 난소암 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 암의 치료방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것인 암의 치료방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 글리칸은 Globo H이고, 상기 면역 조성물은 Globo H에 대한 면역 반응을 이끌어내는 것인 암의 치료방법.
10. 제6항에 있어서, 상기 글리칸은 SSEA3이고, 상기 면역 조성물은 SSEA3에 대한 면역 반응을 이끌어내는 것인 암의 치료방법.
11. 제5항의 면역 조성물의 유효량을 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 암의 치료방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 간암, 구강암, 위암, 결장암, 비인두암, 피부암, 신장암, 뇌종양, 전립선암, 난소암, 자궁경부암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 암의 치료방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것인 암의 치료방법.
14. Globo H 또는 이의 단편 및 α-갈락토실-세라미드(α-GalCer)를 함유하는 조성물의 유효량을 비-인간 포유동물에게 투여하여, Globo H 또는 이의 단편에 결합하는 항체의 생성을 유도하는 단계; 및
    항체를 단리하는 단계를 포함하는, Globo H 또는 이의 단편에 특이적인 항체의 생성방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 Globo H를 함유하는 것인, Globo H 또는 이의 단편에 특이적인 항체의 생성방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 조성물은 SSEA3을 함유하는 것인, Globo H 또는 이의 단편에 특이적인 항체의 생성방법.
17. 2-푸코실트랜스퍼라제 1(FUT1) 또는 2-푸코실트랜스퍼라제 2(FUT2)의 활성을 억제하는 제1제제의 유효량을 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되,
    상기 제제가 FUT1 또는 FUT2와 이의 기질 사이의 상호작용을 차단하는 항체이거나, 또는 FUT1 또는 FUT2의 발현을 억제하는 간섭 RNA인 것인 암의 치료방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 제1제제는 작은 간섭 RNA(siRNA)인 것인 암의 치료방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 siRNA는 siFUT1 또는 siFUT2인 것인 암의 치료방법.
20. 제17항에 있어서, 상기 제1제제는 FUT1의 활성을 억제하며, 대상체에게 FUT2의 활성을 억제하는, FUT2와 이의 기질 사이의 상호작용을 차단하는 항체이거나, 또는 FUT2의 발현을 억제하는 간섭 RNA인 제2제제의 유효량을 추가로 투여하는 것인 암의 치료방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 제1제제 및 제2제제는 siRNA인 것인 암의 치료방법.
22. 제21항에 있어서, 상기 제1제제 및 제2제제는 각각 siFUT1 및 siFUT2인 것인 암의 치료방법.
23. 제17항에 있어서, 상기 암은 유방암인 것인 암의 치료방법.

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