CN107427555B - 使用il-8以增加产奶量和改善哺乳动物中生殖健康并抑制高酮血症的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于改善哺乳动物的生殖健康并增加来自雌性哺乳动物的产奶量的组合物和方法。所述方法涉及向雌性哺乳动物施用有效量的IL‑8，从而使得所述哺乳动物的生殖健康得到改善，或者来自所述哺乳动物的产奶量增加，或者奶的脂肪含量增加。在另一方面，本公开包括通过向雌性哺乳动物施用IL‑8来预防和/或治疗子宫病症。

Description

使用IL-8以增加产奶量和改善哺乳动物中生殖健康并抑制高 酮血症的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年1月5日提交的美国专利申请号62/099,643的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
发明领域
本公开总体上涉及通过施用白介素-8(IL-8)来改善哺乳动物的产奶量和生殖健康。
背景技术
随着世界人口的增长，且更重要的是随着人均购买力平价的增加，对动物蛋白质(奶、肉类和蛋类)的需求将会稳步且不可避免地增加；为了避免通货膨胀压力，动物蛋白质产品的供应必须显著且可持续地增加，但同时要最小化农业用地的扩张。此外，据报道，饲料效率是导致碳足迹变化的单一最大因素，且提高饲料转化效率可以通过减少肠道甲烷和粪肥产量来减少温室气体排放。产后子宫疾病(如，子宫炎、子宫内膜炎和胎盘滞留)对于动物福利十分重要，其导致奶牛产生不适并从牛群中淘汰；还导致繁殖性能受到深刻影响，产奶量降低，以及产生治疗费用。子宫炎和子宫内膜炎通常与子宫的混合细菌感染有关，包括大肠杆菌、酿脓链球菌和坏死梭杆菌(Bicalho等，2012)。增加子宫疾病易感性的一个促成因素是在围产期期间奶牛面临免疫抑制(Drackley，1999；Cai等，1994；Kimura等，1999；Hammon等，2006；Galvao等，2010)。对于针对预防和治疗产后疾病的改进方法以及改善繁殖性能和产奶量具有持续而未满足的需求。本公开满足这些和其它需求。
发明内容
在一个方面，本公开涉及使用重组IL-8以改善雌性哺乳动物的产奶量。IL-8施用也用于预防和/或治疗一种或多种子宫疾病，并用于预防或治疗雌性哺乳动物中的高酮血症。
在一个实施方式中，本公开提供了一种用于改善雌性哺乳动物的健康，和/或增加产奶量和/或所述哺乳动物所产奶的脂肪含量的方法。所述方法包括向所述雌性哺乳动物施用IL-8，从而至少使所述雌性哺乳动物的健康得以改善，和/或所述哺乳动物奶量增加和/或其奶中的脂肪含量增加。
在一个实施方式中，向怀孕的雌性哺乳动物，或向分娩后(如，分娩12个月)的雌性哺乳动物施用IL-8。在一个实施方式中，所述IL-8施用伴随着对哺乳动物中子宫炎或胎盘滞留的预防或治疗，或对高酮血症的抑制，或其组合。在实施方式中，所述IL-8施用是口服、肠胃外、皮下、粘膜内或腹膜内的。肠胃外施用包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、阴道内、子宫内和皮下施用。在一个实施方式中，所述IL-8的施用是子宫内施用。
在多个方面，本公开提供了通过抑制产后子宫炎的发展、或通过抑制胎盘滞留、或通过增加来自所述哺乳动物的产奶量(包括但不限于增加经能量校正的奶产量)、或通过增加所述雌性哺乳动物所产奶的脂肪含量、或上述的组合来改善所述哺乳动物的健康。
在实施方式中，所述雌性哺乳动物是牛科哺乳动物，例如奶牛。在实施方式中，所述雌性哺乳动物是相同物种的雌性哺乳动物群体的成员，且所述IL-8向所述群体的其他成员施用。
在另一方面中，本公开包括已经施用IL-8的雌性哺乳动物所产的奶以及使用此奶生产的乳制品。
在另一方面中，本公开包括一种用于i)改善雌性哺乳动物的健康，和/或ii)增加产奶量和/或所述哺乳动物所产奶的脂肪含量的试剂盒，所述试剂盒包含一个或多个密封容器中的IL-8、递送装置和用于将IL-8引入雌性哺乳动物以获得i)或ii)的说明书。所述递送装置可适用于将IL-8引入非人哺乳动物的子宫。
在另一方面中，本公开包括一种制品，所述制品包含密封容器中的IL-8、包装和打印信息，所述打印信息标识IL-8为所述包装的内容物并提供以下指示：所述IL-8被用于改善雌性哺乳动物的健康，和/或ii)增加产奶量和/或所述哺乳动物所产奶的脂肪含量。
附图说明
图1：初产和经产奶牛的哺乳周产奶量(kg/d)。误差条代表均值的标准误差。L-IL8和H-IL8奶牛的总产奶量相比于对照奶牛更高(P值＜0.01)。处理和哺乳周之间的相互作用不显著(P值＝0.06)。星号(*)表示每周均值差异(P值＜0.05)。
图2：哺乳期前两个月期间的经脂肪校正的产奶量(kg/d)。L-IL8和H-IL8奶牛的总经脂肪校正的产奶量高于对照奶牛(P值＝0.02)。处理和哺乳月之间的相互作用不显著(P值＝0.89)。误差条代表均值的标准误差。
图3：哺乳期前两个月期间的经能量校正的产奶量(kg/d)。L-IL8和H-IL8奶牛的总经能量校正的产奶量相比于对照奶牛更高(P值＝0.02)。处理和哺乳月之间的相互作用不显著(P值＝0.56)。误差条代表均值的标准误差。
图4：哺乳期前两个月期间的体细胞计数线性评分。总体细胞计数未受处理的影响(P值＝0.02)。处理和哺乳月之间的相互作用不显著(P值＝0.09)。误差条代表均值的标准误差。
图5：处理对农场诊断的初产和经产奶牛的产后子宫炎发病率的影响。
图6：处理对初产和经产奶牛的临床子宫内膜炎发病率的影响。
图7：血液β-羟基丁酸酯(BHBA)浓度随泌乳天数(DIM)的变化。对照、L-IL8和H-IL8奶牛的总血液BHBA浓度分别为0.77μmol/L(95％CI＝0.65-0.90)、0.62μmol/L(95％CI＝0.50-0.74)和70μmol/L(95％CI＝0.58-0.82)。处理和泌乳天数之间的相互作用不显著(P值＝0.66)。误差条代表均值的标准误差。
图8：血液IL-8浓度随泌乳天数的变化。IL-8子宫内输注未增加总血液IL-8浓度(P值＝0.17)。处理和泌乳天数之间的相互作用不显著(P值＝0.16)。误差条代表均值的标准误差。
图9：直肠温度随泌乳天数的变化。处理组间的总直肠温度没有差异(P值＝0.47)。处理和泌乳天数之间的相互作用不显著(P值＝0.13)。误差条代表均值的标准误差。
图10：血液触珠蛋白水平随泌乳天数的变化。IL-8子宫内输注未增加总血液触珠蛋白水平(P值＝0.96)。处理和泌乳天数之间的相互作用不显著(P值＝0.48)。误差条代表均值的标准误差。
图11：自分娩日直至泌乳第35天损失的身体状况评分未受处理的影响(P值＝0.99)。
图12：血液IGF-1水平随泌乳天数的变化。IL-8子宫内输注未增加总血液IGF-1水平(P值＝0.18)。处理和泌乳天数之间的相互作用不显著(P值＝0.25)。误差条代表均值的标准误差。
图13：血清葡萄糖浓度随泌乳天数的变化。IL-8子宫内输注未增加总血清葡萄糖浓度(P值＝0.10)。处理和泌乳天数之间的相互作用不显著(P值＝0.55)。误差条代表均值的标准误差。
图14：处理对亚临床酮症发病率的影响。
图15：来自所选动物物种的IL-8的代表性氨基酸序列比对。序列以从N末端至C末端的顺序显示。各行中各物种的序列与共有序列相接。家牛(Bos taurus)序列是SEQ IDNO：1。水牛(Bubalus bubalus)序列是SEQ ID NO：4。马鹿(Cervus elephus)序列是SEQ IDNO：5。绵羊(Ovis aries)序列是SEQ ID NO：6。马(Equus caballus)序列是SEQ ID NO：7。智人(Homo sapiens)序列是SEQ ID NO：8。家犬(Canis lupus familiaris)序列是SEQ IDNO：9。家猫(Felus catus)序列是SEQ ID NO：10。底行中所示的特定哺乳动物序列的共有序列是SEQ ID NO：11。
图16：不同子宫内IL-8处理剂量对哺乳第一个月和第二个月的奶脂百分比的影响。所示的条柱从左至右为针对第一个月和第二个月的对照、低IL-8、中IL-8和高IL-8。
图17：不同子宫内IL-8处理剂量对日产奶量的影响。
图18：不同子宫内IL-8处理剂量对周产奶量的影响。
图19：不同子宫内IL-8处理剂量对经3.5％脂肪校正的产奶量的影响。所示条柱从左至右为对照、IL8-高、IL8-中和IL8-低。
图20：不同子宫内IL-8处理剂量对经能量校正的产奶量的影响。所示条柱从左至右为对照、IL8-高、IL8-中和IL8-低。
图21：显示阴道内IL-8施用显著增加产奶量的图示。在第0日施用IL-8。
具体实施方式
本公开总体上涉及向雌性哺乳动物施用有效量的IL-8，目的在于改善雌性哺乳动物的健康，其可以包括预防和/或治疗一种或多种子宫疾病和/或高酮血症，以及增加产奶量和/或奶的脂肪含量，及其组合。因此，本公开包括向哺乳动物施用有效量的IL-8，从而使得所述哺乳动物的产奶量增加，和/或所述哺乳动物所产奶的脂肪含量增加，和/或所述哺乳动物患有的子宫疾病和/或高酮血症减少。在实施方式中，增加并收集哺乳动物所产的奶。在实施方式中，减少的子宫疾病包括但不必定限于减少的子宫内膜炎和/或产后子宫炎，和/或减少的胎盘滞留。
关于子宫疾病，如本领域公知的，子宫炎通常涉及子宫壁的炎症，而子宫内膜炎通常涉及子宫内膜的炎症。就此而言，无法预见到本申请中发现的外源性施用的IL-8对子宫健康具有有益影响，因为与炎症的相关性是IL-8已知的功能。此外，如下进一步描述的关于IL-8对奶脂肪含量和产奶量的有利影响的偶然发现是意想不到的。鉴于这些发现，本公开的方法导致雌性哺乳动物健康的增加，这一点可通过如下情况证明：例如，增加产奶量、增加经脂肪校正的奶产量、增加经能量校正的奶产量、减少胎盘滞留的发病率、减少子宫炎或临床子宫内膜炎或产后子宫炎的发病率或严重程度、或通过改善哺乳动物分娩时的身体状况评分、或减少酮症，包括但不必定限于减少高酮血症、或减少直肠温度，或其组合。因此，本公开包括可以改善雌性哺乳动物的一般健康和生殖功能的各种方式。
本领域技术人员将认识到，经能量校正的奶(ECM)是基于奶、脂肪和蛋白质的奶中的能量量，并且调节至3.5％脂肪和3.2％蛋白质。常规的ECM公式是ECM＝(0.327X牛奶磅数)+(12.95X脂肪磅数)+(7.65X蛋白质磅数)。
预期本公开的方法将适用于任意雌性哺乳动物。在实施方式中，本公开涉及兽医方法，因此在这方面涉及非人哺乳动物。在实施方式中，施用IL-8的非人雌性哺乳动物是反刍动物，包括但不必定限于牛、绵羊、羚羊、鹿、长颈鹿及其亲属，并且还可以包括伪反刍动物，例如骆驼科动物。在实施方式中，反刍动物是雌性牛科哺乳动物，其是牛属的成员，例如牛、奶牛和水牛。在一个实施方式中，反刍动物是奶牛。在实施方式中，奶牛是初产或经产奶牛。在实施方式中，所述雌性哺乳动物是有蹄类动物。
在一个实施方式中，本公开内容包括向猪属的成员施用IL-8，因此包括用任意猪来实施本发明，其实例不限于家猪(即Sus domesticus)，通常也被称为生猪或猪。
本公开还包括向非牛和非反刍哺乳动物施用IL-8，其包括但不必定限于马、犬和猫科动物。在实施方式中，本公开内容包括向水生哺乳动物施用IL-8，例如鲸类哺乳动物，其实例不必定限于鲸鱼、海豚和鼠海豚。因此，本发明在某些方面中涉及伴侣动物以及保持在保护环境(例如动物园或水族馆)中的动物。
预期本文所述的方法也适合于人类使用，例如通过向人类女性施用IL-8，用于增加产奶量或通过增加其脂肪含量来增加奶的营养价值的目的。
在某些情况下，本公开特定的实施方式也可以排除IL-8施用。例如，在某些方法中，IL-8不施用于在IL-8施用后未从中获得奶的哺乳动物。在某些实施方式中，向例如奶牛施用IL-8之后获得的奶适用于人类饮用。因此，在某些实施方式中，IL-8施用于意在从中获得和/或从中获得奶的非人哺乳动物，其中所述奶是用于人类饮用和/或被人类饮用的。在某些方面，本公开可以排除向特定类型的哺乳动物施用IL-8。在一个实施例中，不向啮齿动物给予IL-8。因此，本公开可以包括向除啮齿动物外的所有类型的哺乳动物施用IL-8，啮齿动物的具体实例包括但不限于小鼠、大鼠和豚鼠。在另一个实施例中，可以从给予IL-8的哺乳动物组中排除包括人和非人灵长类动物中的任一者或两者的灵长类动物。在一个实施例中，施用IL-8的哺乳动物不具有血栓形成，包括但不限于深静脉血栓形成。在某些实施方式中，本公开可以排除某些时间段期间的IL-8施用，例如在某些实施方式中，本公开可以排除怀孕期间的IL-8施用以促进受精、着床或诱导子宫收缩。在某些方面，IL-8不施用于交配后的急性炎症有益于和/或促进受孕的哺乳动物物种。在某些实施方式中，IL-8不通过直接输注到乳腺组织或乳头中施用，因此在实施方式中，IL-8施用不诱导或促进乳腺炎。
IL-8是本领域中公知的由多种不同细胞类型(包括巨噬细胞)产生的趋化因子。它也被称为CXCL8，并且与CXCR1和CXCR2受体具有特异性地结合。其作为前体蛋白质产生，其通常在99个氨基酸(对于人IL-8)和至多103个氨基酸(对于其它物种)之间，并经过剪切以产生活性亚型。人类巨噬细胞最常分泌的人IL-8的剪切形式的长度为72个氨基酸。关于这一点，虽然在本公开中提供了重组牛IL-8施用对奶牛的作用的某些代表性实例，但预期任意动物表达的任意IL-8都可用于本发明的方法中。在非限制性的实施方式中，IL-8是重组产生的家牛(Bos taurus)IL-8，其包含以下序列或其片段：MTSKLAVALL AAFLLSAALCEAAVLSRMST ELRCQCIKTH STPFHPKFIK ELRVIESGPH CENSEIIVKL TNGNEVCLNP KEKWVQKVVQVFVKRAEKQD P(SEQ ID NO：1)
在实施方式中，IL-8是加工形式，因此比前体IL-8序列短。在实施方式中，IL-8的长度为至少70个氨基酸。在实施方式中，本公开的方法中使用的IL-8具有至少70个连续的IL-8氨基酸，其中该至少70个氨基酸与以上呈现的牛序列和/或图15中呈现的共有序列(对齐的底端行)具有至少70.0％的同源性。在实施方式中，IL-8包含具有与家牛序列跨越其70、71、72、73、74、75、76、77、78、79或80或更多个连续氨基酸具有70-100％之间同一性的序列或由其构成。在实施方式中，此序列同一性和长度相对于从N-端开始，或者从N末端直至氨基酸位置2-25(含)的任意氨基酸开始的氨基酸序列，且包括其间的每个氨基酸位置。在实施方式中，IL-8包含图15中呈现的任意氨基酸序列的序列或片段或由其构成。在一个实施方式中，IL-8包含图15中所示的家牛序列(SEQ ID NO：1)中ELR至AAR的变化。
在本公开的方法中使用的IL-8可以从任意合适的来源获得。在一个实施方式中，IL-8从供应商市售获得。例如，在大肠杆菌中表达并作为冻干粉末提供的人IL8可以从Sigma Aldrich获得。牛IL-8可以从明尼苏达州圣保罗市的Kingfisher生物技术公司获得。或者，可以使用本领域技术人员熟知的技术，例如通过使用蛋白表达系统，来重组产生IL-8。
在非限制性和说明性的实施方式中，使用以下方法，或考虑本公开的益处将对本领域技术人员而言显而易见的对以下方法的修饰来重组产生IL-8。质粒构建。通过使用限制性位点NheI和XhoI，从Trc-His-L-EK-IL8亚克隆到pET28A(NOVAGEN，德国达姆施塔特)中来构建pET28-His-L-EK-IL8。通过使用以下核苷酸对密码子优化的牛IL-8 cDNAΔSS进行PCR扩增来构建原始Trc质粒；5′-C GGCGCC GTG CTG TCT CGT ATG TCC ACC GAA C(SEQ IDNO：2)和5′-G CTCGAG TCA CGG ATC TTG TTT TTC TGC ACG(SEQ ID NO：3)。将PCR产物TA克隆到pGEM T载体(PROMEGA，威斯康辛州麦迪逊)中并在蓝白筛选后进行测序。然后用限制性内切酶SfoI和XhoI消化正确的克隆并连接到pTrcHis B载体(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中。为在肠激酶切割时维持IL-8的天然形式，用BamHI消化后用绿豆核酸酶消化，以除去5’突出端并产生用于连接的平端，从而制备Trc载体，然后用XhoI消化载体。通过测序确认最终构建体。
重组IL-8的表达。为确定大肠杆菌BL21对于IL-8完整版本和截短形式(无信号肽)的优选表达条件，将编码序列克隆到pET载体中，如下进行时程试验。所有生长步骤在37℃、以200rpm培养于125厄伦美厄或皮氏培养皿中含有300μg/ml卡那霉素的LB培养基或板中。将冻存培养物(-80℃)在20ml培养基上过夜重新活化。第二天，将0.4ml生长培养物转移到40ml新鲜培养基中并当O.D.达到600nm时加入1mM IPTG，在IPTG诱导之前，每隔一小时移除1ml等分试样，持续4小时。将每个样品以10,000g离心5分钟，并将沉淀重悬于裂解缓冲液(10mM Tris-HCl；1mM EDTA；0.1N NaOH；0.5％SDS)中。随后在4℃下将不溶性蛋白和细胞碎片以13,000g沉淀10分钟。上清液与Laemmli缓冲液(63mM Tris-HCL ph 6.8；10％甘油；2％SDS-电泳级、0.1％β-巯基乙醇和0.0005％溴酚蓝)一起煮沸5分钟以载入12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶。在80V下进行电泳90分钟。将凝胶用染色溶液染色30分钟，并用脱染溶液(Bio-Rad)在剧烈摇振下脱染2小时。我们在大肠杆菌中表达(pET28-His-LEK-IL8)IL8。表达的pET28-His-LEK-IL8部分可溶且便于纯化。
用于本公开的方法中的包含IL-8的组合物可以以各种形式提供，并经由各种途径递送。用于人或非人哺乳动物的组合物可以通过将IL-8与任意合适的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂混合来制备。适用于与IL-8混合的组合物的一些实例可以在：Remington：The Science and Practice of Pharmacy(2005)第21版，宾夕法尼亚州费城，Lippincott Williams&Wilkins中找到。在某些方面，可将IL-8加入到哺乳动物的饲料中，并从而作为饮食添加剂服用以对生殖健康和/或产奶量提供支持。
包含IL-8的组合物可以使用任意可用的方法和途径向哺乳动物施用，包括口服、胃肠外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内、阴道内、子宫内和皮下施用。组合物可以通过粘膜内途径施用。IL-8的施用可以在出生前或出生后进行，并且可以在怀孕期间进行。
在某些实施方式中，受制于如本文进一步描述的某些限制条件，包含IL-8的组合物向怀孕的哺乳动物施用，因此使用产前施用。在某些方法中，在乳腺发育期期间进行所述产前施用，不同物种的乳腺发育期各不相同，但都在怀孕期的最后三分之一之内。作为非限制性说明，在一个实施方式中，荷斯坦牛的怀孕期为280天。因此，据信但无意于受理论束缚，在怀孕约180天之后施用IL-8有助于乳腺的发育，导致产后期产奶量的增加。
在一个实施方式中，产前施用包括含IL-8组合物的阴道内施用。在一个非限制性的实施例中，向怀孕的哺乳动物(例如，奶牛)阴道内施用含IL-8的组合物。
在某些实施方式中，包含IL-8的组合物施用于最近分娩的哺乳动物，因此使用产后施用。在实施方式中，使用产后子宫内施用。在一个非限制性的实施例中，在生产(分娩)后72小时内向哺乳动物(例如，奶牛)产后子宫内施用含IL-8的组合物。本公开还包括在分娩后更短或更长时间内进行施用。在某些非限制性的实施例中，包含IL-8的组合物在分娩后立即施用，直至在分娩20周后施用。因此，在某些方法中，本公开包括在分娩当天或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140天(含)内施用，并包括其间所有整数范围。
在某些方法中，本公开包括作为外源性IL-8施用的替代，产生刺激内源性IL-8从而产生本文所述的一种或多种效应。在非限制性的实施例中，刺激外源IL-8的产生包括向哺乳动物施用一种或多种IL-8刺激化合物和/或组合物，包括但不必定限于肿瘤坏死因子α(TNF-α)、脂多糖(LPS)、白介素-1(IL-1)、血小板激活因子(PAF)，和/或考虑到本公开的益处将可以在本发明的实施方式中使用的其它物质。
在某些实施方式中，本公开包括向一种或多种哺乳动物(其非限制性实例是奶牛)施用含IL-8的组合物，从而实现以下任意一种或任意组合：i)产奶量增加；ii)经能量校正的奶产量的增加；iii)哺乳动物所产奶的脂肪含量的增加；iv)产后子宫炎形成的减少，和/或向多个哺乳动物施用IL-8时，产后子宫炎发病率的减少；v)临床子宫内膜炎形成的减少，和/或当向多个哺乳动物施用IL-8时，临床子宫内膜炎发病率的减少；vi)高酮血症的减少，例如亚临床酮症的减少，和/或向多个哺乳动物施用IL-8时，亚临床酮症发病率的减少，和vii)抑制胎盘滞留。在实施方式中，IL-8施用的前述作用通过利用含IL-8组合物的子宫内施用来实现，但是认为也可以使用其它施用途径。
将认识到，由IL-8的施用而产生的任意前述结果可以与参照相比较以评估IL-8施用的效果。可以使用任意合适的参照，并且本领域技术人员将考虑到本公开益处确认合适的参照。在实施方式中，参照可以是单个数值或一定范围内的数值。例如，参照可以是图表上的标准曲线或区域。参照可以包括阳性或阴性对照。在实施方式中，参照包括对获取自未施用IL-8、或施用不同量的IL-8、或使用不同的IL-8给药方案的哺乳动物的样品进行的测量。在各个方面，对结果的测量可以与参照进行比较，以提供结果的定性或定量测定，其可以与IL-8施用呈正相关或负相关。在某些实施方式中，与参照的比较可以由动物处理或测试领域的个体技术人员来进行。例如，可以由训练有素的农场人员根据本领域公知的特定方案诊断胎盘滞留和子宫炎，并且这些个体可以进行某些与非胎盘滞留或非子宫炎病症相比的测量，无论是否与适当的参照进行直接比较。例如，在某些实施方式中，子宫分泌物的变化，例如伴有发热的恶臭、水样、红棕色子宫分泌物的出现可用于诊断产后子宫炎，而不产生具有此类特征的子宫分泌物的分娩后奶牛被确定为没有产后子宫炎。
本公开包括向任意一个或多个哺乳动物(例如，多个哺乳动物或哺乳动物群体)施用IL-8。在一个实施方式中，多个哺乳动物包括一组奶牛，其可以存在于例如任意规模的奶牛场，小至几头奶牛，大至可容纳数千头奶牛的商业奶牛场。
如将从本公开的实施例和附图中呈现的结果中所认识到的，代表性但非限制性的实验证明了前文中列举的使用包含一系列IL-8量的子宫内和阴道内输注的效果。在特定且非限制性的实施例中，使用9.5mg、1.125mg、0.095mg、0.0095mg和11.25μg重组IL-8来证明本公开的一些方面。因此，本公开证明了很大范围内的IL-8量都可以引起这些作用的部分或全部，并且考虑到本公开的益处，本领域技术人员将会认识到如何修饰IL-8给药以在任意何特定的哺乳动物中都获得期望的结果。此外，本公开包括显示从9.5mg至少至0.0095mg之间的IL-8剂量产生统计学上显著的奶脂肪百分比增加。因此，本公开包括施用有效量的IL-8，其中所述IL-8的有效量是导致期望结果的量。在一个实施方式中，IL-8的量为0.001μg至10mg，包括其间以0.001μg为单位的所有整数和量，以及其间所有μg和mg的范围。在实施方式中，向哺乳动物施用至少11.25μg的IL-8。与此相关，特定IL-8给药方案的形式和特征将取决于施用途径和其他已知变量，考虑到诸如以下的因素：哺乳动物物种的大小、健康、年龄、类型、之前产仔的数目(如果有的话)、之前的子宫或其他相关病症的病史，以及与子宫病症和产奶相关的危险因素。在一个实施方式中，哺乳动物因为例如具有子宫病症的风险或另有患子宫病症倾向，或因为产奶不良，而需要IL-8施用。在实施方式中，IL-8的施用是预防性或治疗性的，或两者皆有。
本公开的IL-8组合物可以一次性或以一系列剂量施用，并且可以与旨在改善哺乳动物的一般健康、或用于促进或增强本文所述的IL-8诱导的作用的特定目的的任意其它化合物或组合物同时或在其后施用。在实施方式中，IL-8施用与抗生素、激素或生长因子结合使用。在某些方法中，IL-8仅施用一次，但对如本文所述的健康和/或产奶结果的任意一种或组合产生持久的作用。
施用IL-8组合物可以在施用之后的不同时间段导致产奶量增加和/或奶的脂肪含量增加。所需的乳脂含量可以使用任意合适的方法测定，其中几种是本领域公知的。例如，乳脂含量可以通过所谓的巴氏测定法或盖勃法来测定。在实施方式中，奶的脂肪含量增加。本公开显示了子宫内和阴道内输注重组IL-8之后，从奶牛获得的奶中乳脂增加。因此，在某些方法中，本公开包括用于刺激生产脂肪增加的奶的方法，并且包括通过此类方法生产的奶。
在某些方面，本公开包括相对于对照提高奶牛所产奶中的乳脂，所述对照例如为未接受IL-8施用的奶牛所产奶中的乳脂量。在某些方法中，增加的乳脂包括至少0.01％至0.5％(含)的乳脂(相对于对照)的增加，并且包括其间至小数点后第二位的所有数字，以及这些数字的所有范围。在某些方法中，根据本公开的一个实施方式生产的奶包含至少3.4％的乳脂，并且可以包含3.4％-4.4％的乳脂，包括其间至小数点后第二位的所有数字，以及这些数字的所有范围。在某些方法中，奶包含刚从哺乳动物获得时的乳脂。因此，所述量可以存在于未加工的奶中。
在某些实施方式中，本公开的实施方法对哺乳动物具有一种或多种可持续一段时间的作用。例如，我们已经证明了来自单次IL-8施用的持续11个月的产奶量以及经脂肪校正和经能量校正的产奶量的增加。在某些实施方式中，IL-8的施用导致的产奶量的增加，或经脂肪校正和/或经能量校正的产奶量的增加，和/或奶中脂肪含量的增加，在IL-8施用之后持续至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月时间。还包括更长的时间段。在某些方法中，IL-8施用对产奶量产生持久的影响，其延续整个单一哺乳期，即完整的哺乳期，IL-8在其即将开始之前或在其期间施用。在一个实施例中，哺乳期结束于随后的妊娠。本公开在一个非限制性的方法中包括以单一剂量施用IL-8，从而使得如本文所述的对奶含量和/或产量的一种或多种作用坚持至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月的时期，或在其之前或其间进行单次IL-8施用的整个哺乳期。在某些实施方式中，IL-8的一种或多种作用在IL-8施用的1、2、3、4、5、6或7天的时间内开始，并且之后可以坚持如本文所述的任何时间。
在某些方面中，本公开包括增加哺乳动物(例如，奶牛)产奶的量。在某些方面中，产奶量的增加包括每天增加至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12磅奶。可以相对于诸如不施用IL-8的奶牛的对照来评估产奶量的增加。本领域技术人员将认识到，本文所述的任何IL-8诱导的变化的值可以被视为例如在一段时间内测定的一组哺乳动物的平均值。
在另一个实施方式中，本公开包括从如上所述用IL-8处理的哺乳动物获得奶，并包括所述奶本身。该方面包括向雌性哺乳动物施用IL-8并收集施用后生产的奶。在一个实施方式中，通过该方法生产的奶与其它类型的奶的不同之处在于其具有增加的脂肪含量，例如如上所述的乳脂含量。在实施方式中，提供了含有从用IL-8处理的哺乳动物获得的奶的容器。该容器可以是任意容器，例如面向消费者的容器，例如牛奶纸盒，或更大的容器，例如桶，或适于运送或以其他方式运输大量奶的容器。在实施方式中，提供了使用获取自本文描述的方法的奶制成的产品。此类产品的非限制性实例包括乳酪、酸奶、基于奶的奶油和奶精、冰淇淋、基于乳制品的浇料以及用所述奶制成的任意其它乳制品。因此，在实施方式中，乳制品可以包含奶的衍生物，例如奶的一种或多种分离的组分，包括但不限于乳脂。因此，可以加工所述奶以分离奶组分用于将其包括在各种乳制品中。本公开包括使用常规方法制造此类产品，只是用本公开的奶替换先前可用的奶。
在另一方面，本发明提供了制品，例如试剂盒。所述试剂盒可以包括一个或多个密封容器，即玻璃或塑料小瓶中的包含IL-8的药物组合物。试剂盒可以包括注射器、导管或其他递送装置。例如，导管可以是人工授精(A.I.)导管，例如镀金(gilt)人工授精导管或等同物。试剂盒还可以包括袋子，例如适合于容纳溶液并适于与导管一起使用，以将溶液通过例如阴道内或子宫内递送引入哺乳动物的袋子。所述试剂盒可以任选地包含纸质的或计算机可读形式的使用其内容物的说明书。试剂盒还可以含有待与载体混合的IL-8，例如冻干形式的IL-8，并且在这种情况下，试剂盒可以进一步包含将冻干的IL-8重构入载体/溶液用于向哺乳动物施用的说明书。例如，所述载体可以是无菌水、生理盐水或磷酸盐缓冲盐水。所述载体可以在一个或多个单独的小瓶中提供。
在另一方面，本公开包括制品。所述制品包含在包装中提供的IL-8。所述包装可以包括容器，或者本身可以是容器。可以使用任何合适的容器，例如塑料或玻璃容器，包括但不限于塑料或玻璃小瓶。在各种实施方式中，所述制品包括印刷材料。所述印刷材料可以是所述包装的一部分，或其可以在标签上提供，或作为所述包装内包含的纸张插入物或其他书面材料。所述印刷材料提供了将IL-8标识为包装的内容物的信息，并指示消费者如何使用IL-8以产生如本文所述的对哺乳动物的任意一种或任意组合的作用。
考虑到前述内容，并且无意于受任何特定理论的束缚，本发明部分地涉及增加对子宫疾病易感性的一个影响因素是奶牛在围产期期间所面临的免疫抑制这一发现(Drackley，1999；Cai等，1994；Kimura等，1999；Hammon等，2006；Galvao等，2010)。中性粒细胞是参与胎盘释放(Kimura等，2002)，以及子宫后的细菌清除(Hussain，1989)和乳腺(Paape等，2002)感染的主要白细胞类型。血液中性粒细胞功能在分娩前开始下降，分娩后不久达到最低点，并在产后约4周内缓慢返回至产前水平(Kehrli和Goff，1989；Goff和Horst，1997)。几个因素可导致中性粒细胞功能的丧失，例如产犊周围血液雌二醇和皮质醇浓度的增加，以及诸如维生素A和E、钙和硒的营养素和矿物质的缺乏(Goff和Horst，1997；Kimura等，2002；Hammon等，2006)。此外，来自患有胎盘滞留(RP)的奶牛的中性粒细胞也具有减小的迁移能力和减小的髓过氧化物酶活性(Kimura等，2002)。中性粒细胞流入子宫最多的母牛具有降低的细菌感染的风险以及降低的子宫内膜炎的发病率(Gilbert等，2007)。据信中性粒细胞向乳腺内的迁移也在清除乳腺炎病原体中发挥了作用(Paape等，2002)。IL-8是中性粒细胞的化学引诱物；IL-8与其受体(CXCR1和CXCR2)在中性粒细胞中的结合诱导中性粒细胞活化、刺激趋化性、并增加吞噬和杀伤能力(Mitchell等，2003)。因为中性粒细胞对子宫内膜健康的维持发挥作用，所以据信需要适当的刺激来选择性地将中性粒细胞吸引入子宫。然而，持续的炎症导致慢性子宫疾病的形成，其损害生育力并降低乳制品利润率(Dubuc等，2011；Lima等，2013)。因此，本发明提供了一种反直觉的方法，以在一个方面提供了通过已知也促进炎症的IL-8施用，来进行对与炎症正相关的子宫病症的治疗和/或预防。在这方面，并且无意于受到理论的束缚，我们探索了，是否尽管其具有促炎性质，施用IL-8仍然可以募集并活化中性粒细胞进入子宫，导致早期的中性粒细胞流入子宫腔、早期的胎盘分离、早期的细菌污染清除，并最终导致以更健康更多产的奶牛为形式的净正面结果，从而开发了本发明。如通过以下实施例所证明，施用IL-8确实导致更健康且更多产的奶牛，并且意想不到地改善了其产奶量和奶的脂肪含量。
以下实施例说明本发明的特定实施方式且无意于进行限制。
实施例
实施例1
本实施例提供了用于生成实施例2中所述数据的材料和方法的描述。
农场和管理
该研究在位于纽约伊萨卡附近的卡约加县的大型商业奶牛场进行。该农场每天在一个双52栏平行挤奶厅里对3300头荷斯坦奶牛挤3次奶。奶牛被安置在散养牛舍里，混凝土牛栏上覆盖垫子并铺上肥料固体。向所有奶牛供给由约55％饲料(玉米青贮、半干青贮和小麦秸秆)和45％浓缩物(玉米粉、豆粕、油菜籽、棉籽和柑橘渣)(干物料基础)构成的全混合日粮。制定饮食以达到或超过对于体重650公斤并且生产45kg经3.5％脂肪校正的奶的泌乳荷斯坦奶牛的NRC营养要求(NRC，2001)。农场生殖管理使用Presynch，Ovsynch，Resynch和发情期检测的组合，25-30％的奶牛通过定时人工智能饲养，剩下的在检测发情后完全通过活动监测器(Alpro；DeLaval，密苏里州堪萨斯城)饲养。
研究设计、处理和样品采集
研究中共入组了217头新奶牛。奶牛被根据胎次隔离并随机分配到3个处理之一：对照、低剂量IL-8(L-IL8)和高剂量IL-8(H-IL8)。分配至H-IL8和L-IL8的奶牛分别接受250ml含1,125和11.25μg重组IL-8的盐水的子宫内输液。使用上述pET28-His-LEK-IL8产生IL-8，且其由SEQ ID NO：1的序列组成。
对照奶牛接受250ml盐水的子宫内输液作为安慰剂。在入组期间可用的所有新奶牛都包括在该研究中。在Excel(Microsoft，华盛顿州雷德蒙德)中使用随机数函数完成随机化并将其导入农场的Dairy Comp 305程序(Valley Agricultural Software，加利福尼亚州图莱里)。
研究团队在分娩后不超过14小时进行处理如下：对奶牛进行控制并用70％乙醇对会阴区域进行清洁和消毒。然后，将附接至250ml盐水袋的无菌“镀金”人工授精导管(Livestock concepts，黑瓦登)引入颅阴道。操纵导管进入子宫，将尖端暴露于子宫腔并将处理剂冲入子宫内。从导管的尖端收集拭子；37℃下在CHROMagar-大肠杆菌(CHROMagar，法国巴黎)上对其进行有氧培养。
从60头哺乳期的前四天的奶牛(每个处理组20头奶牛)采集奶和血液样品。为获得血清样品，使用没有抗凝剂的Vacutainer管和20号62.54cm Vacutainer针(Becton，Dickinson and Company，新泽西富兰克林湖)从尾静脉/动脉采集血液。所有血液样品在冰上运输到实验室，并在离心机中在4℃下以2,000xg旋转15分钟；收获血清并在-80℃下冷冻。
案例定义
根据由康奈尔大学动态生产医学诊所设计的具体方案，由训练有素的农场人员诊断和治疗胎盘滞留和子宫炎。分娩后，将奶牛关在同一围栏中直至泌乳第20天。该围栏由农场雇员监控，如果奶牛显示迟钝和抑郁的迹象，则对其进行全面体检；具有伴随发热的恶臭、水样、红褐色子宫分泌物的奶牛被诊断为产后子宫炎，并由农场雇员进行治疗。农场人员对所述处理不知情。胎盘滞留被定义为奶牛在产犊24小时内未能释放其胎膜的病症。
临床子宫内膜炎评估由研究者在泌乳第35±3天进行，且其被定义为在使用Metricheck装置(Metricheck，SimcroTech，新西兰汉密尔顿)取得的阴道粘液中存在脓性或黏脓性分泌物。使用改良的0到5分制对阴道分泌物进行评分(0＝未取得分泌物质，1＝澄清粘液，2＝阴道分泌物中的脓液斑，3＝阴道分泌物中＜50％的脓液，4＝阴道分泌物中＞50％的脓液，5＝水样、恶臭的阴道分泌物)。得分≥3的奶牛被认为患有临床子宫内膜炎。
使用配有斜探头(11.5cm，42o)的数字温度计(GLA M750，GLA AgricultureElectronics，加利福尼亚州)，测量入组时和泌乳第3、6、9天直肠温度。如前所述(Edmonson等，1989)，单一研究者使用以0.25分为单位的5分制，在入组时和泌乳第35天记录身体状况评分。身体状况评分损失被定义为入组时和泌乳第35天身体状况评分之间的差异。
从农场的DairyComp 305数据库(Valley Agricultural Software，加利福尼亚州图莱里)提取关于牛犊(雌性、雄性、双生子和死胎)、辅助分娩、分娩时的妊娠天数、产奶量和体细胞计数的数据。
血液和奶参数
使用经验证用于牛的人IL-8 ELISA试剂盒(R&D Systems Inc.，明尼苏达州明尼阿波利斯)测定血清和奶样品的IL-8浓度。还使用已经验证用于动物的电子BHBA测量系统(Precision Xtra，Abbott，英国阿宾顿)测试血清样品的BHBA浓度。经测试在哺乳前4天中至少一天的BHBA超过1.2μmol/L的奶牛被认为患有亚临床酮症。使用便携式血糖仪(Accu-Check Active，Roche Diagnostics，印第安纳州印第安纳波利斯)测量血清葡萄糖水平。使用人IGF-1ELISA试剂盒(R&D Systems Inc.，明尼苏达州明尼阿波利斯)测定血清IGF-1水平。
使用通过估计的过氧化物酶活性差异来测量触珠蛋白/血红蛋白复合物的比色方法来测定血清触珠蛋白浓度。简而言之，将5μL血浆或蒸馏水(用于空白测定)加至硼硅酸盐管中的7.5mL O-二茴香胺溶液(在蒸馏水中的0.6g/L的O-联茴香胺、0.5g/L的EDTA和13.8g/L的磷酸二氢钠；pH调节至4.1)。立即向每个管中加入25微升血红蛋白溶液(在蒸馏水中的0.3g/L的牛血红蛋白)。所有管在设为37℃的水浴中培养45分钟。培养后，向每个管中加入100μL新鲜制备的156mM工作浓度的过氧化氢溶液。所有管在室温下培养1小时。培养后，每个管中取200μL转移到96孔聚苯乙烯平底微板的一个孔中，并立即在酶标仪(Bio TekInstruments，Model EL 340，Winooski，VT)中在450nm下读取光密度(OD)。从所有含血浆样品的OD中减去来自空白样品的OD。考虑到使用的方法不含标准曲线，将结果报告为450nm波长下的光密度读数。
统计学分析
在
Figure BDA0001394703980000151
PRO 10中分别使用针对连续和分类数据的ANOVA和卡方函数进行描述性统计分析。使用SAS(SAS Institute)的MIXED程序将十个混合的一般线性模型拟合到数据上。本研究中评估的因变量为：平均日产奶量(kg/d)、平均经脂肪校正的产奶量(kg/d)、平均经能量校正的日产奶量(kg/d)、SCC线性分数、血液BHBA浓度(μmol/L)、血液IL-8浓度(pg/ml)、血液触珠蛋白、血液IGF-1浓度(ng/ml)、血清葡萄糖浓度(mg/dL)和直肠温度(℃)。数据包括每个因变量的一系列重复测量，贯穿哺乳期前8周针对平均每日产奶量进行重复测量；在哺乳期前两个月针对平均经脂肪校正的产奶量、平均经能量校正的日产奶量和SCC线性分数进行重复测量；在哺乳期前四天针对血液BHBA浓度、血液IL-8浓度、血液触珠蛋白、血液IGF-1和血清葡萄糖浓度进行重复测量；以及在产后3、6和9天针对直肠温度进行重复测量。为适当地考虑奶牛内相关性，将误差项通过对所有统计模型施加一阶自回归协方差结构(其假定重复测量的奶牛内相关性)来建模。提供给模型的自变量是：处理、胎次、入组时的胎盘存在、大肠杆菌子宫内培养结果、辅助分娩、产犊、分娩时的身体状况评分、分娩时的妊娠天数、入组时的温度和数据采集时间。向模型提供生物学上可行的双向和三向相互作用。此外，当P值＜0.10时，所有模型中的变量及其各自的交互作用项保留在模型中。变量处理强制进入所有模型。
为评估处理对产后子宫炎、临床子宫内膜炎和亚临床酮症的几率的影响，使用SAS的GLIMMIX程序将三个混合逻辑回归拟合到数据上。该模型包括以下固定效应：处理、胎次、入组时的胎盘存在、大肠杆菌子宫内培养结果、辅助分娩、产犊、分娩时的身体状况评分、分娩时的妊娠天数和入组时的温度。向模型提供生物学上可行的双向和三向相互作用。此外，当P值＜0.10时，所有模型中的变量及其各自的交互作用项保留在模型中。变量处理、胎次以及胎次与处理之间的相互作用项强制进入所有模型。为获得胎次与处理之间的相互作用项的不同浓度的层特异性几率比参数，使用GLIMMIX程序的lsmeans选项(二进制分布)。使用图基HSD检验调整P值以用于多重比较。为评估奶样品中具有可检测的IL-8水平的奶牛的比例，以及产后子宫炎、临床子宫内膜炎和亚临床酮症的发病率，使用
Figure BDA0001394703980000152
PRO 10中的卡方函数。
实施例2
该实施例提供了使用实施例1中所述的材料和方法获得的结果。
关于入组的经产和初产动物的数目、子宫内大肠杆菌培养为阳性的入组动物的数目、入组时存在胎盘的入组动物的数目、采用辅助分娩的入组动物的数目、产犊为雌性、雄性、双生子或死胎的入组动物的数目、分娩时的平均妊娠天数、分娩时的平均身体状况评分和入组时的平均直肠温度的描述性统计数据在表1中呈现。
表1：在三个处理组中入组的213头研究奶牛的描述性统计数据。
Figure BDA0001394703980000161
图1中呈现了处理对初产和经产奶牛的哺乳周产奶量的影响。IL-8处理的奶牛总体产奶量更高；对照、L-IL8和H-IL8奶牛分别为33.1kg/d(95％CI＝32.0-34.2)、35.6kg/d(95％CI＝34.5-36.7)和35.9kg/d(95％CI＝34.9-37.0)(P值＜0.01)。模型中保留了胎次、牛犊、分娩时的平均妊娠天数、入组时的直肠温度和哺乳周这些变量。处理和哺乳周之间的相互作用不显著(P值＝0.06)。
图2中呈现了处理对哺乳期前两个月的经脂肪校正的产奶量的影响。IL-8处理的奶牛的总经脂肪校正的产奶量更高；对照、L-IL8和H-IL8奶牛分别为34.2kg/d(95％CI＝32.6-35.7)，37.1kg/d(95％CI＝35.7-38.5)和36.6kg/d(95％CI＝35.0-38.1)(P值＝0.02)。模型中保留了胎次、分娩时的身体状况评分、分娩时的平均妊娠天数、入组时的直肠温度和哺乳月这些变量。处理和哺乳月之间的相互作用不显著(P值＝0.89)。
图3中呈现了处理对哺乳期前两个月期间经能量校正的产奶量的影响。IL-8处理的奶牛的总经能量校正的产奶量更高；对照、L-IL8和H-IL8奶牛分别为32.8kg/d(95％CI＝30.9-34.6)、35.7kg/d(95％CI＝34.0-37.3)和36.2kg/d(95％CI＝34.3-38.1)(P值＝0.02)。模型中保留了胎次、分娩时的身体状况评分、分娩时的平均妊娠天数和哺乳月这些变量。处理和哺乳月之间的相互作用不显著(P值＝0.56)。
图4中呈现了处理对哺乳期前两个月期间SCC线性评分的影响。处理组之间的总体细胞计数线性评分没有差异；对照、L-IL8和H-IL8奶牛分别为2.46(95％CI＝1.64-3.28)、2.44(95％CI＝1.66-3.23)和2.48(95％CI＝1.65-3.31)(P值＝0.99)。模型中保留了辅助分娩和哺乳月的变量。处理和哺乳月之间的相互作用不显著(P值＝0.09)。
处理对农场诊断的产后子宫炎发病率的影响取决于胎次，且在图5中呈现；处理和胎次之间的相互作用是显著的(P值＜0.01)。对于初产动物，与对照奶牛相比，H-IL8奶牛患有产后子宫炎的几率高7.43(P值＝0.03)，而L-IL8和对照奶牛患有产后子宫炎的几率没有差异(P值＝0.27)。另一方面，对于经产动物，子宫内IL-8处理具有防范产后子宫炎的保护作用；对照奶牛患有产后子宫炎的几率比L-IL8和H-IL8奶牛分别增加7.14(P值＝0.02)和5.88(P值＝0.02)。在一个非限制性实施方式中，本公开涉及在经产动物中预防产后子宫炎。图6中呈现了处理对临床子宫内膜炎发病率的影响。子宫内输注IL-8不能提供防范临床子宫内膜炎的保护(P值＝0.73)。
对照、L-IL8和H-IL8奶牛的总血液BHBA浓度分别为0.77μmol/L(95％CI＝0.65-0.90)、0.62μmol/L(95％CI＝0.50-0.74)和70μmol/L(95％CI＝0.58-0.82)(P值＝0.22)。此外，处理和泌乳天数之间的相互作用不显著(P值＝0.66，图7)。
对照、L-IL8和H-IL8奶牛的总血液IL-8浓度分别为235.0pg/ml(95％CI＝193.9-276.0)、275.5pg/ml(95％CI＝233.7-317.4)和287.5pg/ml(95％CI＝246.0-329.0)(P值＝0.17，图8)。模型中保留了入组时的直肠温度和泌乳天数的变量。处理和泌乳天数之间的相互作用不显著(P值＝0.16)。
用于测试IL-8浓度的大多数奶样品具有低于所用测定的检测限(1.5pg/ml)的水平。在测试的全部182个样品中，只有13.7％(25个样品)的IL-8浓度高于检测限。因此，关于IL-8的子宫内输注对该细胞因子在奶中的浓度的影响几乎无法推断。对照、L-IL8和H-IL8组在处理之前采集的IL-8浓度高于检测限的样品比例分别为40.0％、43.0％和23.5％(P值＝0.10)。对照、L-IL8和H-IL8组在处理之后采集的IL-8水平高于测定检测限的样品比例分别为2.2％，20.0％和0.0％(P值＜0.01)。
对照、L-IL8和H-IL8奶牛的总直肠温度分别为38.8℃(95％CI＝38.7-38.9)、38.8℃(95％CI＝38.8-38.9)和38.8℃(95％CI＝38.8-38.9)(P值＝0.47，图9)。模型中保留了入组时的胎盘、分娩时的身体状况评分、分娩时的妊娠天数和泌乳天数这些变量。处理和泌乳天数之间的相互作用不显著(P值＝0.13)。在泌乳第6天，对照奶牛的直肠温度低于H-IL8奶牛(P值＝0.02)。
分娩后前四天期间的触珠蛋白水平未受处理影响(图10)；对照、L-IL8和H-IL8奶牛的总触珠蛋白水平分别为0.13(95％CI＝0.11-0.16)、0.13(95％CI＝0.11-0.16)和0.13(95％CI＝0.11-0.15)(P值＝0.96)。模型中保留了胎次、产犊和泌乳天数这些变量。处理和泌乳天数之间的相互作用不显著(P值＝0.48)。
处理对从分娩日到泌乳第35天的身体状况评分损失不具有影响(图11)。对照、L-IL8和H-IL8奶牛的平均身体状况评分损失分别为0.23(95％CI＝0.15-0.30)、0.23(95％CI＝0.16-0.30)和0.23(95％CI＝0.16-0.31)(P值＝0.99)。模型中保留了胎次这一变量。
对照、L-IL8和H-IL8奶牛的总IGF-1血清水平分别为149.9ng/ml(95％CI＝133.2-166.5)、172.0ng/ml(95％CI＝153.6-190.4)和153.9ng/ml(95％CI＝136.5-171.4)(P值＝0.18，图12)。模型中保留了泌乳天数这一变量。处理和泌乳天数之间的相互作用不显著(P值＝0.25)。然而，L-IL8奶牛在产后第1天(P值＝0.09)、2天(P值＝0.01)和3天(P值＝0.08)具有或倾向于具有更高的血液IGF-1水平。
对照、L-IL8和H-IL8奶牛的总血清葡萄糖浓度分别为218.5mg/dl(95％CI＝195.2-241.8)、220.5mg/dl(95％CI＝196.7-244.3)和241.6mg/dl(95％CI＝218.6-264.5)(P值＝0.11，图13)。模型中保留了胎次、产犊和泌乳天数这些变量。处理和泌乳天数之间的相互作用不显著(P值＝0.53)。
图14中呈现了处理对亚临床酮症发病率的影响。L-IL8处理具有防范亚临床酮症的保护作用；对照奶牛患有亚临床酮症的几率比L-IL8奶牛增加8.04(P值＝0.02)。然而，对照和H-IL8奶牛之间的亚临床酮症发病率没有差异(P值＝0.30)。
实施例3
本实施例重现了上述实施例1和2中所述的方法，并进一步证明了更大范围的rIL-8剂量对于改善产奶量和奶含量是有效的。该研究也在位于纽约州卡约加的商业奶牛场中进行。共有341头新奶牛入组了研究116天。在分娩的12小时内，随机分配奶牛接受子宫内输注9.5mg rIL-8(高IL-8；n＝86)、0.095mg rIL-8(中IL-8；n＝82)、0.0095mg rIL8(低IL8；n＝88)、或不接受处理(对照；n＝85)。产后奶牛在分娩后12小时内进行处理。奶牛被限制处于头部固定位置，并用乙醇(70％v/v)消毒会阴部位。将附接至分别含有各rIL8剂量的250ml盐水袋的无菌镀金人工授精导管(Livestock Concepts Inc.，爱荷华州黑瓦登)引入颅阴道，操纵通过子宫颈，并将处理剂注入子宫腔。每天记录产奶量并每月将基础奶样品提交给实验室(DairyOne，纽约伊萨卡)用于奶成分评估(蛋白质和乳脂)。计算经能量校正的和经3.5％脂肪校正的奶，并在此报告。
以任意处理剂量，rIL8处理都能增加乳脂百分比(图16)。rIL8处理还增加了日产奶量(图17)、周产奶量(图18)、经3.5％脂肪校正的产奶量(图19)和经能量校正的产奶量(图20)。该结果与从实施例1和2中所述的实验获得的结果一致，并显示与对照相比时，用rIL8处理的奶牛每天平均多产生10磅奶。
实施例4
本实施例说明阴道内IL-8施用。为获得图21中汇总的数据，共随机分配60头奶牛接受安慰剂处理(无菌盐水；n＝30)或1.125mg rIL-8(n＝30)。阴道内施用处理剂和安慰剂。入组的奶牛处于分娩后30-80天之间(哺乳后期)。如从图21可见，阴道内IL-8处理显著增加了产奶量。
虽然已经通过具体实施方式描述了本发明，但是常规修改对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且此类修改旨在本发明的范围内。
参考文献
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序列表
<110> 康奈尔大学(CORNELL UNIVERSITY)
<120> 使用IL-8以增加产奶量和改善哺乳动物中生殖健康并抑制高酮血症的组合物和方法
<130> 018617.00665
<150> 62/099,643
<151> 2015-01-05
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 101
<212> PRT
<213> 牛()
<400> 1
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ala Ala Leu Cys Glu Ala Ala Val Leu Ser Arg Met Ser Thr Glu Leu
20 25 30
Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr His Ser Thr Pro Phe His Pro Lys Phe
35 40 45
Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Glu Asn Ser
50 55 60
Glu Ile Ile Val Lys Leu Thr Asn Gly Asn Glu Val Cys Leu Asn Pro
65 70 75 80
Lys Glu Lys Trp Val Gln Lys Val Val Gln Val Phe Val Lys Arg Ala
85 90 95
Glu Lys Gln Asp Pro
100
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 2
cggcgccgtg ctgtctcgta tgtccaccga ac 32
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<223> 引物
<400> 3
gctcgagtca cggatcttgt ttttctgcac g 31
<210> 4
<211> 101
<212> PRT
<213> 水牛()
<400> 4
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ala Ala Leu Cys Glu Ala Ala Val Leu Ser Arg Met Ser Thr Glu Leu
20 25 30
Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr His Ser Thr Pro Phe His Pro Lys Phe
35 40 45
Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Glu Asn Ser
50 55 60
Glu Ile Ile Val Lys Leu Thr Asn Gly Lys Glu Val Cys Leu Asn Pro
65 70 75 80
Lys Glu Lys Trp Val Gln Lys Val Val Gln Val Phe Val Lys Arg Ala
85 90 95
Glu Lys Gln Asp Pro
100
<210> 5
<211> 101
<212> PRT
<213> 马鹿()
<400> 5
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ala Ala Leu Cys Glu Ala Ala Val Leu Ser Arg Met Ser Thr Glu Leu
20 25 30
Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr His Ser Thr Pro Phe His Pro Lys Phe
35 40 45
Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Glu Asn Ser
50 55 60
Glu Ile Ile Val Lys Leu Thr Asn Gly Lys Glu Val Cys Leu Asn Pro
65 70 75 80
Lys Glu Lys Trp Val Gln Lys Val Val Glu Val Phe Val Lys Arg Ala
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100
<210> 6
<211> 101
<212> PRT
<213> 绵羊()
<400> 6
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ala Ala Leu Cys Glu Ala Ala Val Leu Ser Arg Met Ser Thr Glu Leu
20 25 30
Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr His Ser Thr Pro Phe His Pro Lys Phe
35 40 45
Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Glu Asn Ser
50 55 60
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Lys Glu Lys Trp Val Gln Lys Val Val Gln Ala Phe Leu Lys Arg Ala
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100
<210> 7
<211> 97
<212> PRT
<213> 马()
<400> 7
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Val Phe Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ala Ala Leu Cys Glu Ala Ala Val Val Ser Arg Ile Thr Ala Glu Leu
20 25 30
Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr His Ser Lys Pro Phe Asn Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Lys Glu Met Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Glu Asn Ser
50 55 60
Glu Ile Ile Val Lys Leu Val Asn Gly Ala Glu Val Cys Leu Asn Pro
65 70 75 80
His Thr Lys Trp Val Gln Ile Ile Val Gln Ala Phe Leu Lys Arg Thr
85 90 95
Glu
<210> 8
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人()
<400> 8
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Ile Ser
1 5 10 15
Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu
20 25 30
Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe
35 40 45
Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr
50 55 60
Glu Ile Ile Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro
65 70 75 80
Lys Glu Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala
85 90 95
Glu Asn Ser Leu
100
<210> 9
<211> 101
<212> PRT
<213> 家犬()
<400> 9
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Val Leu Ser
1 5 10 15
Ala Ala Leu Cys Glu Ala Ala Val Leu Ser Arg Val Ser Ser Glu Leu
20 25 30
Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr His Ser Thr Pro Phe His Pro Lys Tyr
35 40 45
Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Asp Ser Gly Pro His Cys Glu Asn Ser
50 55 60
Glu Ile Ile Val Lys Leu Phe Asn Gly Asn Glu Val Cys Leu Asp Pro
65 70 75 80
Lys Glu Lys Trp Val Gln Lys Val Val Gln Ile Phe Leu Lys Lys Ala
85 90 95
Glu Lys Gln Asp Pro
100
<210> 10
<211> 101
<212> PRT
<213> 家猫()
<400> 10
Met Thr Ser Lys Leu Val Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Met Leu Ser
1 5 10 15
Ala Ala Leu Cys Glu Ala Ala Val Leu Ser Arg Ile Ser Ser Glu Leu
20 25 30
Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr His Ser Thr Pro Phe Asn Pro Lys Leu
35 40 45
Ile Lys Glu Leu Thr Val Ile Asp Ser Gly Pro His Cys Glu Asn Ser
50 55 60
Glu Ile Ile Val Lys Leu Val Asn Gly Lys Glu Val Cys Leu Asp Pro
65 70 75 80
Lys Gln Lys Trp Val Gln Lys Val Val Glu Ile Phe Leu Lys Lys Ala
85 90 95
Glu Lys Gln Asn Ala
100
<210> 11
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列()
<220>
<223> 基于图15中序列的IL-8共有序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
<223> Xaa可以为任何天然的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(30)
<223> Xaa可以为任何天然的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (71)..(71)
<223> Xaa可以为任何天然的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (75)..(75)
<223> Xaa可以为任何天然的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)..(79)
<223> Xaa可以为任何天然的氨基酸
<220>
<221> UNSURE
<222> (28)..(28)
<223> The 'Xaa' at location 28 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (30)..(30)
<223> The 'Xaa' at location 30 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (71)..(71)
<223> The 'Xaa' at location 71 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (75)..(75)
<223> The 'Xaa' at location 75 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<220>
<221> UNSURE
<222> (79)..(79)
<223> The 'Xaa' at location 79 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 11
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ala Ala Leu Cys Glu Ala Ala Val Leu Ser Arg Xaa Ser Xaa Glu Leu
20 25 30
Arg Cys Gln Cys Ile Lys Thr His Ser Thr Pro Phe His Pro Lys Phe
35 40 45
Ile Lys Glu Leu Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Glu Asn Ser
50 55 60
Glu Ile Ile Val Lys Leu Xaa Asn Gly Lys Xaa Val Cys Leu Xaa Pro
65 70 75 80
Lys Glu Lys Trp Val Gln Lys Val Val Gln Val Phe Leu Lys Arg Ala
85 90 95
Glu Lys Gln Asp Pro
100

Claims (22)

1.一种用于增加产奶量和/或增加雌性哺乳动物所产奶的脂肪含量的方法，所述方法包括向所述雌性哺乳动物施用有效量的白介素-8(IL-8)，从而使得在所述施用之后发生增加的产奶量和/或增加的脂肪含量。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述雌性哺乳动物为怀孕的或在分娩的二十周内。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述雌性哺乳动物的产奶量增加。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述哺乳动物所产奶的脂肪含量增加。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述IL-8的施用是子宫内施用或阴道内施用。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述雌性哺乳动物是相同物种的雌性哺乳动物群体的成员，所述方法进一步包括向所述群体的其它成员施用所述IL-8，使得在所述施用之后在所述其它成员中发生增加的产奶量和/或增加的脂肪含量。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是牛科哺乳动物。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述牛科哺乳动物是奶牛。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述雌性哺乳动物是奶牛，且其中发生增加的产奶量和/或增加的脂肪含量。
10.白介素-8(IL-8)在制备一种试剂盒中的用途，所述试剂盒用于i)改善雌性哺乳动物的健康，其中所述改善雌性哺乳动物的健康包括预防或治疗经产奶牛的子宫炎、或抑制所述哺乳动物中的酮症，或其组合，和/或ii)增加产奶量和/或增加哺乳动物所产奶的脂肪含量。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述雌性哺乳动物为怀孕的或在分娩的二十周内。
12.如权利要求10或11所述的用途，其中在施用所述试剂盒之后，至少ii)发生，且其中所述雌性哺乳动物的产奶量增加。
13.如权利要求10或11所述的用途，其中在施用所述试剂盒之后，至少ii)发生，且其中所述哺乳动物所产奶的脂肪含量增加。
14.如权利要求10所述的用途，其中所述改善所述雌性哺乳动物的健康包括抑制酮症。
15.如权利要求10所述的用途，其中所述预防子宫炎包括抑制产后子宫炎的发展。
16.如权利要求10所述的用途，其中所述试剂盒用于子宫内施用或阴道内施用。
17.如权利要求10所述的用途，其中所述哺乳动物是牛科哺乳动物。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述牛科哺乳动物是奶牛。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述雌性哺乳动物是奶牛，且其中至少ii)在施用所述试剂盒之后发生。
20.一种试剂盒，所述试剂盒用于i)改善雌性哺乳动物的健康，其中所述改善雌性哺乳动物的健康包括预防或治疗经产奶牛的子宫炎、或抑制所述哺乳动物中的酮症、或其组合，和/或ii)增加产奶量和/或哺乳动物所产奶的脂肪含量，所述试剂盒包含一个或多个密封容器中的IL-8、递送装置和用于将IL-8引入雌性哺乳动物以获得i)或ii)的说明书。
21.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述用于引入IL-8的说明书包括用于将所述IL-8引入奶牛的说明书。
22.如权利要求20所述的试剂盒，其中所述递送装置是适于向奶牛子宫内或阴道内施用所述IL-8的导管。
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