ES2939300T3

ES2939300T3 - Composiciones y procedimientos de uso de IL-8 para mejorar la producción de leche y la salud reproductiva en mamíferos

Info

Publication number: ES2939300T3
Application number: ES16735288T
Authority: ES
Inventors: Rodrigo Bicalho
Original assignee: Cornell University
Current assignee: Cornell University
Priority date: 2015-01-05
Filing date: 2016-01-05
Publication date: 2023-04-20
Anticipated expiration: 2036-01-05
Also published as: US10500253B2; RU2682318C2; AU2016205456B2; AU2016205456A1; JP6799543B2; US20180028615A1; EP3242675B1; MX2017008881A; RU2017127776A; EP3242675A4; EP3242675A1; CN107427555B; CN107427555A; BR112017014412A2; CA2972957A1; RU2017127776A3; WO2016111992A1; JP2018502916A; US11406689B2; US20200046803A1

Abstract

La presente descripción proporciona composiciones y métodos para mejorar la salud reproductiva de los mamíferos y aumentar la producción de leche de las hembras de los mamíferos. Los métodos implican administrar una cantidad eficaz de IL-8 a un mamífero hembra de manera que se mejora la salud reproductiva del mamífero, o se incrementa la producción de leche del mamífero, o se incrementa el contenido de grasa de la leche. En otro aspecto, la divulgación incluye profilaxis y/o terapia de afecciones uterinas mediante la administración de IL-8 a un mamífero hembra. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y procedimientos de uso de IL-8 para mejorar la producción de leche y la salud reproductiva en mamíferos Campo

Esta descripción se refiere generalmente a mejorar la salud en mamíferos hembra mediante la administración de interleucina-8 (IL-8).

Antecedentes

Con el crecimiento de la población mundial y, más importante, a medida que la paridad del poder adquisitivo per capita aumenta, la demanda de proteína animal (leche, carne y huevos) aumentará constante e inevitablemente; para evitar presiones inflacionarias, el suministro de productos de proteína animal debe aumentar significativamente y de manera sostenible con una expansión mínima en el uso de tierra agrícola. Adicionalmente, se ha informado que la eficiencia de la alimentación es el único factor mayor que contribuye a la variación en la huella de carbono, y que mejora la eficiencia con que la conversión de la alimentación puede reducir las emisiones de gases de efecto invernadero tanto mediante reducciones en el metano entérico como en la salida de estiércol. Enfermedades uterinas postparto, tales como metritis, endometritis y placenta retenida, son importantes por causa del bienestar del animal, pues contribuyen al malestar de las vacas y a la eliminación del rebaño; acoplado con un rendimiento reproductivo afectado profundamente, un rendimiento reducido de la leche y costes de tratamiento. La metritis y la endometritis se asocian comúnmente con infección bacteriana mixta del útero, incluyendo E. coli, T. pyogenes y F. necrophorum (Bicalho y col., 2012). Un factor contribuyente que aumenta la susceptibilidad a las enfermedades uterinas es la inmunosupresión que enfrentan las vacas durante el periodo periparto (Drackley, 1999; Cai y col., 1994; Kimura y col., 1999; Halmmon y col., 2006; Galvao y col., 2010). Existe una necesidad continua e insatisfecha de estrategias mejoradas dirigidas a la profilaxis y a la terapia de enfermedades postparto. La presente descripción aborda estas y otras necesidades.

El documento EP0543476 A1 describe el uso de IL-8 para la fabricación de un medicamento para inducir la maduración cervical en una mamífero hembra.

El documento WO02064167 A1 describe agentes biológicamente activos útiles para la maduración cervical, incluyendo la IL-8 y sus derivados.

El documento WO9527900 A1 describe la detección de un posible parto prematuro mediante el ensayo del nivel de IL-8 en la secreción vaginal o mucus del cuello del útero. Barber Michele R y col, "Chemotactic activities in nonmastitic and mastitic mammary secretions: Presence of interleukin-8 in mastitic but not nonmastitic secretions", Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, (199801), vol. 5, no. 1, ISSN 1071-412X, págs. 82 - 86, XP009510674 se refiere al papel que desempeña la IL-8 en la mastitis.

Kimura, "Decreased Neutrophil Function as a Cause of Retained Placenta in Dairy Cattle", Journal of Dairy Science, (20020000), vol. 85, págs. 544 - 550, XP 026990386 reporta que la IL-8 puede ser un factor que afecta la función de los neutrófilos en vacas que desarrollan placenta retenida.

Galvao K N y col, "Association between interleukin-8 receptor-alpha (CXCR1) polymorphism and disease incidence, production, reproduction, and survival in Holstein cows", Journal of Dairy Science, (201104) se refiere a la asociación entre el polimorfismo del receptor de IL-8 a (CXCR1) y la incidencia de la enfermedad en vacas Holstein.

Sumario

En una realización, la descripción proporciona IL-8 para usar en un procedimiento para mejorar la salud de una mamífero hembra. La IL-8 para uso comprende administrar IL-8 al mamífero hembra de manera que se mejora al menos la salud del mamífero hembra.

En una realización, la IL-8 se administra a una mamífero hembra después del parto dentro de las 20 semanas del parto. En las realizaciones, la administración de IL-8 es parenteral. Las administraciones parenterales incluyen la administración intravaginal e intrauterina. En una realización, la administración de la IL-8 es una administración intrauterina.

En diversos aspectos, la divulgación proporciona la mejora de la salud del mamífero mediante la inhibición del desarrollo de la metritis puerperal, o mediante la inhibición de la retención de la placenta.

En realizaciones, el mamífero hembra es un mamífero bovino, tal como una vaca lechera. En realizaciones, el mamífero hembra es un miembro de una población de mamíferos hembra de la misma especie, y la administración de IL-8 se proporciona a otros miembros de la población.

En otro aspecto, la divulgación incluye un kit para i) mejorar la salud de una mamífero hembra, comprendiendo el kit IL-8 en uno o más recipientes sellados, un dispositivo de administración e instrucciones para introducir IL-8 en una mamífero hembra para obtener i) o ii). El dispositivo de administración puede ser adecuado para introducir la IL-8 en el útero de un mamífero no humano.

La divulgación también incluye un artículo de fabricación que comprende IL-8 en un recipiente sellado, envase e información impresa, identificando la información impresa IL-8 como contenido del envase y proporcionando una indicación de que la IL-8 debe usarse para mejorar la salud de una mamífero hembra.

Descripción de las figuras

Figura 1 (Referencia): Producción de leche (kg/d) por semana de lactancia para vacas primíparas y multíparas. Las barras de error representan el error estándar de la media. La producción global de leche fue mayor para las vacas L-IL8 y H-IL8 en comparación con las vacas de control (valor de P < 0,01). La interacción entre el tratamiento y la semana de lactancia no fue significativa (valor de P = 0,06). Un asterisco (*) indica que las medias semanales difieren (valor de P < 0, 05).

Figura 2 (Referencia): Producción de leche corregida en grasa (kg/d) durante los dos primeros meses de lactancia. La producción global de leche corregida en grasa fue mayor para las vacas L-IL8 y H-IL8 que para las vacas de control (valor de P = 0,02). La interacción entre el tratamiento y el mes de lactancia no fue significativa (valor de P = 0,89). Las barras de error representan el error estándar de la media.

Figura 3 (Referencia): Producción de leche corregida en energía (kg/d) durante los dos primeros meses de lactancia. La producción global de leche corregida en energía fue mayor para las vacas L-IL8 y H-IL8, en comparación con las contrapartes de control (valor de P = 0,02). La interacción entre el tratamiento y el mes de lactancia no fue significativa (valor de P = 0,56). Las barras de error representan el error estándar de la media.

Figura 4 (Referencia): Puntuación lineal del recuento de células somáticas durante los primeros dos meses de lactancia. La puntuación lineal global del recuento de células somáticas no se vio afectada por el tratamiento (valor de P = 0,02). La interacción entre el tratamiento y el mes de lactancia no fue significativa (valor de P = 0,09). Las barras de error representan el error estándar de la media.

Figura 5: El efecto del tratamiento en la incidencia de metritis puerperal diagnosticada en granja en vacas primíparas y multíparas.

Figura 6: El efecto del tratamiento sobre la incidencia clínica de endometritis en vacas primíparas y multíparas.

Figura 7: Concentración de beta hidroxil butirato en sangre (BHBA) por DIM (Days In Milk = Días en Lactancia). La concentración global de BHBA en sangre fue de 077 pmol/L (IC del 95 % = 0,65 - 0,90), 0,62 pmol/L (IC del 95 % = 0,50 -0,74) y 70 pmol/L (IC del 95 % = 0,58 - 0,82) para las vacas de control, L-IL8 y H-IL8, respectivamente (valor de P = 0,22). La interacción entre el tratamiento y DIM no fue significativa (valor de P = 0,66). Las barras de error representan el error estándar de la media.

Figura 8: Concentración de IL-8 en sangre por DIM. La concentración global de IL-8 en sangre no aumentó por infusión intrauterina de IL-8 (valor de P = 0,17). La interacción entre el tratamiento y DIM no fue significativa (valor de P = 0,16). Las barras de error representan el error estándar de la media.

Figura 9: Temperatura Rectal por DIM. La temperatura rectal global no fue diferente entre los grupos de tratamiento (valor de P = 0,47). La interacción entre el tratamiento y DIM no fue significativa (valor de P = 0,13). Las barras de error representan el error estándar de la media.

Figura 10: Niveles de haptoglobina en sangre por DIM. El nivel global de haptoglobina en sangre no aumentó por infusión intrauterina de IL-8 (valor de P = 0,96). La interacción entre el tratamiento y DIM no fue significativa (valor de P = 0,48). Las barras de error representan el error estándar de la media.

Figura 11: La pérdida de puntuación de la condición corporal desde el día del parto hasta 35 DIM no se vio afectada por el tratamiento (valor de P = 0,99).

Figura 12: Niveles de IGF-1 en sangre por DIM. El nivel global de IGF-1 en sangre no aumentó por infusión intrauterina de IL-8 (valor de P = 0,18). La interacción entre el tratamiento y DIM no fue significativa (valor de P = 0,25). Las barras de error representan el error estándar de la media.

Figura 13: Concentración de glucosa en suero por DIM. La concentración global de glucosa en suero no aumentó por infusión intrauterina de IL-8 (valor de P = 0,10). La interacción entre el tratamiento y DIM no fue significativa (valor de P = 0,55). Las barras de error representan el error estándar de la media.

Figura 14 (Referencia): El efecto del tratamiento sobre la incidencia subclínica de cetosis.

Figura 15: Alineamientos de secuencia de aminoácidos representativos de IL-8 de especies animales seleccionadas. Las secuencias se muestran de extremos N- a extremos C-. La secuencia para cada especie y la secuencia consenso es contigua a lo largo de las filas. La secuencia de Bos taurus es SEQ ID NO:1. La secuencia de Bubálsamo bublisus es SEQ ID NO:4. La secuencia de Cervus elephus es SEQ ID NO:5. La secuencia de Grupos Ovis es SEQ ID NO:6. La secuencia de Palallo igual es SEQ ID NO:7. La secuencia de Hommo sapiens es SEQ ID NO:8. La secuencia de Celilla lúpica es SEQ ID NO:9. La secuencia de Felus cus es SEQ ID NO:10. El consenso de las secuencias de mamíferos específicos que se muestran en la fila inferior es la SEQ ID NO:11.

Figura 16 (Referencia): Efecto de las diferentes dosis de tratamiento de IL-8 intrauterinas en el porcentaje de grasa en la leche en los meses primero y segundo de lactancia. Las barras se muestran por el primer mes y el segundo mes de izquierda a derecha como Control, IL-8 baja, IL-8 media e IL-8 alta.

Figura 17 (Referencia): Efecto de las diferentes dosis de tratamiento con IL-8 intrauterinas en la producción diaria de leche. Figura 18 (Referencia): Efecto de las diferentes dosis de tratamiento con IL-8 intrauuterinas en la producción semanal de leche.

Figura 19 (Referencia): Efecto de las diferentes dosis de tratamiento con IL-8 intrauterinas en leche corregida en grasa al 3,5 %. Se muestran las barras de izquierda a derecha como Control, IL8-ALTA, IL8-MEDIA e IL8-BAJA

Figura 20 (Referencia): Efecto de las diferentes dosis de tratamiento con IL-8 intrauuterinas en leche corregida en energía. Las barras se muestran de izquierda a derecha como Control, IL8-ALTA, IL8-MEDIA e IL8-BAJA.

Figura 21 (Referencia): La representación gráfica de los datos que muestran la administración intravaginal de IL-8 aumenta significativamente la producción de leche. IL-8 se administró el día 0.

Descripción detallada

La presente divulgación se refiere en general a la administración de una cantidad eficaz de IL-8 a mamíferos hembra con la intención de mejorar la salud de los mamíferos hembra. Por lo tanto, la descripción abarca la administración de una cantidad eficaz de IL-8 a un mamífero de manera que el mamífero tenga una enfermedad uterina reducida. La enfermedad uterina reducida es una metritis puerperal reducida y/o una placenta retenida reducida.

Con respecto a las enfermedades uterinas, como se conoce en la técnica, la metritis generalmente implica la inflamación de la pared del útero, mientras que la endometritis implica generalmente inflamación del endometrio. A este respecto, el presente descubrimiento de que la IL-8 administrada exógenamente tiene efectos beneficiosos sobre la salud uterina no se preveía porque, entre las funciones conocidas de la IL-8 estaba su asociación con la inflamación. Además, el descubrimiento fortuito no reivindicado de los efectos favorables de la IL-8 sobre el contenido de grasa de la leche y la producción de leche como se describe adicionalmente a continuación fue inesperado. En vista de estos hallazgos, los usos de la presente divulgación dan como resultado un aumento en la salud de una mamífero hembra, tal como se evidencia mediante la reducción de la incidencia de la placenta retenida, o la reducción de la incidencia o gravedad de la metritis puerperal Se espera que la IL-8 para su uso en los procedimientos de la presente descripción sea aplicable a cualquier mamífero hembra. En realizaciones, la divulgación se dirige a estrategias veterinarias y, por lo tanto, en este aspecto se refiere a mamíferos no humanos. En realizaciones, el mamífero hembra no humana al que se administra IL-8 es un rumiante, que incluye pero no se limita necesariamente a bovinos, ovejas, antílopes, venados y sus parientes, y además puede incluir pseudorumiantes, tales como los camélidos. En realizaciones, el rumiante es un mamífero bovino hembra que es un miembro del género Bos, tales como bueyes, vacas y búfalos. En una realización, el rumiante es una vaca lechera. En realizaciones, la vaca lechera es una vaca primípara o multípara. En realizaciones, el mamífero hembra es un ungulado. En una realización, la divulgación incluye administrar IL-8 a un miembro del género Sus, y, por lo tanto, abarca poner en práctica la invención con cualquier mamífero porcino, cuyos ejemplos no se limitan al cerdo doméstico (es decir, Sus domesticus), también denominado comúnmente como puerco o marrano.

La divulgación también incluye la administración de IL-8 a mamíferos no bovinos y no rumiantes, incluyendo, pero no necesariamente limitado a, equinos, caninos y felinos. En las realizaciones, la descripción incluye administrar IL-8 a mamíferos acuáticos, tales como mamíferos cetáceos, ejemplos de los cuales no se limitan necesariamente a ballenas, delfines y marsopas. Por lo tanto, la invención en ciertos aspectos se refiere a animales de compañía, así como a animales mantenidos en entornos de conservación, por ejemplo, en zoológicos o acuarios.

Las implementaciones particulares de esta divulgación también pueden excluir la administración de IL-8 en determinadas circunstancias. Por ejemplo, en ciertas estrategias, la administración de IL-8 no se proporciona a un mamífero del que no se obtiene leche después de la administración de IL-8. En ciertas realizaciones, la leche obtenida después de la administración de IL-8 a, por ejemplo, una vaca lechera, es adecuada para el consumo humano. Por lo tanto, en ciertas realizaciones, la administración de IL-8 es a una mamífero hembra no humana del que se pretende obtener y/o se obtiene leche, en donde la leche es para consumo humano y/o se consume por humanos. En ciertos aspectos, la divulgación puede excluir la administración de IL-8 a tipos particulares de mamíferos. En un ejemplo, la IL-8 no se proporciona a un roedor. Por lo tanto, la descripción puede comprender administrar IL-8 a todos los tipos de mamíferos, excepto los roedores, ejemplos específicos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, ratones, ratas y cobayas. En otro ejemplo, los primates que incluyen tanto primates humanos como no humanos, pueden excluirse del grupo de mamíferos a los que se proporciona la IL-8. En un ejemplo, el mamífero al que se administra IL-8 no tiene trombosis, incluyendo, pero no limitado a, trombosis venosa profunda. En ciertas realizaciones, la divulgación puede excluir la administración de IL-8 durante determinados períodos de tiempo, por ejemplo, en ciertas realizaciones, la descripción puede excluir la administración de IL-8 durante el embarazo para promover la fertilización, implantación, o para inducir contracciones uterinas. En ciertos aspectos, la IL-8 no se administra a una especie de mamífero para la que la inflamación aguda después del coito es beneficiosa para y/o promueve la concepción. En ciertas realizaciones, la IL-8 no se administra por infusión directa en tejido mamario o un pezón y, por lo tanto, en las realizaciones, la administración de IL-8 no induce ni promueve la mastitis.

La IL-8 es bien conocida en la técnica como una quimiocina producida por varios tipos de células diferentes, incluyendo macrófagos. También se denomina CXCL8, y se une con especificidad a los receptores CXCR1 y CXCR2. Se produce como una proteína precursora que típicamente está entre 99 aminoácidos (para IL-8 humana), y hasta 103 aminoácidos para otras especies, y experimenta escisión para producir isoformas activas. La versión escindida de la IL-8 humana que es secretada con mayor frecuencia por los macrófagos humanos es de 72 aminoácidos de longitud. En relación con esto, mientras que ciertos ejemplos representativos de los efectos de la administración de IL-8 bovina recombinante a vacas lecheras se proporcionan en esta divulgación, se espera que cualquier IL-8 expresada por cualquier animal pueda usarse en la invención. En realizaciones no limitantes, la IL-8 es una IL-8 producida de forma recombinante de Bos taurus que comprende la siguiente secuencia o un fragmento de la misma:

MTSKLAVALL AAFLLSAALC EAAVLSRMST ELRCQCIKTH STPFHPKFIK ELRVIESGPH CENSEIIVKL

TNGNEVCLNP KEKWVQKVVQ VFVKRAEKQD P (SEQ ID NO:1)

En realizaciones, la IL-8 es la forma procesada y, por lo tanto, es más corta que una secuencia precursora de IL-8. En realizaciones, la IL-8 tiene al menos 70 aminoácidos de longitud. En realizaciones, la IL-8 usada en esta descripción tiene al menos 70 aminoácidos de IL-8 contiguos, en donde los al menos 70 aminoácidos tienen al menos 70,0 % de homología con la secuencia bovina presentada anteriormente, y/o a la secuencia consenso presentada en la Figura 15 (fila inferior de alineación). En realizaciones, la IL-8 comprende o consiste en una secuencia que tiene entre el 70-100 % idéntico a la secuencia de Bos Taurus en 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, u 80, o más, aminoácidos contiguos de los mismos. En realizaciones, dicha identidad de secuencia y longitud es relativa a la secuencia de aminoácidos que comienza en el extremo N, o comenzando en cualquier aminoácido del extremo N a través de la posición de aminoácido 2-25, inclusive, e incluyendo cada posición de aminoácido entre ellos. En realizaciones, la IL-8 comprende o consiste en la secuencia o un fragmento de cualquier secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 15. En una realización, la IL-8 comprende un cambio del ELR a AAR en la secuencia de Bos Taura mostrada en la Figura 15 (SEQ ID NO:1).

La IL-8 usada en los procedimientos de esta descripción puede obtenerse de cualquier fuente adecuada. En una realización, la IL-8 se obtiene comercialmente de un proveedor. Por ejemplo, la IL8 humana expresada en E. coli y proporcionada como un polvo liofilizado puede obtenerse de Sigma Aldrich. Se puede obtener IL-8 bovina de Kingfiher Biotech, Inc., de Saint Paul, MN. Alternativamente, la IL-8 puede producirse de manera recombinante usando técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, tales como mediante el uso de un sistema de expresión de proteínas.

En una realización no limitante e ilustrativa, la IL-8 se produce de forma recombinante usando la siguiente estrategia, o modificaciones de las mismas que serán evidentes para los expertos en la técnica, dado el beneficio de la presente descripción. Construcción de plásmidos. Se construyó una IL8 pET28-His-L-EK-IL8 mediante la subclonación de Trc-His-L-EK-IL8 en pET28A (NOVAGEN, Darmstadt, Alemania) usando los sitios de restricción Nhel y XhoI. El plásmido Trc original se construyó mediante amplificación por PCR del ADNc ASS de IL-8 bovina optimizado con codones usando los siguientes nucleótidos; 5' - C GGCGCC GTG CTG TCT CGT ATG TCC ACC GAA C (SEQ ID NO:2) y 5' - G CTCGAG TCA CGG ATC TTG TTT TTC TGC ACG (SEQ ID NO:3). El producto de PCR se clonó a TA en un vector T pGEM (PROMEGA, Madison, WI) y se secuenció después del cribado blanco azul. El clon correcto se digirió luego con las enzimas de restricción Sfol y Xhol y se ligó en un vector pTrcHis B (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para mantener una versión nativa de IL-8 tras la escisión de enteroquinasa, el vector Trc se preparó mediante digestión con BamHI seguido de digestión con nucleasa de judía mungo para eliminar el saliente 5’ y crear un extremo romo para la ligadura, el vector se digirió con XhoI. La construcción final se confirmó mediante secuenciación.

Expresión de la IL-8 recombinante. Para determinar las condiciones de expresión preferidas de BL21 de E. coli para la versión completa de IL-8 y la forma truncada (sin péptido señal), las secuencias codificantes se clonaron en el vector pET, se realizó un piloto de curso temporal como sigue. Todas las etapas de crecimiento se incubaron a 37 °C, a 200 rpm en caldo LB o placas, que contenían 300 pg/ml de kanamicina, en el Erlenmeyer 125 o Cápsulas de Petri. Los cultivos de reserva congelados (-80 °C) se reactivaron durante la noche en 20 ml de medio. Al día siguiente, se transfirieron 0,4 ml del cultivo de crecimiento a 40 ml de medio recién preparado y se añadió 1 mM de IPTG cuando la D.O. alcanzó 600 nm, se retiró una alícuota de 1 ml antes de la inducción con IPTG y a intervalos de una hora durante 4 horas. Cada muestra se centrifugó a 10.000 g durante 5 min y los sedimentos se resuspendieron en tampón de lisis (10 mM de Tris- HL; 1 mM de EDTA; 0, 1 N de NaOH; SDS al 0,5 %). Posteriormente, las proteínas insolubles y los residuos celulares se sedimentaron durante 10 minutos a 13.000 g a 4 0C. El sobrenadante se hirvió con tampón Laemmli (63 mM de Tris- HCL pH 6,8; 10 % de glicerol; SDS al 2 % - grado de electroforesis, p-mercaptoetanol al 0,1 % y azul de bromofenol al 0,0005 %) durante 5 minutos para cargar un gel de SDS-poliacrilamida al 12 %. La electroforesis se realizó a 80 V durante 90 minutos. El gel se tiñó con solución de tinción durante 30 minutos y se destiñó con solución de desteñido (Bio-Rad) durante 2 horas con agitación vigorosa. Se expresó (pET28-His-LEK-IL8) IL8 en E. coli. La pET28-His-LEK-IL8 expresada es parcialmente soluble y conveniente para purificación.

Las composiciones que comprenden IL-8 para usar en los procedimientos de esta descripción pueden proporcionarse en una variedad de formas y suministrarse mediante una variedad de vías. Las composiciones para su uso en seres humanos o mamíferos no humanos pueden prepararse mezclando IL-8 con cualquier vehículo, excipiente y/o estabilizantes farmacéuticamente aceptables adecuados. Algunos ejemplos de composiciones adecuadas para mezclar con IL-8 se pueden encontrar en: Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2005) 21a Ed., Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins. En ciertos aspectos, la IL-8 puede añadirse a la alimentación de un mamífero y, por lo tanto, consumirse como un aditivo dietético para dar soporte a la salud reproductiva y/o la producción de leche.

Composiciones que comprenden IL-8 pueden administrarse al mamífero usando cualquier procedimiento y vía disponibles, incluyendo administraciones orales, parenterales, subcutáneas, intraperitoneales, intrapulmonares e intranasales. Las infusiones parenterales incluyen intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intravaginal, intrauterina y administración subcutánea. La composición se puede administrar a través de una estrategia intracelular. La administración de IL-8 puede realizarse antes o después del nacimiento, y puede realizarse durante el embarazo.

En ciertas realizaciones, sujetos a ciertas condiciones como se describe adicionalmente en esta invención, las composiciones que comprenden IL-8 se administran a una mamífero hembra embarazada y, por lo tanto, se usa una administración de preparación. En ciertas estrategias, la administración de la preparación se realiza durante el periodo de la mamogénesis que varía de especies a especies, pero está dentro del último tercio de la gestación. Como ilustración, en una realización, el periodo de gestación de una vaca Holstein es de 280 días. Por lo tanto, la administración de IL-8 después de aproximadamente 180 días de gestación se cree, sin pretender limitarse a la teoría, que ayuda al desarrollo de la glándula mamaria a fin de un aumento en la producción de leche en el período postparto.

En una realización, una administración de la preparación comprende una administración intravaginal de una composición que contiene IL-8. En un ejemplo, una administración intravaginal de una composición que contiene IL-8 se administra a una mamífero hembra embarazada, tal como una vaca lechera.

En ciertas realizaciones, las composiciones que comprenden IL-8 se administran a una mamífero hembra que recientemente ha dado a luz y, por lo tanto, se usa una administración postparto. En realizaciones, se usa una administración intrauterina postparto. En un ejemplo, una administración intrauterina postparto de una composición que contiene IL-8 se administra a un mamífero, tal como una vaca lechera, dentro de 72 horas de dar a luz (parto). La administración dentro de tiempos más cortos o más largos después del parto también está abarcada por esta descripción. En ciertos ejemplos, la composición que comprende IL-8 se administra inmediatamente después del parto, y hasta 20 semanas después del parto. En ciertas estrategias, la divulgación incluye administrar el mismo día del parto, o dentro de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131,132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140 días, inclusive, e incluyendo todos los intervalos de enteros entre ellos.

En ciertas estrategias, la descripción comprende, como alternativa a la administración exógena de IL-8, estimular la producción endógena de IL-8 de manera que se produzcan uno o más de los efectos descritos en la presente descripción. En ejemplos, estimular la producción exógena de IL-8 comprende administrar a un mamífero uno o más compuestos y/o composiciones estimulantes de IL-8, que incluyen, pero no se limitan necesariamente al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), lipopolisacárido (LPS), una interleucina-1 (IL-1), factor de activación de plaquetas (PAF) y/u otras sustancias que se pueden usar en realizaciones de la presente invención, dado el beneficio de la presente descripción.

En ciertas realizaciones, la presente descripción comprende la administración de una composición que contiene IL-8 a uno o más mamíferos, un ejemplo de los cuales es una o varias vacas lecheras, de modo que se logra una o cualquier combinación de lo siguiente: i) un aumento en la producción de leche; ii) un aumento en la producción de leche corregida en energía; iii) un aumento en el contenido de grasa de la leche producida por el mamífero; iv) una reducción en el desarrollo de la metritis puerperal, y/o una reducción en la incidencia de la metritis puerperal cuando se administra IL-8 a una pluralidad de mamíferos; v) una reducción en el desarrollo de endometritis clínica y/o una reducción en la incidencia de endometritis clínica cuando se administra IL-8 a una pluralidad de mamíferos; vi) una reducción en la hipercetonemia, tal como una reducción en la cetosis subclínica, y/o la incidencia de cetosis subclínica cuando se administra IL-8 a una pluralidad de mamíferos y vii) inhibiendo la placenta retenida. En realizaciones, los efectos anteriores de la administración de IL-8 se logran mediante el uso de una administración intrauterina de la composición que contiene IL-8, pero se considera que también podrían usarse otras vías de administración.

Se reconocerá que cualquiera de los resultados anteriores producido como resultado de la administración de IL-8 puede compararse con una referencia para evaluar el efecto de la administración de IL-8. Se puede usar cualquier referencia adecuada, y los expertos en la técnica reconocerán referencias adecuadas dado el beneficio de esta descripción. En realizaciones, la referencia puede ser un único valor o un intervalo de valores. Por ejemplo, una referencia puede ser una curva estandarizada o un área en un gráfico. La referencia puede comprender un control positivo o negativo. En las realizaciones, la referencia comprende una medición hecha de una muestra obtenida de un mamífero al que no se administró IL-8, o se administró una cantidad diferente de IL-8, o se usó un programa de dosificación de IL-8 diferente. En diversos aspectos, se puede comparar una medición de un resultado con una referencia para proporcionar una determinación cualitativa o cuantitativa del resultado, que puede correlacionarse positiva o negativamente con la administración de IL-8. En ciertas realizaciones, la comparación con una referencia puede realizarse por un experto en la manipulación de animales o pruebas con animales. Por ejemplo, la placenta retenida y la metritis pueden diagnosticarse por personal de granja entrenado según protocolos específicos conocidos en la técnica, y las personas pueden realizar determinadas mediciones en comparación con una condición no retenida o una condición no aumentada. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se puede usar un cambio en la descarga uterina, tal como la aparición de una descarga uterina fétida, acuosa o marrón rojiza acompañada de fiebre para diagnosticar la metritis puerperal, mientras que las vacas postparto que no producen una descarga uterina con tales características se determinan que no tienen metritis puerperal.

Esta descripción incluye administrar IL-8 a uno cualquiera, o más de un mamífero, tal como una pluralidad o población de mamíferos. En una realización, la pluralidad de mamíferos comprende un grupo de vacas lecheras que pueden estar presentes, por ejemplo, en una granja de producción de leche de cualquier escala, que varía de unas pocas vacas lecheras a una granja lechera comercial que puede alojar miles de vacas lecheras.

Como se reconocerá a partir de los resultados presentados en los Ejemplos y Figuras de esta descripción, los experimentos representativos demuestran los efectos enumerados anteriores usando infusiones intrauterina e intravaginal que comprenden un intervalo de cantidades de IL-8. En ejemplos particulares, los aspectos de la divulgación se demuestran usando 9,5 mg, 1,125 mg, 0,095 mg, 0,0095 mg y 11,25 pg de lL-8 recombinante. Por lo tanto, la divulgación demuestra que un amplio intervalo de cantidades de IL-8 puede provocar algunos o todos estos efectos, y dado el beneficio de esta divulgación los expertos en la materia reconocerán cómo modificar la dosificación de IL-8 para obtener un resultado deseado en cualquier mamífero particular. Además, la divulgación incluye una demostración de que las dosis de IL-8 que varían de 9,5 mg, a tan poco como 0,0095 mg, producen un aumento estadísticamente significativo en el porcentaje de grasa en la leche. Por consiguiente, la divulgación incluye administrar una cantidad eficaz de IL-8, en la que la cantidad eficaz de IL-8 es una cantidad que da como resultado un resultado deseado. En una realización, la cantidad de IL-8 es de 0,001 pg a 10 mg, incluyendo todos los números enteros y cantidades entre las unidades de 0,001 pg y todos los intervalos de pg y mg entre ellos. En realizaciones, al menos 11,25 pg de IL-8 se administra al mamífero. En relación con esto, la forma y el carácter del régimen particular de dosificación de IL-8 se dictarán por la vía de administración y otras variables conocidas, teniendo en cuenta tales factores como el tamaño, la salud, la edad, el tipo de especie de mamíferos, el número de partos anteriores (si lo hay), antecedentes previos de afecciones uterinas u otras relacionadas, y factores de riesgo relacionados con afecciones uterinas y producción de leche. El mamífero puede necesitar una administración de IL-8 porque, por ejemplo, tiene un riesgo de estar predispuesto o de otro modo en una condición uterina, o debido a una mala producción de leche. La administración de IL-8 puede ser profiláctica o terapéutica, o ambas.

Las composiciones de IL-8 de esta descripción pueden administrarse una vez o en una serie de dosis, y pueden administrarse simultánea o secuencialmente con cualquier otro compuesto o composición destinada a mejorar la salud general del mamífero, o para el propósito específico de promover o mejorar los efectos inducidos por IL-8-descritos en la presente descripción. En las realizaciones, la administración de IL-8 se usa junto con un antibiótico, una hormona o un factor de crecimiento. En ciertas estrategias, la IL-8 se administra solo una sola vez, pero produce un efecto duradero sobre la salud como se describe en la presente descripción.

En otro aspecto, la presente invención proporciona artículos de fabricación, tales como un kit. El kit puede incluir una composición farmacéutica que comprende IL-8 en uno o más recipientes sellados, es decir, viales de vidrio o plástico. El kit puede incluir una jeringa, un catéter u otro dispositivo de suministro. Por ejemplo, en el caso de un catéter, puede ser un catéter de inseminación artificial (I.A.), tal como un catéter Gilt I.A. El kit también puede incluir una bolsa, tal como una bolsa que es adecuada para contener una solución y adaptada para su uso con el catéter para introducir una solución en un mamífero, por ejemplo, mediante administración intravaginal o intrauterina. El kit puede incluir opcionalmente instrucciones para el uso de su contenido ya sea escrito en un papel o en un formato legible por ordenador. El kit también puede contener IL-8 que se va a mezclar con un vehículo, tal como IL-8 en forma liofilizada, y en este caso el kit puede incluir además instrucciones para reconstituir la IL-8 liofilizada en un vehículo/solución para la administración al mamífero. Por ejemplo, el vehículo puede ser agua estéril, solución salina normal o solución salina tamponada con fosfato. El vehículo puede proporcionarse en uno o más viales separados.

En otro aspecto, la presente descripción comprende un artículo de fabricación. El artículo de fabricación comprende IL-8 proporcionada en un envase. El envase puede comprender un recipiente, o puede ser un recipiente. Se puede usar cualquier recipiente adecuado, tal como un recipiente de plástico o vidrio, que incluye, pero no se limita a, viales de plástico o vidrio. En diversas realizaciones, el artículo de fabricación incluye material impreso. El material impreso puede ser parte del envase, o puede proporcionarse en una etiqueta, o como inserto de papel u otro material escrito incluido con el envase. El material impreso proporciona información que identifica IL-8 como contenido del paquete, e indica a un consumidor cómo usar la IL-8 para producir uno cualquiera o cualquier combinación de los efectos en mamíferos como se describe en esta invención.

En vista de lo anterior, y sin pretender limitarse a ninguna teoría particular, la presente invención se refiere en parte a la observación de que un factor contribuyente que aumenta la susceptibilidad a las enfermedades uterinas es la inmunosupresión enfrentada por las vacas durante el período periparto (Drackley, 1999; Cai y col., 1994; Kimura y col., 1999; Halmmon y col., 2006; Galvao y col., 2010). Los neutrófilos son el principal tipo de leucocitos implicado en la liberación placentaria (Kimura y col., 2002), y en la eliminación bacteriana después de la infección uterina (Hussain, 1989) y de la glándula mamaria (Pasimiet y col., 2002). La función de neutrófilos en sangre comienza a disminuir antes del parto, alcanza un mínimo poco después del parto, y vuelve lentamente a los niveles de aproximadamente 4 semanas posteriores al parto (Kehrli y Goff, 1989; Goff y Horst, 1997). Varios factores pueden explicar la pérdida en la función de los neutrófilos, tales como aumentos en las concentraciones de estradiol y cortisol en sangre alrededor del parto, y el déficit de nutrientes y minerales tales como vitaminas A y E, calcio y selenio (Goff y Horst, 1997; Kimura y col., 2002; Hammon y col., 2006). Adicionalmente, los neutrófilos de vacas con placenta retenida (RP) también tienen una menor capacidad de migración y una disminución de la actividad de mieloperoxidasa (Kimura y col., 2002). Vacas con la mayor entrada de neutrófilos en el útero tienen un riesgo reducido de infección bacteriana y una incidencia reducida de endometritis (Gilbert y col., 2007). También se cree que la migración de neutrófilos en la glándula mamaria desempeña un papel en la eliminación de los patógenos de la mastitis (Paape y col., 2002). IL-8 es un quimioatrayente para neutrófilos; la unión de IL-8 a sus receptores (CXCR1 y CXCR2) en el neutrófilo induce la activación de neutrófilos, estimula la quimiotaxis y aumenta la capacidad de fagocitosis y de destrucción (Mitchell y col., 2003). Debido a que los neutrófilos desempeñan un papel en el mantenimiento de la salud endometrial, se cree que se necesita un estímulo apropiado para atraer selectivamente neutrófilos hacia el útero. Sin embargo, la inflamación continua resulta en el desarrollo de enfermedad uterina crónica, que altera la fertilidad y reduce la rentabilidad lechera (Dubuc col., 2011; Lima y col., 2013). Por lo tanto, la presente invención proporciona una estrategia contraintuitiva para, en un aspecto, proporcionar terapia y/o profilaxis de afecciones uterinas que se sabe que se correlacionan positivamente con la inflamación mediante la administración de IL-8, que también se sabe que promueve la inflamación. A este respecto, y sin pretender limitarse a la teoría, se desarrolló la presente invención explorando si la administración de IL-8 podría, a pesar de sus propiedades proinflamatorias, no obstante, reclutar y activar neutrófilos en el útero, dando como resultado el flujo precoz de neutrófilos a la cavidad uterina, el desprendimiento temprano de la placenta, la eliminación temprana de la contaminación bacteriana y, en última instancia, un resultado positivo neto en forma de vacas lecheras más fértiles. Como se evidencia por los siguientes ejemplos, la administración de IL-8 da como resultado vacas lecheras más saludables y más fértiles.

Ejemplo 1

Este Ejemplo proporciona una descripción de material y procedimientos utilizados para generar datos descritos en el Ejemplo 2.

Granja y Administración

El estudio se llevó a cabo en una granja lechera comercial grande ubicada en el Condado de Cayuga, cerca de Ithaca, NY. La granja ordeñó 3.300 vacas Holstein 3 veces al día en una sala de ordeño paralela doble de 52 casillas. Las vacas se alojaron en cobertizos con puestos libres, con establos de concreto cubiertos con colchones y espacio para estiércol sólido. Todas las vacas se ofrecían a una Ración Mezclada Total que consistía en aproximadamente 55 % de forraje (ensilaje de maíz, heno y paja de trigo) y 45 % de concentrado (harina de maíz, harina de soja, canola, semilla de algodón y pulpa de cítricos) en una base de Materia Seca. La dieta se formuló para cumplir o superar los requerimientos de nutrientes del NRC para vacas Holstein lactantes que pesaban 650 kg y producen 45 kg de Leche Corregida en Grasa al 3,5 % (NRC, 2001). El tratamiento reproductivo de granja usó una combinación de presinc., ovsinc., resinc y detección de estro, con 25 a 30 % de vacas criadas a través de IA cronometrada y el resto criada después de la detección del estro únicamente por monitores de actividad (Alpro; DeLaval, Kansas City, MO).

Diseño del estudio, tratamiento y recolección de muestras

Se incluyeron en el estudio un total de 217 vacas recién paridas. Las vacas se bloquearon por paridad y se asignaron aleatoriamente en uno de 3 tratamientos: control, IL-8 de baja dosis (L-IL8) e IL-8 de alta dosis (H-IL8). Las vacas asignadas en H-IL8 y L-IL8 recibieron infusión intrauterina de 250 ml de solución salina que contenía 1.125 y 11,25 pg de IL-8 recombinante, respectivamente. La IL-8 se produjo usando la pET28-His-LEK-IL8 descrita anteriormente y consistió en la secuencia de SEQ ID NO:1.

Las vacas de Control recibieron infusión intrauterina de 250 ml de solución salina, como placebo. Todas las vacas recién paridas que estaban disponibles durante el período de inscripción se incluyeron en el estudio. La aleatorización se completó en Excel (Microsoft, Redmond, WA) usando la función de números aleatorios e importó al programa para granjas Dairy Comp 305 (Valley Agricultural Software, Tulare, CA).

Los tratamientos se administraron no más de 14 horas después del parto por el equipo de investigación de la siguiente manera: las vacas se contuvieron y se limpió el área del perineo y se desinfectó con etanol al 70 %. A continuación, se introdujo un catéter "Gilt" I.A. estéril (Livestock concepts, Hawarden) unido a una bolsa salina de 250 ml en la vagina craneal. El catéter se manipuló en el útero y la punta se expuso a la cavidad uterina y el tratamiento se descargó dentro del útero. Se recogió un hisopo de la punta del catéter; se cultivó aeróbicamente en CHROMagar-E. coli (CHROMagar, París, Francia) a 37 °C.

Se recogieron muestras de leche y sangre de 60 Vacas (20 vacas por grupo de tratamiento) durante los primeros cuatro días de lactancia. Para obtener muestras de suero, se recolectó sangre de una vena/arteria coxígea usando un tubo Vacutainer sin anticoagulante y una aguja Vacutainer calibre 20 de 62,54 cm (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). Todas las muestras de sangre se transportaron al laboratorio sobre hielo y se centrifugaron en una centrífuga a 2.000xg durante 15 min a 4 °C; se recogió suero y se congeló a -80 °C.

Definiciones de Caso

La placenta retenida y la metritis se diagnosticaron y trataron por personal de granja entrenado según protocolos específicos diseñados por la Ambulatory and Production Medicine Clínic en Universidad de Cornell. Después del parto, las vacas se mantuvieron en el mismo corral hasta 20 DIM. Este corral se controló por empleados de granja y las vacas se sometieron a un examen físico completo si mostraban signos de torpeza y depresión; las vacas con descarga uterina fétida, acuosa, marrón rojiza acompañada de fiebre fueron diagnosticadas con metravitis puerperal y se trataron por empleados de la granja. El personal de la granja se mantuvo ciego a los tratamientos. La placenta retenida se definió como una condición en la que las vacas no lograron liberar sus membranas fetales dentro de las 24 h del parto.

La evaluación de la endometritis clínica fue realizada por los investigadores a 35 ± 3 DIM, y se definió como una presencia de descarga purulenta o mucopurulenta, recuperando el moco vaginal usando el dispositivo Metricheck (Metricheck, SimcroTech, Hamilton, Nueva Zelanda). La descarga vaginal se puntuó usando una escala modificada de 0 a 5 (0 = sin material de secreción recuperado, 1 = moco transparente, 2 = motas de pus en la descarga vaginal, 3 = < 50 % de pus en la descarga vaginal, 4 => 50 % de pus en la descarga vaginal, 5 = descarga vaginal aguada, fétida). Se consideró que las vacas que habían marcado > 3 tenían endometritis clínica.

La temperatura rectal se midió en la inscripción, 3, 6 y 9 DIM usando un termómetro digital (GLA M750, GLA Agriculture Electronics, CA) equipado con una sonda de ángulo (11,5 cm, 42o). Las puntuaciones de condición corporal se registraron en la inscripción y 35 DIM por un único investigador usando una escala de 5 puntos con un sistema de cuarto de punto, como se describió previamente (Edmonson y col., 1989). La pérdida de puntuación de la condición corporal (BCS - Body Condition Score) se definió como la diferencia entre la BCS en la inscripción y a 35 DIM.

Los datos con respecto a los becerros (hembras, machos, gemelos y mortinatos), parto asistido, días de gestación al parto, producción de leche y recuentos de células somáticas se extrajeron de la base de datos DairyComp 305 de la granja (Valley Agricultural Software, Tulare, CA).

Parámetros de sangre y leche

Las concentraciones de IL-8 de muestras de suero y leche se determinaron usando un kit ELISA de IL-8 humana (R& D Systems Inc., Minneapolis, MN) validado para su uso en ganado bovino. Las muestras de suero también se probaron para concentraciones de BHBA usando un sistema electrónico de medición de BHBA (Precision Xtra, Abbott, Abingdon, Reino Unido) ya validado para uso animal. Las vacas que se probaron con más de 1,2 pmol/L de BHBA en al menos uno de los primeros cuatro días de lactancia se consideraron que tenían cetosis subclínica. Los niveles de glucosa en suero se midieron usando un glucómetro portátil (Accu-Check Active, Roche Diagnostics, Indianápolis, IN). Los niveles de IGF-1 en suero se determinaron usando un kit ELISA de IGF-1 humano (R& D Systems Inc., Minneapolis, MN).

La concentración de haptoglobina sérica se determinó usando un procedimiento colorimétrico que mide el complejo haptoglobina/hemoglobina mediante diferencias estimadas en la actividad de peroxidasa. En resumen, se añadieron 5 pl de plasma o agua destilada (para la determinación en blanco) a 7,5 mL de solución de O-dianisidina (0,6 g/L de O-dianisidina, 0,5 g/L de EDTA, y 13,8 g/L de fosfato de sodio monobásico en agua destilada; pH ajustado a 4,1) en un tubo de borosilicato. Se añadieron inmediatamente veinticinco microlitros de una solución de hemoglobina (0,3 g/L de hemoglobina bovina en agua destilada) a cada tubo. Todos los tubos se incubaron en un baño de agua ajustado a 37 °C durante 45 min. Después de la incubación, se añadieron 100 pl de una concentración de trabajo recién preparada de solución de peróxido de hidrógeno 156 mM a cada tubo. Todos los tubos se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Después de la incubación, se transfirieron 200 pl de cada tubo a un pocillo en una microplaca de fondo plano de poliestireno de 96 pocillos y se leyó inmediatamente la densidad óptica (DO) a 450 nm en un lector de microplacas (BioTek Instruments, Modelo EL 340, Winooski, VT). La DO de la muestra en blanco se restó de la DO de todas las muestras que contenían plasma. Los resultados se informaron como lecturas de densidad óptica a 450 nm de longitud de onda, dado que el procedimiento que se usó no contiene una curva estándar.

Análisis estadístico

Se realizaron análisis de estadísticas descriptivas en JMP®PRO 10, usando las funciones ANOVA y chi-cuadrado para datos continuos y categóricos, respectivamente. Se ajustaron diez modelos lineales generales mixtos a los datos usando el procedimiento MIXED de SAS (SAS Institute). Las variables dependientes evaluadas en este estudio fueron: producción media diaria de leche (kg/d), producción media de leche corregida en grasa (kg/d), leche con corrección en energía diaria promedio (kg/d), puntuación lineal de SCC, concentración de BHBA en sangre (pmol/L), concentración de IL-8 en sangre (pg/ml), haptoglobina sanguínea, concentración de IGF-1 en sangre (ng/ml), concentración de glucosa en suero (mg/dL) y temperatura rectal ( “ C). Los datos comprendían una serie de medidas repetidas de cada variable dependiente, a lo largo de las primeras ocho semanas de lactancia para la producción promedio de leche diaria; los primeros dos meses de lactancia para la producción media de leche corregida en grasa, la leche con corrección en energía diaria promedio y la puntuación lineal de SCC, y los primeros cuatro días de lactancia para la concentración de BHBA en sangre, concentración de IL-8 en sangre, haptoglobina sanguínea, iGF-1 sanguíneo y concentración de glucosa en suero, y 3, 6, y 9 días después del parto para la temperatura rectal. Para tener en cuenta adecuadamente la correlación en la vaca, el término de error se modelizó imponiendo una estructura de covarianza autorregresiva de primer orden para todos los modelos estadísticos (que asumió la correlación dentro de la vaca de las medidas repetidas). Las variables independientes ofrecidas a los modelos fueron: tratamiento, paridad, presencia de placenta en la inscripción, resultado del cultivo intrauterino de E. coli, parto asistido, becerro, puntuación de la condición corporal al parto, días de gestación al parto, temperatura en la inscripción y tiempo de recolección de datos. Se ofrecen interacciones bidireccional y de tres vías biológicamente plausibles a los modelos. Además, las variables y sus respectivos términos de interacción en todos los modelos se mantuvieron en el modelo cuando el valor de P < 0,10. El tratamiento variable se forzó a todos los modelos.

Para evaluar el efecto del tratamiento en las probabilidades de metritis puerperal, endometritis clínica y cetosis subclínica, se ajustaron tres regresiones logísticas mixtas a los datos usando el procedimiento de GLIMMIX de SAS. Los modelos incluyeron los efectos fijos del tratamiento, la paridad, la presencia de la placenta en la inscripción, el resultado del cultivo intrauterino de E. coli, parto asistido, becerro, puntuación de la condición corporal al parto, días de gestación al parto y la temperatura en la inscripción. Se ofrecen interacciones bidireccional y de tres vías biológicamente plausibles a los modelos. Además, las variables y sus respectivos términos de interacción en todos los modelos se mantuvieron en el modelo cuando el valor de P < 0,10. El tratamiento variable, la paridad y el término de interacción entre la paridad y el tratamiento fueron forzados a todos los modelos. Para obtener parámetros de razón de probabilidades específicas de estratos para las diferentes concentraciones del término de interacción entre paridad y tratamiento, se usó la opción lsmeans del procedimiento GLIMMIX (distribución binaria). Los valores de P se ajustaron para comparaciones múltiples usando la prueba HSD de Tukey. Para evaluar la proporción de vacas que tenían niveles detectables de IL-8 en muestras de leche, y las incidencias de la metritis puerperal, la endometritis clínica y la cetosis subclínica, se usó la función de chi-cuadrado en JMP®PRO 10.

Ejemplo 2

Este ejemplo proporciona resultados obtenidos usando los materiales y procedimientos descritos en el Ejemplo 1.

Las estadísticas descriptivas con respecto al número de animales hembras multíparas y primíparas inscritas, el número de animales inscritos que eran positivos para el cultivo de E. coli intrauterino, el número de animales inscritos con placenta presente en la inscripción, el número de animales inscritos que tuvieron parto asistido, el número de animales inscritos que parieron becerros hembras, machos, gemelos o mortinatos, los días promedio de gestación al parto, la puntuación de la condición corporal promedio al parto y la temperatura rectal promedio en la inscripción se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1: Estadística descriptiva de las 213 vacas del estudio incluidas en tres grupos de tratamiento.

Control IL-8 (11,25 pg) IL-8 (1125,00 pg) Valor de P Vacas primíparas inscritas (%) 32 (48) 41 (51) 31 (47)

Vacas multíparas inscritas (%) 35 (52) 39 (49) 35 (53) 0,86 Total 67 80 66

Vacas inscritas con resultado intrauterino

_{positivo E. coli (%)}42 (63) 39 (49) 30 (45) 0,10 Vacas con placenta presentes en la

_{inscripción (%)}21 (31) 23 (29) 27 (41) 0,28 Vacas inscritas con parto asistido 2 (3) 3 (4) 1 (2) 0,71 Vacas inscritas que parieron un becerro

_{hembra (%)}37 (55) 38 (48) 37 (56)

Vacas inscritas que parieron un becerro

_{macho (%)}23 (34) 37 (46) 25 (38)

_0,28Vacas inscritas que parieron gemelos (%) 4 (5) 0 (0) 2 (3)

Vacas inscritas que parieron mortinatos

3 (6) 5 (6) 2 (3)

J % )___________________________________

Días promedio de gestación al parto 274,9 277,4 275,2 0,06 BCS media al parto 3,36 3,41 3,40 0,42 Temperatura rectal promedio en la

_inscripción38,7 38,8 38,8 0,59 Total de animales inscritos (%) 67 (31) 80 (38) 66 (31)

El efecto no reivindicado del tratamiento sobre la producción de leche por semana de lactancia para vacas primíparas y multíparas se presenta en la Figura 1. La producción global de leche fue mayor para las vacas tratadas con IL-8; 33,1 kg/d (IC del 95 % = 32,0 - 34,2), 35,6 kg/d (IC del 95 % = 34,5 - 36,7), y 35,9 kg/d (IC del 95 % = 34,9 - 37,0) para las vacas de control, L-IL8 y H-IL8, respectivamente (Valor de P < 0,01). La paridad de4 variables, becerro, días promedio de gestación al parto, temperatura rectal en la inscripción y semana de lactancia se mantuvieron en el modelo. La interacción entre el tratamiento y la semana de lactancia no fue significativa (valor de P = 0,06).

El efecto no reivindicado del tratamiento sobre la producción de leche corregida con grasa durante los dos primeros meses de lactancia se presenta en la Figura 2. La producción global de leche corregida en grasa fue mayor para las mazorcas tratadas con IL-8; 34, 2 kg/d (IC del 95 % = 32,6 - 35,7), 37,1 kg/d (IC del 95 % = 35,7 - 38,5), y 36,6 kg/d (IC del 95 % = 35.0 - 38,1) para las vacas de control, L-IL8 y H-IL8, respectivamente (valor de P = 0,02). La paridad de las variables, la puntuación de la condición corporal al parto, los días promedio de gestación al parto, la temperatura rectal en la inscripción y el mes de lactancia se conservaron en el modelo. La interacción entre el tratamiento y el mes de lactancia no fue significativa (valor de P = 0,89).

El efecto no reivindicado del tratamiento sobre la producción de leche corregida por energía durante los primeros dos meses de lactancia se presenta en la Figura 3. La producción global de leche corregida por energía fue mayor para las mazorcas tratadas con IL-8; 32, 8 kg/d (IC del 95 % = 30,9 - 34,6), 35,7 kg/d (IC del 95 % =34,0 - 37,3) y 36,2 kg/d (IC del 95 % = 34,3 - 38,1) para las vacas de control, L-IL8 y H-IL8, respectivamente (valor de P = 0,02). La paridad de las variables, la puntuación de la condición corporal al parto, los días promedio de gestación al parto y el mes de lactancia se mantuvieron en el modelo. La interacción entre el tratamiento y el mes de lactancia no fue significativa (valor de P = 0,56).

El efecto no reivindicado del tratamiento en puntuación lineal de SCC durante los primeros dos meses de lactancia se presenta en la Figura 4. La puntuación lineal global del recuento de células somáticas no fue diferente entre grupos de tratamiento; 2, 46 (IC del 95 % = 1,64 - 3,28), 2,44 (IC del 95 % = 1,66 - 3,23) y 2,48 (IC del 95 % = 1,65 - 3,31) para las vacas de control, L-IL8 y H-IL8, respectivamente (valor de P = 0,99). Las variables parto asistido y mes de lactancia se mantuvieron en el modelo. La interacción entre el tratamiento y el mes de lactancia no fue significativa (valor de P = 0,09). El efecto del tratamiento en la incidencia de la metritis puerperal diagnosticada en la granja dependía de la paridad, y se presenta en la Figura 5; la interacción entre el tratamiento y la paridad fue significativa (valor de P < 0,01). Para animales hembra primíparas, las vacas H-IL8 fueron a 7,43 mayores probabilidades de tener metritis puerperal en comparación con las vacas de control (valor de P = 0,03), mientras que las probabilidades de tener metritis puerperal para las vacas L-IL8 y de control no fueron diferentes (valor de P = 0,27). Por otro lado, para hembras multíparas, el tratamiento intrauterino con IL-8 tuvo un efecto protector contra la metritis puerperal; las vacas de control fueron a 7,14 (valor de P = 0,02) y 5,88 (valor de P = 0,02) mayores probabilidades de tener metritis puerperal que las vacas L-IL8 y las vacas H-IL8, respectivamente. En una realización no limitativa, la divulgación se refiere a la profilaxis de la metritis puerperal en animales hembra multíparas. El efecto no reivindicado del tratamiento en la incidencia clínica de endometritis se presenta en la Figura 6. La infusión intrauterina de IL-8 no era protectora contra la endometritis clínica. (Valor de P = 0,73).

La concentración global de BHBA en sangre fue de 0,77 pmol/L (IC del 95 % = 0,65 - 0,90), 0,62 pmol/L (IC del 95 % = 0,50 - 0,74) y 70 pmol/L (IC del 95 % = 0,58 - 0,82) para las vacas de control, L-IL8 y H-IL8, respectivamente (valor de P = 0,22). Adicionalmente, la interacción entre el tratamiento y DIM no fue significativa (valor de P = 0,66, Figura 7).

La concentración global de IL-8 en sangre fue 235,0 pg/ml (IC del 95 % = 193,9 - 276,0), 275,5 pg/ml (IC del 95 % = 233,7 - 317,4) y 287,5 pg/ml (IC del 95 % = 246,0 - 329,0) para las vacas de control, L-IL8 y H-IL8, respectivamente (valor de P = 0,17, Figura 8). Las variables de la temperatura rectal en la inscripción y DIM se mantuvieron en el modelo. La interacción entre el tratamiento y DIM no fue significativa (valor de P = 0,16).

La mayoría de las muestras de leche probadas para la concentración de IL-8 tuvieron niveles por debajo del límite de detección del ensayo usado (1,5 pg/ml). A partir de todas las 182 muestras sometidas a ensayo, solo 13,7 % (25 muestras) tenían una concentración de IL-8 por encima del límite de detección. Por lo tanto, se puede hacer muy poca inferencia con respecto al efecto de la infusión intrauterina de IL-8 en la concentración en la leche de esta citocina. La proporción de muestras recogidas antes del tratamiento que tenían concentraciones de IL-8 por encima del límite de detección fue de 40.0 %, 43,0 % y 23,5 % para control, L-IL8 y H-IL8, respectivamente (valor de P = 0,10). La proporción de muestras recogidas después del tratamiento que tenía niveles de IL-8 por encima del límite de detección del ensayo fue de 2,2 %, 20.0 %, y 0,0 %, para control, L-IL8 y H-IL8, respectivamente (valor de P < 0,01).

La temperatura rectal global era 38,8 (IC del 95 % = 38,7 - 38,9), 38,8 (IC del 95 % = 38,8 - 38,9) y 38,8 0C (IC del 95 % = 38,8 - 38,9) para las vacas de control, L-IL8 y H-IL8, respectivamente (valor de P = 0,47, Figura 9). Las variables placenta en la inscripción, puntuación de la condición corporal al parto, días de gestación al parto y DIM se mantuvieron en el modelo. La interacción entre el tratamiento y DIM no fue significativa (valor de P = 0,13). A 6 DIM, las vacas de control tenían una temperatura rectal más baja en comparación con las vacas H-IL8 (valor de P = 0,02).

Los niveles de haptoglobina durante los primeros cuatro días después del parto no se vieron influenciados por el tratamiento (Figura 10); el nivel global de haptoglobina era de 0,13 (IC del 95 % = 0,11 - 0,16), 0,13 (IC del 95 % = 0,11 - 0,16), y 0,13 (IC del 95 % = 0,11 - 0,15) para las vacas de control, L-IL8 y H-IL8, respectivamente (valor de P = 0,96). Las variables paridad, becerro y DIM se mantuvieron en el modelo. La interacción entre el tratamiento y DIM no fue significativa (valor de P = 0,48).

El tratamiento no tuvo un efecto sobre la pérdida de puntuación de la condición corporal desde el día del parto hasta 35 DIM (Figura 11). La pérdida promedio de puntuación de la condición corporal fue 0,23 (IC del 95 % = 0,15 - 0,30), 0,23 (IC del 95 % = 0,16 - 0,30), y 0,23 (IC del 95 % = 0,16 - 0,31) para las vacas de control, L-IL8 y H-IL8, respectivamente (valor de P = 0,99). La paridad variable se retuvo en el modelo.

Los niveles generales de suero de IGF-1 fueron 149,9 ng/ml (IC del 95 % = 133,2 - 166,5), 172,0 ng/ml (IC del 95 % = 153,6 - 190,4) y 153,9 ng/ml (IC del 95 % = 136,5 - 171,4) para las vacas de control, L-IL8 y vacas H-IL8, respectivamente (valor de P = 0,18, Figura 12). La variable DIM se retuvo en el modelo. La interacción entre el tratamiento y DIM no fue significativa (valor de P = 0,25). Sin embargo, las vacas L-IL8 habían tenido o tendían a tener mayores niveles de IGF-1 sanguíneo en los días 1 (valor de P = 0,09), 2 (valor de P = 0,01) y 3 (valor de P = 0,08) postparto.

La concentración global de glucosa en suero fue 218,5 mg/dl (IC del 95 % = 195,2 - 241,8), 220,5 mg/dl (IC del 95 % = 196,7 - 244,3) y 241,6 mg/dl (IC del 95 % = 218,6-6- 264,5) para las vacas de control, L-IL8 y H-IL8, respectivamente (valor de P = 0,11, Figura 13). Las variables paridad, becerro y DIM se mantuvieron en el modelo. La interacción entre el tratamiento y DIM no fue significativa (valor de P = 0,53).

El efecto no reivindicado del tratamiento en la incidencia subclínica de cetosis se presenta en la Figura 14. El tratamiento con L-IL8 tuvo un efecto protector contra la cetosis subclínica; las vacas de control fueron a 8,04 mayores probabilidades de tener cetosis subclínica que las vacas L-IL8 (valor de P = 0,02). Sin embargo, la incidencia de cetosis subclínica no era diferente entre las vacas de control y H-IL8 (valor de P = 0,30).

Ejemplo 3 (referencia)

Este ejemplo reproduce la estrategia descrita en los Ejemplos 1 y 2 anteriores, y demuestra además que una dosificación de rIL-8 de intervalo más amplio es eficaz para mejorar la producción de leche y el contenido de la leche. El estudio también se realizó en una granja lechera comercial ubicada en Cayuga, NY. Se incluyeron un total de 341 vacas recién paridas en el estudio durante 116 días. Dentro de 12 horas del parto, las vacas se asignaron aleatoriamente para recibir una infusión intrauterina con 9,5 mg de rIL-8 (IL-8 Alta; n = 86), 0,095 mg de rIL-8 (IL-8 Media; n= 82), 0,0095 mg de rIL8 (IL8 Baja; n = 88), o no recibe tratamiento (Control; n = 85). Las vacas postparto se trataron dentro de las 12 horas después del parto. Las vacas se restringieron en las estaciones de bloqueo de cabeza y tuvieron su área perineal desinfectada con etanol (70 % v/v). Un catéter de inseminación artificial Gilt estéril (Livestock Concepts Inc., Hawarden, IA) unido a una bolsa salina de 250 mL, que contenía la dosis respectiva de rIL8, se introdujo en la vagina craneal, se manipuló a través del cuello uterino, y los tratamientos se infundieron en la cavidad uterina. La producción de leche se registró diariamente y se sometieron muestras de leche mensualmente al laboratorio (DairyOne, Ithaca, NY) para la evaluación de los componentes de la leche (proteína y grasa en la leche). La leche corregida en energía y en grasa al 3,5 % se calculó y se informó aquí.

El tratamiento con rIL8 aumentó el porcentaje de grasa en la leche independientemente de la dosis de tratamiento (Figura 16). El tratamiento con rIL8 también aumentó el rendimiento diario de leche (Figura 17), la producción semanal de leche (Figura 18), la leche corregida en grasa al 3,5 % (Figura 19) y la leche corregida en energía (Figura 20). Los resultados están de acuerdo con los resultados obtenidos de los experimentos descritos en los Ejemplos 1 y 2, y muestran que las vacas tratadas con rIL8 produjeron en promedio 10 libras más leche por día en comparación con el control.

Ejemplo 4 (referencia)

Este Ejemplo demuestra la administración intravaginal de IL-8. Para obtener los datos resumidos en la Figura 21, un total de 60 vacas se asignaron aleatoriamente para recibir un tratamiento con placebo (solución estéril; n=30) o 1,125 mg de rIL-8 (n=30). Los tratamientos y los placebos se administraron intravaginalmente. Las vacas inscritas estaban entre 30-80 días después del parto (lactancia tardía). Como puede verse en la Figura 21, el tratamiento intravaginal con IL-8 aumentó significativamente la producción de leche.

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Fuentes

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Claims

REIVINDICACIONES

i. Interleucina-8 (IL-8) para su uso en un procedimiento para mejorar la salud de un mamífero hembra, el uso comprende administrar al mamífero hembra una cantidad eficaz de interleucina-8 (IL-8);

en donde el mamífero hembra está dentro de las veinte semanas de parto; y

en donde la mejora de la salud del mamífero hembra comprende inhibir el desarrollo de la metritis puerperal.
2. Interleucina-8 (IL-8) para su uso según la reivindicación 1, en donde la mejora de la salud del mamífero comprende además la retención de la placenta reducida.
3. Interleucina-8 (IL-8) para su uso según las reivindicaciones 1 o 2, en donde la administración de la IL-8 es una administración intrauterina o una administración intravaginal.
4. Interleucina-8 (IL-8) para su uso según las reivindicaciones 1-3, en donde el mamífero hembra es un miembro de una población de mamíferos hembra de la misma especie, el procedimiento comprende además administrar la IL-8 a otros miembros de la población de manera que se produce una mejora en la salud de los otros miembros después de la administración.
5. Interleucina-8 (IL-8) para su uso según las reivindicaciones 1-4, en donde el mamífero es un mamífero bovino; en donde, opcionalmente, el mamífero bovino es una vaca lechera.
6. Un kit que comprende la IL-8 para su uso según la reivindicación 1, en donde la IL-8 está en uno o más recipientes sellados, el kit comprende además un dispositivo de administración, e instrucciones para introducir IL-8 en un mamífero hembra para obtener una mejora en la salud del mamífero hembra mediante la inhibición del desarrollo de metritis puerperal.
7. El kit de la reivindicación 6, en donde las instrucciones para introducir IL-8 comprenden instrucciones para introducir la IL-8 en una vaca lechera; o en donde el dispositivo de administración es un catéter adecuado para la administración intrauterina o intravaginal de la IL-8 a una vaca lechera.