BR122019025365B1 - Uso de uma composição veterinária - Google Patents

Abstract

São providos composições e métodos para o uso na profilaxia de metrite puerperal e aprimoramento da função reprodutiva de ruminantes. Os métodos e as composições são para a administração subcutânea e são providos como composições veterinárias e como artigos de manufatura. A composição veterinária pode conter células inteiras selecionadas a partir de células inteiras de Escherichia coli (E. coli), Trueperella pyogenes (T. pyogenes), Fusobacterium necrophorum (F. necrophorum) e combinações dos mesmos; e/ou proteínas selecionadas a partir de F. necrophorum leucotoxina (LKT), adesina fimbrial de tipo 1 de E. coli (FimH), pirolisina de T. pyogenes (PLO), e todas as combinações das células inteiras e das proteínas.

Description

DIVIDIDO DO BR112015012288-4, DEPOSITADO EM 08/10/2013 REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório US No. 61/731.333, depositado em 29 de novembro de 2012, cuja descrição é incorporada aqui por referência.

CAMPO DA DESCRIÇÃO

[002] A presente descrição se refere em geral à saúde de ruminantes e mais especificamente às composições e aos métodos para mitigar os efeitos de infecções bacterianas que estão relacionadas com doença uterina.

FUNDAMENTOS DA DESCRIÇÃO

[003] Doenças uterinas pós-parto de vacas leiteiras comprometem o bem-estar do animal e podem resultar em remoção precoce do rebanho ou desempenho reprodutivo prejudicado. Metrite puerperal é definida por um útero anormalmente alargado e uma descarga uterina marrom avermelhada, aquosa, fétida associada com sinais de doença sistêmica (produção de leite diminuída, embotamento, ou outros sinais de toxemia) e temperatura >39,5°C dentro de 21 dias após o parto, enquanto endometrite se refere à inflamação do útero sem doença sistêmica, que acontece depois de 21 dia após o parto. Na América do Norte, a metrite afeta 10% a 20% das vacas, enquanto que a incidência de endometrite é de aproximadamente 28%, variando de 5,3% a 52,6%. A metrite puerperal comumente é tratada com antibióticos como penicilina ou cefalosporinas de terceira geração.

[004] No entanto, a resistência a antibióticos mundial é reconhecida como um desafio de saúde pública de topo e assim existe uma preocupação crescente com relação ao impacto potencial do uso extensivo de antibióticos em animais alimentícios, incluindo cefalosporinas de última geração. O custo de cada caso de metrite foi reportado em aproximadamente US$329 a 386, devido ao tratamento de antibiótico e os efeitos prejudiciais de metrite em desempenho reprodutor, produção de leite, e capacidade de sobrevivência. Assim, existe uma necessidade atual e não satisfeita por composições e métodos para o uso na profilaxia contra doenças uterinas. A presente descrição satisfaz estas necessidades.

BREVE SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

[005] A presente descrição provê em um aspecto um método para a profilaxia de metrite puerperal em um ruminante. O método em geral compreende administrar de maneira subcutânea uma composição veterinária para um mamífero ruminante. A composição veterinária pode compreender células inteiras selecionadas a partir de células inteiras de Escherichia coli (E. coli), Trueperella pyogenes (T. pyogenes), Fusobacterium necrophorum (F. necrophorum) e combinações dos mesmos; e/ou (2) proteínas selecionadas a partir de F. necrophorum leucotoxina (LKT), adesina fimbrial de tipo 1 de E. coli (FimH), pirolisina de T. pyogenes (PLO), e todas as combinações das células inteiras e as proteínas. Nas modalidades, a composição veterinária compreende as células inteiras de E. coli, T. pyogenes, e F. necrophorum. Nas modalidades, a composição compreende as proteínas FimH, PLO e LKT. Nas modalidades, a composição veterinária compreende as células inteiras de E. coli, T. pyogenes, e F. necrophorum e as proteínas FimH, PLO e LKT.

[006] Espera-se que o método seja adequado para o uso com qualquer mamífero ruminante. Nas modalidades, o ruminante é um membro do gênero Bos, tal como um touro, vaca ou búfalo, e em certas modalidades o ruminante é uma vaca leiteira.

[007] Em uma abordagem, a vaca leiteira é um membro de um grupo de vacas leiteiras e o método inclui administrar de maneira subcutânea a composição veterinária para vacas leiteiras adicionais no grupo tal que a incidência de metrite puerperal no grupo é reduzida.

[008] Em outro aspecto a descrição inclui aprimorar a função reprodutiva de um ruminante. O método para aprimorar a função reprodutiva de um ruminante compreende administrar de maneira subcutânea para o ruminante uma composição veterinária como descrito aqui tal que a função reprodutiva do ruminante é aprimorada.

[009] Em outro aspecto a descrição inclui uma composição veterinária compreendendo células inteiras selecionadas a partir de células inteiras de E. coli, T. pyogenes, F. necrophorum e combinações dos mesmos; proteínas selecionadas a partir de F. necrophorum LKT, E. coli FimH, PLO, e combinações dos mesmos; e qualquer combinação das células inteiras e das proteínas.

[0010] Em outro aspecto um artigo de manufatura é provido. O artigo de manufatura compreende embalagem e pelo menos um recipiente vedado. O recipiente contém uma composição veterinária compreendendo células inteiras selecionadas a partir de células inteiras de E. coli, T. pyogenes, F. necrophorum e combinações dos mesmos; proteínas selecionadas a partir de LKT de F. necrophorum, FimH, PLO de E. coli, e combinações das mesmas; e qualquer combinação das células inteiras e das proteínas. A embalagem compreende adicionalmente material impresso provendo uma indicação de que a composição veterinária é para a administração subcutânea para um ruminante para a profilaxia de metrite puerperal, e/ou para aumentar a função reprodutiva do ruminante.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0011] A Figura 1 mostra um exemplo da prevalência de fatores de virulência específicos de espécies bacterianas, IktA (Fusobacterium necrophorum), fimH (Escherichia coli), e fimA e plo (Arcanobacterium pyogenes) em 3 estágios de lactação diferentes. * V.F. > 1 = Pelo menos um fator de virulência presente.

[0012] A Figura 2 mostra um exemplo de um efeito de detecção de fimH a 1 a 3 dias em leite (DIM) no desempenho reprodutor. A linha preta sólida representa vacas com fimH negativo e a linha interrompida representa vacas com fimH positivo. Vacas com fimH positivo foram 2,1 vezes menos prováveis de ser confirmadas como grávidas do que vacas com fimH negativo (P <0,001).

[0013] A Figura 3 mostra um exemplo de um efeito de vacinação na temperatura retal a 6 + 1 DIM. Vacinas foram avaliadas separadamente (A, Valor P = 0,14), e agrupadas (B, Valor P = 0,018). Erros padrão das médias são representados pelas barras de erro.

[0014] A Figura 4 mostra um exemplo de um efeito de vacinação em soro IgG detectado por ELISA contra E. coli (A), FimH (B), F. necrophorum (C), LKT (D), T. pyogenes (E), e PLO (F). O eixo X representa dias com relação ao parto, enquanto o eixo Y representa OD65o de soro IgG detectado por ELISA contra vários antígenos. Erros padrão das médias são representados pelas barras de erro.

[0015] A Figura 5 mostra um exemplo de análise de sobrevivência de Kaplan-Meier de intervalo de concepção de parto pelo tratamento agrupado como controle, vacinas subcutâneas e vacinas intravaginais. O intervalo de concepção de parto médio para as vacinas subcutâneas (linha interrompida interna), vacinas intravaginais (linha interrompida média), e controle (linha sólida) foi de 94, 114, e 120 respectivamente. (Valor P = 0,04).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA DESCRIÇÃO

[0016] A presente descrição em geral está direcionada para composições e métodos para aprimorar a saúde de ruminantes, e mais especificamente para a profilaxia de doença intrauterina de ruminantes.

[0017] Nós avaliamos várias abordagens diferentes para desenvolver as composições e os métodos que desejam mitigar doenças intrauterinas em ruminantes e avaliam estas abordagens para uma variedade de efeitos em metrite e endometrite, dentre outras respostas. Como é conhecido na técnica, metrite em geral envolve a inflamação da parede do útero, enquanto endometrite em geral envolve a inflamação do endométrio. Nossas abordagens incluem fazer distintas formulações de vacina e avaliar os efeitos das diferentes formulações e rotas de administração nos aspectos de saúde de ruminante. Estes efeitos incluem a estimulação de respostas imunológicas contra bactérias e proteínas bacterianas, efeitos na endometrite e metrite, efeitos na contaminação bacteriana intrauterina, efeitos em sintomas relacionados com doença uterina, tais como temperatura retal, e efeitos em função reprodutiva. Os resultados obtidos foram inesperados pelo fato de que foi descoberto apenas que a administração subcutânea foi profilática para a metrite puerperal, e apenas a administração subcutânea foi eficaz para aprimorar a função reprodutiva em ruminantes. Nós também determinamos que vacinação intravaginal e subcutânea induz um aumento significativo em titulações de soro IgG contra todos os antígenos, mas vacinação subcutânea foi mais eficaz na estimulação da produção de IgG. No entanto, não obstante os resultados positivos para a profilaxia de metrite e aprimoramentos na função reprodutiva obtiveram uso de administração subcutânea, nenhuma das vacinas, independentemente da rota de administração, protegeu contra a endometrite ou diminuir de maneira significativa a propensão de contaminação bacteriana intrauterina. Assim, como será mais completamente descrito abaixo, a presente invenção provê novas e eficazes composições e métodos para a profilaxia de metrite puerperal e para aprimorar função reprodutiva em ruminantes, bem como outros benefícios que serão aparentes para os versados na técnica a partir da presente descrição.

[0018] Nas modalidades o ruminante ao qual uma composição da invenção é administrada é um membro do gênero Bos, tal como um touro, vaca ou búfalo. Em uma modalidade o ruminante é uma vaca leiteira.

[0019] A presente descrição inclui composições compreendendo células inteiras e/ou um ou mais outros imunogenes. Nas modalidades as composições compreendem células inteiras selecionadas a partir de células inteiras de Escherichia coli (E. coli), Trueperella pyogenes (T. pyogenes), Fusobacterium necrophorum (F. necrophorum) e combinações dos mesmos. Nas modalidades as composições compreendem proteínas selecionadas a partir de F. necrophorum leucotoxina (LKT), adesina fimbrial de tipo 1 de E. coli (FimH), pirolisina de T. pyogenes (PLO), e combinações dos mesmos. Nas modalidades as composições compreendem qualquer combinação das células inteiras e das proteínas. Assim, as composições podem compreender um, dois ou três tipos distintos de bactéria, e/ou uma, duas ou três das proteínas. Nas modalidades, mais do que uma cepa de qualquer tipo de bactéria pode estar incluída na composição veterinária. Tipos adicionais de bactérias e proteínas também podem estar incluídos.

[0020] Qualquer uma das proteínas descritas aqui pode ser isolada a partir da bactéria que produz as proteínas de maneira endógena e, se for desejado, purificada para qualquer grau de pureza. Qualquer uma das proteínas também pode ser reproduzida de maneira recombinante usando técnicas convencionais, tais como através de expressão usando qualquer vetor de expressão adequado e sistema de expressão. As sequências de aminoácido e as sequências de polinucleotídeo que codificam as sequências de aminoácido de cada uma das proteínas descritas aqui são conhecidas na técnica.

[0021] Nas modalidades, a composição compreende um carreador, excipiente ou diluente veterinariamente aceitável tal que a composição é uma composição veterinária. Carreadores, excipientes ou diluentes adequados são conhecidos na técnica. Nas modalidades a composição veterinária funciona como uma vacina.

[0022] As células bacterianas inteiras na composição veterinária podem ser inativadas usando qualquer um de uma variedade de métodos. Bactéria inativada é aquela que foi tratada de forma que eles possuem menos patogenicidade com relação à bactéria que não foi tratada de maneira similar. Nas modalidades a bactéria é inativada tal como pela exposição a um solvente orgânico, um exemplo não limitante disto é a formalina.

[0023] As composições veterinárias também podem compreender quaisquer outros agentes que podem ser esperados de prover um benefício terapêutico e/ou profilático para o recipiente, tal como antibióticos e/ou adjuvantes. Adjuvantes que são adequados para o uso com composições veterinárias são bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, o adjuvante é hidróxido de alumínio. Exemplos não limitantes de outros adjuvantes incluem lipossomas e archaeosomes, sais de cálcio, emulsões de óleo, nanopartículas e micropartículas, saponinas, complexos de estimulação imune, copolímeros de bloco não iônicos, polissacarídeos derivados, proteínas de carreador, produtos bacterianos e seus derivados, derivados de complemento de citocinas 4, e outros. Em certas modalidades, o método pode ser realizado antes, concorrentemente, ou subsequente às abordagens antibacterianas e anti-inflamatórias convencionais, incluindo, mas não limitado a regimes de antibióticos.

[0024] Em uma modalidade, a presente descrição inclui um artigo de manufatura compreendendo embalagem e pelo menos um recipiente vedado. O recipiente vedado pode compreender as composições veterinárias. As composições veterinárias compreendem células inteiras selecionadas a partir de E. coli, T. pyogenes, F. necrophorum e combinações dos mesmos. O recipiente pode compreender proteínas selecionadas a partir de LKT de F. necrophorum, FimH de E. coli, PLO de T. pyogenes, e combinações dos mesmos. Nas modalidades o recipiente inclui qualquer combinação das células inteiras e das proteínas. Nas modalidades, a embalagem pode ter mais do que um recipiente que separadamente contém qualquer um ou qualquer combinação das células e/ou das proteínas. A embalagem compreende material impresso provendo uma indicação que a composição veterinária é para a administração para um ruminante e pode incluir uma descrição de administração subcutânea, e uma indicação de que a administração é para a profilaxia de metrite em um ruminante, e/ou para aprimorar a função reprodutiva do ruminante.

[0025] A descrição provê métodos para fabricar composições veterinárias e artigos de manufatura. O método de fabricação de uma composição veterinária compreende provendo células inteiras de E. coli, e/ou T. pyogenes, e/ou F. necrophorum, e/ou LKT, e/ou FimH, e/ou PLO, e combinando um ou mais destes agentes com um carreador, excipiente e/ou diluente veterinariamente aceitável para prover uma composição veterinária para o uso na profilaxia de metrite e/ou para o uso no aprimoramento da função reprodutiva de um ruminante. Para fazer um artigo de manufatura, as composições veterinárias são colocadas em recipientes adequados e embaladas. A embalagem é feita para incluir material impresso que provê uma indicação de que as composições veterinárias são para o uso na administração subcutânea para a profilaxia de metrite, e/ou para aprimorar a função reprodutiva de ruminantes. O material impresso pode ser parte da embalagem material, ou pode ser um inserto de papel, ou pode ser um rótulo afixado, por exemplo, aos recipientes.

[0026] Em outro aspecto a presente descrição inclui um método de estimulação de uma resposta imune em um ruminante. O método compreende administrar uma composição veterinária descrita aqui para um ruminante. A resposta imune pode compreender uma resposta mediada por célula e/ou humoral. A resposta humoral pode compreender um aumento nas imunoglobulinas específicas para qualquer antígeno expresso pela bactéria, e/ou específica para qualquer uma das proteínas administradas na composição veterinária. Nas modalidades as imunoglobulinas estimuladas são IgG. A resposta imune em certas modalidades provê um efeito profilático contra metrite puerperal. Os termos "Profilaxia" e "profilático" como usados aqui querem dizer inibição pelo menos parcial da formação e/ou persistência de sintomas associados com a doença uterina, e em particular com metrite puerperal.

[0027] Os versados na técnica na técnica serão capazes de determinar, dado o benefício da presente descrição, quando e quão frequentemente se deve administrar as composições e quanto de cada agente imunogênico deve incluir. Em geral, fatores que passarão por esta determinação incluem, mas não estão necessariamente limitados ao tipo, tamanho, idade e saúde geral do ruminante. Nas modalidades, as composições são administradas para o ruminante antes do parto, mas podem ser administradas durante a gravidez ou qualquer momento durante o ciclo de vida.

[0028] Em certas modalidades da presente descrição administração subcutânea de uma composição veterinária para um ruminante diminui um aumento na temperatura retal do ruminante devido a uma infecção bacteriana, com relação à temperatura retal de um ruminante com uma infecção bacteriana, mas a qual as composições veterinárias não são administradas.

[0029] Em uma modalidade, a administração de uma composição veterinária descrita aqui para um ruminante aprimora a função reprodutiva do ruminante. Um aprimoramento na função reprodutiva pode compreender uma redução em um intervalo entre partos - concepção com relação ao intervalo entre partos - concepção em um ruminante ao qual uma composição veterinária não foi administrada.

[0030] Nas modalidades a presente descrição inclui diminuir a incidência de metrite puerperal em um grupo de animais compreendendo administrar uma composição veterinária como descrita aqui de maneira subcutânea para os membros de um grupo de animais tal que a incidência de metrite puerperal no grupo de animais é menor do que se a composição não fosse administrada. Em certas modalidades o grupo de animais é de vacas leiteiras. O grupo de animais pode estar presente, por exemplo, em uma fazenda de leite de qualquer escala, variando de umas poucas vacas leiteiras para uma fazenda leiteira comercial que pode alojar milhares de vacas leiteiras.

[0031] Os seguintes exemplos são apresentados para ilustrar a presente descrição. Eles não estão intencionados a ser limitantes de qualquer maneira.

EXEMPLO 1

[0032] Este exemplo mostra a relação entre fatores de virulência específicos de espécies bacterianas (VFs) presentes no útero a 3 diferentes estágios de lactação (1 a 3, 8 a 10, e 34 a 36 Dias Em leite (DIM)) e a incidência de metrite e endometrite clínica em vacas leiteiras. Os seguintes genes VF foram investigados: plo (piolisina), cbpA (proteína de ligação de colágeno), e fimA (expressão de fímbrias) que são específicos de Arcanobacterium pyogenes (um componente de pelos do tipo 1), Escherichia coli; e IktA (leucotoxina), específico de Fusobacterium necrophorum. Cotonetes uterinos foram coletados a partir de 111 vacas leiteiras no pós- parto. PCR foi usado para detectar a presença de genes plo, cbpA, fimA, fimH e IktA. cbpA de A. pyogenes foi detectado em apenas 5 amostras e, portanto, não foi sujeitado às análises adicionais. E. coli (fimH) está significativamente associada com metrite e endometrite quando detectada de 1 a 3 DIM; F. necrophorum (IktA) está significativamente associada com metrite quando detectada de 1 a 3 e 8 a 12 DIM e com endometrite quando detectada em 34 a 36 DIM; e A. pyogenes (fimA e plo) está associado com metrite (fimA) quando detectada de 1 a 3 DIM e endometrite (fimA e plo) quando detectada de 8 a 10 e 34 a 36 DIM.

[0033] Fazenda, gerenciamento e coleta de amostra. Cotonetes uterinos foram coletados a partir de 111 vacas leiteiras no pós-parto que são alojadas em uma fazenda leiteira comercial localizada próxima de Ithaca, Nova Iorque. Amostras foram coletados a partir de abril de 2010 até junho de 2010. Gerenciamento reprodutivo usa uma combinação de Presynch, Ovsynch, Resynch, e detecção de cio, com 25 a 30% das vacas criadas através de TAI e o restante criado após a detecção do cio somente pelos monitores de atividade (ALPRO; DeLaval, Kansas City, MO). Amostras de secreção uterina foram coletadas a partir de cada vaca três vezes durante o período de estudo (de 1 a 3 DIM, de 8 a 10 DIM, e de 34 a 36 DIM). Dois métodos de coleta de amostra uterinos foram usados: cotonete uterino para a primeira e a segunda amostra e lavagem uterina para a terceira amostra. De 34 a 36 DIM os úteros comumente involuíram e o volume de fluido uterino diminuiu. Assim, neste ponto, a realização da lavagem uterina provavelmente é um melhor modo de amostragem. Adicionalmente, lavagem uterina também foi usada de 34 a 36 DIM para o diagnóstico de endometrite. Cotonetes uterinos foram coletados como na sequência: vacas foram contidas e a área do períneo foi purificada e desinfetada com 70% de etanol. Então, um cotonete estéril (Cotonete de Cultura Uterina de Guarda Dupla Har-Vet™ McCullough, Spring Valley, WI) coberto por uma pipeta estéril (dentro de uma bainha plástica) foi introduzido para a vagina craniana. A pipeta foi manipulada através do colo do útero para o útero, a bainha então foi rompida, e o cotonete foi exposto à secreção uterina. O cotonete foi puxado dentro de uma pipeta e mantido em meio de transporte a 4°C até ser processado no laboratório. Amostras de lavagem uterina foram coletadas. Brevemente, as vacas foram presas e a área do períneo foi limpa e desinfetada com 70% de etanol. Uma pipeta de infusão de plástico (dentro de uma bainha plástica) foi introduzida para a vagina craniana. A bainha subsequentemente foi rompida, e a ponta de pipeta limpa foi manipulada através do colo uterino para o útero. Um total de 40 ml de solução salina estéril foram injetados para o útero, agitado gentilmente, e uma amostra do fluido aspirado. O volume de fluido recuperado variou de 5 a 15 ml. Amostras foram mantidas em gelo antes do processamento em laboratório. Esta proposta de projeto foi revisada e aprovada por Cornell University Institutional Animal Care and Use Committee (# 2011-0111).

[0034] Definição de caso. Metrite puerperal foi definida clinicamente como um útero anormalmente alargado e uma descarga uterina marrom avermelhada, aquosa, fétida, com sinais de doença sistêmica (produção de leite diminuída, embotamento ou outros sinais de toxemia) de 8 a 10 dias após o parto e diagnosticado por um dos veterinários do time de pesquisa. Endometrite clínica de uma amostra uterina de lavagem obtida foi avaliada de 34 a 36 DIM por inspeção visual. Deste modo nós fomos capazes de garantir que sinais de inflamação visíveis (exsudado purulento ou mucopurulento) emanado a partir do útero, em vez de a partir de outro local. Todas as amostras de lavagem uterina foram pontuadas visualmente por um investigador, que avalia a presença de uma secreção purulenta ou mucopurulenta na amostra de lavagem uterina. A pontuação varia de 0 a 2, com 0 indicando a ausência de uma secreção purulenta ou mucopurulenta na amostra de lavagem, 1 indicando uma amostra de sangue, mas não purulenta, e 2 a presença de pus na amostra de lavagem. Vacas com uma pontuação de 2 foram considerados como diagnóstico com endometrite clínica. Pontuações de condição de corpo foram gravadas no momento de cada lavagem uterina usando uma escala de cinco pontos com um sistema de quarto de ponto. Adicionalmente, partos registrados de fazenda facilmente pontuam 1 a 5 (1 e 2 foram partos não auxiliados e 3 a 5 foram partos auxiliados com grau crescente de dificuldade), parto natimorto, e incidência de placenta retida foram usados como fatores de risco.

[0035] Extração de DNA, PCR, eletroforese de gel e sequenciamento. Amostras de cotonete foram imersas em 1 ml de solução salina tamponada por fosfato (PBS) em um tubo Falcon de 15 mL e agitadas em turbilhão para dispersar qualquer muco, bactéria, células, ou meio de cultura de transporte. O isolamento de DNA total foi realizado a partir de 400 μl da suspensão através do uso de um minikit de DNA QIAmp (Qiagen, Santa Clara, CA) de acordo com as instruções do fabricante para a purificação de DNA a partir de sangue e fluidos corporais. Algumas modificações convenientes, tais como a adição de 400μg de lisozima e a incubação por 12h a 56°C, foram incubadas para maximizar a extração de DNA bacteriano. O DNA total foi eluído em 100 μl de água livre de DNase/RNase estéril (Promega, Madison, WI). A concentração de DNA e a pureza foram avaliadas por densidade óptica usando o espectrofotômetro Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies, Rockland, DE).

[0036] PCR foi usado para a ampliação de partes de genes de VFs específicas. Dentre os genes de VF que contribuem para o potencial patogênico de A. pyogenes, três foram amplificados: plo, cbpA e fimA. Para categorizar E. coli, o gene fimH foi escolhido. O gene de leucotoxina (IktA), que parece ser único para F. necrophorum, foi usado como aquele VF da bactéria. Detalhes com relação às sequências iniciadoras, temperaturas de cozimento, e tamanhos de ampliação podem ser encontrados na Tabela 1. A presença de genes de VF de A. pyogenes, E. coli e F. necrophorum conhecidos ou putativos foi avaliada de maneira independente. Parâmetros de ciclo térmico foram ajustados de acordo com a maior sequência, como descrito na Tabela 1. Todas as reações foram realizadas em um volume de 25 μl usando 24 μl de 1 x Green GoTaq Master Mix (feito de 2xGreen GoTaq Master Mix que consiste de Green GoTaqReaction Buffer, 400 μM dATP, 400 μM dGTP, 400μM dCTP, 400 μM dTTP, e 3 mMMgCh; Promega Corp., Madison, WI) e iniciadores, e 1 μl de extrato de DNA. Todos os protocolos de ciclos térmicos foram realizados em um 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA). Controles negativos que consistem de mistura de PCR sem DNA foram incluídos em todas as corridas de PCR. Produtos de amplificação foram separados por eletroforese através de um gel de agarose de 1,2% (peso/vol), corado com brometo de etídio 0,5 μg/ml, e visualizado com um Sistema de Formação de Imagem Kodak Gel Logic 100 (GL 100, Scientific Imaging Systems, Eastman Kodak Co., New Haven, CT). Resultados positivos foram considerados como sendo ampliações do tamanho molecular esperado. Tabela 1. Iniciadores de PCR e condições de reação usadas para amplificar sequências de gene de fator de virulência.

[0037] Para confirmar a origem dos produtos de PCR, uma amostra aleatória de 5 amostras positivas de PCR a partir de cada um dos genes fimH, plo, fimA, e Ikta foi purificado e submetido ao sequenciamento. As sequências obtidas foram comparadas com as sequências em GenBank usando o algoritmo de BLAST. Todas as sequências corresponderam com os seus respectivos genes com uma identidade de sequência > 98%.

[0038] Análise estatística. Vacas foram dicotomizadas várias vezes para VF positivo (1) ou VF negativo (0). Para avaliar a relação entre a presença de gene VF e as chances de metrite e endometrite clínica, dois modelos de regressão logística de múltiplas variáveis foram ajustados aos dados; variáveis dependentes foram metrite (sim - não) e endometrite clínica (sim - não). As variáveis independentes oferecidas para os modelos foram: parto assistido (pontuação de facilidade de parto > 3), placenta retida, grupo de paridade (1, 2, >3), pontuação de condição de corpo, e YFsfimH, plo, fimA, e IktA em DIM de 1 a 3, 8 a 10, e 34 a 36. Todos os possíveis termos de interação de dois sentidos foram adicionados ao modelo. As variáveis foram manualmente e gradualmente removidas a partir dos modelos em ordem descendente de valor de P (eliminação para trás). Significância estatística foi considerada quando um P < 0,05 foi observado. Outro conjunto de regressões logísticas de múltiplas variáveis foram realizadas para avaliar a associação entre fatores de risco (parto assistido, placenta retida, paridade, pontuação de condição corporal), e os VFs anteriores que foram significativamente associados com doença uterina.

[0039] Análise de sobrevivência de Kaplan-Meier foi realizada para avaliar a associação de genes VF (plo, cbpA, fimA, fimH e IktA) com o desempenho reprodutor usando Medcalc versão 10,4.0.0 (Mariakerke, Bélgica); o teste de Logrank foi usado para computar valores P. A variável da série de tempo para este modelo foi o intervalo entre partos - concepção ou dias desde o parto até o fim do período de acompanhamento; o período de acompanhamento mínimo foi de 150 e o máximo foi de 250. Significância estatística foi considerada quando P < 0,05 foi observado.

[0040] Os seguintes resultados foram obtidos usando os materiais e métodos descritos acima.

[0041] Estatística descritiva. Um total de 111 vacas de Holstein foram usadas neste estudo, das quais 56 (50,4%) foram primíparas, 34 (30,6%) foram de segunda paridade, e 21 (18,9%) foram de terceira paridade ou maior. O cbpA de VF de A. pyogenes não foi identificado em primeira amostragem (1 a 3 DIM), e 2 e 3 vacas foram identificadas de 8 a 10, e 34 a 36 DIM, respectivamente. Por causa da sua baixa prevalência cbpA de VF foi excluído a partir de todas as análises de associação de doença. fimA e plo de VFs de A. pyogenes foram predominantes em todas as 3 diferentes amostragens (1 a 3, 8 a 10, e 34 a 36 DIM) e a maior predominância foi observada de 8 a 10 DIM (Figura 1). O VF mais predominante foi IktA de VF de F. necrophorum, que codifica uma exotoxina (leucotoxina). YFfimH de E. coli também foi detectado em todos os 3 períodos de amostragem, sendo o mais predominante de 8 a 10 DIM (Figura 1). A incidência total de metrite nesta população de estudo foi de 40,5%, e a prevalência de endometrite clínica diagnosticada de 34 a 36 DIM foi de 19,8%.

[0042] A associação de fatores de virulência específicos de espécies bacterianas e a prevalência de metrite. Duas variáveis foram descobertas como afetando de maneira significativa (P < 0,05) a prevalência de metrite: presença de fimH de E. coli de 1 a 3 DIM e IktA de F. necrophorum diagnosticado de 8 a 10 DIM (Tabela 2). Vacas contaminadas com E. coli positiva para fimH tiveram chances 4,7 vezes maiores de desenvolver metrite se comparadas com vacas com fimH negativo (valor de P < 0,001). IktA de VF de F. necrophorum foi o único VF detectado de 8 a 10 DIM que está significativamente associado com metrite; prevalência de metrite foi de 54,1% para vacas positivas para IktA e 24% para vacas negativas para IktA (Tabela 2).Tabela 2. Fatores de risco com um efeito significativo nas chances de metrite diagnosticada de 8 a 10 DIM.

[0043] A associação de fatores de virulência específicos de espécies bacterianas e a prevalência de endometrite clínica. Três variáveis foram descobertas como afetando de maneira significativa (P < 0,05) a prevalência de metrite: presença de fimH de E. coli de 1 a 3 DIM e fimA de A. pyogenes diagnosticado de 8 a 10 e 34 a 36 DIM (Tabela 3). YFfimH de E. coli foi associado com uma prevalência de endometrite significativamente aumentada apenas quando detectada na primeira coleta de amostra (DIM 1 a 3); a prevalência de endometrite foi de 38,1% e 15,6% para vacas de fimH positivo e negativo, respectivamente (valor P < 0,01). fimA de Arcanobacterium pyogenes foi bastante associado com endometrite clínica quando detectado de 8 a 10 e 34 a 36 dias após o parto; as vacas que foram positivas para fimA de 34 a 36 DIM tiveram 8,8 vezes mais chances de endometrite clínica se comparadas com vacas negativas. Tabela 3. Fatores de risco com um efeito significativo nas chances de endometrite clínica diagnosticada de 34 a 36 DIM

[0044] Fatores de risco para fimH de 1 a 3 DIM, fimA de 8 a 10 e 34 a 36 DIM, e IktA de 8 a 10 DIM. Resultados com relação aos fatores de risco com um efeito significativo na prevalência de VFs específicos (fimH de 1 a 3 DIM, fimA de 8 a 10 e 34 a 36 DIM, e IktA de 8 a 10 DIM) são apresentados na Tabela 4. Vacas com uma placenta retida tiveram 44,8 vezes mais chances de ser contaminadas com E. coli positiva para fimH se comparadas com vacas sem uma placenta retida e este foi o efeito mais forte observado. Tabela 4. Resultados de 4 diferentes modelos de regressão logística de múltiplas variáveis que avaliaram a associação de vários fatores de risco com as chances de prevalência de fimH de fatores de virulência (1 a 3 DIM), fimA (8 a 10 DIM), fimA (34 a 36 DIM), e IktA (8 a 10 DIM).

[0045] A associação de fatores de virulência específicos de espécies bacterianas com desempenho reprodutor. O único VF significativamente associado com desempenho reprodutor foi fimH de 1 a 3 DIM; vacas que foram positivas para fimH na primeira amostragem foram 2,1 vezes mais prováveis de ser confirmadas grávidas quando comparado com vacas com fimH negativo (P < 0,01, Figura 2). Como será aparente a partir do dito anteriormente, neste exemplo, a presença de E. coli portando fimH de 1 a 3 DIM foi bastante associada com metrite e endometrite clínica. No entanto, E. coli não foi associada com doenças uterinas quando detectada em estágios posteriores de lactação (8 a 10 e 34 a 36 DIM), sugerindo que E. coli provavelmente está dentre a primeira bactéria a colonizar o ambiente intrauterino, potencialmente induzindo alterações que vão favorecer a colonização futura por bactéria anaeróbia estrita (F. necrophorum) e facultativa (A. pyogenes) que por último vai causar sinais clínicos de doença uterina. E. coli patogênica intrauterina (IUPEC) possui um arsenal de VFs (fimH, hlyA, cdt, kpsMII, ibeA e astA) associado com E. coli patogênica extraintestinal (ExPEC). Dos seis VFs associados com metrite e endometrite, fimH foi o mais significativo por causa da sua alta prevalência e forte associação com doenças uterinas e falha reprodutiva.

[0046] fimH é uma adesina (de pelos do tipo 1) que pertence a uma família de proteínas envolvida em aderência de bactérias para vários alvos, incluindo células de mamífero hospedeiras. Resultados a partir de um estudo anterior mostraram que E. coli clone isolada a partir de vacas com metrite foram mais aderentes a e invasivas para células endometrial, epitelial e estromal do que foram bactéria clone isolada a partir de animais clinicamente inafetados. Outro estudo também concluiu que a bactéria tem falta de genes de patogenicidade tipicamente associados com virulência em E. coli - eles avaliaram 17 genes VF e nenhum foi encontrado como associado com doença uterina.

[0047] Neste exemplo, vacas com fimH positivo de 1 a 3 DIM tiveram 16,2 vezes mais propensão de desenvolver contaminação intrauterina por F. necrophorum de 8 a 10 DIM. Estas descobertas suportam a noção que estabelecimento e persistência de infecção uterina por F. necrophorum e outra bactéria anaeróbia gram negativa é influenciada pela presença de um ambiente intrauterino adequado estabelecido por uma infecção de E. coli anterior. Adicionalmente, no presente estudo, a presença de E. coli portando fimH de 8 a 10 ou 34 a 36 DIM não foi associada com metrite, endometrite clínica ou falha reprodutiva. De fato, vacas com fimH positivo de 8 a 10 DIM tiveram uma incidência numericamente inferior de metrite (32,1 %) quando comparada com vacas com fimH negativo (43,4%). Este fato destaca a etiologia multifatorial de doenças uterinas pós-parto e a hipótese de que a população microbiana intrauterina varia enquanto vacas avançam para a sua lactação. Mais de 90% das vacas com fimH positivo de 1 a 3 DIM foram contaminadas com F. necrophorum uma semana posterior e a presença de F. necrophorum foi um fator de risco importante para a aparência de A. pyogenes.

[0048] Amostras coletadas de 8 a 10 DIM apresentam a prevalência bacteriana mais alta comparada com os outros dois estágios de lactação - pelo menos um VF estava presente em 71% das vacas. De maneira interessante, A. pyogenes e F. necrophorum foram descobertos como predominantes nas amostras a partir do segundo período de coleta. De 8 a 10 DIM o IktA de VF foi o único VF bastante associado com metrite: a prevalência de metrite foi de 54,1% para vacas positivas para F. necrophorum e 24% para as vacas negativas.

[0049] Neste exemplo, contaminação uterina por F. necrophorum e A. pyogenes foi descoberta como sendo mais alta no segundo e no terceiro períodos de amostragem, respectivamente, em vacas que precisam de auxílio durante o parto. Tanto A. pyogenes quanto F. necrophorum foram bastante associados com endometrite clínica quando detectados no terceiro período de amostragem (DIM 34 a 36) no estudo neste exemplo.

[0050] Neste exemplo, placenta retida aumenta as chances de contaminação intrauterina por E. coli positiva para fimH por 44,8 vezes. Adicionalmente, as vacas que tiveram parto assistido tiveram maior risco de contaminação por F. necrophorum e A. pyogenes. Assim, doença uterina é influenciada por eventos de parto e contaminação bacteriana ambiental desempenha um papel importante.

[0051] Este exemplo provê evidencia de que a etiologia de bactéria de doenças uterinas pós-parto é dinâmica e multifatorial, com uma contribuição significativa de pelo menos três diferentes bactérias: Escherichia coli, Fusobacterium necrophorum, e Arcanobacterium pyogenes.

[0052] Finalmente, vacas que foram positivas para fimH na primeira amostragem (DIM 1 a 3) foram 2,1 vezes menos prováveis para se tornar grávidas comparadas com vacas com fimH negativo; fimH foi o único VF gene associado significativamente com desempenho reprodutor reduzido.

[0053] O fimH específico de E. coli e os genes VF de IktA específicos de F. necrophorum foram significativamente associados com uma maior prevalência de metrite quando detectada em 1 a 3 e 8 a 10 DIM, respectivamente. Os genes VF de fimH específicos de E. coli e de fimA específicos de A. pyogenes foram associados de maneira significativa com endometrite clínica quando detectados de 1 a 3 dias (fimH) e de 8 a 10 e 34 a 36 (fimA) DIM.

EXEMPLO 2

[0054] Neste exemplo, a eficácia de cinco formulações de vacina contendo diferentes combinações de proteínas (FimH; leucotoxina, LKT; e piolisina, PLO) e/ou células inteiras inativadas (Escherichia coli, Fusobacterium necrophorum, e Trueperella pyogenes) para a profilaxia de doenças uterinas pós-parto foi estudada. Nossa expectativa inicial foi que imunização pré-parto contra antígenos relevantes para doenças uterinas pós- parto pode evitar a ocorrência de metrite puerperal e endometrite.

[0055] Como descrito adicionalmente abaixo, células inteiras inativadas foram produzidas usando duas cepas geneticamente distintas de cada espécie de bactéria (E. coli, F. necrophorum, e T. pyogenes). Subunidades de FimH e PLO foram produzidas usando expressão de proteína recombinante, e LKT foi recuperado a partir de cultura de uma cepa de F. necrophorum selvagem. Três vacinas subcutâneas foram formuladas: Vacina 1 foi composta de células inteiras de bactéria inativadas e proteínas; Vacina 2 foi composta de proteínas apenas; e Vacina 3 foi composta de células inteiras de bactéria inativadas apenas. Duas vacinas intravaginais foram formuladas: Vacina 4 foi composta de células inteiras de bactéria inativadas e proteínas; e Vacina 5 foi composta de PLO e LKT. Para avaliar a eficácia de vacina, uma tentativa clínica aleatória foi conduzida em uma fazenda leiteira comercial; 371 novilhos de primavera foram alocados de maneira aleatória em um dos seis diferentes grupos de tratamento: controle, Vacina 1, Vacina 2, Vacina 3, Vacina 4 e Vacina 5. Novilhas grávidas mais tarde designadas para um dos grupos de vacina foram cada uma vacinada duas vezes: em 230 dias e em 260 dias de gravidez. Quando as vacinas foram avaliadas e agrupadas como subcutânea e intravaginal, as subcutâneas foram descobertas como reduzindo de maneira significativa a incidência de metrite puerperal. Adicionalmente, vacinação subcutânea reduziu de maneira significativa a temperatura retal em 6 + 1 dias em leite. Desempenho reprodutor foi aprimorado para vacas que receberam vacinas subcutâneas. Em geral, vacinação induziu um aumento significativo nas titulações de soro IgG contra todos os antígenos, com vacinação subcutânea novamente sendo mais eficaz. Em conclusão, vacinação subcutânea com componentes bacterianos inativados e/ou subunidades de proteína de E. coli, F. necrophorum e T. pyogenes podem evitar metrite puerperal com sucesso durante a primeira lactação de vacas leiteiras, levando a desempenho reprodutor aprimorado.

[0056] Materiais e Métodos. Componentes bacterianos inativados. Cepas de E. coli 4612- 2 e 12714-2 foram usadas para este Exemplo. Cepas foram cultivadas de maneira aeróbia em caldo de Luria-Bertani (LB) (Sigma- Aldrich) a 37°C. Elas foram inoculadas com 1% de uma cultura durante a noite e crescida em 800 ml de meio, com agitação (150 rpm). Para a cepa 12714-2, células foram coletadas a 4 h, com OD600 de 0,432 e 1,0 x 109 CFU/ml; para a cepa 4612-2, células foram coletadas a 3,5 h, OD600 de 0,473 e 1,2 x 109 CFU/ml. As culturas foram inativadas com 0,1 % de formalina por 12 horas, e as células foram concentradas 4 vezes (volume final de 200 ml), então 0,25 ml de cada cepa pode estar presente na formulação de vacina final, com aproximadamente 109 CFU por dose.

[0057] Cepas 10481-8 e 6375-1 de Trueperella pyogenes foram isoladas a partir do lúmen uterino de vacas leiteiras. Cepas foram crescidas em VersaTREK REDOX 1 (Trek Diagnostic Systems, OH) em 7% de CO2 a 37°C. Células foram coletadas a 48 h, com 1,3 x 108 e 0,5 x 108 CFU/ml para as cepas 10481-8 e 6375-1, respectivamente. As culturas foram inativadas com 0,1% de formalina por 12 h, e 1 ml de cada cepa foi adicionado à formulação de vacina final, com aproximadamente 108 CFU por dose.

[0058] Cepas 5663 e 513 de Fusobacterium necrophorum foram isoladas a partir do lúmen uterino de vacas leiteiras. Cepas foram crescidas em VersaTREK REDOX 2 (Trek Diagnostic Systems, OH) de maneira anaeróbia a 37°C. Todas as culturas foram inativadas com 0,1% de formalina por 12 h antes de as células serem concentradas. Células foram coletadas a 12 h, com 1,6 x 1012 e 1.8 x 1012 CFU/ml para as cepas 513 e 5663, respectivamente. As culturas foram inativadas com 0,1% de formalina por 12 h, e 0,01 ml de cada cepa foi adicionado à formulação de vacina final, com aproximadamente 1010 CFU por dose.

[0059] Expressão de proteína recombinante e purificação. Condições de indução e crescimento de cepa bacteriana. E. coli TOP 10 (Invitrogen, NY) foi crescida tanto em ágar de LB ou em caldo de LB (Sigma-Aldrich, MO) a 37°C. Ampicilina (50 μg/ml) foi adicionada como apropriado. T. pyogenes 49698 (American Type Culture Collection, VA) foi crescido em ágar de infusão de cérebro e coração (BHI) ou em caldo de BHI (BD BBL, MD) suplementado com 5% de sangue de cavalo desfibrinado a 37°C e 7% CO2.

[0060] Para a preparação de proteínas marcadas com His (His-PLO ou FimH1-156-His), culturas de E. coli apropriadas foram crescidas a 37°C com agitação (200 rpm) para uma densidade óptica a 600 nm de -0,6. Neste ponto, isopropil 1-tio-β-D-galactopiranosida (IPTG; Sigma) foi adicionado às culturas para 1 mM, que foram adicionalmente incubadas com agitação por pelo menos 3 h.

[0061] Manipulação de DNA e construtos. Procedimentos padrão para transformação de E. coli e extração de plasmídeo, restrição de DNA, ligação, e eletroforese de gel de agarose foram realizados. Iniciadores foram sintetizados por IDT, e PCRs foram realizados em um GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, CA). Para confirmar que nenhuma mutação foi introduzida por PCR, todos os construtos de DNA foram sequenciados usando um sequenciador de DNA automatizado (Cornell Biotechnology Resource Center, NY) e analisados usando software de LaserGene (DNASTAR, WI).

[0062] Clonagem e purificação de His-PLO recombinante. O gene PLO, que não possui a região de codificação para a sequência de sinal prevista, foi amplificado a partir de DNA genômico ATCC49698 de A. pyogenes por PCR com um iniciador 5’ contendo um sítio XhoI (5'- ACAGCATCCTCGAGTGCCGGATTGGGAAAC-3' (SEQ ID NO: 11)) e um iniciador 3’ contendo um sítio EcoRI (5’- TGGAATTCCCTAGGATTTGACATTGT-3 ' (SEQ ID NO: 12)). A reação de 50 μl contém 1x tampão de amplificação de Pfx (Invitrogen) com 1 mM MgSO4 (Invitrogen, NY), 0,3 mM de cada dNTP, 0,3 μM de cada iniciador, 1 U de Platinum Pfx DNA polimerase (Invitrogen, NY), e aproximadamente 50 ng de DNA matriz. Os parâmetros de ciclo para a amplificação foram: desnaturação inicial por 5 minutos a 94°C, seguido por 30 ciclo de desnaturação (94°C por 1 minuto), recozimento (58°C por 1 min), extensão (72°C por 3 min), e uma extensão final a 72°C por 7 min. A ampliação de 1,5 kb foi digerida com XhoI-EcoRI e clonada para pTrcHisB digerida por XhoI- EcoRI (Invitrogen, NY).

[0063] Após 3 horas de indução, as células foram coletadas por centrifugação a 10.000 x g por 10 minutos e o glóbulo foi ressuspenso em 1 X Tampão de Extração/Lavagem (fosfato de sódio 50 mM, NaCl 300 mM) (pH 7,0). Lisozima foi adicionada a uma concentração final de 0,75 mg/ml e a mistura foi incubada a 4°C com agitação por 30 minutos. As células foram rompidas por duas passagens através de uma célula de pressão French (Amicon) a 20.000 psi (138 Mpa), e o material insolúvel foi removido por centrifugação a 12.000 x g por 30 minutos. His-PLO foi purificado a partir da fração solúvel com resina de afinidade de metal TALON (Clontech, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Fração de proteína pura isolada foi concentrada usando um sistema de concentração/dessalinização de fibra usando um filtro com uma exclusão de peso molecular de 10 kDa (Amicon ultra 100K, Millipore, MA) e sujeitado a SDS-PAGE (15%) usando o sistema de eletroforese Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Rad, CA), seguindo protocolos padrão. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford.

[0064] Um total de 30 litros de cultura foi crescido para produzir um total de 321,24 mg de His-PLO. O volume final de His-PLO foi de 41 ml e a concentração final foi de 7,83 mg/ml.

[0065] Clonagem e purificação de FimH1-156-His recombinante. A porção do gene fimH que codifica o peptídeo de sinal e os primeiros 156 aminoácidos (o domínio de lectina de ligação de manose, LD) da proteína madura foi amplificado a partir do plasmídeo pET-22b(+)-F3-LD, provido por Dr. Evgeni Sokurenko, University of Washington, WA. O iniciador 5’ usado contém um sitio BamHI (5'-CGCGGATCCATGAAACGTGTTATTACCCTG-3' (SEQ ID NO: 13)) e o iniciador 3' contém um sítio HindIII (5'- CCCAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGATGGCCGCCAGTAGGC ACCAC-3 ' (SEQ ID NO: 14)) e um marcador de histidina seis seguindo a sequência autêntica da proteína. Os componentes de PCR foram como descritos para amplificação de gene PLO. Os parâmetros de ciclo para a amplificação foram: desnaturação inicial por 5 min a 94°C, seguido por 25 ciclos de desnaturação (94°C por 1 min), recozimento (61°C por 1 min), extensão (72°C por 3 min), e uma extensão final a 72°C por 7 min. A ampliação, aproximadamente de 0,6 kb, foi digerida com BamHI-HindIII e clonado para pTrcHisA digerido por BamHI-HindIII (Invitrogen). Após 5 h de indução, purificação de FimH1-156-His foi realizada como descrito por PLO.

[0066] Um total de 92 litros de cultura foi crescido para produzir 216,34 mg de FimH1-156-His. O volume final de FimH1-156-His foi de 172,5 ml e a concentração foi de 1,25 mg/ml.

[0067] Sobrenadante concentrado de cultura e purificação de afinidade de Leucotoxina. Cepa 6586 de F. necrophorum foi crescida em VersaTREK REDOX 2 por 12 h de maneira anaeróbia a 37 °C. O sobrenadante de cultura foi concentrado a 4°C em um sistema de concentração/dessalinização de fibra oca usando um filtro com uma exclusão de peso molecular de 100 kDa (Amicon ultra 100K, Millipore, MA). Purificação por afinidade de LKT foi realizada para avaliar a concentração de LKT no sobrenadante concentrado de cultura 6586 de F. necrophorum. Brevemente, mAb F7B10 purificado (3,5 mg) foi acoplado com 5 ml de suporte de afinidade Affi-Gel 10 (Bio-Rad, CA) e empacotado por uma coluna de 1 x 20 cm. O sobrenadante concentrado de cultura 6586 de F. necrophorum foi aplicado à coluna, e materiais não ligantes foram removidos passando 15 mL de NaCl 0,5 M em PBS através da coluna. LKT purificado foi eluído com 0,2 M de glicina-HCl (pH 3,0), imediatamente neutralizado com NaOH, e lavado e concentrado usando um Amicon ultra 10K. a pureza da toxina foi determinada por SDS-PAGE.

[0068] Um total de 10 L de F. necrophorum 6586 foi crescida para produzir 220 mL de sobrenadante concentrado contendo 0,186 mg/ml de LKT. A presença e a concentração de LKT no sobrenadante concentrado foi determinada por purificação por afinidade.

[0069] Formulação da Vacina. Cinco diferentes formulações de vacina foram feitas: três vacinas subcutâneas (Vacinas 1 a 3) e duas vacinas intravaginais (Vacina 4-5). Vacina 1 foi composta de células inteiras de bactéria inativadas (E. coli, T. pyogenes e F. necrophorum) e proteínas (FimH, PLO e LKT); Vacina 2 foi composta apenas de proteínas (FimH, PLO e LKT); e Vacina 3 foi composta apenas de células inteiras de bactéria inativadas (E. coli, T. pyogenes e F. necrophorum). Vacina 4 foi composta de células inteiras de bactéria inativadas (E. coli, T. pyogenes e F. necrophorum) e proteínas (FimH, PLO e LKT), e Vacina 5 foi composta apenas de proteínas (PLO e LKT). O adjuvante para as vacinas subcutâneas foi de hidróxido de alumínio (Rehydragel HPA, General Chemical, NJ). O adjuvante volume usado nas vacinas subcutâneas foi de 25% do volume de vacina final. Hidróxido de alumínio foi adicionado a cada componente separadamente, e foi agitado gentilmente durante a noite. O adjuvante para as vacinas intravaginais foi de 20 μg/dose de toxina da cólera (List Biological Laboratories, Inc., CA).

[0070] Todos os componentes da vacina foram testados para a esterilidade antes da vacina final ser montada e engarrafada. A esterilidade foi avaliada por cultivo de 100 μl de componente de vacina de maneira aeróbia em caldo de LB, de maneira aeróbia em 7% de CO2 em VersaTREK REDOX 1 e de maneira anaeróbia em VersaTREK REDOX 2 a 37°C por 48 h. Componentes foram considerados contaminados se existe crescimento bacteriano em qualquer um dos três meios de cultura pelo fim do período de incubação.

[0071] Avaliação dos níveis de endotoxina foi realizada usando o Ensaio de Ponto Final de LAL (Hycult Biotech, Holanda) seguindo as instruções do fabricante. Todas as formulações de vacina tiveram níveis de endotoxina abaixo de 105 EU/ml.

[0072] Fazenda e gerenciamento. A tentativa de campo foi conduzida em uma fazenda leiteira comercial localizada próxima de Ithaca, Nova Iorque. As vacas foram inscritas a partir de 24 de maio de 2012 até 16 de agosto de 2012; o período de acompanhamento continuou até 30 de abril de 2013. Esta fazenda foi selecionada por causa da sua longa relação de trabalho com a Clínica de Medicina de Produção e Ambulatória em Cornell University. O protocolo de pesquisa foi revisado e aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee de Cornell University (Número de protocolo: 20110111). A fazenda ordenhou 3.300 vacas Holstein 3 vezes ao dia em um salão de ordenha paralelo de 52 tendas duplas. As vacas foram alojadas em celeiros livres com tendas de concreto cobertas com colchões e incorporadas com sólidos de adubo. Todas as vacas foram oferecidas uma razão misturada total (TMR) que consiste de aproximadamente 55% de forragem (silagem de milho, ensilagem, e palha de trigo) e 45% de concentrado (fubá, farelo de soja, canola, semente de algodão, e polpa cítrica) em uma base de matéria seca da dieta. A dieta foi formulada para satisfazer ou exceder os requisitos nutrientes de NRC para lactação de vacas Holstein que pesam 650 kg e produzem 45 kg de leite corrigido com 3,5% de gordura. O gerenciamento reprodutivo usou uma combinação de Presynch, Ovsynch, Resynch, e detecção de estro, com 25% a 30% de vacas criadas através de inseminação artificial temporizada e o restante criado após a detecção de estro somente por monitores de atividade (ALPRO; DeLaval, Kansas City, MO).

[0073] Grupos de tratamento e definição de caso. Novilhas grávidas mais tarde foram inscritas em uma base semanal; critérios de inclusão para a inscrição foram: 230 + 3 dias de gravidez, 629 a 734 dias de idade e pontuação de condição corporal (BCS) maior do que 2,5. Novilhas que estavam visualmente mal não foram incluídas no estudo. Um projeto de estudo de tentativa de campo aleatório total foi usado; novilhas foram alocadas de maneira aleatória em um de seis diferentes grupos de tratamento usando a função de número aleatório de Excel (Microsoft, Redmond, MA). Um total de 371 novilhas grávidas foram inscritas no estudo; 105, 54, 54, 53, 53 e 53 novilhas foram alocadas de maneira aleatória aos grupos controle, Vacina 1, Vacina 2, Vacina 3, Vacina 4 e Vacina 5, respectivamente. Novilhas designadas para os grupos de vacina receberam duas doses de vacina: a 230 + 3 dias de gravidez e 260 + 3 dias de gravidez.

[0074] Pontuações de condição de corpo foram determinadas para todas as vacas do estudo a 230 + 3 dias de gestação, 260 + 3 dias de gestação, 2 + 1 dias em leite (DIM), 6 + 1 DIM e a 35 + 3 DIM por um único investigador que não conhecida o tratamento de grupo usando uma escala de cinco pontos com um sistema de quarto de ponto. Para obter amostras de soro, sangue foi coletado a partir de uma veia do cóccix/artéria usando um tubo Vacutainer sem anticoagulante e uma agulha de calibre 20 x 2,54 cm de Vacutainer (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). Todas as amostras de sangue foram transportadas para o laboratório em gelo e fiadas em uma centrifuga a 2.000 x g por 15 minutos a 4°C; soro foi coletado e congelado a - 80°C. Amostras de soro foram coletadas a 230 + 3 dias de gestação, 260 + 3 dias de gestação, 1 + 2 DIM, 6 ±1 DIM e 35 + 3 DIM.

[0075] Cotonetes cervicais foram coletados a 2 + 1 DIM e 6 + 1 DIM; vacas foram presos e a área do períneo foi limpa e desinfetada com 70% de solução de etanol. O cotonete foi manipulado dentro do colo do útero e exposto à secreção uterina. Os cotonetes foram mantidos dentro de um frasco estéril a 4°C até ser processado no laboratório. Cotonetes coletados a 2 ± 1 DIM foram cultivados de maneira aeróbia em Chromagar (Difco) a 37°C e colônias de E. coli foram distintas por uma cor azul; cotonetes coletados a 6 ± 1 DIM foram cultivados de maneira anaeróbia em ágar LKV (Anaerobe Systems) e colônias de F. necrophorum foram distintas por morfologia.

[0076] Placenta retida, metrite puerperal, cetose, e mastite clínica foram diagnosticados e tratados por pessoal de fazenda treinado que segue um protocolo de diagnóstico específico projetado por veterinários a partir da Clínica de Medição de Produção e Ambulatório, Cornell University. Pessoal da fazenda não conhecia os tratamentos.

[0077] Após o parto, as vacas foram mantidas no mesmo curral por cerca de 20 DIM. Este curral foi monitorado de maneira intensiva por empregados da fazenda, e as vacas foram submetidas para um exame físico completo se eles estivessem mostrando sinais de embotamento e depressão; vacas com descarga uterina marrom avermelhada, aquosa, fétida acompanhada com febre foram diagnosticadas com metrite puerperal e tratadas por empregados de fazenda. Placenta retida foi definida como uma condição em que as vacas falharam em liberar as suas membranas fetais dentro de 24 h do parto. Diagnóstico de metrite puerperal pelo time de pesquisa foi realizado a 6 + 1 DIM. Metrite puerperal foi definida como a presença de descarga uterina marrom avermelhada, aquosa, fétida e temperatura retal maior do que 39,5°C. Informação com relação ao diagnóstico de metrite puerperal não foi trocada entre pessoal da fazenda e o time de pesquisa. Dados com relação às características de saúde e reprodução foram extraídos a partir da base de dados DairyComp 305® da fazenda (Valley Agricultural Software, Tulare, CA).

[0078] Diagnóstico de endometrite clínica foi avaliado a 35 + 3 DIM por inspeção visual da amostra de lavagem uterina para a presença de secreção purulenta. Para obter amostras de lavagem uterina, as vacas foram presas, a área do períneo foi limpa e desinfetada com 70% de etanol, e uma pipeta de infusão de plástico foi introduzida para a vagina craniana e manipulada através do colo uterino para o útero. Um total de 20 ml de solução salina estéril foi infundido para o útero e agitado gentilmente, e uma amostra do fluido foi aspirada. O volume de fluido recuperado variou de 5 a 15 ml. Todas as amostras foram pontuadas visualmente por um investigador, que avalia a presença de uma secreção purulenta ou mucopurulenta na amostra de lavagem uterina. A pontuação varia de 0 a 2, com 0 indicando a ausência de uma secreção purulenta ou mucopurulenta, 1 indicando uma amostra com sangue, mas não purulenta, e 2 indicando a presença de pus na amostra de lavagem. Vacas com uma pontuação de 2 foram consideradas como diagnosticadas com endometrite clínica. Amostras foram mantidas em gelo até que foram cultivadas em placas de ágar de Mueller-Hinton (BBL™) suplementado com 5% de sangue de ovelha desfibrinado por 48 h de maneira aeróbia em 5% de CO2 a 38°C. Colônias de T. pyogenes típicas foram distintas por morfologia de colônia, hemólise de pós-incubação, e aparência característica na cepa Gram.

[0079] Ensaios de imunossorvente ligado por enzima (ELISAs). Porções de antígenos produzidos para a preparação de vacinas foram usados em ELISAs. Cepas de E. coli foram agrupadas como um único antígeno. O mesmo foi feito para cepas de F. necrophorum e T. pyogenes.

[0080] Amostras de soro bovino foram descongeladas e misturadas antes da análise. Os protocolos de ELISA selecionados foram como na sequência. Placas de microtitulação de ELISA (Greiner Bio-One, Alemanha) foram revestidas com PBS (Solução salina tamponada por fosfato 10X, pH 7,4, Ambion®) contendo tanto 0,295 μg/ml de FimH1-156-His, 0,036 μg/ml de His-PLO, 0,186 μg/ml de LKT, 107 células/ml de E. coli, 10 células/ml de F. necrophorum, e 10 células/ml de T. pyogenes para ensaios de IgG anti-FimH, anti-LKT, anti-PLO, anti-E. coli, anti-F. necrophorum, e anti-A. pyogenes, respectivamente. A ligação de antígeno para poços de microtitulação foi realizada durante a noite a 4°C, sítios de ligação não específicos foram bloqueados com PBS contendo 1% de caseína (Thermo Scientific, Rockford, IL). Diluições de amostras de soro bovino então foram adicionadas às placas de ELISA; amostras de soro foram diluídas nas proporções de 1:1000, 1:5000, 1:5000, 1:150, 1:500, e 1:150 para ensaios de IgG anti-FimH, anti-LKT, anti- PLO, anti-E. coli, anti-F. necrophorum, e anti-A. pyogenes, respectivamente. As concentrações ótimas de antígeno e de anticorpo foram determinadas através da realização de protocolo de ELISA quantitativo com concentrações variáveis. O anticorpo específico de sorotipo ligado à placa de ELISA foi detectado com anticorpo de IgG antibovino conjugado com peroxidase de raiz forte, diluído de acordo com as instruções do fabricante (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), seguido pela adição de substrato, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina - TMB (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). A densidade óptica de cada poço foi medida após 20 minutos a 650 nm usando um leitor de placa de ELISA (Synergy HTmicroplate reader BioTek Instruments, VT). A quantidade de cor produzida foi proporcional à quantidade de anticorpo primário ligado às proteínas no fundo dos poços. Entre cada etapa do ensaio, os poços de microtitulação foram aspirados e rinsados 3 vezes com a solução de lavagem (Solução Salina Tamponada com Fosfato IX Tween-20).

[0081] Análises estatísticas. Análise estatística descritiva foi tomada em SAS usando o procedimento de FREQ (SAS Institute INC., Cary, NC). Para avaliar o efeito de vacinação nas chances de resultados de cultura de RDPMET, FDPMET, endometrite, E. coli, F. necrophorum, e T. pyogenes, modelos de regressão logística foram ajustados em SAS usando o procedimento logístico. O efeito de vacinas subcutâneas e intravaginais na reprodução foi analisado por perigo proporcional de Cox usando o procedimento de regressão de perigo proporcional em SAS. Para avaliar o efeito da vacinação na temperatura retal a 6 + 1 DIM, modelos lineares gerais mistos foram ajustados aos dados usando JMP®PR09. Para avaliar o efeito da vacinação em antígenos de vacina contra IgG de soro de detecção de ELISA, modelos lineares gerais mistos foram ajustados para os dados usando JMP®PR09. Para todos os modelos descritos acima, variáveis independentes e as suas respectivas interações foram mantidas quando P < 0,10 em uma tentativa de reduzir o risco de erro do tipo II enquanto mantém um risco de erro do tipo I rigoroso de 5%. O tratamento de variável foi forçado em todos os modelos estatísticos mesmo na ausência de significância estatística. A idade em dias na inscrição, e BCS na inscrição foram oferecidos para todos os modelos.

[0082] Usando os materiais e métodos descritos acima neste exemplo, os seguintes resultados foram obtidos.

[0083] Estatísticas descritivas. Estatísticas descritivas com relação à idade média na inscrição (dias), BCS médio na inscrição a 6 + 1 dias após o parto, comprimento de gestação médio na inscrição, e número total de animais inscritos são apresentados na Tabela 5. Apenas novilhas grávidas foram inscritas neste estudo, permitindo que se tenha tão pouca variação entre os animais quanto for possível. Tabela 5: Estatísticas descritivas de grupos de tratamento

[0084] Efeito da vacinação na incidência de metrite puerperal diagnosticada pelo pesquisador (RDPMET), metrite puerperal diagnosticada na fazenda (FDPMET), e temperatura retal a 6 + 1 DIM. O efeito de vacinação na incidência de RDPMET é apresentado na Tabela 6. Quando avaliadas separadamente, vacinas 1, 2 e 3 foram associadas com reduções numéricas na incidência de RDPMET, enquanto que as vacinas 4 e 5 foram associadas com incidências aumentadas. No entanto, estas diferenças não foram estatisticamente significativas (Valor P = 0,21). Quando as vacinas foram avaliadas agrupadas tanto como subcutânea quanto como vacinas intravaginais, as vacinas subcutâneas foram associadas com uma redução significativa na incidência de RDPMET (valor P = 0,03).Tabela 6: Efeitos de diferentes formulações de vacina na incidência de metrite puerperal de diagnóstico de pesquisador. Vacinas foram avaliadas separadamente no Modelo 1, e agrupadas no Modelo 2. A idade em dias e a pontuação de condição corporal na inscrição foram oferecidas para ambos os modelos matemáticos

[0085] O efeito de vacinação na incidência de FDPMET está presente na Tabela 7. Quando as vacinas foram avaliadas separadamente, a incidência de FDPMET tende a ser diferente dentre os tratamentos (Valor P = 0,064). Adicionalmente, quando as vacinas foram avaliadas agrupadas como vacinas subcutâneas ou intravaginais, as vacinas subcutâneas foram associadas com uma chance significativamente menor de FDPMET (Valor P = 0,047).Tabela 7: Efeitos de diferentes formulações de vacina na incidência de metrite puerperal diagnosticada em fazenda. Vacinas foram avaliadas separadamente no Modelo 1, e agrupadas no Modelo 2. A idade em dias e a pontuação de condição corporal na inscrição foram oferecidas para ambos os modelos

[0086] O efeito de vacinação na temperatura retal a 6 + 1 DIM é apresentado na Figura 3. A temperatura retal não foi estatisticamente diferente dentre os grupos de tratamento quando as vacinas foram avaliadas separadamente (Valor P = 0,14). No entanto, temperatura retal foi estatisticamente diferente entre os grupos de tratamento quando as vacinas foram avaliadas agrupadas como controle, vacinas subcutâneas ou vacinas intravaginais (Valor P = 0,018).

[0087] Vacinação subcutânea foi associada com uma redução significativa na temperatura retal a 6 + 1 DIM.

[0088] Efeito da vacinação na incidência de endometrite e resultados de cultura de secreção uterina. Vacinas não foram eficazes na prevenção de endometrite, quando avaliadas separadamente ou quando agrupadas como vacinas subcutâneas e intravaginais (Valor P = 0,99). A incidência de endometrite foi de 8,57%, 7,89%, 12,12%, 7,50%, 9,09%, e 9,76% para controle, vacina 1, vacina 2, vacina 3, vacina 4, e vacina 5, respectivamente. A incidência de endometrite foi de 9,01 % e 9,46% para vacinas subcutâneas e intravaginais, respectivamente. Adicionalmente, não houve efeito significativo de vacinação na propensão de contaminação bacteriana intrauterina (Tabela 8).Tabela 8: Efeitos de diferentes formulações de vacina na incidência de Escherichia coli intrauterina a 2 + 1 DIM, Fusobacterium necrophorum a 6 + 1 DIM e Trueperella pyogenes a 35 + 3 DIM. Vacinas foram avaliadas separadamente no Modelo 1, Modelo 3 e Modelo 5; e agrupadas no Modelo 2, Modelo 4 e Modelo 6. A idade dias e pontuação de condição corporal na inscrição foram oferecidas para todos os modelos

[0089] Efeito da vacinação na reprodução. Vacas que receberam vacinação subcutânea foram 1,36 vez mais prováveis de conceber quando comparadas com vacas de controle (valor P = 0,04). No entanto, para vacas que receberam vacinas intravaginais, a propensão de conceber não foi estatisticamente diferente das vacas de controle (razão de perigo = 1,12, valor P = 0,46). A idade em dias na inscrição e BCS na inscrição foram mantidas no modelo para a análise (valor P = 0,02 e 0,01, respectivamente). O aprimoramento no desempenho reprodutor é adicionalmente ilustrado pela análise de sobrevivência (Figura 5) que demonstra que as vacas vacinadas com vacinas subcutâneas ficaram grávidas mais rápido do que vacas de controle e vacas que receberam vacinação intravaginal.

[0090] Respostas sorológicas à vacinação. O efeito de vacinação em soro IgG detectado por ELISA contra vários antígenos é apresentado na Figura 4. Em geral, a vacinação induziu um aumento significativo nas titulações de soro IgG contra todos os antígenos; vacinação subcutânea foi mais eficaz em aumentar titulantes de IgG de soro do que a vacinação intravaginal.

[0091] A Figura 5 mostra um exemplo de análise de sobrevivência de Kaplan-Meier de intervalo de concepção de parto pelo tratamento agrupado como controle, vacinas subcutâneas e vacinas intravaginais. As administrações de vacinação foram: controle (sem vacina), vacinas subcutâneas (vacinas 1,2, e 3 combinadas) e vacina intravaginal (vacinas 4 e 5 combinadas). O eixo Y é a % de vacas não grávidas e o eixo X são os dias a partir do parto até a gravidez. O intervalo de concepção de parto médio para as vacinas subcutâneas (linha interrompida interna), vacinas intravaginais (linha interrompida média), e controle (linha sólida) foi de 94, 114, e 120 respectivamente. (valor P = 0,04). A inclinação da linha que representa a vacina subcutânea é mais inclinada e demonstra que um número aumentado de vacas fica grávida no grupo da vacina subcutânea quando comparadas com os grupos de vacina intravaginal e de controle.

[0092] Como será aparente a partir dos resultados ditos anteriormente apresentados neste Exemplo, os efeitos de 5 diferentes formulações de vacina (3 vacinas subcutâneas e 2 vacinas intravaginais) contendo diferentes combinações de proteínas (FimH, F. necrophorum leucotoxina (LKT), pirolisina de T. pyogenes (PLO) e células inteiras inativadas (E. coli, F. necrophorum e T. pyogenes) na saúde uterina de vacas leiteiras são diferentes pelo fato de que a vacinação subcutânea diminui de maneira significativa a incidência de metrite puerperal, enquanto que vacinação intravaginal não foi eficaz.

[0093] Metrite puerperal é caracterizada por inflamação em toda a espessura da parede uterina, e está associada com sinais de doença sistêmica tal como embotamento, produção de leite diminuída e febre. Quando diagnosticada como descrito aqui, a incidência de metrite puerperal foi de 12,12% e quando diagnosticada por trabalhadores de fazenda foi de 27,62%. Esta discrepância pode ser atribuída ao período durante o qual as vacas foram monitoradas; enquanto que trabalhadores de fazenda monitoram as vacas diariamente durante os seus 20 primeiros dias após o parto, a equipe de pesquisa examina as vacas em 6 + 1 dias após o parto. As vacas foram examinadas neste ponto por causa de picos de metrite nos primeiros 7 dias após o parto. No entanto, em geral, o efeito de vacinação em metrite puerperal foi consistente entre os diagnósticos dos grupos de pesquisa e de trabalhadores de fazenda; vacinação subcutânea reduziu de maneira significativa a incidência de metrite puerperal, enquanto que vacina intravaginal não foi eficaz em evitar a doença.

[0094] E. coli e F. necrophorum são bactérias gram negativas, caracterizadas pela presença de lipopolissacarídeo (LPS) na sua membrana externa, e são agentes etiológicos conhecidos de metrite puerperal; LPS é conhecido de causar aumento da temperatura corporal em gado. Apesar de a vacinação não diminuir de maneira significativa a porcentagem de vacas que foram positivas para E. coli e F. necrophorum intrauterina, vacas vacinadas de maneira subcutânea não possuem uma menor temperatura retal a 6 + 1 DIM. Isto sugere que, mesmo na presença de bactéria no útero, vacas imunizadas foram menos prováveis de desenvolver sinais sistêmicos causados por LPS liberado a partir de E. coli e F. necrophorum. É conhecido que a redução de uma carga de bactéria de E. coli diminui a gravidade da doença; portanto, imunização diminuída da carga de patogênico dentro do útero.

[0095] Respostas imunes mucosas podem ser induzidas de maneira eficaz pela administração de vacinas em superfícies mucosas, enquanto que vacinas subcutânea e intramuscular tipicamente falham em induzir imunidade de mucosa, e são menos eficazes na prevenção de infecção de superfícies de mucosa. Resultados promissores com relação à prevenção de UTI de humanos por imunização intravaginal com uma vacina de célula inteira já foram reportados. No entanto, é conhecido como síntese local de anticorpos específicos por células que secretam anticorpo uterino contribui para imunidade uterina. No presente estudo, imunização intravaginal não foi eficaz na prevenção de doenças uterinas.

[0096] Em geral, vacinação subcutânea aumentou os níveis de soro de IgG contra E. coli, FimH, F. necrophorum, LKT, T. pyogenes, e PLO.

[0097] É conhecido que LKT de F. necrophorum é bastante tóxico para PMNs de bovinos, induzindo morte mediada por apoptose dos mesmos; esta toxicidade é dependente da dose. É possível que a imunização das as vacas contra LKT pode ter reduzido o efeito prejudicial desta toxina em PMNs intrauterinos, aprimorando a capacidade de sistema imune inato para eliminar infecções bacterianas a partir do útero através de fagocitose. PMNs recrutados são participantes chave na defesa imune do útero; migração reduzida de PMNs 2 semanas antes do parto é associada com placenta retida, e menor atividade de fagocitose e capacidade de impulso oxidativo de PMNs estão associados com a ocorrência de metrite e endometrite.

[0098] A incidência de metrite puerperal foi significativamente reduzida com vacinação subcutânea pré-parto com vacinas contendo diferentes combinações de proteínas (FimH, LKT, PLO) e células inteiras inativadas (E. coli, F. necrophorum e T. pyogenes). Em contraste, vacinação intravaginal não foi eficaz em diminuir a incidência de metrite puerperal. Assim uma vacina produzida comercialmente contra metrite pode se tornar uma parte integral de uma estratégia preventiva contra metrite, que pode ser esperada de reduzir a incidência da doença e reduzir o uso de antibióticos aliviando desta forma tanto a aflição do animal quanto o impacto econômico negativo geral de metrite na indústria de laticínios.

[0099] Enquanto a descrição foi mostrada particularmente e descrita com referência às modalidades especificas (algumas das quais são modalidades preferidas), deve ser entendido pelos versados na técnica que várias alterações na forma e detalhe podem ser feitas na mesma sem fugir do espírito e escopo da presente descrição como descrita aqui.

Claims (5)

1. Uso de uma composição veterinária compreendendo uma combinação de proteína de F. necrophorum leucotoxina (LKT), proteína adesina fimbrial de tipo 1 de E. coli (FimH) e proteína pirolisina de T. pyogenes (PLO) e células inteiras selecionadas a partir de células inteiras de Escherichia coli (E. coli), Trueperella pyogenes (T. pyogenes), Fusobacterium necrophorum (F. necrophorum), caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para a profilaxia de metrite puerperal em um mamífero ruminante.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o mamífero ruminante é uma vaca leiteira.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a vaca leiteira é um membro de um grupo de vacas leiteiras, compreendendo adicionalmente administrar de maneira subcutânea a composição veterinária para vacas leiteiras adicionais no grupo tal que a incidência de metrite puerperal no grupo é reduzida.

4. Uso de uma composição veterinária compreendendo uma combinação de proteína de F. necrophorum leucotoxina (LKT), proteína adesina fimbrial de tipo 1 de E. coli (FimH) e proteína pirolisina de T. pyogenes (PLO) e células inteiras selecionadas a partir de células inteiras de Escherichia coli (E. coli), Trueperella pyogenes (T. pyogenes), Fusobacterium necrophorum (F. necrophorum), caracterizado pelo fato de ser para manufatura de um medicamento para aprimorar a função reprodutiva de um ruminante, em que o aprimoramento da função reprodutiva do ruminante compreende a redução de intervalo de concepção de parto em relação ao intervalo de concepção de parto em um ruminante controle.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ruminante é uma vaca.

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