CN102793920A - 复方免疫增强剂、禽用灭活疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及复方免疫增强剂及其在制备兽用疫苗中的应用。复方免疫增强剂含有0.5～100μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～1000μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、5～2000μg/mL的β-葡聚糖和5～2000μg/mL的左旋咪唑，所述含CpG基序的核酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明复方免疫增强剂与H9亚型禽流感灭活疫苗混合，可缩短免疫窗口期2周，抗体持续期延长8周，对H9亚型同型毒株攻击产生消除性免疫保护，降低配制疫苗用的抗原含量。

Description

复方免疫增强剂、禽用灭活疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及复方免疫增强剂、禽用灭活疫苗及其制备方法。

背景技术

畜禽各类传染病的灭活疫苗，对防控这些疫病发挥了重要作用。使用灭活疫苗希望能够达到消除性免疫，即在接受某种疫苗免疫后，完全保护机体免受此类疫病的感染发发病，或者在感染后不排毒，不将病毒传播给其它动物。但现有疫苗在应用中仍存在一定的缺陷，疫苗质量有待于进一步改善。这些缺陷包括以下方面。

现有灭活疫苗免疫机体后抗体产生较慢，抗体持续期较短，抗体水平整齐度差。常规灭活疫苗免疫后3周，才能对同型病毒的攻击提供保护。由于动物个体间的抗体水相差较大，导致群体抗体离散度大。在规模化养殖条件下，群体中少部分动物因抗体水平较低而发病，可能会波及整群发病，带来灾难性的后果。临床生产中常规疫苗抗体持续期约为3-4个月。为了使抗体水平整齐度较好，同时使维持较高的抗体水平，一般需多次免疫。这将加大人力投入，同时增加对动物的应激反应，影响生产性能和饲料报酬。

通常，兽用灭活疫苗配制中抗原用量较多。一方面，疫苗抗原纯化工艺不成熟，表现在疫苗抗原中杂蛋白较多，导致副反应较大。另外一方面，现有禽用灭活多联疫苗在配制时需进行抗原浓缩，以保证疫苗中的抗原含量和疫苗的免疫效果，但增加疫苗的生产成本。临床生产亟需通过合适的技术方法，在保证较好的抗体水平情况下，有效降低抗原用量，降低副反应。

禽用细菌灭活苗存在免疫原性较弱，激发机体产生抗体效价低等缺陷。由副鸡嗜血杆菌为抗原制备的鸡传染性鼻炎疫苗也存在此类缺陷。但单纯从提高由副鸡嗜血杆菌抗原量来提高抗体效价，不但使得生产成本提高，也导致疫苗副反应增大，难以吸收。临床应用中需要一种技术克服以上缺点。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种复方免疫增强剂，该复方免疫增强剂能够缩短现有疫苗免疫窗口期，显著提高抗体效价，提高抗体整齐度，延长抗体持续期，有效降低抗原用量和产生消除性免疫。

本发明的目的之二是提供复方免疫增强剂的制备方法，该方法简单易操作。

本发明的目的之三是提供禽用疫苗，该禽用疫苗含有上述复方免疫增强剂，疫苗的免疫窗口期缩短，抗体效价高，抗体整齐度高，抗体持续期长，抗原用量降低，并且能够产生消除性免疫。

本发明的目的之四是提供所述禽用疫苗的制备方法，该方法简单易操作。

采用如下技术方案实现实现上述目的：

一种复方免疫增强剂，含有0.5～100 μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～1000 μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、5～2000μg /mL的β-葡聚糖和5～2000μg /mL的左旋咪唑，所述含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

该复方免疫增强剂含有0.5～5μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～100μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、5～200μg/mL的β-葡聚糖和5～10μg/mL的左旋咪唑。

该复方免疫增强剂含有5～100μg/mL的含CpG基序的核酸序列、100～1000μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、200～2000μg /mL的β-葡聚糖和10～2000μg /mL的左旋咪唑。

一种制备所述复方免疫增强剂的方法，包括下述步骤：

（1）配制水相溶液：在磷酸盐缓冲液中加入含CpG基序的核酸序列、α-半乳糖基神经酰胺、β-葡聚糖和左旋咪唑，然后加入吐温-80，配制成水相溶液；

（2）配制油相溶液：在白油中加入司盘-80配制成油相溶液；将所述水相溶液与油相溶液充分混合，即得所述复方免疫增强剂。

所述禽用疫苗含有0.5～100μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～1000μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、5～2000μg/mL的β-葡聚糖、5～2000μg /mL的左旋咪唑和灭活疫苗抗原；所述含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述禽用疫苗优选含有0.5～5μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～100μg /mL的α-半乳糖基神经酰胺、5～200μg /mL的β-葡聚糖和5～10μg/mL的左旋咪唑和灭活疫苗抗原。

所述禽用疫苗优选：含有5～100μg/mL的含CpG基序的核酸序列、100～1000μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、200～2000μg /mL的β-葡聚糖和10～2000μg /mL的左旋咪唑和灭活疫苗抗原。

所述禽用疫苗为H9亚型禽流感疫苗或新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、产蛋下降综合症四联灭活疫苗或新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊三联灭活疫苗或鸡传染性鼻炎灭活疫苗。

一种制备所述禽用疫苗的方法，包括下述步骤：

（1）在磷酸盐缓冲液中加入含CpG基序的核酸序列、α-半乳糖基神经酰胺、β-葡聚糖和左旋咪唑，然后加入吐温-80，配制成水相溶液；

（2）在所述水相溶液中加入灭活疫苗抗原，混匀后得到灭活抗原溶液；

（3）在白油中加司盘-80配制成油相溶液；

（4）将所述灭活抗原溶液与油相溶液充分混合，即得所述复方免疫增强剂。

有益效果：本发明复方免疫增强剂，由于其各成分的协同作用，使疫苗的免疫窗口期缩短，显著提高抗体效价，延长抗体持续期，产生针对同型毒株攻毒提供消除性免疫保护，降低抗原用量。本发明复方免疫增强剂与H9亚型禽流感灭活疫苗混合使用免疫鸡，与常规疫苗比较，抗体产生提前2周，即免疫窗口期缩短2周，将抗体持续期延长8周。本发明复方免疫增强剂与1/10的H9亚型禽流感灭活疫苗抗原配伍使用即可达到与H9亚型禽流感常规疫苗的免疫效果。本发明含有该复方免疫增强剂的H9亚型禽流感灭活疫苗能够提供消除性免疫。本发明提供的复方免疫增强剂亦对新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、产蛋下降综合症四联灭活疫苗和新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊三联灭活疫苗中的各抗原均有显著免疫增强作用。本发明提供的复方免疫增强剂亦对细菌性灭活疫苗鸡传染性鼻炎灭活疫苗具有显著免疫增强作用。本发明所述禽用疫苗的制备方法，简单易操作。

附图说明

图1显示各组免疫后血清针对H9检测抗原的HI抗体效价。 

图2显示各组免疫后针对H9检测抗原的HI抗体持续期。

图3显示各组免疫后针对H9检测抗原的HI抗体效价

图4 显示免疫后4周各免疫组对ND、IB、H9和EDS检测抗原的抗体效价。

图5显示 免疫后4周各免疫组针对三联苗中的ND和IB检测抗原的抗体。

图6显示 免疫后4周各免疫组针对三联苗中的IBD检测抗原的抗体。

图7 免疫后4周各免疫组对鸡传染性鼻炎的抗体效价。

具体实施方式

实施例1  复方免疫增强剂、禽用疫苗的配制

（1）   试验材料

含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5'–GTTCCTGACGTTGGTGCATCGATGCAGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGGGTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGGGGGGGCTAGACGTTAGCGT-3'，由。β-葡聚糖，α-半乳糖基神经酰胺(α-galactosylceramide,简称α-GC)购自Invivogen。左旋咪唑购自SIGMA公司。白油购自法国埃索公司，吐温-80和司盘-80购自广东肇庆超能实业有限公司。配制磷酸盐缓冲液的无机盐购自国药集团化学试剂有限公司。

（2）   试验方法

制备复方免疫增强剂：

水相溶液的配制：首先配制磷酸盐（PBS）缓冲液，含1.44g/L的 Na₂HPO₄ ，1.44g/L的 KH₂PO₄ ，8g/L的 NaCl ，0.2g/L的KCl ，pH为7.0，灭菌后备用。然后在所述PBS缓冲液中加入含CpG基序的核酸序列、α-GC、β-葡聚糖和左旋咪唑，经混匀后加入吐温-80，配制成水相溶液，所述吐温-80在水相溶液的体积百分含量为4%。其中含CpG基序的核酸序列、α-GC、β-葡聚糖和左旋咪唑均是免疫增强剂。

油相溶液的配制：在白油中加入司盘-80，配制成油相溶液。司盘-80在油相溶液中的体积百分含量为4%。

将所述水相溶液和油相溶液按照体积比为1:3混合均匀，即得到复方免疫增强剂。

该复方免疫增强剂，含有0.5～100 μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～1000 μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、5～2000μg /mL的β-葡聚糖和5～2000μg /mL的左旋咪唑，所述含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

该复方免疫增强剂的优选配方为：含有 0.5～5μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～100μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、5～200μg/mL的β-葡聚糖和5～10μg/mL的左旋咪唑。

该复方免疫增强剂的另一优选配方为：含有5～100μg/mL的含CpG基序的核酸序列、100～1000μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、200～2000μg /mL的β-葡聚糖和10～2000μg /mL的左旋咪唑。

禽用疫苗及其配制方法：

禽用疫苗，含有0.5～100μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～1000μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、5～2000μg/mL的β-葡聚糖、5～2000μg /mL的左旋咪唑和灭活疫苗抗原；所述含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

禽用疫苗优选配方，含有0.5μg～5μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～100μg /mL的α-半乳糖基神经酰胺、5～200μg /mL的β-葡聚糖、5～10μg/mL的左旋咪唑和灭活疫苗抗原。

禽用疫苗另一优选配方，含有5～100μg/mL的含CpG基序的核酸序列、100～1000μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、200～2000μg /mL的β-葡聚糖、10～2000μg /mL的左旋咪唑和灭活疫苗抗原。

该禽用疫苗含有上述复方免疫增强剂。为了与现有疫苗相区分，以下实施例中将该禽用疫苗均称为含有复方免疫增强剂的禽用疫苗。

所述禽用疫苗为H9亚型禽流感疫苗或新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、产蛋下降综合症四联灭活疫苗或新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊三联灭活疫苗或鸡传染性鼻炎灭活疫苗。

制备禽用疫苗的方法：

第一种方法，配制母液，所述母液的成分与所述复方免疫增强剂相同，所述母液中含CpG基序的核酸序列、α-GC、β-葡聚糖和左旋咪唑浓度为禽用疫苗中相应物质浓度的10倍；将所述母液与现有疫苗按照体积比为1:9混合均匀，即得到禽用疫苗。饲养户在实际操作过程中，能够将该复方免疫增强剂与各种现有疫苗混合使用，操作方便，灵活。

第二种方法，包括如下步骤：（1）配制水相溶液：在磷酸盐缓冲液中加入含CpG基序的核酸序列、α-GC、β-葡聚糖和左旋咪唑，然后加入吐温-80，配制成水相溶液；所述吐温-80在水相溶液的体积百分含量为4%。（2）在所述水相溶液中加入灭活疫苗抗原，混匀后得到灭活抗原溶液；（3）配制油相溶液：在白油中加入司盘-80，配制成油相溶液，司盘-80在油相溶液的体积百分含量为4%；（4）将所述灭活抗原溶液与油相溶液按照体积比为1:3充分混合，即得禽用疫苗。这种方法，对于疫苗生产企业来说，操作更加的方便易行。

采用上述两种方法制备的相同配方的禽用疫苗，在免疫效果上相同。特别列举出两种方法，是为了满足不同用户操作方便的需要。

配制禽用疫苗：

H9亚型禽流感疫苗

新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、产蛋下降综合症四联灭活疫苗

新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊三联灭活疫苗

鸡传染性鼻炎灭活疫苗。各种禽用疫苗分别配制三种配方：禽用疫苗A、B和C。

禽用疫苗A含有0.5μg /mL的含CpG基序的核酸序列、0.5μg/mL的α-GC、5μg/mL的β-葡聚糖和5μg/mL的左旋咪唑和灭活疫苗抗原，将禽用疫苗A简称为A-VA2。

禽用疫苗B含有5μg/mL的含CpG基序的核酸序列、100μg/mL的α-GC、200μg/mL的β-葡聚糖和10μg/mL的左旋咪唑和灭活疫苗抗原，将禽用疫苗B简称为B-VA2。

禽用疫苗C含有100μg/mL的含CpG基序的核酸序列、1mg/mL的α-GC、2mg/mL的β-葡聚糖和2mg/mL的左旋咪唑和灭活疫苗抗原，将禽用疫苗C简称为C-VA2。

本实施例中，免疫增强剂的各组分可以在给出的配比范围内灵活进行组合，在此不一一例举。

实施例2 复方免疫增强剂对H9亚型禽流感疫苗免疫效力和抗体持续期的影响

（1）试验材料  

H9亚型禽流感疫苗和H9亚型禽流感标准检测抗原均购自南京天邦生物科技有限公司。制苗用白油购自法国埃索公司（Esso, Marcol 52），吐温-80和司盘-80购自广东肇庆超能实业有限公司。无特定病原体（Specific Pathogen Free，SPF）鸡系从北京梅里亚维通实验动物技术有限公司购买鸡胚，经自行孵化后于隔离器内饲养，饲养至28日龄待用。

采用现有的H9亚型禽流感疫苗，按照实施例1第一种方法制备含复方免疫增强剂的H9亚型禽流感疫苗A-VA2、B-VA2和C-VA2，分别缩写为A-VA2-H9、B-VA2-H9、C-VA2-H9。

为了证明本发明复方免疫增强剂包含的四种免疫增强剂之间存在协同效应，参照实施例1中配制禽用疫苗的方法（先配制含单一免疫增强剂的油乳剂，然后将其与H9亚型禽流感疫苗混合），配制含单一免疫增强剂成分H9亚型禽流感疫苗：仅含100μg/mL 含CpG基序的核酸序列的H9亚型禽流感单苗，简称为CpG-H9；仅含1mg/mLα-GC的H9亚型禽流感单苗，简称为α-GC-H9；仅含2mg/mL β-葡聚糖的H9亚型禽流感单苗，简称为β-葡聚糖-H9；仅含2mg/mL左旋咪唑的H9亚型禽流感单苗，简称为左旋咪唑-H9。

（2）试验方法

免疫和分组：根据《兽用生物制品质量标准汇编（2006-2008）》，简称“规程”， 4周龄鸡免疫0.3mL/鸡，5周龄以上的鸡按0.5mL/鸡免疫，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取35日龄鸡，经颈部皮下途径按0.5mL/鸡免疫，设立含复方免疫增强剂的A-VA2-H9、B-VA2-H9和C-VA2-H9疫苗组；含单一免疫增强剂成分的H9亚型禽流感疫苗组，包括CpG-H9、α-GC-H9、β-葡聚糖-H9和左旋咪唑-H9， H9亚型禽流感疫苗组（免疫现有疫苗，缩写为H9常规苗组）、以及空白对照组（不免疫），共9组，各疫苗免疫组设40只鸡/组，空白对照组20只鸡。 

（3）复方免疫增强剂对H9亚型禽流感疫苗免疫效力的影响

采血和抗体效价检测：免疫后第2周和第4周经静脉采血，分离血清，用H9亚型禽流感标准检测抗原，采用微量血凝抑制试验(HI)检测血清抗体效价，HI检测方法参考2010年版《中国兽药典》。根据每组鸡的几何平均抗体效价（GMT）和方差（SD），比较复方免疫增强剂对现有H9亚型禽流感疫苗的免疫增强效果。

结果

在免疫后2周，含复方免疫增强剂的疫苗组的抗体效价高于常规疫苗效价至少1.5log2，高于规程要求的常规疫苗免疫后4周的合格抗体效价（7log2）。即含复方免疫增强剂的疫苗能将免疫窗口期缩短2周。含复方免疫增强剂疫苗组的抗体效价亦高于含单一免疫增强剂成分H9亚型疫苗组的抗体效价。同时，可以看出：复方免疫增强剂显著提高了H9亚型禽流感疫苗（现有疫苗）免疫后的抗体效价，大于单一免疫增强剂对H9亚型禽流感疫苗抗体效价提高之和，也就是说复方免疫增强剂包含的各免疫增强剂之间存在协同效应。

免疫后4周，含免疫复方增强剂的疫苗组的抗体效价均高于常规疫苗组抗体效价，含免疫复方增强剂疫苗组之间的几何平均抗体效价相当，远高于常规疫苗抗体效价，亦高于含单一免疫增强剂成分的H9亚型疫苗组的抗体效价。经Two-Way ANOVA分析，表明：含复方免疫增强剂疫苗的抗体效价与常规疫苗组抗体效价比较，差异显著（P＜0.05），在图1中以*表示。含复方免疫增强剂的疫苗在免疫后产生的抗体离散度小于常规苗。即，含免疫增强剂疫苗免疫后抗体效价整齐度优于常规疫苗。详见图1。同时，可以看出，复方免疫增强剂显著提高了H9亚型禽流感疫苗（现有疫苗）免疫后的抗体效价，大于单一免疫增强剂对H9亚型禽流感疫苗免疫后抗体效价提高之和，也就是说复方免疫增强剂包含的各免疫增强剂之间存在协同效应。

试验结果表明，不同剂量的复方免疫增强剂配方均能提高H9亚型禽流感疫苗抗体效价，具有明显的免疫增强作用，与常规疫苗相比较能缩短免疫窗口期，含复方免疫增强剂疫苗组的抗体离散度远小于常规疫苗离散度，即，抗体整齐度优于常规疫苗。结果提示，各免疫增强剂成分经合适搭配之后成为复方佐剂，具有显著的协同增强作用。

（4）复方免疫增强剂对H9亚型禽流感疫苗的抗体持续期的影响

采血和抗体效价检测：免疫后第2、4、8、12、16、20、24和28周经静脉采血，分离血清，用H9亚型禽流感标准检测抗原，采用微量血凝抑制试验(HI)检测血清抗体效价。

结果和结论

从免疫后2周开始检测抗体，含复方免疫增强剂的H9亚型禽流感疫苗在免疫后的抗体均高于常规疫苗组，达到“规程”要求的7log2以上。A-VA2-H9疫苗组在免疫后4~20周抗体效价在8log2以上，直至第20周抗体效价低于7 log2。B-VA2-H9疫苗组在免疫后4~20周抗体效价在9log2以上，直至第28周抗体效价低于7 log2。C-VA2-H9疫苗组在免疫后4~20周抗体效价均在9log2以上，直至第28周抗体效价低于7 log2。而常规疫苗免疫后仅在第4周到第12周抗体效价维持在7log2以上，此后抗体效价持续下降，至第28周时抗体效价为5.32log2。含单一免疫增强剂成分的H9亚型禽流感疫苗，其抗体持续期与常规疫苗无明显差异，远短于含复方免疫增强剂成分H9亚型禽流感疫苗组。详见图2。

试验结果表明，本发明中的复方免疫增强剂能缩短现有H9亚型禽流感疫苗免疫窗口期2周，提高H9亚型禽流感疫苗抗体效价，并在后续的抗体持续期中比常规疫苗维持较高的效价长达4-8周，具有显著的免疫增强作用。含复方免疫增强剂成分H9亚型禽流感疫苗组其抗体持续期远优于含单一免疫增强剂成分的H9亚型禽流感疫苗，各免疫增强剂成分经合适搭配之后，具有显著的协同效应。

（4）复方免疫增强剂对同型H9亚型禽流感攻毒后抑制排毒的影响

攻毒和排毒检测  免疫后第4周，从各组取一半的鸡用于攻毒。即，各疫苗免疫组20只，空白对照组10只。攻毒毒株为H9亚型禽流感病毒NJ/02株，购自南京天邦生物科技有限公司。攻毒剂量为10^7.5EID₅₀（鸡胚半数感染量）/0.1mL，经点眼滴鼻途径攻毒。攻毒后第3天、5天、7天和10天，分别从喉气管和泄殖腔采取棉拭子。将此棉拭子浸于含5%小牛血清和5000U卡那霉素及5000U庆大霉素的PBS（pH7.0）中。每一棉拭经挤压后，12000转/分，离心10分钟。将离心所得上清液按0.1mL/胚，接种10日龄SPF鸡胚，每一棉拭子样品接种3枚鸡胚，用于分离病毒。鸡胚接种后，置37℃温箱中，每天照胚2次，弃去24小时内死亡的鸡胚，观察至接种后120小时，及时将死亡鸡胚取出，检测血凝（Heamagglutinin，HA）效价。以3个胚中的1个或以上测出HA效价高于4log2者判为病毒分离阳性。

结果和结论

在攻毒后第3天、5天、7天和10天的喉气管和泄殖腔棉拭子样品检测中，含复方免疫增强剂的疫苗组均未分离到病毒。而常规疫苗免疫组和含免疫增强剂单一成分疫苗组在攻毒后第3天、5天、7天从部分免疫鸡的喉气管分离到病毒，泄殖腔则在攻毒后第3天、5天分离到病毒。未免疫的所有对照鸡在攻毒后第3天、5天、7天从喉气管和泄殖腔均能分离到病毒，在攻毒后第10天，从部分鸡喉气管和泄殖腔均能分离到病毒。详见表1。

试验结果表明，本发明中的复方免疫增强剂能对与疫苗抗原相同的病毒攻击完全抑制排毒，即可提供消除性免疫保护，这为将来某类传染病的消灭提供有力的技术支持。含复方免疫增强剂疫苗组在抑制排毒的能力方面远优于单一免疫增强剂成分疫苗。

表1 不同免疫组在攻毒后的病毒分离率

实施例3复方免疫增强剂降低H9亚型禽流感疫苗中抗原用量

（1）试验材料  

现有的H9亚型禽流感疫苗（抗原为灭活H9N2亚型禽流感病毒NJ/02株）和H9禽流感检测抗原和灭活H9N2亚型禽流感病毒NJ/02株购自南京天邦生物科技有限公司。

采用实施例1第一种方法，用复方免疫增强剂和现有的H9亚型禽流感疫苗混合，分别配制抗原含量为现有的H9亚型禽流感疫苗中抗原含量的1/2，1/4和1/10的疫苗。按照实施例1中第二种制备方法，采用灭活H9亚型禽流感病毒NJ/02株配制抗原量等同于现有的H9亚型禽流感疫苗的疫苗。此步配制的疫苗中所含复方免疫增强剂成分和含量与B-VA2相同，所以上述4种疫苗分别命名为1/2 B-VA2-H9，1/4 B-VA2-H9，1/10 B-VA2-H9，B-VA2-H9。

（2）试验方法

免疫和分组：根据 “规程”， 4周龄鸡免疫0.3mL/鸡，5周龄以上的鸡按0.5mL/鸡免疫，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取35日龄鸡，经颈部皮下途径按0.5mL/鸡接种，设立上述4种疫苗组、H9常规疫苗组以及空白对照组（不免疫），共6组。免疫组每组20只鸡，空白对照组10只鸡。H9常规疫苗组采用现有的H9亚型禽流感疫苗，由南京天邦生物科技有限公司提供。

采血和抗体效价检测  免疫后第2、4周经静脉采血，分离血清，用H9禽流感检测抗原，采用微量血凝抑制试验(HI)检测血清抗体效价。根据每组鸡的几何平均效价和方差，比较复方免疫增强剂对疫苗的免疫增强效果。

（3）结果和结论

从图3可以看出：在免疫后2周，含复方免疫增强剂的疫苗组的抗体效价高于常规疫苗组的抗体效价。含复方免疫增强剂的疫苗组中，即使用含1/10抗原量的疫苗免疫后，抗体效价与常规疫苗免疫后的抗体效价相当。含免疫增强剂的疫苗组抗体效价在免疫后2周即达到“规程”要求。经Two-Way ANOVA，含免疫增强剂疫苗的抗体效价与常规疫苗组抗体效价比较，差异显著（P＜0.05），在图3中以*表示。

在免疫后4周，除使用1/10抗原量的复方免疫增强剂疫苗组抗体效价与常规疫苗抗体效价相当。其余含复方免疫增强剂疫苗的3个组，包括常规抗原量组、1/2和1/4抗原剂量组在免疫后抗体效价显著高于常规疫苗组。经Two-Way ANOVA，含免疫增强剂疫苗的抗体效价与常规疫苗组抗体效价比较，差异显著（P＜0.05），在图3中以*表示。

试验结果表明，在降低抗原用量的情况下，复方免疫增强剂能提高H9亚型禽流感疫苗抗体效价，具有明显的免疫增强作用，且复方免疫增强剂疫苗组的抗体整齐度优于常规疫苗组，这对于各种联苗的配伍具有现实意义。  

实施例4复方免疫增强剂对鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、产蛋下降综合症四联灭活疫苗免疫效力影响

（1）试验材料  

试验用鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、产蛋下降综合症四联灭活疫苗（ND-IB-H9-EDS，简称NI9E）和鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、产蛋下降综合症检测抗原均购自南京天邦生物科技有限公司。

按照实施例1第一种方法制备含复方免疫增强剂的鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、产蛋下降综合症四联灭活疫苗A-VA2、B-VA2和C-VA2，分别缩写为A-VA2-NI9E、B-VA2-NI9E、C-VA2-NI9E。

（2）试验方法

免疫和分组：根据 “规程”， 4周龄鸡免疫0.3mL/鸡，5周龄以上的鸡按0.5mL/鸡免疫，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取42日龄鸡，用A-VA2-NI9E、B-VA2-NI9E、C-VA2-NI9E疫苗和常规NI9E四联疫苗（现有的鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、产蛋下降综合症四联灭活疫苗），经颈部皮下途径按0.5mL/鸡接种，共4组，每组各免疫20只鸡。

采血和抗体效价检测  免疫后第4周经翅静脉采血，分离血清，用鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、产蛋下降综合症检测抗原，采用微量血凝抑制试验(HI)，分别检测针对各抗原的血清抗体效价。根据每组鸡的几何平均效价和方差，比较免疫增强剂对疫苗的免疫增强效果。

结果和结论

在免疫后第4周，分别用针对鸡新城疫（缩写为ND）、传染性支气管炎（缩写为IB）、H9亚型禽流感（缩写为H9）和产蛋下降综合症（缩写为EDS）的检测抗原检测血清HI抗体效价，结果见图4。经One-Way ANOVA，Tukey分析，含复方免疫增强剂疫苗组的抗体效价与常规疫苗组抗体效价比较，差异显著（P＜0.05），在图4中以*表示。

四联苗与不同剂量复方免疫增强剂混合使用的免疫组，针对ND的HI抗体效价，均显著高于常规四联灭活疫苗免疫组。

四联苗与不同剂量复方免疫增强剂混合使用的免疫组，针对IB的HI抗体效价，仅接种A-VA2-NI9E、B-VA2-NI9E的免疫组的抗体效价显著高于常规四联灭活疫苗免疫组，接种C-VA2-NI9E的免疫组抗体效价高于常规四联灭活疫苗免疫组，但差异不显著。

四联苗与不同剂量复方免疫增强剂混合使用的免疫组，针对H9的HI抗体效价，均显著高于常规四联灭活疫苗免疫组。

四联苗与不同剂量复方免疫增强剂混合使用的免疫组，针对EDS的HI抗体，均显著高于常规四联灭活疫苗免疫组。

试验结果表明，复方免疫增强剂能提高鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、产蛋下降综合症四联灭活疫苗抗体效价，具有明显的免疫增强作用，这为含更多种抗原的多联苗的研制具有现实意义。  

实施例5 复方免疫增强剂对鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊三联灭活疫苗免疫效力影响

（1）试验材料  

现有鸡新城疫、传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗（ND-IB-IBD，简称NID）购自南京梅里亚动物保健有限公司。鸡新城疫、传染性支气管炎检测抗原均购自南京天邦生物科技有限公司。鸡传染性法氏囊检测抗原购自中国兽医药品监察所。SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。M199培养基购自Gibico公司。

按照实施例1第一种方法制备含复方免疫增强剂的鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊三联灭活疫苗A-VA2、B-VA2和C-VA2，分别简称为A-VA2-NID、B-VA2-NID、C-VA2-NID。

（2）试验方法

免疫和分组：根据 “规程”， 4周龄鸡免疫0.3mL/鸡，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取14日龄鸡，用A-VA2-NID、B-VA2-NID、C-VA2-NID疫苗和常规NID三联疫苗（现有鸡新城疫、传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊三联灭活），经颈部皮下途径按0.3mL/鸡接种，共4组，每组各免疫20只鸡。

采血和抗体效价检测  免疫后第4周经翅静脉采血，分离血清，用鸡新城疫、传染性支气管炎检测抗原，采用微量血凝抑制试验(HI)，分别检测针对鸡新城疫（缩写为ND）检测抗原、传染性支气管炎(缩写为IB) 检测抗原的血清抗体效价。根据每组鸡的几何平均效价和方差，比较免疫增强剂对疫苗的免疫增强效果。

针对传染性法氏囊（缩写为IBD）的抗体效价，采用在鸡胚成纤维细胞（CEF）上作病毒血清中和试验的方法。操作步骤参考“规程”。

（3）结果和结论

在免疫后第4周，分别用针对ND、IB的检测抗原检测血清HI抗体效价（结果见图5）。针对IBD的抗体效价以在CEF上的病毒血清中和效价判定（结果见图6）。经One-Way ANOVA，Tukey分析，含复方免疫增强剂疫苗的抗体效价与常规疫苗组抗体效价比较，差异显著（P＜0.05），在图5和图6中以*表示，差异极显著（P＜0.01），在图5中以**表示。

三联苗与复方免疫增强剂混合使用的免疫组，针对ND的HI抗体，均显著高于常规三联灭活疫苗免疫组。

三联苗与复方免疫增强剂混合使用的免疫组，针对IB的HI抗体，均显著高于常规三联灭活疫苗免疫组。

三联苗与复方免疫增强剂混合使用的免疫组，针对IBD的HI抗体，均显著高于常规三联灭活疫苗免疫组。

试验结果表明，复方免疫增强剂能提高鸡新城疫、传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊三联灭活疫苗抗体效价，具有明显的免疫增强作用。

实施例6 复方免疫增强剂对鸡传染性鼻炎灭活疫苗免疫效力影响

（1）试验材料  

现有鸡传染性鼻炎灭活疫苗（IC），购自青岛易邦生物工程有限公司。副鸡嗜血杆菌A型C-Hpg-8株检测抗原购自中国兽医药品监察所。SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

按照实施例1第一种方法制备含复方免疫增强剂的鸡传染性鼻炎灭活疫苗A-VA2、B-VA2和C-VA2，分别简称为A-VA2-IC、B-VA2-IC、C-VA2-IC。

（2）试验方法

免疫和分组：根据现有鸡传染性鼻炎灭活疫苗（IC）说明，42日龄以下鸡免疫0.25mL/鸡，42日龄以上的鸡按0.5mL/鸡免疫，免疫途径为肌肉或皮下注射。本次试验取21日龄鸡，用A-VA2-IC、B-VA2-IC、C-VA2-IC疫苗和常规IC灭活疫苗（即现有鸡传染性鼻炎灭活疫苗），经颈部皮下途径按0.25mL/鸡接种，共4组，每组各免疫10只鸡。

采血和抗体效价检测  免疫后第4周经翅静脉采血，分离血清，用副鸡嗜血杆菌A型C-Hpg-8株检测抗原，参考“规程”采用血凝抑制试验(HI)，检测血清抗体效价。根据每组鸡的几何平均效价和方差，比较复方免疫增强剂对疫苗的免疫增强效果。

（3）结果和结论

在免疫后第4周，采用血凝抑制试验检测抗体效价。经One-Way ANOVA，Tukey分析，含复方免疫增强剂的鸡传染性鼻炎灭活疫苗的抗体效价显著高于常规IC疫苗组抗体效价，差异显著（P＜0.05），在图7中以*表示，差异极显著（P＜0.01），在图7中以**表示。

根据试验结果可以得知，本发明复方免疫增强剂对细菌类灭活疫苗亦具有较好的免疫增强效果。

                        SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏省农业科学院

 

<120>  复方免疫增强剂、禽用灭活疫苗及其制备方法

 

<130>  20120821

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  137

<212>  DNA

<213>  Artificial

 

<220>

<223>  含CpG基序的核酸序列

 

<400>  1

gttcctgacg ttggtgcatc gatgcagggg ggtcgtcgtt ttgtcgtttt gtcgttgggg     60

 

ggtcgtcgtt ttgtcgtttt gtcgttgggg ggtcgtcgtt ttgtcgtttt gtcgttgggg    120

 

gggctagacg ttagcgt                                                   137

 

 

Claims (9)

1.一种复方免疫增强剂，其特征在于该复方免疫增强剂含有0.5～100 μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～1000 μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、5～2000μg /mL的β-葡聚糖和5～2000μg /mL的左旋咪唑，所述含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的复方免疫增强剂，其特征在于：该复方免疫增强剂含有0.5～5μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～100μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、5～200μg/mL的β-葡聚糖和5～10μg/mL的左旋咪唑。

3.根据权利要求1所述的复方免疫增强剂，其特征在于：该复方免疫增强剂含有5～100μg/mL的含CpG基序的核酸序列、100～1000μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、200～2000μg /mL的β-葡聚糖和10～2000μg /mL的左旋咪唑。

4.一种制备权利要求1所述复方免疫增强剂的方法，包括下述步骤：

配制水相溶液：在磷酸盐缓冲液中加入含CpG基序的核酸序列、α-半乳糖基神经酰胺、β-葡聚糖和左旋咪唑，然后加入吐温-80，配制成水相溶液；

配制油相溶液：在白油中加入司盘-80配制成油相溶液；将所述水相溶液与油相溶液充分混合，即得所述复方免疫增强剂。

5.一种禽用疫苗，其特征在于所述禽用疫苗含有0.5～100μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～1000μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、5～2000μg/mL的β-葡聚糖、5～2000μg /mL的左旋咪唑和灭活疫苗抗原；所述含CpG基序的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求5所述禽用疫苗，其特征在于含有0.5～5μg/mL的含CpG基序的核酸序列、0.5～100μg /mL的α-半乳糖基神经酰胺、5～200μg /mL的β-葡聚糖和5～10μg/mL的左旋咪唑和灭活疫苗抗原。

7.根据权利要求5所述禽用疫苗，其特征在于：含有5～100μg/mL的含CpG基序的核酸序列、100～1000μg/mL的α-半乳糖基神经酰胺、200～2000μg /mL的β-葡聚糖和10～2000μg /mL的左旋咪唑和灭活疫苗抗原。

8.根据权利要求5或6或7所述禽用疫苗，其特征在于所述禽用疫苗为H9亚型禽流感疫苗或新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、产蛋下降综合症四联灭活疫苗或新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊三联灭活疫苗或鸡传染性鼻炎灭活疫苗。

9.一种制备权利要求5所述禽用疫苗的方法，包括下述步骤：

（1）在磷酸盐缓冲液中加入含CpG基序的核酸序列、α-半乳糖基神经酰胺、β-葡聚糖和左旋咪唑，然后加入吐温-80，配制成水相溶液；

（2）在所述水相溶液中加入灭活疫苗抗原，混匀后得到灭活抗原溶液；

（3）在白油中加司盘-80配制成油相溶液；

（4）将所述灭活抗原溶液与油相溶液充分混合，即得所述复方免疫增强剂。

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