JP2011502964A - インバリアント鎖発現および／または異所性ｃｌｉｐ結合の競合的阻害剤 - Google Patents

インバリアント鎖発現および／または異所性ｃｌｉｐ結合の競合的阻害剤 Download PDF

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Abstract

本発明は、ＣＬＩＰ分子のターゲッティングを介した免疫機能を調節するための方法に関する。結果は、自己免疫性疾患、癌、アルツハイマー病、アレルギー性疾患、移植および細胞移植拒絶、ＨＩＶ感染および他のウイルス、細菌および寄生虫感染、ならびにＡＩＤＳを含む多数の疾病および症状を処置するか、その発症を阻害するか、またはそれに対処するための、広範な新規の治療レジメンである。１または２以上のペプチド配列を、抗原配列におけるＭＨＣクラスＩＩ結合領域を予測するソフトウェアに供給することにより、ＣＬＩＰをはずして置換することができる特性を有するペプチドを製造するための方法、および関連する製品もまた提供される。

Description

関連出願
本願は、いずれも「インバリアント鎖発現および／または異所性ＣＬＩＰ結合の競合的阻害剤」と表題された２００７年１０月２３日に出願された米国仮出願第６１／０００，１５２号および２００８年７月２５日に出願された米国仮出願第６１／１３５，９６４号、ならびに「ウイルス性障害を処置するための方法」と表題された２００８年７月２５日に出願された米国仮出願第６１／１３７，１５０号に対して３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張し、これらは本明細書においてその全体が参照として組み込まれる。
発明の分野
本発明は、コンピューターに実装された分析の方法および結合するペプチドを同定するための方法に関する。本発明はまた、一般的に免疫学の分野に関する。さらにとりわけ、本発明は、ＣＬＩＰ阻害剤を用いて免疫機能を調節する能力、ならびに関連する製品および方法に関する。
発明の背景
ＨＩＶ感染を定義づける特徴は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の欠乏である。ウイルスによる感染ＣＤ４＋Ｔ細胞の直接の殺傷、またはＣＤ８＋リンパ球によるＨＩＶ感染細胞の「古典的な」殺傷を含む、多数の機構がＣＤ４＋Ｔ細胞の死に関与し得る。細胞傷害性Ｔ細胞による殺傷の有効性は、ウイルスのＴａｔおよびＮｅｆタンパク質の作用に起因する感染細胞表面におけるクラスＩの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の発現の下方調節により、劇的に損なわれる。しかし、細胞傷害性Ｔ細胞により媒介される殺傷を損なう同じＭＨＣクラスＩの発現の低下は、死を誘導する受容体の発現の増加と組み合わされた場合には、代わりに、ＮＫ細胞による殺傷の標的として細胞をマークし得る。
（ＭＨＣ）によりコードされる分子は、Ｔ細胞免疫の重要な成分である。これらの分子の組織適合性分子としての重要性は、１９３０年代の後期に最初に観察された。Peter GorerおよびGeorge Snellは、同じ種の遺伝子的に非同一のメンバーから腫瘍を移植した場合、腫瘍は常に拒絶されるが、同じ種の遺伝子的に同一のメンバー間で腫瘍を移植した場合、腫瘍は「受け入れられる」場合があり、同一遺伝子の動物において増殖する場合があることを観察した。その後、拒絶に関与する遺伝子複合体が、主要組織適合性分子として知られるタンパク質生成物をコードする一連の遺伝子であることが発見された。免疫応答遺伝子またはＩＲ遺伝子としても知られるこれらの遺伝子およびそれらのタンパク質生成物は、全ての移植片拒絶の原因である。ＭＨＣ分子には２つの型：ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩが存在する。全ての有核細胞は細胞表面ＭＨＣクラスＩを発現する。特殊化された細胞のサブセットはクラスＩＩのＭＨＣを発現する。特殊化された、専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）に含まれるのは、とりわけ、Ｂ細胞、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞およびランゲルハンス細胞である。
上記のとおり、Ｂ細胞はＭＨＣクラスＩＩを発現する。抗原がＢ細胞上の抗原受容体に結合すると、抗原およびその受容体は、エンドソーム区画中に貪食される。このコンパートメントは、ライソゾームとして知られる別のコンパートメントと融合する。Ｂ細胞は、抗原をより小さな部分に分解することおよび、ライソゾーム中でそれらの部分をＭＨＣクラスＩＩ中に取り込ませることにおいて、非常に効率的である。ＭＨＣは次いで、Ｂ細胞が抗原をＣＤ４＋Ｔ細胞に効果的に「提示」できる細胞表面に輸送される。活性化されたＣＤ４細胞はまた、ヘルパー細胞とも称され、Ｔｈ１およびＴｈ２の２種の主要なカテゴリーがある。
ＭＨＣ細胞は、応答が必要とされる抗原のみがＴ細胞に対して提示されることを保証するために、エンドソーム／ライソゾームコンパートメント中に固く保護される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、抗原の取り込みの前は、ＣＤ７４としても知られる、インバリアント鎖と称される分子と結びついている。インバリアント鎖は、ＭＨＣ分子の抗原結合溝（antigen binding groove）中への抗原の取り込みの前に、ＭＨＣクラスＩＩと結びついている（最近では特定のＭＨＣクラスＩ分子とも結びついていることが示されている）。抗原が処理された時、インバリアント鎖は、コンパートメント内でプロテアーゼにより切断される。第一に末端の断片が、次いでＣＬＩＰ（クラスＩＩインバリアント鎖関連ペプチド）として知られる別の断片が取り除かれる。ＣＬＩＰは、抗原が正しく処理されるまで、最終的に抗原が保持される溝を充填する。ＣＬＩＰを含むインバリアント鎖の詳細な概説については、本明細書においてその全体が組み込まれるMatzaら、Trends Immunol., 24(5): 264-268, 2003を参照のこと。インバリアント鎖およびＣＬＩＰについてのこの「シャペロン」の役割が同定されているにも関わらず、免疫のシグナリングおよび活性に対するこれらの分子の完全な影響は、当該分野によりまだ理解されておらず、インバリアント鎖の発現または異所性ＣＬＩＰ結合を阻害することにより何らかの有用な働きがあるという認識は、先行技術には全く存在していなかった。
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によりコードされる分子は、Ｔ細胞免疫の重要な成分である。これらの分子の組織適合性分子としての重要性は、１９３０年代の後期に最初に観察された。Peter GorerおよびGeorge Snellは、同じ種の遺伝子的に非同一のメンバーから腫瘍を移植した場合、腫瘍は常に拒絶されるが、同じ種の遺伝子的に同一のメンバー間で腫瘍を移植した場合、腫瘍は「受け入れられる」場合があり、同一遺伝子の動物において増殖する場合があることを観察した。その後、拒絶に関与する遺伝子複合体が、主要組織適合性分子として知られるタンパク質生成物をコードする一連の遺伝子であることが発見された。免疫応答遺伝子またはＩＲ遺伝子としても知られるこれらの遺伝子およびそれらのタンパク質生成物は、全ての移植片拒絶の原因である。ＭＨＣ分子には２つの型：ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩが存在する。全ての有核細胞は細胞表面ＭＨＣクラスＩを発現する。特殊化された細胞のサブセットはクラスＩＩのＭＨＣを発現する。特殊化された、専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）に含まれるのは、とりわけ、Ｂ細胞、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞およびランゲルハンス細胞である。
上記のとおり、Ｂ細胞はＭＨＣクラスＩＩを発現する。抗原がＢ細胞上の抗原受容体に結合すると、抗原およびその受容体は、エンドソーム区画中に貪食される。このコンパートメントは、ライソゾームとして知られる別のコンパートメントと融合する。Ｂ細胞は、抗原をより小さな部分に分解することおよび、ライソゾーム中でそれらの部分をＭＨＣクラスＩＩ中に取り込ませることにおいて、非常に効率的である。ＭＨＣは次いで、Ｂ細胞が抗原をＣＤ４＋Ｔ細胞に効果的に「提示」できる細胞表面に輸送される。活性化されたＣＤ４細胞はまた、ヘルパー細胞とも称され、Ｔｈ１およびＴｈ２の２種の主要なカテゴリーがある。
ＭＨＣ細胞は、応答が必要とされる抗原のみがＴ細胞に対して提示されることを保証するために、エンドソーム／ライソゾームコンパートメント中に固く保護される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、抗原の取り込みの前は、ＣＤ７４としても知られる、インバリアント鎖と称される分子と結びついている。インバリアント鎖は、ＭＨＣ分子の抗原結合溝（antigen binding groove）中への抗原の取り込みの前に、ＭＨＣクラスＩＩと結びついている（最近では特定のＭＨＣクラスＩ分子とも結びついていることが示されている）。抗原が処理された時、インバリアント鎖は、コンパートメント内でプロテアーゼにより切断される。第一に末端の断片が、次いでＣＬＩＰ（クラスＩＩインバリアント鎖関連ペプチド）として知られる別の断片が取り除かれる。ＣＬＩＰは、抗原が正しく処理されるまで、最終的に抗原が保持される溝を充填する。ＣＬＩＰを含むインバリアント鎖の詳細な概説については、本明細書においてその全体が組み込まれるMatzaら、Trends Immunol., 24(5): 264-268, 2003を参照のこと。インバリアント鎖およびＣＬＩＰについてのこの「シャペロン」の役割が同定されているにも関わらず、免疫のシグナリングおよび活性に対するこれらの分子の完全な影響は、当該分野によりまだ理解されておらず、インバリアント鎖の発現または異所性ＣＬＩＰ結合を阻害することにより何らかの有用な働きがあるという認識は、先行技術には全く存在していなかった。
発明の要旨
本発明は、いくつかのの側面において、複対立遺伝子標的タンパク質に対するペプチドの結合アフィニティーを、複アレルなどの構造的類似性を有するタンパク質のファミリーにおいて比較するコンピューター分析に関する。例として、ペプチドを同定するために、それらがＣＬＩＰをＭＨＣアレルの結合溝からはずして置換する（displace）能力について、コンピューター分析を行った。本発明の方法を用いて、任意のＭＨＣアレルによりコードされる任意のＭＨＣ分子の溝からＣＬＩＰをはずして置換することができるペプチドについて最適な配列を同定した。
いくつかの側面において本発明は、
類似の結合部位を有する少なくとも２つの標的タンパク質について、結合部位についてのデータポイントのアミノ酸予測マトリックスを準備すること、ここで、前記予測マトリックスは、アミノ酸を表わす第１軸および結合部位の位置番号を表わす第２軸を有し、ここで、各データポイントは、その結合部位の位置番号でのアミノ酸についてのスコアを表わす、
前記少なくとも２つの標的タンパク質についての前記アミノ酸予測マトリックスにおける各々のデータポイントについての平均スコアを準備すること、ならびに
結合ペプチドの各部位についてゼロまたはそれより大きなスコアを有するアミノ酸を選択することにより、各々のデータポイントについての平均スコアに基づいて結合ペプチドを決定すること、
により、標的タンパク質結合ペプチドを同定するための、コンピューターに実装された方法である。
他の側面において本発明は、
類似の結合部位を有する少なくとも２つの標的タンパク質についてのアミノ酸予測マトリックスのセットにおける各データポイントについての平均スコアをコンピューターで計算すること、ここで、前記予測マトリックスは、アミノ酸を表わす第１軸および結合部位の位置番号を表わす第２軸を有し、ここで、各データポイントは、その結合部位の位置番号におけるアミノ酸についてのスコアを表わす、ならびに
結合ペプチドの各部位についてゼロまたはそれより大きなスコアを有するアミノ酸を選択することにより、各データポイントについての平均スコアに基づいて結合ペプチドを決定すること
により標的タンパク質結合ペプチドを同定するための、コンピューターに実装された方法である。
本発明は、いくつかの態様において、最高平均スコアに基づいて結合ペプチドを決定することに関する。他の態様において、類似の結合部位を有する全ての標的タンパク質についてのアミノ酸予測マトリックスを準備する。なお他の態様において、少なくとも２つの標的タンパク質は、ある遺伝子（例えばＭＨＣクラスＩＩまたはＭＨＣクラスＩ）のアレルに対応する。
また、結合ペプチドについて予測されるペプチド結合スコアを作成してもよく、予測されるペプチド結合スコアを予測されるＣＬＩＰ結合スコアと比較してもよく、ここで、予測されるペプチド結合スコアが予測されるＣＬＩＰ結合スコアよりも高いかまたは等価である場合、ペプチドはＣＬＩＰ阻害剤である。
他の態様において、各々のデータポイントについての平均スコアの結果を表示し、それにより少なくとも１つの結合ペプチドのアミノ酸配列を出力する。
本発明の他の側面にしたがって、１または２以上のプロセッサにおいて実行可能な指示をコードするコンピューター可読媒体が提供され、ここで、前記指示は、実行された場合に標的タンパク質結合ペプチドを自動的に同定する方法を実施する。前記方法は、類似の結合部位を有する少なくとも２つの標的タンパク質についてのアミノ酸予測マトリックスのセットにおける各々のデータポイントについての平均スコアを計算すること、ここで、前記予測マトリックスは、アミノ酸を表わす第１の軸および結合部位の位置番号を表わす第２の軸を有し、ここで、各データポイントは、その結合部位の位置番号におけるアミノ酸についてのスコアを表わす、ならびに結合ペプチドの各々の位置についてゼロまたはそれより大きなスコアを有するアミノ酸を選択することにより、各データポイントの平均スコアに基づいて結合ペプチドを決定すること、を含む。
他の側面において、本発明は、対象のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルを決定すること、ならびにＣＬＩＰ阻害剤がＣＬＩＰをＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルからはずして置換することについて有効であるか否かを決定することにより、ＣＬＩＰ阻害剤による処置に対して感受性である対象を同定するための方法であり、ここで、前記ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルがＣＬＩＰ阻害剤と結びつく場合、前記対象はＣＬＩＰ阻害剤による処置に対して感受性である。
本発明の他の側面に従って、対象のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルを決定し、該対象に、ＣＬＩＰを細胞の表面からはずして置換するために有効な量のＣＬＩＰ阻害剤を投与することにより、対象をＣＬＩＰ阻害剤により処置する方が提供される。
本発明の他の側面に従って、ＣＬＩＰ阻害剤を同定するための方法が提供される。方法は、予測されるペプチド結合スコアを作成するために、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルのペプチドへの結合についてのアミノ酸予測マトリックスを分析すること、予測されるペプチド結合スコアを予測されるＣＬＩＰ結合スコアと比較すること、を含み、ここで、予測されるペプチド結合スコアが予測されるＣＬＩＰ結合スコアより高いかまたは等価である場合、ペプチドはＣＬＩＰ阻害剤である。いくつかの態様において、方法は、ＭＨＣ特異的ＣＬＩＰ阻害剤を同定するための方法であって、単一のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲについて単一のアミノ酸予測マトリックスを用いる。他の態様において、方法は、複数のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲについての予測マトリックスのセットについて行われ、平均予測ペプチドスコアが作成される。
別の側面に従って、対象特異的ＣＬＩＰ阻害剤を同定するために、対象のＭＨＣクラスＩＩのアレルを決定すること、およびＭＨＣクラスＩＩのアレルに基づいてＣＬＩＰ阻害剤であるペプチドを決定することによる、対象特異的ＣＬＩＰ阻害剤を同定するための方法が提供される。一態様において、ペプチドを、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩアレルとの所定の関係に基づいて決定する。別の態様において、ペプチドを、予測されるペプチド結合スコアを作成するためにＭＨＣクラスＩＩアレルのペプチドへの結合についての予測マトリックスを分析すること、予測されるペプチド結合スコアを予測されるＣＬＩＰ結合スコアと比較することにより決定し、ここで、予測されるペプチド結合スコアが予測されるＣＬＩＰ結合スコアよりも高いかまたは等価である場合、ペプチドを、対象特異的ＣＬＩＰ阻害剤として同定する。
本発明のなお別の側面にしたがって、疾患特異的ＣＬＩＰ阻害剤を同定するための方法が提供される。方法は、疾患特異的ＣＬＩＰ阻害剤を同定するために、ある疾患についての優性（predominant）のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルを決定すること、および、前記ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルに基づいてＣＬＩＰ阻害剤であるペプチドを決定することを含む。
他の側面において、本発明は、少なくとも部分的に、ＣＬＩＰ阻害剤が、Ｔｒｅｇなどの調節性Ｔ細胞の活性を増強すること、γδＴ細胞などのエフェクターＴ細胞の活性、増殖（expansion）もしくは機能に干渉すること、および／または抗原に非特異的に活性化されたＢ細胞の殺傷をもたらす活性を誘導することにより、免疫細胞の機能を変化させる、という発見に基づく。本発明のＣＬＩＰ阻害剤は、ウイルス感染、例えばＨＩＶ、細菌感染および寄生虫感染などを含む感染症、自己免疫疾患、癌、アレルギー性疾患、アルツハイマー病ならびに組織移植片拒絶などの障害の処置において有用である。
本発明は、対象をＭＨＣ分子中のＣＬＩＰをはずして置換するペプチドで処置することにより、ＣＬＩＰを標的化するための有効な方法を提供する。本発明は、この目的のための新規ペプチドを提供するが、また、上記のとおりＣＬＩＰをはずして置換することができる他のペプチドを明らかにするための方法も提供する。これらのペプチドは、簡易に合成できる非常に短いものであり得る。
いくつかの側面において、本発明は、Ｘ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＸ６Ｘ７（配列番号３）の単離されたペプチドであって、ここで、各Ｘはアミノ酸であり、ここでＲはアルギニン、Ｌはロイシンであり、ここで、Ｘ２およびＸ３の少なくとも１つはメチオニンであり、ここで、ペプチドはＮ−ＭＲＭＡＴＰＬＬＭ−Ｃ（配列番号４）ではなく、ここで、ペプチドはＣＬＩＰ置換物（displacer）である。いくつかの態様において、Ｘ１はフェニルアラニン、Ｘ２はイソロイシン、Ｘ３はメチオニン、Ｘ４はアラニン、Ｘ５はバリン、Ｘ６はアラニン、および／またはＸ７はセリンである。他の態様において、ペプチドはさらに１〜５個のアミノ酸をＮおよび／またはＣ末端において含む。例えば、ペプチドは、Ｘ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＸ６Ｘ７（配列番号３）のＣ末端において１〜５個のアミノ酸を含んでもよく、および／またはペプチドは、Ｘ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＸ６Ｘ７（配列番号３）のＮ末端において１〜５個のアミノ酸を含む。一部の態様において、ペプチドは、ＦＲＩＭＸ４ＶＬＸ６Ｓ（配列番号６）を含み、ここで、Ｘ４およびＸ６は任意のアミノ酸であり、ここでＸ４およびＸ６は任意にアラニンである。他の態様にしたがって、ペプチドは、ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）またはＮ−ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ−Ｃ（配列番号７）を含む。なお他の態様において、ペプチドは、本質的にＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）からなる。他の態様において、ペプチドはＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）からなる。ペプチドは、最短で９アミノ酸の長さを有する。一部の態様において、ペプチドは９〜２０アミノ酸の長さを有する。ペプチドは、環式であっても非環式であってもよい。一部の態様において、ペプチドはＰＥＧ化されている。
他の側面において、本発明は、ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）を含む単離されたペプチドである。
本発明のペプチドとキャリアとの組成物が、他の側面において提供される。いくつかの態様において、キャリアは、ステルスリポソーム（stealth liposome）などのリポソームである。他の態様において、キャリアは、粒子、例えばナノ粒子または低密度粒子である。他の態様において、キャリアは経粘膜吸収促進剤である。
本発明はいくつかの側面において、ＣＬＩＰ分子を発現する細胞を、該ＣＬＩＰ分子を発現する細胞によるγδＴ細胞の増殖、活性化および／またはエフェクター機能に干渉するために有効な量の本発明のペプチドと接触させることにより、γδＴ細胞の増殖、活性化および／またはエフェクター機能に関連する疾患を処置するための方法である。一部の態様において、γδＴ細胞は、ｖγ９ｖδ２Ｔ細胞である。γδＴ細胞の増殖および／または活性化に関連する障害として、例えば自己免疫性疾患、ＨＩＶ感染、ならびに細胞、組織および移植片拒絶が挙げられる。
いくつかの態様において、ＣＬＩＰ分子を発現する細胞はＢ細胞である。他の態様において、ＣＬＩＰ化合物を発現する細胞は、ニューロン、オリゴデンドロサイト、ミクログリア細胞、またはアストロサイトである。なお他の態様において、ＣＬＩＰ化合物を発現する細胞は、心臓の細胞、膵臓ベータ細胞、腸上皮細胞、肺細胞、子宮内膜の上皮細胞（epithelial cell lining the uterine wall）、および皮膚細胞である。細胞がＢ細胞である場合、方法はさらに、Ｂ細胞を、該Ｂ細胞を殺傷するために有効な量の抗ＨＬＡクラスＩまたはＩＩ抗体と接触させることを含んでもよい。
対象にＣＬＩＰ阻害剤と薬学的に許容可能なキャリアとの組成物を投与することにより疾患を処置するための方法もまた提供される。いくつかの側面において、ＣＬＩＰ阻害剤は、ＭＨＣクラスＩＩのＣＬＩＰの阻害剤である。他の態様において、ＣＬＩＰ阻害剤は本発明のペプチドである。これらの側面において、疾患は、ＨＩＶ、ヘルペス、Ａ、ＢもしくはＣ型肝炎、ＣＭＶ、ＥＢＶまたはBorrelia burgdorferiなどのウイルス感染、リーシュマニアもしくはマラリアなどの寄生虫感染、アレルギー性疾患、アルツハイマー病、自己免疫性疾患、あるいは細胞または組織移植片であってもよい。本発明のこれらの側面において、ＣＬＩＰ阻害剤はまた、ＭＨＣクラスＩの阻害剤であってもよい。ＣＬＩＰ阻害剤がＭＨＣクラスＩのＣＬＩＰの阻害剤である他の側面において、疾患は癌または細菌感染であってもよい。
いくつかの態様において、投与は８週間の期間にわたって行う。他の態様において、投与は週二回であり、それは連続した日におけるものであってよい。他の態様において、投与はまた、経口、非経口、皮下、静脈内、鼻内、肺内、筋肉内および粘膜投与の少なくとも１つであってよい。
いくつかの態様において、方法は、抗ＨＩＶ剤、抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、抗菌剤、抗癌剤、抗アレルギー性医薬、または自己免疫疾患用医薬などの別の医薬を対象に投与することを含む。他の態様において、方法は、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、ナノ粒子、ヌクレオチドｐｐＧｐｐおよびｐｐｐＧｐｐ、殺菌したBordetella pertussisまたはそのコンポーネント、Corynebacterium由来のＰ４０コンポーネント、殺菌したコレラ毒素またはその一部分、および／または殺菌したマイコバクテリアまたはそのコンポーネントなどのアジュバントを投与することを含む。
いくつかの態様において、方法は、本明細書において記載される任意の組成物を投与することを含む。
いくつかの態様において、自己免疫疾患は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、ウイルス性心内膜炎、ウイルス性脳炎、炎症性腸疾患、関節リウマチ、グレーブス病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性筋炎または円板状エリテマトーデスである。他の態様において、移植組織または細胞は、心臓、肺、腎臓、皮膚、角膜、肝臓、神経型の組織または細胞、造血または胚性幹細胞を含む幹細胞である。
本発明は、その用途において、以下の説明において記載されるかまたは図面において説明される成分の構成および配置の詳細に限定されない。本発明は、他の態様が可能であり、多様な方法において実施することまたは実行することが可能である。また、本明細書において用いられる用語および専門用語は、説明を目的とするものであり、限定するものとしてみなされるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、または「有する」、「含む（containing）」、「含む（involving）」およびこれらの変化形は、本明細書において、その後に列記される品目およびそれらの等価物ならびにさらなる品目を包含することを意味する。本明細書において用いられる場合、「ａ」または「ａｎ」の特定は、１または２以上を意味し得る。本請求の範囲において用いられる場合、語「含む（comprising）」と組み合わせて用いられる場合、語「ａ」または「ａｎ」は、１または１より多くを意味し得る。本明細書において用いられる場合、「別の」は、少なくとも２番目または３番目以上を意味し得る。
添付の図面は原寸で描かれることを意図されていない。図面において、多様な図中に描図される各々の同一またはほぼ同一の成分は、類似の数詞により表わされる。明確化を目的として、各図面における全ての成分が標識されているわけではない。図面中：
図１は、耐性のＣ５７Ｂｌ６、対、感受性のコクサッキーウイルス感染マウスにおける、感染の１〜５日後のＢ細胞の殺傷の％を表わす。 図２Ａおよび２Ｂは、ＣＤ４０リガンド活性化Ｂ細胞を自家性ＰＭＢＣと５日間共培養した５日培養物のフローサイトメトリー分析を表わすドットプロットである。
図３は、胸腺核タンパク質（ＴＮＰ）混合物に対する応答におけるモデルＢ細胞株（DaudiおよびRaji）の表面からのＣＬＩＰの除去・置換を表わす。図３Ａは３時間の反応である。 図３は、胸腺核タンパク質（ＴＮＰ）混合物に対する応答におけるモデルＢ細胞株（DaudiおよびRaji）の表面からのＣＬＩＰの除去・置換を表わす。図３Ａは３時間の反応である。 図３は、胸腺核タンパク質（ＴＮＰ）混合物に対する応答におけるモデルＢ細胞株（DaudiおよびRaji）の表面からのＣＬＩＰの除去・置換を表わす。図３Ｂは２４時間の反応である。 図３は、胸腺核タンパク質（ＴＮＰ）混合物に対する応答におけるモデルＢ細胞株（DaudiおよびRaji）の表面からのＣＬＩＰの除去・置換を表わす。図３Ｂは２４時間の反応である。 図３は、胸腺核タンパク質（ＴＮＰ）混合物に対する応答におけるモデルＢ細胞株（DaudiおよびRaji）の表面からのＣＬＩＰの除去・置換を表わす。図３Ｃは４８時間の反応である。 図４は、２−デオキシグルコースおよびジクロロ酢酸がＢ細胞表面のＣＬＩＰに影響を及ぼすことを表わす。 図５は、４時間（５Ａおよび５Ｂ）ならびに２４時間（５Ｃおよび５Ｄ）の、未処置（５Ａおよび５Ｃ）またはＭＫＮ．５による処置（５Ｂおよび５Ｄ）に対する応答におけるRaji Ｂ細胞株の表面からのＣＬＩＰの除去・置換を表わす。
図６は、４時間（６Ａおよび６Ｂ）ならびに２４時間（６Ｃおよび６Ｄ）の、未処置（６Ａおよび６Ｃ）またはＭＫＮ．５による処置（６Ｂおよび６Ｄ）に対する応答におけるDaudi Ｂ細胞株の表面からのＣＬＩＰの除去・置換を表わす。 図７は、ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）による２４時間の処置に対する応答における、Raji（７Ｂ）またはDaudi（７Ａ）Ｂ細胞株の表面からのＣＬＩＰの除去・置換を表わす。 図８は、未処置またはＭＫＮ．４もしくはＭＫＮ．６による処置に対する応答におけるDaudi細胞の表面におけるＣＬＩＰ（８Ａ）、ＨＬＡ ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ（８Ｂ）の染色を示す棒グラフのセットである。
図９は、未処置またはＭＫＮ．４もしくはＭＫＮ．１０による処置に対する応答におけるＢ細胞の表面におけるＣＬＩＰ（ｙ軸）およびＨＬＡ ＤＲ（ｘ軸）の染色を示す。 図１０は、未処置（１０Ａ）もしくはＤＭＳＯ（１０Ｇ）、またはＭＫＮ．３、ＭＫＮ５、ＭＫＮ６、ＭＫＮ．８もしくはＭＫＮ．１０による処置（それぞれ１０Ｂ〜１０Ｆ）に対する応答におけるＢ細胞の表面におけるＣＬＩＰ（ｙ軸）およびＨＬＡ ＤＲ（ｘ軸）の染色を表わす。 図１０は、未処置（１０Ａ）もしくはＤＭＳＯ（１０Ｇ）、またはＭＫＮ．３、ＭＫＮ５、ＭＫＮ６、ＭＫＮ．８もしくはＭＫＮ．１０による処置（それぞれ１０Ｂ〜１０Ｆ）に対する応答におけるＢ細胞の表面におけるＣＬＩＰ（ｙ軸）およびＨＬＡ ＤＲ（ｘ軸）の染色を表わす。 図１０は、未処置（１０Ａ）もしくはＤＭＳＯ（１０Ｇ）、またはＭＫＮ．３、ＭＫＮ５、ＭＫＮ６、ＭＫＮ．８もしくはＭＫＮ．１０による処置（それぞれ１０Ｂ〜１０Ｆ）に対する応答におけるＢ細胞の表面におけるＣＬＩＰ（ｙ軸）およびＨＬＡ ＤＲ（ｘ軸）の染色を表わす。 図１１は、未処置（１１Ａ）またはＭＫＮ．６（１１Ｂ）もしくはＴＮＰ（１１Ｃ）による処置に対する応答におけるＴｒｅｇを表わす。
図１２は、ＴＬＲアクチベーターがＣＬＩＰ−ＭＨＣ ＨＬＡの結びつきを促進し、ＣＬＩＰ阻害剤ペプチドがＴＬＲアクチベーターにより促進されたＣＬＩＰ−ＭＨＣ ＨＬＡの結びつきを低下させることを示す。図１２は、一方の側において全Ｂ細胞死の％（菱形はＣｐＧ ＯＤＮのみを表わし、正方形はＣｐＧのＯＤＮ＋ＭＫＮ３を表わす）を表わし、他方の側においてＣＬＩＰ＋のＢ細胞死の％（三角形はＣｐＧ ＯＤＮおよびＣＬＩＰのみを表わし、ＸはＣｐＧ ＯＤＮ＋ＭＫＮ３およびＣＬＩＰを表わす）を表わす、二重のＹ軸を有する線グラフである。
図１３は、脾臓およびリンパ節におけるＣＬＩＰ陽性Ｂ細胞の変化を示す。図１３は、一方の側に脾臓におけるＣＬＩＰ＋Ｂ細胞数の％（実線を伴う明灰色の正方形はＣｐＧ ＯＤＮのみを表わし、実線を伴う暗灰色の正方形はＣｐＧ ＯＤＮ＋ＭＫＮ３を表わす）を表わし、他方の側にリンパ節におけるＣＬＩＰ＋Ｂ細胞数の％（破線を伴う菱形はＣｐＧ ＯＤＮのみを表わし、破線を伴う明灰色の正方形はＣｐＧ ＯＤＮ＋ＭＫＮ３を表わす）を表わす、二重のＹ軸を有する線グラフである。
図１４は、多数の異なるＴＬＲアクチベーターによる処置の存在下または不在下における、ＣＬＩＰ陽性のＢ６．１２９培養Ｂ細胞（Ｈ−２ｂハプロタイプ）およびＨ２Ｍ−／−（Ｃ３Ｈ ＨｅＪマウスからのもの）培養Ｂ細胞を試験するグラフのセットである。 図１５は、ＨＩＶ感染ヒトの末梢血およびリンパ節中に存在する細胞の型を示す表およびグラフのセットである。対象の特徴は、図１５における表中に示す。図１５Ａは、ＣＤ２０＋ＣＬＩＰ＋Ｂ細胞の量を平均蛍光強度として表わす線グラフである。図１５Ｂおよび１５Ｃは、リンパ節（ＬＮ）または末梢血（ＷＢ）中の異なるタイプのＣＬＩＰ＋細胞のパーセンテージを表わす線グラフである。
図１６は、ＦＲＭＩＡＶＬＡＳ（配列番号２）についてのアフィニティーに基づく、より速いＡＩＤｓの進行のリスクを表わすグラフである。図１６のｘ軸はリスクファクターであり、ｙ軸は結合スコアである（より高いものはより強い結合相互作用を予測する）。 図１７は、脾臓対リンパ節の細胞性（cellularity）、およびＴＬＲリガンドによる活性化後のＣＬＩＰ＋Ｂ細胞を評価するためのin vivo研究を表わす線グラフのセットである。
図１８は、表面にＣＬＩＰを有するＭＨＣクラスＩＩ分子の模式図である。図は、いくつかの自己ペプチドが、特定のＭＨＣクラスＩＩに対してより強力なアフィニティーを有し得、むしろＣＬＩＰを無力化する可能性が高いことを表わす。いくつかの対象は、ＣＬＩＰを強固に保持するＭＨＣクラスＩＩを有し、したがって、ＣＬＩＰを強固に保持するＭＨＣクラスＩＩを有さず疾患のＨＩＶへの進行が遅いことが予測される他のものよりも、疾患のＨＩＶへの進行が速いことが予測される。
詳細な説明
開示の明確性のために、限定することなく、本発明の詳細な説明を以下のサブセクションに分割する：
（ｉ） 結合するペプチドを同定するための方法
（ｉｉ） ＣＬＩＰ／Ｔｒｅｇ／疾患
（ｉｉｉ） ＣＬＩＰ阻害剤
（ｉｖ） 本発明の組成物の使用
（ｖ） 感染性疾患
（ｖｉ） 移植／移植片拒絶
（ｖｉｉ） 自己免疫疾患
（ｖｉｉｉ） 癌
（ｉｘ） アルツハイマー病
（ｘ） アレルギー性疾患
（ｘｉ） ＣＬＩＰ阻害剤活性の特徴づけおよび実証
（ｘｉｉ） 抗体との組合せ
（ｘｉｉｉ） 投与レジメン
（ｘｉｖ） 投与、剤形
（ｘｖ） ペプチドの合成（精製、組み換え、ペプチド合成）
（ｘｖｉ） 製品
（ｘｖｉｉ） 治療モニタリング
（ｉ）結合するペプチドを同定するための方法
コンピューター分析を含む、理想的な結合特性を有するペプチドを同定するための方法が、本明細書において提供される。方法は、複対立遺伝子などの構造的類似性を有するタンパク質のファミリー中の標的タンパク質への推定されるペプチドの結合アフィニティーを比較することを含む。方法は、試験される標的タンパク質の全てについての理想的な結合物（binder）を同定するために、コンピューターにより補助される、標的タンパク質の各々についての結合部位中の各アミノ酸における特定のアミノ酸に対する結合部位のアフィニティーの比較を含む。標的タンパク質は類似の結合部位を有するタンパク質である。「類似の結合部位を有するタンパク質」とは、異なる一次構造を有するが、他方と同じ結合パートナーに結合するものである。好ましくは、これらのタンパク質は、結合パートナーに対する結合部位において、少なくとも８０％の相同性を共有する。一部の態様において、これらのタンパク質は、結合パートナーに対する結合部位において、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を共有する。類似の結合部位を有する標的タンパク質は、アレルのバリアントから生成されるタンパク質であってもよい。例えば、ＭＨＣクラスＩとＩＩとは、複対立遺伝子であり、類似の結合部位を有する標的タンパク質を産生する。
標的タンパク質結合ペプチドは、結合部位についてのデータポイントのアミノ酸予測マトリックスを用いて同定することができる。アミノ酸予測マトリックスの例を、例の後の表４／付録Ａに示す。表４／付録Ａは、Singh, H.およびRaghava, G.P.S. (2001)、「ProPred: prediction of HLA-DR binding sites.」（Bioinformatics, 17(12), 1236-37）から複製されるものであり、本発明の一部ではない。
第１軸は、ｘ軸であってもｙ軸であってもよく、群中の各アミノ酸を表わす。アミノ酸の群は、２０個の主要（primary）または標準（standard）アミノ酸の全てまたはそれ以下を含む。２０個の一次アミノ酸およびそれらの一般的に公知の特性は、以下の表１に含められる。第１軸は、一次アミノ酸の全てを含んでよく、または一次アミノ酸の全てより少ないものを含んでよく、たとえばこれは１０個またはそれ以上を含んでもよい。
Figure 2011502964
アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であっても、天然に存在しないアミノ酸であってもよい。天然に存在するアミノ酸は、アミノ基がＣＯＯＨ基の後の最初の炭素原子に結合しているので、一般にαアミノ酸である。
第２の軸は、結合部位の位置番号を表わす。結合部位の位置番号とは、推定される結合ペプチドにおけるアミノ酸の位置番号を指す。慣用的に、ペプチドはＮ末端からＣ末端の方へ数える。しかし、予測マトリックスにおける位置番号は、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかから読んだアミノ酸の番号も指す場合がある。
第１の軸および第２の軸の交差により、データポイントがもたらされる。予測マトリックスにおける各データポイントは、その結合部位の位置番号におけるアミノ酸についてのスコアを表わす。スコアは正もしくは負の番号であり得、またはこれはゼロであってもよい。正のスコアは、結合ペプチドのその位置におけるアミノ酸についての標的ペプチドへの良好な結合の予測を反映する。負のスコアは、結合ペプチドのその位置のアミノ酸は、結合相互作用を妨げる可能性があることを示す。ゼロのスコアは、その位置において２つのペプチド間の結合に関して中性（neutral）であるアミノ酸を反映する。
平均スコアを、次いで、アミノ酸予測マトリックス中の各データポイントについて準備する。平均スコアは、標的タンパク質の全てについて予測マトリックス上の特定の交差点における各データポイントを加算し、予測マトリックスの合計数／分析された標的タンパク質により割ることによりもたらされる。平均の結果を、平均予測マトリックスと称する別の予測マトリックスにおいて表示することができる。平均予測マトリックスは、第１軸と第２軸とを、データポイントとともに含む。各データポイントは、本明細書において、標的タンパク質の全てについての平均スコアを反映する。
結合ペプチドを、次いで、各データポイントについての平均スコアに基づいて、ゼロまたはそれより大きなスコアを有するアミノ酸を結合ペプチドの各部位について選択することにより、決定することができる。いくつかの例において、特異的結合物である可能性が最も高いペプチドを選択するために、各アミノ酸結合部位について最大のスコアを選択することが望ましい場合がある。しかし、選択されるペプチドが最大のスコアを有する必要はない。ゼロまたはそれより大きなスコアを有するデータポイントに基づく複数のペプチドまたは全ての可能性がある結合ペプチドを選択することが望ましい場合がある。
分析は、標的タンパク質のセットについて行うことができる。セットは、類似の結合部位を有する標的タンパク質の全てを含んでもよい。しかし、これは、類似の結合部位を有する標的タンパク質の全てより少ないものを含んでもよい。実際に、これは、セット中に２つの標的タンパク質しか含まなくともよい。
結果を表示することは必要ではないが、各データポイントについての平均スコアを、コンピュータースクリーンなどの物理的な形式において表示してもよい。結果を表示しない場合、これらをさらにコンピューターにより処理することができる。結果を表示する場合、少なくとも１つの結合ペプチドのアミノ酸配列を出力することは、表示から明らかである。
特定の例において、ペプチドをそれらのＭＨＣのアレルの結合溝からＣＬＩＰをはずして置換する能力について同定するために、コンピューター分析を行った。本発明の方法を用いて、任意のＭＨＣのアレルによりコードされる任意のＭＨＣ分子の溝からＣＬＩＰをはずして置換し得るペプチドについての最適な配列を同定した。また、結合ペプチドについて予測されるペプチド結合スコアを作成してもよく、予測されるペプチド結合スコアを予測されるＣＬＩＰ結合スコアと比較してもよい。ここで、予測されるペプチド結合スコアが予測されるＣＬＩＰ結合スコアよりも高い場合、ペプチドはＣＬＩＰ阻害剤である。
概説されるＣＬＩＰの例において、標的タンパク質のセットを分析することは必要ではない。単一のＭＨＣペプチドを用いてコンピューターによる方法を行うことができ、同定される結合ペプチドを、ＭＨＣペプチドに対するＣＬＩＰの結合と比較することができる。
上述のことから、互いに独立してまたは任意の組み合わせにおいて用いることができる、本明細書において記載される本発明の多数の側面が存在することが理解されるべきである。特に、多数の組み合わせおよび手順の任意のものにおいて、本明細書において記載される操作のいずれを使用してもよい。さらに、本発明の側面は、多様なタイプの画像または任意の次元と関連して用いることができる。さらに、本発明の側面はこの点において限定されないので、１または２以上の自動操作を１または２以上の手動操作と組み合わせて用いてもよい。しかし、得られる結果は、本明細書において記載される技術の任意のものを単独でまたは組み合わせて用いて、任意のペプチド結合部位の特徴づけを容易にするために用いることができる。
本明細書において記載される本発明の態様は、多数の方法のうちのいずれに実装されてもよい。例えば、自動ペプチド分析の態様をハードウェア、ソフトウェアまたはこれらの組み合わせを用いて実装してもよい。ソフトウェアに実装される場合、ソフトウェアのコードは、単一のコンピューターにおいて提供されるかまたは複数のコンピューター間に分配される任意の好適なプロセッサまたはプロセッサの集積上で実行することができる。本明細書において記載される機能を実施する任意の成分または成分の集合は、本明細書において議論される機能を制御する１または２以上のコントローラーとして一般的にみなし得ることが理解されるべきである。１または２以上のコントローラーは、本明細書において記載される機能を実行するためにマイクロコードまたはソフトウェアを用いてプログラムされている、専用のハードウェアを用いてまたは汎用のハードウェア（例えば１または２以上のプロセッサ）を用いるなど、多数の方法において実装することができる。
本明細書において概説される多様な方法は、多様なオペレーティングシステムまたはプラットフォームのいずれかを使用する１または２以上のプロセッサにおいて実行することができるソフトウェアとしてコードされていてもよいことが理解されるべきである。さらに、かかるソフトウェアは、多数の好適なプログラム言語および／または慣用的なプログラムツールまたはスクリプトツールのいずれを用いて記載されていてもよく、また、実行可能な機械言語コードとしてコンパイルされていてもよい。この点において、本発明の一態様は、実行された場合に本明細書において議論される本発明の多様な態様を実装する方法を１または２以上のコンピューターまたは他のプロセッサ上で実行する、１または２以上のプログラムをコードするコンピューター可読媒体または複数のコンピューター可読媒体（例えば、コンピューターのメモリ、１または２以上のフロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、光学ディスク、磁気テープなど）に向けられる。コンピューター可読媒体は、それに保存されているプログラムを、１または２以上の異なるコンピューターまたは他のプロセッサにロードして、本明細書において議論される本発明の多様な側面を実装することができるように、可搬型である。
用語「プログラム」は、本明細書において、コンピューターまたは他のプロセッサを本明細書において議論される本発明の多様な側面を実装するようにプログラムするために使用することができる任意の型のコンピューターコードまたは指示のセットを指すように、総括的な意味において使用されることが理解されるべきである。さらに、この態様の一側面にしたがって、実行された場合に本発明の方法を実行する１または２以上のコンピュータープログラムは、単一のコンピューターまたはプロセッサ中に存在する必要はなく、本発明の多様な側面を実装するために、多数の異なるコンピューターまたはプロセッサの間でモジュール方式において分配されていてもよい。
（ｉｉ）ＣＬＩＰ／Ｔｒｅｇ／疾患
疾患におけるインバリアント鎖（ＣＤ７４）およびＣＬＩＰの役割についての新たな知見が見出された。本発明は、したがって、インバリアント鎖／ＣＤ７４およびＣＬＩＰの標的化を通して免疫機能を調節する新規のアプローチ、ならびに関連する製品に関する。多数の疾患におけるＣＬＩＰの役割を発見した。結果は、自己免疫疾患、癌、アルツハイマー病、アレルギー性疾患、移植または細胞移植拒絶および感染症を含む多数の疾病および状態の発症または進行を処置または阻害するための、広範な新規の治療レジメンである。
Ｂ細胞は、抗体の産生に加えて、いくらか抗原非特異的なバイスタンダー様式においても活性化され得る。例えば、ウイルスまたは細菌感染の間に、炎症または刺激性の病変の近傍に存在した抗原特異的Ｂ細胞の領域中の非抗原特異的Ｂ細胞が、バイスタンダー様式において活性化されることができる。この場合において、ＣＬＩＰは溝中に留まり、Ｂ細胞の細胞表面に輸送される。細胞表面におけるＣＬＩＰは危険である。なぜならば、ＣＬＩＰが溝から自己抗原により取り除かれてしまうと、Ｂ細胞は、自己反応性のＴ細胞に対して自己抗原を提示する立場となり、このプロセスは、自己反応性および自己免疫性疾患をもたらし得るからである。一部のＢ細胞にとって、これは、近傍のキラー細胞、おそらくはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるＢ細胞の死をもたらし得る。しかし、もし潜在的自己反応性のＢ細胞を取り除かず、これがその抗原を認識し得るＣＤ４＋Ｔ細胞に（最も可能性が高いのは胸腺に存在しなかったものである）遭遇したとすれば、ＣＬＩＰは取り除かれ、この場合、Ｂ細胞は、いまや溝（ＭＨＣ分子における抗原結合位置）を占有し始める抗原に対して特異的なＴ細胞から、さらなる補助を受けられる。あるいは、ダメージを受けた自己細胞を検出することを仕事とする近傍の細胞が、自己抗原を提示するＢ細胞により活性化される場合もある。かかるダメージ検出細胞は、例えば、γδＴ細胞とも称されるガンマデルタ細胞（γδは、その受容体の鎖を指す）であって、これは、次いで、炎症の他の部位（例えばＭＳにおいては脳内、自己免疫性心筋炎においては心臓内、Ｉ型糖尿病においては膵臓内）を探索する。あるいは、γδＴ細胞は、自己抗原に対して応答し得るＣＤ４ Ｔ細胞を殺傷しようとする場合もある。いずれのイベントにおいても、γδＴ細胞の活性化は望ましくはない可能性がある。
抗原受容体が本物の抗原により結合されていない場合の選択的なＢ細胞の死の必要性の例は、コクサッキーウイルスにおけるものである。コクサッキーウイルスに接触する殆どの人々は、インフルエンザ様の疾患を得、その後回復するが、遺伝的な様式において、一部の人々（特に若い男性）は、コクサッキーウイルスと接触し、その後続いて自己免疫性心筋炎を発症する。一部の遺伝的に近交系のマウスの系統においては、マウスは感染後の心筋炎に対して耐性である。他のマウスの系統においては、マウスは病に倒れる。一つの相違点は、感受性であったマウスは、ＭＨＣクラスＩＩの特定のアイソフォームを有したことであった。人為的におよび遺伝的に挿入されたＭＨＣクラスＩＩの他のアイソフォームを有する耐性のバックグラウンドのマウスは、単純にアイソフォームに基づいて感受性を示し、感受性はγδＴ細胞の存在に依存することが示された（Huberら、1999年）。
さらに、感染の経過の間に自己免疫疾患を発症しなかったマウスにおいて、それらのＢ細胞の全てが死滅したことが観察された。かかるＢ細胞の死を伴う場合ですら、新たなＢ細胞が持続的に産生されるので動物は生き延びる。しかし、自己免疫疾患に対して感受性の動物は、Ｂ細胞の死を有さなかった。この考察についてのさらなる裏付けは、γδノックアウトマウス（これらは遺伝的にγδＴ細胞を有さない）が、多発性硬化症のマウス版であるＥＡＥにならず、これらはまた１型糖尿病にもならないことである。ＮＫ細胞ノックアウト動物は、いずれの場合においてもより悪性の疾患となった。さらに、インバリアント鎖ノックアウト動物は、自己免疫疾患の動物モデルに対してもまた耐性であった。機構によって拘束されないが、本発明によれば、γδＴ細胞の除去はＭＳのための治療的処置であること、および、ＮＫ細胞が正常なヒトおよび動物において抗原非特異的Ｂ細胞を殺傷し、それにより疾患を予防していることが考えられる。これらの２種の調節性細胞型の間には機能の相反性が存在すると考えられる。
自己免疫性疾患および移植の疾患を遮断するための多くの治療が、Ｂ細胞を取り除くか阻害することを含む。これらのＢ細胞を枯渇させる治療が治療の結果を改善する機構は未知である。本発明者は、γδＴ細胞の活性化がしばしば脂質修飾されているタンパク質に関連することを観察した。インバリアント鎖がアシル化された（例えばパルミトイル化された）脂肪酸であることが明らかになった。抗ＣＬＩＰ抗体により処置された、抗原非特異的に活性化されたヒトＢ細胞は、細胞表面ＣＬＩＰを発現する。本発明者は、Ｂ細胞表面のＣＬＩＰの発現によりγδＴ細胞が活性化される可能性が高いことに気付いた。例えば、所与の部位において炎症があった場合、長命のγδＴ細胞は、傷害の部位において、ＣＤ４ヘルパーＴ細胞のうち疾患を向上することができる型のもの（Ｔｈ２ ＣＤ４＋Ｔ細胞；これらはまたそれらの表面にＣＬＩＰを発現してγδＴ細胞の標的となる可能性が高い）を殺傷する。これらは炎症組織を攻撃し、かつＴｈ２細胞を殺傷して、いまやＴｈ１細胞に対して自己抗原（ＣＬＩＰ結合部位を有する）を提示するようになったＢ細胞を残す。Ｔｈ１細胞は続いてさらなるＣＤ８キラー細胞を活性化するとともに、組織を攻撃し続ける。γδＴ細胞は一旦活性化されると、損傷を受けた組織を探索する。重要なことに、ＣＬＩＰは、ＭＨＣクラスＩＩの特定のアイソフォーム（マウスにおいてはＩ−Ｅ、ヒトにおいてはＨＬＡ−ＤＲ）と、および特定のＭＨＣクラスＩ（例えばＣＤ１であるがこれに限定されない）と、優先的に結びつくことができる。興味深いことに、多くの自己免疫性疾患が同じＨＬＡ−ＤＲアレルに位置（map）しており、他のアイソフォームには位置していない。
（ｉｉｉ）ＣＬＩＰ阻害剤
本発明は、ＣＬＩＰをはずして置換することができる多数の分子の発見、ならびにＣＬＩＰをはずして置換する能力を有する多数の分子を生成するための方法に関する。例えば、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩとＣＬＩＰまたはＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ結合ポケットとの間の結合相互作用の分析は、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩに結合してＣＬＩＰをはずして置換することができる他の分子を同定するための情報を提供する。これを達成する一方法は、定量的マトリックスを用いて抗原配列におけるＭＨＣクラスＩＩ結合領域を予測するソフトウェアの使用、および、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩとの結合とＣＬＩＰとＭＨＣクラスＩＩとの結合とを比較することを含む。定量的マトリックスを用いて抗原配列におけるＭＨＣクラスＩＩ結合領域を予測するためのソフトウェアは、例えばSingh, H.およびRaghava, G.P.S. (2001)、「ProPred: prediction of HLA-DR binding sites.」（Bioinformatics, 17(12), 1236-37）に記載されている。ＭＨＣクラスＩＩに対する結合アフィニティーがＣＬＩＰと同等であるかまたはより良好であるペプチド配列は、ＭＨＣクラスＩＩに結合してＣＬＩＰをはずして置換するはずである。
「理想的な」ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの例が、本発明により生成される。ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲは異なる長さのペプチドに結合し得るため、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＬＩＰ結合の分析を行った。方法は、例においてより詳細に記載される。ＨＬＡ−ＤＲは、ＭＨＣクラスＩＩのヒトのバージョンであり、マウスＩ−Ｅと相同である。ＨＬＡ−ＤＲのアルファ鎖はベータ鎖より多型性であるので、ＨＬＡ−ＤＲのベータ鎖（以下ＨＬＡ−ＤＲＢ）をより詳細に研究した。ＨＬＡ−ＤＲアレルの概説は、Cano, P.ら、「Common and Well-Documented HLA Alleles」、Human Immunology 68, 392-417 (2007)にあり、これは本明細書において参考として組み込まれる。５１個の一般的なアレルについてのペプチド結合データは、公共において利用可能である。
５１個の一般的なＨＬＡ−ＤＲアレルの各々についてのペプチド結合データに基づく予測マトリックスが利用可能である。マトリックスは、http://www.imtech.res.in/raghava/propred/page4.htmlから得ることができ、本願の表４／付録Ａに示す。これらのマトリックスは、ペプチドの各位置における各アミノ酸の重要性を重みづける。重要なアンカー残基は、結合のために非常に限定されたアミノ酸のセットを必要とする。他の位置は、より重要性が低いが、なおＭＨＣの結合に影響を及ぼす可能性がある。２〜３の位置は、結合に全く影響を及ぼさないと考えられる。分析は、利用可能なオープンソースＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド予測サーバーを用いて達成してもよく、これは、http://www.imtech.res.in/raghava/propredでオンラインで入手することができる。
有効なＣＬＩＰ置換物であるＣＬＩＰ阻害剤を開発するために、アルゴリズムを開発し、用いた。各アレルについてのペプチド結合スコアマトリックスは、２０×９のマトリックスであるが、上記のとおり、他のサイズのマトリックスを用いてもよい。１つの軸はＭＨＣ上の結合位置を表わし、１〜９の位置が存在する。他の軸はアミノ酸（２０個の異なるアミノ酸の候補）を表わす。この２０×９のマトリックス中の各位置において、スコアが与えられる。ゼロのスコアは、アミノ酸が結合に寄与しないかまたは結合を阻害することを意味する。正のスコアは、アミノ酸が結合に寄与することを意味し、負のスコアは、それがその位置にあった場合、アミノ酸が結合を阻害することを意味する。試験された５１個のアレルについてのマトリックスを、以下の表４／付録Ａに示す。各位置における最良のアミノ酸を選択し、それにより理想の結合物の配列を決定するために、全てのＭＨＣアレルについての各位置における各アミノ酸のスコアを平均化した。この平均マトリックスもまた（表２に示すように）２０×９のマトリックスであった。各位置についての最良のアミノ酸を選択するために、最大の平均スコアを有するアミノ酸を選択した。いくつかの位置について、全てのアミノ酸についての平均スコアはゼロであった。これらの位置について、アラニンを用いた。次いで、各位置における最大のスコアのアミノ酸を選択して、ＦＲＩＭ［Ａｎｙ］ＶＬ［Ａｎｙ］Ｓ（配列番号６）を得た。「Ａｎｙ」とは、任意のアミノ酸を指す。さらなる分析を簡略化するために、さらなる特徴づけのために、Ａｎｙとして示される位置の両方においてアラニンを用いた。結果として生じたペプチドは、一文字系においてＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）、３文字の略号においてはＰｈｅ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ（配列番号２）としての配列を有する。ペプチド中の「Ａｎｙ」の位置ならびに他の位置は、可溶性などの他の目的のために最適化することができる。
Figure 2011502964
本発明のペプチドがＭＨＣクラスＩＩに結合してＣＬＩＰをはずして置換する能力を、ペプチドについてのＣＬＩＰとの予測される結合価を比較することにより試験した。表３は、研究された各々のＭＨＣクラスＩＩアレルについての、ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）の予測されるＭＨＣクラスＩＩ結合領域の、ＣＬＩＰの予測されるＭＨＣクラスＩＩ結合領域に対する比較である。ＨＬＡ−ＤＲについてのヒトインバリアント鎖の一部であるＣＬＩＰペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１であり、これは、１文字の系においてはＭＲＭＡＴＰＬＬＭ（配列番号１）の、３文字の略号においてはＭｅｔ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｍｅｔ（配列番号１）の配列を有する。このペプチドは多くのＨＬＡ−ＤＲアレルに結合する。典型的なＭＨＣ結合ペプチドは、いくつかのアレルに良好に結合するが、他のものには結合しない。これは、ＭＨＣクラスＩＩ中に装着された天然のペプチドが、ＤＲアレルのように多型であるというよりはむしろ、所与のアレルと適合する必要があるのみであるという事実と一致する。ＭＨＣの多型の免疫学および進化における選択が、異なる集団における特定のアレルをもたらす。
Figure 2011502964
Figure 2011502964
表３の各行は、ＨＬＡ−ＤＲのアレルを表わし、各ペプチドについてのスコアが示される。ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）がＣＬＩＰ（配列番号１）よりも高いスコアを有したアレルをハイライトしてある。全てのアレルにわたる平均スコアもまた計算した。ＣＬＩＰについてはそれは4.3156862275であり、ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）についてはそれは6.266666667であり、このことは、ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）がＣＬＩＰをはずして置換することができることを示す。
ＣＬＩＰ阻害剤は、本明細書において使用される場合、ＭＨＣクラスＩＩと相互作用するかまたはＭＨＣクラスＩＩと相互作用する化合物を生成して、ＣＬＩＰと結び付く活性を阻害する化合物を指す。ＣＬＩＰ阻害剤は、例えば競合的なＣＬＩＰフラグメント、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドおよびペプチド模倣物を含むがこれらに限定されない。
したがって、本発明は、ＭＨＣクラスＩＩに結合してＣＬＩＰをはずして置換するペプチドおよびペプチド模倣物を含む。例えば、Ｘ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＸ６Ｘ７（配列番号３）を含む単離されたペプチドであって、ここでＸはアミノ酸であり、ここでＲはアルギニン、Ｌはロイシンであって、ここでＸ２およびＸ３の少なくとも１つはメチオニンであって、ここでペプチドはＮ−ＭＲＭＡＴＰＬＬＭ−Ｃ（配列番号４）ではなく、ここでペプチドはＣＬＩＰ置換物である、前記ペプチドが、本発明にしたがって提供される。Ｘは、天然に存在するかまたは修飾された任意のアミノ酸を指す。一部の態様において、式Ｘ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＸ６Ｘ７（配列番号８）において示されるＸは、以下の値を有する：
Ｘ１は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＰｒｏまたはＴｒｐであり、
Ｘ２は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＰｒｏまたはＴｒｐであり、
Ｘ３は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＰｒｏまたはＴｒｐであり、
ここでＸ４は、任意のものであり、
Ｘ５は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＰｒｏまたはＴｒｐであり、
Ｘ６は、任意のものであり、
Ｘ７は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｔｙｒである。
ペプチドは好ましくは、Ｘ４およびＸ６が任意のアミノ酸であってＡｌａであってもよいような、ＦＲＩＭＸ４ＶＬＸ６Ｓ（配列番号６）である。
ＨＬＡ−ＤＲに結合するための最小のペプチドの長さは、９アミノ酸である。しかし、オープンな結合溝のいずれの側に突出するアミノ酸が存在してもよい。一部のよく研究されたペプチドについて、ＮおよびＣ末端の両方における付加的な突出するアミノ酸は、結合を増強し得ることが知られている。したがって、ペプチドは、９アミノ酸の長さであっても、それより長くてもよい。例えば、ペプチドはＮおよび／またはＣ末端に付加的なアミノ酸を有していてもよい。いずれの末端におけるアミノ酸も、１〜１００アミノ酸の間のいずれかであってよい。一部の態様において、ペプチドは、１〜５０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜５またはこれらの間の任意の整数の範囲を含む。ペプチドが「Ｎ−ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ−Ｃ」（配列番号７）または「Ｎ−Ｘ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＸ６Ｘ７−Ｃ」（配列番号９）として示される場合、−Ｃおよび−Ｎは、ペプチドの末端を指し、したがって、ペプチドは９アミノ酸のみの長さである。しかし、９アミノ酸のペプチドは、−Ｃまたは−Ｎ末端のいずれかにおいて、または内部において、他の非ペプチド部分に結合していてもよい。
ペプチドは環式であっても非環式であってもよい。いくつかの例における環式ペプチドは、安定性の特性が改善されている。当業者は、環式ペプチドを製造する方法を知っている。
ペプチドはまた、他の分子に結合していてもよい。２または３以上の分子が、直接的に互いに（例えば、ペプチド結合を介して）結合していても；ペプチドであってもペプチドでなくてもよいリンカー分子を介して結合していても；または例えば共通のキャリア分子への結合により互いに非直接的に結合していてもよい。
したがって、リンカー分子（「リンカー」）を、ペプチドを別の分子に結合させるために、任意に用いることができる。リンカーは、１個から複数のアミノ酸からなるペプチドであっても、非ペプチド分子であってもよい。本発明において有用なペプチドリンカー分子の例として、グリシンリッチペプチドリンカー（例えばUS 5,908,626を参照）が挙げられ、ここで、アミノ酸残基の半分以上がグリシンである。好ましくは、かかるグリシンリッチペプチドリンカーは、約２０個またはそれより少ないアミノ酸からなる。
リンカー分子はまた、非ペプチド分子または部分的にペプチドの分子を含んでもよい。例えば、ペプチドを、他の分子に、グルタルアルデヒドまたはＥＤＣ（Pierce, Rockford, Illinois）などの周知の架橋分子を用いて結合させてもよい。二官能性架橋分子は、２つの区別し得る反応部位を有するリンカー分子である。例えば、二官能性リンカー分子の反応部位の一方は、ペプチドの官能基と共有結合を形成するように反応することができ、他の反応部位は、別の分子の官能基と共有結合を形成するように反応することができる。架橋分子についての一般的な方法は概説されている（例えば、MeansおよびFeeney、Bioconjugate Chem., 1: 2-12（1990）を参照）。
ホモ二官能性架橋分子は、化学的に同一である２つの反応部位を有する。ホモ二官能性架橋分子として、限定することなく、グルタルアルデヒド；Ｎ，Ｎ’−ビス（３−マレイミド−プロピオニル−２−ヒドロキシ−１，３−プロパンジオール（スルフヒドリル特異的ホモ二官能性架橋剤）；特定のＮ−スクシンイミドエステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル（discuccinimyidyl suberate）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、および可溶性ビススルホン酸、ならびにこれらの塩（例えばPierce Chemicals, Rockford, Illinois; Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Missouriを参照）が挙げられれる。
好ましくは、二官能性架橋分子は、ヘテロ二官能性リンカー分子であり、これは、リンカーが少なくとも２つの異なる反応部位を有し、これらの各々が別々にペプチドまたは他の分子に結合することができることを意味する。かかるヘテロ二官能性リンカーの使用は、反応部位の各々を、選択されたペプチド配列に対して化学的に分離することおよびこれらに段階的に付加することを可能とする。本発明において有用なヘテロ二官能性リンカー分子として、限定することなく、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Greenら、Cell, 28: 477-487（1982）；Palkerら、Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 84: 2479-2483（1987）を参照）；ｍ−マレイミド−ベンゾイルスルホスクシンイミドエステル；γ−マレイミド酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル；およびＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジル−ジチオ）プロピオネート（例えばCarlosら、Biochem. J., 173: 723-737（1978）；Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, Missouriを参照）が挙げられる。
本明細書において記載されるペプチドのカルボキシル末端のアミノ酸残基はまた、遊離の末端のカルボン酸基の反応を遮断または減少させるために、例えばエステルの形成、ペプチド結合および他の反応を妨げるために、修飾されていてもよい。かかる遮断基として、カルボン酸基のアミドを形成させることが挙げられる。やはりそのような遮断が望ましくない免疫反応を引き起こさないかまたはペプチドが具体的に機能する能力を有意に変化させないことを前提として、ポリペプチド中に存在し得る他のカルボン酸基もまた遮断することができる。
ペプチドは、例えば、ＰＥＧ分子に結合していてもよい。かかる分子はＰＥＧ化されたペプチドとして言及される。
本明細書において有用なペプチドは、単離されたペプチドである。本明細書において用いられる場合、用語「単離されたペプチド」とは、ペプチドが、実質的に純粋であり、それらの意図されている用途のために実質的かつ適切な程度まで、天然またはin vivoの系においてそれらが結合している他の物質を本質的に含まないことを意味する。特に、ペプチドは十分に純粋であり、例えば、医薬製剤の製造またはシークエンシングにおいて用いるために十分な程度に、それらの宿主細胞の他の生物学的成分を含まない。本発明の単離されたペプチドは、医薬製剤中で薬学的に許容可能なキャリアと混合されていてもよいため、ペプチドは、製剤の重量の小さい割合のみを構成することができる。それにもかかわらず、それが生体系において結びついている可能性がある物質から実質的に分離されているという点において、ペプチドは実質的に純粋である。
ネイティブなまたは天然に存在するＣＬＩＰの好適な生物学的に活性なバリアントは、そのポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体であってもよい。「アナログ」により、ネイティブなポリペプチドまたはネイティブなポリペプチドのフラグメントのいずれかのアナログが意図され、ここで、アナログは、１または２以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有するネイティブなポリペプチドの配列および構造を含む。ＣＬＩＰのフラグメントは、ＣＬＩＰペプチドの全長と同一であるかまたはＣＬＩＰペプチドの全長と少なくとも９０％もしくはそれ未満で相同のペプチドであり、本明細書においてＣＬＩＰの一部として言及される。ＣＬＩＰの一部は、全長ＣＬＩＰポリペプチドを表わすものである。フラグメントは、それがＣＬＩＰの少なくとも２個のアミノ酸（連続したものまたは不連続なもの）を含み、ＭＨＣクラスＩＩに結合する場合、全長ＣＬＩＰポリペプチドを表わすものである。いくつかの態様において、一部は、完全なネイティブなヒトＣＬＩＰポリペプチドの９０％未満である。他の態様において、一部は、完全なネイティブなヒトＣＬＩＰポリペプチドの５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％または５％未満である。「誘導体」により、ＣＬＩＰ阻害剤の所望の生物学的活性が保持される限りにおいて、目的のポリペプチド、ポリペプチドのフラグメント、またはそれらのそれぞれのアナログの、任意の好適な修飾、例えばグリコシル化、リン酸化、ポリマー共役（例えばポリエチレングリコールと）、または他の外来性部分の付加が意図される。ポリペプチドのフラグメント、アナログおよび誘導体を製造するための方法は、当該分野において一般に利用可能である。
ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ネイティブの目的のポリペプチドをコードするクローニングされたＤＮＡ配列中の変異により調製することができる。変異導入およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当該分野において周知である。例えば、本明細書において参考として組み込まれるWalkerおよびGaastra編（1983）Techniques in Molecular Biology（MacMillan Publishing Company, New York）；Kunkel（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492；Kunkelら（1987）Methods Enzymol. 154:367-382；Sambrookら（1989）Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor, New York）；U.S. Pat. No. 4,873,192；およびこれらにおける参考文献を参照。目的のポリペプチドの生物学的活性に影響を及ぼさない適切なアミノ酸置換のためのガイダンスは、本明細書において参考として組み込まれるAtlas of Protein Sequence and Structure（Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.）中のDayhoffetら（1978）のモデルにおいて見出すことができる。１個のアミノ酸を類似の特性を有する別のものと交換するなどの保存的置換が好ましい場合がある。保存的置換の例として、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；およびＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒが挙げられるがこれらに限定されない。
任意の２つの配列の間の同一性の％の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの１つの好ましい非限定的な例は、MyersおよびMiller（1988）CABIOS 4:11-17のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム（バージョン2.0）において利用される。アミノ酸配列を比較する場合、ALIGNプログラムとともに、PAM120重さ留数（weight residue）表、１２のギャップ長ペナルティ、４のギャップペナルティを用いることができる。２つの配列の比較において用いるための数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、KarlinおよびAltschul（1990）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264の、KarlinおよびAltschul（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877におけるもののように改変されたアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Altschulら（1990）J. Mol. Biol. 215:403のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれる。BLASTヌクレオチド検索を、NBLASTプログラム（score＝100、wordlength＝12）により実行して、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。BLASTタンパク質検索を、XBLASTプログラム（score＝50、wordlength＝3）により実行して、目的のポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得ることができる。
比較を目的としてギャップを有するアラインメントを得るために、Altschulら（1997）Nucleic Acids Res. 25:3389に記載されるようなGapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-Blastを用いて、分子間の遠い関係を検出する反復検索（iterated search）を実行することができる。上記Altschulら（1997）を参照。BLAST、Gapped BLASTおよびPSI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトのパラメーター（例えばXBLASTおよびNBLAST）を用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照。また、ALIGNプログラム（Atlas of Protein Sequence and Structure 5:Suppl. 3中、Dayhoff (1978)（National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.））およびWisconsin Sequence Analysis Package、バージョン８（Genetics Computer Group, Madison, Wis.から入手可能）中のプログラム、例えばGAPプログラム（プログラムのデフォルトのパラメーターを利用する）も参照。
アミノ酸配列同一性のパーセンテージを考慮する場合、一部のアミノ酸残基の位置が、タンパク質の機能の特性に影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換の結果として異なっていてもよい。これらの場合において、配列同一性の％は、保存的に置換されたアミノ酸における類似性のために、上方に調節することができる。かかる調節は当該分野において周知である。例えばMyersおよびMiller（1988）Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17を参照。
本明細書において記載されるペプチドに加えて、ＣＬＩＰ阻害剤は、ペプチド模倣物を含み、これは、一部の例において、ペプチドより好ましい薬物動態特性を有する。ＣＬＩＰペプチド模倣物は、ＣＬＩＰまたはＣＬＩＰのフラグメントに構造的に類似する有機化合物である。したがって、ペプチド模倣物は、理想的にはＣＬＩＰペプチドまたはそのフラグメントの機能を模倣するが、改善された細胞輸送特性、低い毒性、より少ない副作用、およびより堅固な構造、ならびにプロテアーゼ耐性を有する。
コンピューターによる方法およびスクリーニング方法を含むペプチド模倣物の開発のための多様な方法が、当該分野において公知である。かかる方法についての総説として、例えば、Zutshi Rら、Inhibiting the assembly of protein-protein interfaces. Cur Open Chem. Biol 1998, 2:62-6、Cochran AG：Antagonists of protein-protein interactions. Chem Biol 2000, 7:R85-94およびToogood PL：Inhibition of protein-protein association by small molecules: approaches and progress. J Med Chem 2002, 45:1543-58が挙げられる。スーパーミメティック（supermimetic）法と称される別のアプローチは、ペプチド模倣物を、既知のタンパク質の構造および模倣物の構造を用いて直接的に検出する。Goede A.ら、BMC Bioinformatics 2006, 7:11。この方法において、両方の構造における特定の原子の位置を定義し、それらの空間配置に関して比較する。この方法において、タンパク質の骨格に当てはまる有機化合物が同定される。逆に、特定の模倣物が挿入され得るタンパク質の位置を見出すことが可能である。かかる方法を用いて、結合部位を模倣し、したがってタンパク質の機能を模倣する、有機化合物を見出すことまたは人工ペプチドを設計することが可能である。かかる方法を可能にするプログラムは、SuperMimicのウェブサイト（http://bioinformatics.charite.de/supermimic）からダウンロードすることができる。
ペプチド模倣物および標的に結合する他の分子を同定するための方法は記載されている。例えば、Tidorらへの米国特許第6,230,102号は、リガンドの特性を決定するための方法を含むコンピューターに実装されたシステムを記載し、リガンドは、次いで、タンパク質または他の分子標的に結合するためのリガンドを設計するために用いることができる。方法は、所与の標的部位についての静電気的相補体（electrostatic complement）、および形状（geometry）を定義することを含む。静電気的相補体は、標的部位に対する立体補完物（steric complement）とともに、明示的構成を介してならびにコンビナトリアルライブラリーの設計およびバイアスを介して、リガンドを発見するために用いられる。方法は、最適な電荷分布に適合する点電荷を有する分子の同定をもたらし、それは結合する分子を同定するために用いることができる。
（ｉｖ）本発明の組成物の使用
本発明は、少なくとも部分的に、特定のペプチドがＣＬＩＰ阻害剤であり、本発明の方法において有用であるという発見に基づく。本発明は、したがって、それを必要とする対象にＣＬＩＰ阻害剤を投与することによる、感染性疾患、癌、自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、アルツハイマー病および移植片拒絶のための処置に関する。本発明はまた、Ｔｒｅｇの発達を促進するための方法に関する。
対象とは、ヒト、またはイヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、および霊長類、例えばサルを含むがこれらに限定されない脊椎哺乳動物を意味する。したがって、本発明はまた、非ヒト対象における疾患または状態を処置するためにも用いることができる。好ましくは対象はヒトである。
本明細書において用いられる場合、用語、処置（treat）、処置される（treated）または処置する（treating）とは、疾患に関連して用いられる場合、疾患の発症に対する対象の耐性を増大させるか、または言い換えれば、対象が疾患を発症させる可能性を低下させる予防的処置、ならびに、対象が疾患を発症した後での、疾患と戦うため、疾患が悪化することを防ぐため、または治療の不在下と比較して疾患の進行を遅延させるための処置を指す。
本発明の治療薬と組み合わせて用いられる場合、既知の治療薬の投与量は、一部の場合において、副作用を回避するために減少させることができる。
ＣＬＩＰ阻害剤は、他の治療剤と組み合わせて投与してもよく、かかる投与は、同時であっても逐次的であってもよい。他の治療剤が同時に投与される場合、それらは同じ製剤中で投与されても別々の製剤中で投与されてもよいが、同じ時点で投与される。他の治療剤とＣＬＩＰ阻害剤との投与はまた、時間的に分離されていてもよく、これは、治療剤が、ＣＬＩＰ阻害剤の投与の前または後のいずれかにおいて異なる時間に投与されることを意味する。これらの化合物の投与の間の時間の分離は、数分間のものであっても、より長いものであってもよい。
例えば、ＣＬＩＰ阻害剤は、抗ＭＨＣ抗体または抗ＣＬＩＰ抗体などの抗体と組み合わせて投与してもよい。細胞を抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体に暴露する目的は、例えば、一旦ＣＬＩＰが取り除かれた細胞が、該細胞がＣＬＩＰ阻害剤をすぐ取り込まなかった場合に、ＭＨＣと関連して提示される可能性がある自己抗原を取り込むことを防ぐことである。また、抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体は、Ｂ細胞と連結してこれを殺傷し得る。ＣＬＩＰが取り除かれた後で、抗体は、ＭＨＣと相互作用してＢ細胞の死を引き起こすことができる。これは、空（empty）のＭＨＣを有するＢ細胞が、自己抗原を取り込んで提示すること、または、さらなるγδＴ細胞の増殖および活性化をもたらし得る表面における別のＣＬＩＰ分子を取得することを防ぐ。
方法はまた、傷害を処置するために、抗原非特異的に活性化されたＢ細胞および／またはγδＴ細胞を対象から取り除くことを含んでもよい。方法は、上記のように単独で、またはかかる細胞を枯渇させるための既知の方法と組み合わせて達成することができる。
（ｖ）感染性疾患
本発明の方法により処置または予防することができる感染性疾患は、ウイルス、細菌、真菌、原虫および寄生虫を含むがこれらに限定されない感染性病原体により引き起こされる。
本発明は、それを必要する対象に、ＣＬＩＰ阻害剤を含む組成物を単独でまたはＣＬＩＰ阻害剤以外の１または２以上の予防剤または治療剤と組み合わせて投与することにより、感染性疾患を予防または処置する方法を提供する。感染性疾患の予防または処置のために有用であることが既知であるかまたは現在用いられている任意の薬剤または治療を、本明細書において記載される方法に従って、本発明の組成物と組み合わせて用いることができる。
本発明の方法により処置または予防することができるウイルス性疾患として、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−Ｉ）、ＩＩ型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−ＩＩ）、牛疫、ライノウイルス、エコーウイルス、ロタイウルス、呼吸器多核体ウイルス、パピローマウイルス、パポローマウイルス（papolomavirus）、サイトメガロウイルス、エキノウイルス（echinovirus）、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルスおよびポリオウイルスにより引き起こされるものが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の一部の好ましい態様に従って、本発明の方法により処置または予防される疾患は、ヒト免疫不全ウイルス（Ｉ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−Ｉ）またはＩＩ型ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−ＩＩ））により引き起こされるものであり、例えば関連する疾患はＡＩＤＳである。他の態様において、本発明の方法により処置または予防される疾患は、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、ボレリアウイルス、サイトメガロウイルスまたはエプスタイン・バーウイルスにより引き起こされる。
ＡＩＤＳまたはＨＩＶ感染
本発明の一態様によれば、本明細書において記載される方法は、ＡＩＤＳまたはＨＩＶ感染を処置する上で有用である。ＨＩＶは、ＡＩＤＳを引き起こすヒト免疫不全ウイルスの略号である。ＨＩＶは、免疫系、特に疾患と戦うために免疫系にとって重要な白血球（Ｔ細胞またはＣＤ４細胞）を攻撃するので、多数の他のウイルスと異なっている。特定の態様において、処置は、１または２以上のＣＬＩＰ阻害剤をＨＩＶに感染した対象に導入することによる。
Ｂ細胞およびＴ細胞の両方の集団は、ＨＩＶ感染の後で劇的な変化を経験する。ＨＩＶ感染の初期段階の間、末梢のＢ細胞は、おそらくはHIV gp120によるそれらの活性化の結果として（He, B., et al., HIV-1 envelope triggers polyclonal Ig class switch recombination through a CD40-independent mechanism involving BAFF and C-type lectin receptors. J Immunol, 2006. 176(7): p. 3931-41）、抗原非依存的な様式の有害なポリクローナル活性を起こす（Lang, K.S., et al., Toll-like receptor engagement converts T-cell autoreactivity into overt autoimmune disease. Nat Med, 2005. 11(2): p. 138-45）。初期段階においては、Ｂ細胞はＴ細胞媒介性細胞傷害性に対して耐性であるように見える（Liu, J. and M. Roederer, Differential susceptibility of leukocyte subsets to cytotoxic T cell killing: implications for HIV immunopathogenesis. Cytometry A, 2007. 71(2): p. 94-104）。しかし、感染の後期において、おそらくはそれらの抗原非依存的な活性化の直接的な結果として（Cambier, J.C., et al., Differential transmembrane signaling in B lymphocyte activation. Ann N Y Acad Sci, 1987. 494: p. 52-64；Newell, M.K., et al., Ligation of major histocompatibility complex class II molecules mediates apoptotic cell death in resting B lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(22): p. 10459-63）、Ｂ細胞はアポトーシスを開始する（Ho, J., et al., Two overrepresented B cell populations in HIV-infected individuals undergo apoptosis by different mechanisms. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006. 103(51): p. 19436-41）。
ＨＩＶ感染を定義づける特徴は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇である。ウイルスによる感染ＣＤ４＋Ｔ細胞の直接的な殺傷または細胞傷害性ＣＤ８＋リンパ球によるＨＩＶ感染細胞の「習慣的な」殺傷を含む多数の機構が殺傷に寄与し得る。細胞傷害性Ｔ細胞の殺傷の有効性は、ウイルスのＴａｔおよびＮｅｆタンパク質の作用に起因する感染細胞表面におけるクラスＩの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）の発現の下方調節により、劇的に損なわれる（Joseph, A.M., M. Kumar, and D. Mitra, Nef: "necessary and enforcing factor" in HIV infection. Curr HIV Res, 2005. 3(1): p. 87-94）。しかし、細胞傷害性Ｔ細胞により媒介される殺傷を損なう同じＭＨＣクラスＩの発現の低下は、死を誘導する受容体の発現の増加と組み合わされた場合は、替わりに、ＣＤ４＋マクロファージおよびＣＤ４＋Ｔ細胞などの感染細胞を、ＮＫ細胞またはγδＴ細胞による殺傷の標的としてマークし得る。
最近の研究は、ＨＩＶ−１感染が、サイトカインの変化、リンパ球亜集団の再分布、免疫細胞の機能不全および細胞死を誘導する、広範なレベルの免疫系の慢性的活性化をもたらすことを示唆する（Biancotto, A., et al., Abnormal activation and cytokine spectra in lymph nodes of people chronically infected with HIV-1. Blood, 2007. 109(10): p. 4272-9）。本発明者らの初期の研究は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴ細胞受容体の抗原およびＭＨＣのクラスの認識に先立つＣＤ４の結合が、ＣＤ４＋Ｔ細胞のアポトーシスによる細胞死を開始させることを実証した（Newell, M.K., et al., Death of mature T cells by separate ligation of CD4 and the T-cell receptor for antigen. Nature, 1990. 347(6290): p. 286-9）。ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルが低下するとともに、軽微な感染を撃退する能力は低下し、ウイルス血症は増大し、疾病の症状が現れる。
Ｂ細胞の活性化は、典型的には、休止しているＢ細胞と特異的抗原との相互作用を必要とする、精巧によく調節されたプロセスである。しかし、ＨＩＶ感染（および特定の自己免疫疾患）の経過の間に、末梢のＢ細胞が、抗原非依存的な機構によりポリクローナル性に活性化される。逆説的に、ならびに、ポリクローナル性のＢ細胞活性化、および初期ＨＩＶ感染に特徴的なその後の高ガンマグロブリン血症（hypergammaglobulinemia）とは対照的に、患者は、ワクチン投与などの免疫学的チャレンジに対するＢ細胞の応答が損なわれる（Mason, R.D., R. De Rose, and S.J. Kent, CD4+ T-cell subsets: what really counts in preventing HIV disease? Expert Rev Vaccines, 2008. 7(2): p. 155-8）。これらの初期において、Ｂ細胞は、Ｔ細胞媒介性の細胞傷害に対して耐性であるように見える。感染の経過の後期において、ＨＩＶ感染患者からのＢ細胞は、アポトーシスを開始する。ＨＩＶにおけるポリクローナル性に活性化されたＢ細胞および後期のＢ細胞の死の病理学的役割は、未だ知られていない。
ＨＩＶ感染におけるＴｒｅｇの役割についての矛盾する報告が存在する。いくつかは、Ｔｒｅｇが適当なＣＤ４ Ｔ細胞の感染に対する応答を妨げること、およびＴｒｅｇの減少が直接的にまたは間接的にＣＤ４ Ｔ細胞の欠失に寄与する可能性があることを議論する。他のものは、Ｔｒｅｇの減少とウイルス血症の減少および疾患の進行との間に正の相関を認めている。Ｔｒｅｇのこれらの外見的には反対の機能は、ＨＩＶ感染が疾患の２つの段階においてＴｒｅｇを機能不全にするという事実により折り合いがつく可能性がある。初期のＴｒｅｇの機能不全は、ポリクローナル性に活性化されたＢ細胞のＢ細胞死を予防し、後期疾患においては、ＨＩＶにより誘導されたＴｒｅｇの死は、後期の従来型ＣＤ４ Ｔ細胞の活性化、および活性化により誘導される活性化従来型ＣＤ４ Ｔ細胞の欠失をもたらす細胞死と相関する。したがって、本発明の重要な治療的介入は、疾患の初期および後期の両方におけるＴｒｅｇの機能不全の逆転に関する。これらの方法は、本発明のＣＬＩＰ阻害剤を用いて達成することができる。出願人は提案される作用機構により拘束されないが、ＣＬＩＰ阻害剤は、Ｔｒｅｇ活性化のためのペプチド標的であり得ると考えられる。したがって、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩの溝において自己抗原を有するポリクローナル性に活性化されたＢ細胞は、標的ペプチド（ＣＬＩＰ阻害剤）のための抗原提示細胞として働き、その結果、標的ペプチドがＣＬＩＰをはずして置換する可能性がある。これは、Ｔｒｅｇの活性化をもたらす。
多数の疾患に対する感受性または耐性は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子をコードする遺伝子により決定されると考えられる。免疫応答遺伝子（またはＩＲ遺伝子）としてしばしば言及されるこれらの分子は、Ｔ細胞活性化を制限する上での重要なプレイヤーである。Ｔ細胞、ＣＤ８およびＣＤ４の両方が陽性のＴ細胞は、抗原がそれぞれＭＨＣクラスＩ（全ての有核細胞において発現する）またはＭＨＣクラスＩＩ分子（抗原をＣＤ４＋Ｔ細胞に提示する細胞において発現する）と結びついてＴ細胞に提示された場合のみ、抗原を認識する。ＭＨＣ分子は高度に多型性であり、これは、所与のＭＨＣ遺伝子座において、多数の候補となるアレルが存在することを意味する。ＭＨＣの多型性は、同じ種の個々のメンバーの間における免疫応答の大きな差異の原因である。抗原がＭＨＣ分子に結合する能力は、したがって、その個体のＭＨＣのアレルに遺伝的に依存する。
Viral Genetics Inc.は、米国国外において、ＨＩＶに感染した患者におけるＴＮＰ抽出物（ＴＮＰ−１、知見においてはＶＧＶ−１として言及された）の安全性および効力を試験する６つのヒト臨床治験を実施した。６つ全ての研究において、対象に８ｍｇのＶＧＶ−１を、２．０ｍＬのＴＮＰの４．０ｍｇ／ｍＬの懸濁液筋肉内注射として、週２回８週間にわたり全１６用量を与えた。研究は例のセクションにおいて詳細に記載される。データは、ヒト治験において、ＨＩＶ−１感染患者におけるＴＮＰ−１処置が安全でありかつ良好に耐容されることを示唆した。治験において、ＣＤ４細胞の減少が観察され、これは疾患の自然な進行と一致する傾向にあった。しかし、観察されたＨＩＶ−１のＲＮＡの変化は、ＨＩＶ−１感染の自然な経過の間に期待されるよりも少なかった。
南アフリカでの研究は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者の多様なサブセットにおけるＴＮＰの効力を実証し、一方で、良好に耐容される化合物のさらなる評価を提供した。簡単に述べると、ＴＮＰは、免疫系がより重篤に損傷を受けた患者のサブセットにおいて、ＨＩＶウイルスのレベルに対して有意義な効果を有することが明らかとなった。本発明の、特にＣＬＩＰ阻害剤に関する発見は、治験において生じたいくつかの観察についての説明と一致し、それらについての説明を提供する。例えば、免疫に基づく薬物であると長く考えられてきたＴＮＰが、免疫系がより損傷を受けた患者において優れた効果を示したことは、折り合いをつけることが困難である。しかし、本発明の結果は、上記のとおり、特にＣＬＩＰ阻害剤がＨＩＶ疾患におけるＴｒｅｇの機能不全を逆転させる能力に関する。
さらに、臨床治験におけるＴＮＰの一過的な短期の抗ＨＩＶ効果は、説明することが困難であった。本発明の結果は、これらの結果が単純な用量の問題であると考えられることを示す。臨床治験において用いられた製剤は、理想的な投与量ではなかったし、それが投与された回数もまた最適ではなかった可能性がある。ＴＮＰを投与する期間を延長して投与量を増大させることにより、それがより長く持続する効果を達成し得ることが明らかとなる可能性がある。
臨床治験において観察された別の現象は、ＴＮＰが患者の２５〜４０％において働くと考えられる事実に関した。本発明の発見は、このことについての説明を提供する。ＴＮＰは、ヒト患者の特定の亜群においてはＨＩＶを処置することができるはずであるが、それらの全てにおいてではない、いくつかのタンパク質化合物を含むことが発見されている。このことは、患者の特異的なＭＨＣに基づく。本発明はまた、はるかに大きな患者の群に対してより効果的な処置を提供する、ＭＨＣが適合するペプチドの亜群の発見に関する。個体間において広く差異があるＭＨＣ分子に対するＴＮＰペプチドの異なる結合アフィニティーは、多様なＨＩＶ感染患者の間でのＴＮＰペプチドが疾患を調節する能力の差異の原因であり得る。ＭＨＣの多型性もまた、ＨＩＶによる最初の感染と末期ＡＩＤＳの発症までの時間の間の時間が広範囲に表わされることの原因であり得る。
ＴＮＰは胸腺に由来するので、ＴＮＰ混合物におけるエピトープは、Ｔｒｅｇの選択に関与し得る。Ｂ細胞は、ＴＮＰペプチド（ＣＬＩＰ阻害剤）または他の適切な自己ペプチドがＢ細胞のＭＨＣクラスＩＩの溝における内因性ペプチドを競合的に置き換えるまで、Ｔｒｅｇにより認識されない。ＴＮＰペプチドは、胸腺においてＴｒｅｇを選択するプールへと濃縮される可能性があり、これらのペプチドは、疾患の状態に依存して差次的に処理されてＢ細胞において提示される。したがって、ＶＧＶ−１標的化ペプチド処置により処置された患者において観察されたＨＩＶウイルス負荷を減少させる上での部分的な成功は、以下の一連の観察により説明される：１）ＨＩＶからのｇｐ１２０が、保存された自己抗原をＭＨＣクラスＩＩ（または）を介して提示するＢ細胞をポリクローナル性に活性化し、活性化されたＢ細胞が、ガンマデルタＴ細胞を刺激すること、２）ＶＧＶ−１標的化ペプチドが、より強力なアフィニティーでポリクローナル性に活性化されたＢ細胞のＭＨＣ分子に結合すること、３）その結果、その活性化および増殖がウイルス負荷の減少と対応するＴｒｅｇの活性化および増殖、γδＴ細胞の活性化の低下、ならびに、活性化により誘導される非Ｔｒｅｇ（従来型として言及される）ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞死の阻害の結果としての改善であること。
本発明の発見は、ＨＩＶ患者におけるＴＮＰ抽出物処置の成功が、ＴＮＰ混合物からの標的化されたペプチドの、活性化Ｂ細胞表面における細胞表面主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子への結合に関与することを示唆する。ＭＨＣ分子は、遺伝子的に個体にユニークであり、各々の親から共優性的に（co-dominantly）遺伝する。ＭＨＣ分子は、新規に遭遇した抗原を抗原特異的Ｔ細胞に提示するために働く。本発明者らのモデルによれば、ＭＨＣ分子が、活性化されたＢ細胞表面においてＭＨＣ分子の溝を占めているペプチドよりも高いアフィニティーで個体のＭＨＣ分子に結合することがコンピューターにより予測されている標的化されたペプチドに結合した場合、その結果は、炎症性応答を抑制することができるＴｒｅｇ細胞の活性化となるであろう。Ｔｒｅｇは通常は、自己に対してより高いアフィニティーを有し、胸腺において選択される。ＴＮＰは胸腺に由来するため、これらのエピトープがＴｒｅｇの選択に関与し得ることを示唆することは妥当である。有害に活性化されたＢ細胞は、胸腺において提示されないペプチドを発現するように切り替わっている。ＴＮＰペプチドは、胸腺においてＴｒｅｇを選択するプールにおいて提示され得る。活性化されたＢ細胞上への胸腺由来のペプチドの組み込みが、次いで、ユニークなＢ細胞／抗原提示細胞をもたらし、Ｔｒｅｇを活性化する。
別の態様によれば、本発明の方法は、ＡＩＤＳまたはＨＩＶ感染の習慣的処置と組み合わせて、またはかかる処置を補足するものとして、適用することができる。歴史的に、ＨＩＶ感染のための認知された処置は、ヌクレオシドアナログ、ＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）の阻害剤である。これらの抗レトロウイルス剤による介入は、報告されるＡＩＤＳ症例の数の減少をもたらし、進行性ＡＩＤＳに関連する罹患率および死亡率を低下させることが示されている。これらの逆転写酵素阻害剤による長期の処置は、最終的には、それらの抗ウイルス効果に対して耐性のウイルス株の出現をもたらす。最近、ＨＩＶプロテアーゼの阻害剤が、新たなクラスのＨＩＶ化学療法として出現した。ＨＩＶプロテアーゼは、ウイルスの感染性および複製にとって不可欠の酵素である。プロテアーゼ阻害剤は、ＨＩＶ−１のＲＴを標的とするヌクレオシドアナログよりも高い効力をＨＩＶに対してin vitroで示した。ＨＩＶプロテアーゼの阻害は、慢性感染細胞からの成熟感染性ウイルス粒子の形成を妨げる。この酵素は、治療的介入のための実行可能な標的および組み合わせ治療のための候補となっている。
ＨＩＶプロテアーゼの構造の知識もまた、サキナビル、リトナビル、インジナビルおよびネルフィナビルなどの新規の阻害剤の開発をもたらしている。ＮＮＲＴＩ（非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤）は、最近、ＨＩＶ感染の治療において益々重要な役割を得てきている。いくつかのＮＮＲＴＩは、臨床開発へと進んでいる（すなわち、チビラピン（tivirapine）、ロビリド（loviride）、MKC-422、HBY-097、DMP 266）。ネビラピンおよびデラビルジンは、既に臨床使用を認可されている。ＨＩＶ複製のライフサイクル中の全段階が、薬物開発のための標的候補である。
最近化学療法において用いられている抗レトロウイルス薬の多くが、天然の生成物から直接誘導されるか、または天然の生成物のモデルに基づいて合成される。デオキシヌクレオシドを天然に基づく抗ウイルス薬として含めることの背景となる根拠は、１９５０年までもの早期に遡る一連の刊行物に始まり、ここで、空気乾燥されたバハマの海綿（Cryptotethia crypta）からのチミンペントフラノシドの発見および単離が報告された。ＡＺＴおよびアシクロビルを含む非常に多数のヌクレオシドが、修飾糖以外の通常の基剤、または非環式誘導体および環式誘導体の両方を用いて製造された。天然の海綿由来の生成物は、ヌクレオシドの第１世代、およびその後の第２〜第３世代（ＡＺＴ、ＤＤＩ、ＤＤＣ、Ｄ４Ｔ、３ＴＣ）のＨＩＶ−１のＲＴの特異的阻害剤である抗ウイルス剤をもたらした。
多数の非ヌクレオシド薬剤（ＮＮＲＴＩ）が、ＲＴをアロステリックに阻害する天然生成物から発見されている。ＮＮＲＴＩは、相当の構造的多様性を有するが、それらの阻害プロフィールにおいて特定の共通の特徴を共有する。天然生成物から単離されたＮＮＲＴＩの間では、以下が挙げられる：Calophyllum lanigerumからのカラノリドＡ；Maporonea African aからのトリテルピン類。海洋ホヤのアルカロイド類であるラメラリンからの天然のＨＩＶインテグラーゼ阻害剤についての刊行物が存在する。
ライム病は、Borrelia属に属する細菌により引き起こされるマダニ媒介疾患である。Borrelia burgdorferiは、米国におけるライム病の主な原因であり、一方Borrelia afzeliiおよびBorrelia gariniiは、一部の欧州諸国において関連付けられる。感染の初期の症状は、熱、頭痛、疲労および遊走性紅斑と呼ばれる特徴的な皮疹を含み得る。長期的には、疾患は、間接、心臓および神経系の機能不全を伴う。現行では、疾患は抗生物質により処置される。疾患の処置のために一般的に用いられる抗生物質は、ドキシサイクリン（成年において）、アモキシシリン（小児において）、およびセフトリアキソンである。遅い、遅延した、または不適切な処置は、ライム病の後期の症状をもたらし、これは障害をもたらし、処置することが困難である。
スピロヘータ細菌の北米株に対するLymerixと呼ばれるワクチンは、ＦＤＡにより承認され、後に市場から回収された。これはB. burgdorferiの細胞表層タンパク質Ａ（ＯｓｐＡ）に基づいていた。アレルＨＬＡ−ＤＲ４を有する患者が、ＯｓｐＡのエピトープと、これらの患者におけるリンパ球の機能に関連する抗原との間で、Ｔ細胞の交差反応に感受性であり、これが自己免疫反応を引き起こすことが発見された。
本発明によれば、Borrelia Bergdorfもまた、ＴＬＲ２のためのＴｏｌｌリガンドを産生すると考えられる。特定の個体のＭＨＣフィンガープリントに対して高いアフィニティーを有するＣＬＩＰ阻害剤での処置によるＢ細胞の表面におけるＣＬＩＰの置き換えは、重要なＴｒｅｇの活性化をもたらし得、これは次いで、抗原非特異的Ｂ細胞の減少を引き起こし得る。したがって、ＣＬＩＰ阻害剤による処置は、特定のＴｒｅｇを再活性化して、ライム病に特徴的な慢性炎症状態に必要な病原性の炎症を抑制することができる。適切な対象のＭＨＣ分析により、その対象を処置するための特異的なＣＬＩＰ阻害剤を合成することができる。したがって、全ての異なる型のＭＨＣフィンガープリントを有する個体を、ライム病について効果的に処置することができる。
慢性的なライム病は、ときに、クラリスロマイシン（ビアキシン（biaxin））などのマクロライド抗生物質とヒドロクロロキン（プラケニル（plaquenil））との組合せにより処置される。ヒドロキシクロロキンは、B. burgdorferiが住み着き得る細胞内の酸性の液胞のｐＨを高めると考えられる。ｐＨを高めることは、マクロライド抗生物質を活性化させてスピロヘータによるタンパク質合成を阻害することを可能にすると考えられる。
１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１）、２型単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−２）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）および水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）を含む少なくとも４種のヒトヘルペスウイルスが、感染し、特定の感染個体の組織において病変を引き起こすことが知られている。ヘルペスウイルスによる感染は、感染の部位に基づいて、いくつかの識別し得る障害に分類される。例えば、一緒に、これらの４種のウイルスは、開発途上国における感染性失明の主要な原因である。目に見える症状が口唇ヘルペスである口腔ヘルペスは、顔および口に感染する。生殖器ヘルペスとして一般に知られる生殖器の感染は、ヘルペスの別の一般的な形態である。ヘルペス性のひょう疽、剣状ヘルペス（herpes gladiatorum）、眼ヘルペス（角膜炎）、脳ヘルペス感染脳炎、モラレ（Mollaret）髄膜炎、および新生児ヘルペスなどの他の障害は、全て単純ヘルペスウイルスにより引き起こされる。単純ヘルペスは、感染個体の病変または体液との直接の接触により最も容易に伝染する。伝染はまた、無症候性の出芽（shedding）の期間の皮膚から皮膚への接触を介しても起こる。
ＨＳＶ−１は、第１に口腔に感染し、一方、ＨＳＶ−２は、第１に生殖器部位に感染する。しかし、眼、皮膚および脳を含む身体のあらゆる領域が、ＨＳＶのいずれかの型により感染し得る。一般に、ＨＳＶは、感染個体の感染部位との直接の接触により、非感染個体に伝染する。
呼吸器経路により伝染するＶＺＶは、感染個体の皮膚上の斑状丘疹状皮疹により特徴づけられる水痘の原因である。臨床感染が回復するにつれ、ウイルスは節（ganglia）において潜伏期の状態に入り、一部の個体において帯状疱疹（herpes zoster）または「帯状疱疹（shingles）」として再発するのみである。再発した皮膚病変は、皮板と密接に関連したままであり、罹患している個体において強い疼痛および掻痒を引き起こす。
ＣＭＶは、よりユビキタスであり、体液中で伝染し得る。ＣＭＶの潜伏期の正確な部位は、正確に同定されていないが、感染した宿主の白血球であると考えられる。ＣＭＶは水疱性の病変を引き起こさないが、湿疹を引き起こす。ヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）は、一群の関連するヘルペスウイルスである。一次感染の後で、ウイルスは潜伏状態で体内に残留する。身体的または精神的ストレスが、潜伏期ＨＣＭＶの再活性化を引き起こす。細胞媒介性免疫応答は、ＨＣＭＶ感染に対する制御および防御において重要な役割を果たす。ＨＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞がドナーから患者に移植された場合、ＨＣＭＶ感染に対する免疫応答が観察され得る（P. D. Greenbergら、1991年、Development of a treatment regimen for human cytomegalovirus (CMV) infection in bone marrow transplantation recipients by adoptive transfer of donor-derived CMV-specific T cell clones expanded in vitro. Ann. N.Y. Acad. Sci., Vol.: 636, pp 184 195）。機能的な免疫系を有する成人において、感染は平穏な経過を有し、最大でも消耗および若干の体温の上昇などの非特異的症状を示す程度である。小児におけるかかる感染は、しばしば、重篤な呼吸器感染として現れ、年長の小児および成人においては、これらは無黄疸性肝炎および単核球症として現れる。妊娠中のＨＣＭＶによる感染は、精神遅滞および聴覚消失を生じる先天性奇形をもたらす場合がある。免疫不全の成人において、肺疾患および網膜炎は、ＨＣＭＶ感染に関連する。
エプスタイン・バーウイルスは、頻繁にＥＢＶとして言及され、ヘルペスウイルスのファミリーのメンバーおよび最も一般的なヒトウイルスの一つである。ウイルスは、世界中で起こり、殆どの人がその人生のいつかの時点においてＥＢＶに感染する。多くの子供がＥＢＶに感染し、これらの感染は通常何らの症状も引き起こさないか、他の温和な短期間の小児の疾患と区別し得ない。思春期または青年期の間にＥＢＶによる感染が起こった場合、これは、感染性の単核球症を引き起こす。ＥＢＶはまた、身体の免疫系の一部の細胞内で一生涯の休止感染を確立する。このウイルスのごく僅かなキャリアにおける後期のイベントは、米国においては通常は見出されない２種の稀な癌であるバーキットリンパ腫および上咽頭癌の出現である。ＥＢＶは、それらの悪性腫瘍において重要な役割を果たすが、おそらくは疾患の単独の原因ではない。
ヘルペスウイルスを身体から根絶することができる処置は、現在は存在しない。抗ウイルス医薬は、流行の頻度、期間および重篤度を低減することができる。抗ウイルス薬はまた、無症候性の出芽を減少させる。ヘルペスウイルスに対する抗ウイルス薬は、ウイルス複製を妨害することにより働き、ウイルスの複製速度を有効に遅延させ、介入するための免疫応答のためのより多くの機会を提供する。単純ヘルペスの流行を制御するための抗ウイルス医薬として、アシクロビル（Zovirax）、バラシクロビル（Valtrex）、ファムシクロビル（Famvir）およびペンシクロビルが挙げられる。皮膚への適用のための局所用ローション、ゲルおよびクリームとして、ドコサノール（Avanir Pharmaceuticals）、トロマンタジンおよびジラクチン（Zilactin）が挙げられる。
ＨＣＭＶに対する処置のために多様な物質が用いられる。例えば、ホスカルネットは、単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルスおよびサイトメガロウイルスなどのヒトヘルペスウイルスならびに肝炎ウイルスに対して選択的活性を示すことが細胞培養物において確立されている、抗ウイルス物質である。抗ウイルス活性は、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素などのウイルスの酵素の阻害に基づく。
肝炎とは、肝臓の炎症を指し、肝炎の感染は肝臓に影響を及ぼす。最も一般的な型は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、およびＣ型肝炎である。Ａ型肝炎は、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）により引き起こされ、慢性感染または慢性肝臓疾患を生じない自己制限された疾患をもたらす。ＨＡＶ感染は、第１に糞便−経口経路により、ヒトからヒトへの接触または汚染された食物もしくは水の摂取を介して伝染する。Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）により引き起こされ、急性疾患を引き起こし得、慢性または生涯の感染、肝臓の硬変（瘢痕）、肝臓癌、肝不全および死亡をもたらし得る。ＨＢＶは、感染性の血液または体液との経皮（皮膚を通した穿刺）または粘膜の接触を介して伝染する。Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により引き起こされ、ときに急性の疾患を生じるが、最も頻繁には硬変、肝不全、肝臓癌および死をもたらし得る無症候性の慢性感染となる。慢性ＨＣＶ感染は、ＨＣＶ感染個体の大多数において発症する。ＨＣＶは、感染個体の血液との接触により拡散する。
現在では、最も効果的なＨＣＶ治療は、アルファインターフェロンとリバビリンとの組合せを用いる。最近の臨床の結果は、ＰＥＧ化されたアルファインターフェロンが、単独治療として、未修飾のアルファインターフェロンよりも優れていることを実証する。しかし、ＰＥＧ化されたアルファインターフェロンとリバビリンとの組合せを伴う実験的な治療レジメンによってすら、相当の部分の患者は、ウイルス負荷の減少が持続しない。
ウイルス感染を処置するためにＣＬＩＰ阻害剤と組み合わせて用いることができる抗ウイルス剤の例として、アマンタジン、リバビリン、リマンタジン、アシクロビル、ファムシクロビル、ホスカルネット、ガンシクロビル、トリフルリジン、ビダラジン、ジダノシン（ｄｄＩ）、スタブジン（ｄ４Ｔ）、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ジドブジン（ＡＺＴ）、ラミブジン、アバカビル、デラビルジン、ネビラピン、エファビレンツ、サキナビル、リトナビル、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、ロピナビルおよびインターフェロンが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の方法により処置または予防することができる寄生虫疾患は、リーシュマニアおよびマラリアを含むがこれらに限定されない寄生虫により引き起こされる。Hisaeda H.ら、Escape of malaria parasites from host immunity requires CD4+CD25+ regulatory T cells Nature Medicine 10, 29-30（2004）は、なぜマラリア寄生虫による感染が頻繁に全体的な免疫抑制を誘導するかを理解するために設計された研究を記載する。かかる免疫抑制は、宿主に、長期間持続する免疫を維持する上でのチャレンジを提示する。Hisaedaらは、Plasmodium yoeliiの致死性株に感染した場合に、Ｔｒｅｇの枯渇がマウスを死から保護したこと、および、この保護が、寄生虫由来の抗原に対するＴ細胞の応答性の増大に関連することを示した。著者らは、「Ｔｒｅｇ細胞の活性化は、マラリア感染の間の免疫抑制に寄与し、マラリア寄生虫が宿主の免疫応答から逃れるのを助ける」と結論付けた。Suffia I.J., et al Infected site-restricted Foxp3+ natural regulatory T cells are specific for microbial antigens, JEM, Volume 203, Number 3, 777-788 (2006)は、天然のＴｒｅｇ細胞は、リーシュマニアに対して特異的に応答することができるという知見を記載する。感染部位における天然のＴｒｅｇ細胞の大部分は、リーシュマニア特異的であった。この知見は、リーシュマニアが、感染した後、対象の免疫応答を抑制するのを補助するようにＴｒｅｇを誘導することを示唆する。したがって、本発明の方法は、Ｔｒｅｇを活性化させてかかる寄生虫により引き起こされる免疫抑制を防ぐことにより寄生虫感染を処置するために有用である。
抗寄生虫剤（parasiticide）は、寄生虫を直接殺傷する薬剤である。かかる化合物は、当該分野において公知であり、一般的に市販されている。ヒトへの投与のために有用な抗寄生虫剤の例として、アルベンダゾール、アムホテリシンＢ、ベンズニダゾール、ビチオノール、クロロキンＨＣｌ、リン酸クロロキン、クリンダマイシン、デヒドロエメチン、ジエチルカルバマジン、フロ酸ジロキサニド、エフロルニチン、フラゾリドン、グルココルチコイド、ハロファントリン、ヨードキノール、イベルメクチン、メベンダゾール、メフロキン、アンチモン酸メグルミン、メラルソプロール、メトリフォネート、メトロニダゾール、ニクロサミド、ニフルチモックス、オキサムニキン、パロモマイシン、イセチオン酸ペンタミジン、ピペラジン、プラジカンテル、リン酸プリマキン、プログアニル、パモ酸ピランテル、ピリメタミン−スルホンアミド、ピリメタミン−スルファドキシン、キナクリンＨＣｌ、硫酸キニーネ、グルコン酸キニジン、スピラマイシン、スチボグルコネートナトリウム（アンチモングルコン酸ナトリウム）、スラミン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、チアベンダゾール、チニダゾール、トリメトピウム−スルファメトキサゾール、およびトリパルサミドが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の方法により処置または予防することができる細菌性疾患は、マイコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、ボレリアおよびレジオネラを含むがこれらに限定されない細菌により引き起こされる。
出願人は、特定の作用機構に拘束されないが、本発明のＣＬＩＰ阻害剤はＭＨＣクラスＩからＣＬＩＰをはずして置換し、Ｔｒｅｇ活性の下方調節および／またはγδＴ細胞などのエフェクターＴ細胞の活性化を引き起こす。Ｔｒｅｇ活性の調節性機能の下方調節は、免疫応答の抑制を妨げ、対象が細菌に対して効果的なまたは増強された免疫応答を開始することを可能にする。同時に、Ｔｒｅｇ細胞は、エフェクター機能へとシフトして、抗原特異的な免疫応答をもたらすことができる。したがって、本発明のペプチドによるＣＬＩＰの置き換えは、特にペプチドが腫瘍特異的抗原と組み合わせて投与された場合に、細菌に対する抗原特異的ＣＤ８＋応答の促進をもたらす。エフェクターＴ細胞の活性化はまた、細菌に対する免疫応答を増強して、より効果的な処置をもたらす。
本発明の一構成要素は、本発明の化合物を投与することにより細菌に対する免疫応答の増強を促進することを含む。化合物は、細菌特異的応答をさらに増強するために、抗原と組み合わせて投与してもよい。「細菌の抗原」とは、本明細書において用いられる場合、細菌表面に結びついており抗原提示細胞の表面にＭＨＣ分子と結びついて発現する場合に免疫応答を惹起することができる、ペプチドまたは炭水化物などの化合物である。好ましくは、抗原は細菌の細胞表面において発現する。
本発明の化合物は、抗菌剤と組み合わせて用いてもよい。細菌感染を処置するためのかかる薬剤の例として、葉酸アンタゴニスト（例えば、マフェニド、スルファジアジン銀、サクシニルスルファチアゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルファメトキサゾール、スルファサラジン、スルフィソキサゾール、ピリメタミン、トリメトプリム、コトリモキサゾール）、細胞壁合成の阻害剤（例えば、ペニシリン類、セファロスポリン類、カルバペネム類、モノバクタム類、バンコマイシン、バシトラシン、クラブラン酸、スルバクタム、タゾバクタム）、タンパク質合成阻害剤（例えば、テトラサイクリン類、アミノグリコシド類、マクロライド類、クロラムフェニコール、クリンダマイシン）、フルオロキノロン類（例えば、シプロフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン）、ナリジクス酸、メテナミン、ニトロフラントイン、アミノサリチル酸、シクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、クロファジミンおよびダプソンが挙げられるがこれらに限定されない。
（ｖｉ）移植／移植片拒絶
本発明の一態様によれば、本明細書において記載される方法は、細胞移植または組織移植の拒絶を阻害する上で有用である。したがって、方法は、心臓、肺、腎臓、皮膚、角膜、肝臓、神経組織もしくは細胞などのそのような移植された組織、または、例えば造血幹細胞もしくは胚性幹細胞を含む幹細胞によるもののために有用である。
器官および組織の外科移植の成功は、移植レシピエントの免疫応答を調節する臨床医の能力にほぼ依存する。特に移植された外来組織に対する免疫学的応答は、組織を生存させ機能させるのであれば、制御されなければならない。現行では、皮膚、腎臓、肝臓、膵臓、肺および心臓が、同種間移植が行われる主要な器官または組織である。移植レシピエントの正常に機能している免疫系が、移植された器官を「非自己」組織として認識し、その後、移植された器官の存在に対して免疫応答を開始することは、長い間知られていた。チェックされない場合、免疫応答は、最終的に移植された器官の生物学的機能の喪失または死をもたらす複数の細胞およびタンパク質を生成する。
この組織／器官拒絶は、超急性、急性および慢性の３種類に分類することができる。超急性拒絶は、本質的に、血中を循環する、移植された器官の組織（移植片）に対して指向された抗体により引き起こされる。超急性拒絶は、非常に短時間に起こり、移植片のネクローシスをもたらす。急性移植片拒絶反応もまた、免疫学的に媒介され、超急性拒絶と比較していくらか遅い。移植の何年も後に起こりえる移植片拒絶の慢性形態は、一般に移植動脈疾患（Graft Arterial Disease：ＧＡＤ）として言及される疾患状態の結果である。ＧＡＤは、大体においては、大血管および小血管における平滑筋細胞の新生内膜増殖および単核細胞の浸潤により特徴づけられる血管の疾患である。この新生内膜増殖は、血管の線維症および閉塞をもたらし、移植片組織への血流を減少させ、器官の不全をもたらす。現行の免疫抑制治療は、慢性拒絶を十分に予防しない。前の１０年間における生存者の増加は、急性拒絶を予防する免疫抑制薬の改善に起因する。しかし、慢性拒絶による損失は同じであり続け、それを予防し得る薬物は、重要な未だ対処されていない医学的要求である。
血液および骨髄移植を行う患者に共通の免疫反応のリスクを低減するために臍帯血から得られたＴｒｅｇの使用を試験する臨床治験が、最近開始された。治療が、血液癌患者の全体的な生存率を改善すること、ならびに自己免疫性疾患を処置するための新しい方法の可能性を提供することが期待される。
移植の状況において、ドナーのＴ−ｒｅｇは、健康なドナーの血液を製造する幹細胞および免疫細胞が増殖できるように、レシピエントの免疫系を抑制し、生命を脅かす移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）を撃退するのを補助することができる。ＧＶＨＤは、提供された細胞中の免疫細胞が、移植レシピエントの身体を攻撃する場合に起こる。最近の研究（Xiaら、Ex vivo-expanded natural CD4+CD25+ regulatory T cells synergize with host T-cell depletion to promote long-term survival of allografts. Am J Transplant. 2008 Feb;8(2):298-306）において、Ｔ調節性細胞の治療的利用が、心臓移植の動物モデルにおいて探求されている。Ｔｒｅｇが、ドナー特異的な様式において同種移植の生存を延長することができたことが発見された。
本発明の方法は、細胞表面ＣＬＩＰ阻害剤による細胞表面ＣＬＩＰの置き換えによるＴｒｅｇの特異的活性化を含む。この活性化は、移植片の拒絶を抑制するための免疫系の減弱をもたらすはずである。
移植片（transplant）／移植片（graft）拒絶を処置するための方法は、通例の移植片（transplant）／移植片（graft）拒絶の処置と組み合わせて、またはそれを補足するために、適用してもよい。組織移植片および器官移植のレシピエントは、通例では、移植された器官または組織に対する移植レシピエントの免疫応答を抑制することを目指して、免疫１または２以上の細胞傷害剤により処置される。現行の免疫抑制薬として、以下が挙げられる：シクロスポリン、タクロリムス（FK506）、シロリムス（ラパマイシン）、メトトレキサート、ミコフェノール酸（ミコフェノール酸モフェチル）、エベロリムス、アザチオプリン、ステロイド類およびNOX-100。これらの薬物の全てが、それらの長期使用を困難にする副作用（以下に詳述する）を有する。例えば、１１アミノ酸残基からなり真菌種Tolypocladium inflatum Gamsにより生成される環式ポリペプチドであるシクロスポリン（シクロスポリンＡ）は、現在、同種（すなわち、ドナーとレシピエントとが哺乳動物の同じ種である）の腎臓、肝臓、膵臓および心臓の移植のレシピエントへの投与のために最適な薬物である。しかし、シクロスポリンの投与は、薬物が腎臓および肝臓の毒性ならびに高血圧を引き起こし得るために、欠陥がないわけではない。さらに、シクロスポリンの使用は、薬物の長期処置を受けている患者においてそれが誘導する免疫抑制の「全体的（global）」な性質に起因して、悪性腫瘍（白血病など）、ならびに日和見感染をもたらし得る。すなわち、病原性微生物に対する宿主の正常な保護的な免疫応答が下方調節され、それによりこれらの病原体により引き起こされる感染のリスクが増大する。
FK506（タクロリムス）もまた、独立型処置として、または組み合わせにおいて、免疫抑制剤として使用されてきた。その免疫抑制活性はシクロスポリンの１０〜１００倍高いが、これはなお毒性の問題を有する。既知の副作用として、腎臓の損傷、癲癇、振戦、高血圧、糖尿病、高血中カリウム、頭痛、不眠、錯乱、癲癇、ニューロパシーおよび痛風が挙げられる。これはまた、流産とも関連してきた。メトトレキサートは、細胞傷害剤の処置に一般的に添加される。メトトレキサートは、移植の後に低い用量で数回投与される。シクロスポリンとメトトレキサートとの組合せは、移植片拒絶の重篤度を低減する上で有効であることが見出されているが、口腔の痛みおよび肝臓の損傷などの副作用が存在する。重篤な移植片拒絶は、ステロイド類により処置することができる。しかし、ステロイド類の副作用は、体重増加、体液貯留、血糖の上昇、気分障害極度および／または指向の混乱など、極度であり得る。
抗拒絶薬として用いられる親油性マクロライドであるラパマイシンは、第１の細胞傷害剤の毒性の量を低減するために他の抗拒絶薬（すなわちシクロスポリン）と組み合わせて服用することができるが、これもまた、高コレステロール、高トリグリセリド、高血圧、湿疹および挫瘡を引き起こすなどの特定の副作用を有する。さらに、これは、貧血、関節痛、下痢、低カリウムおよび血小板の減少と関連してきた。
（ｖｉｉ）自己免疫疾患
本発明の一態様によれば、本明細書において記載される方法は、ＣＬＩＰ阻害剤を対象に投与することにより対象において自己免疫性疾患の発症を阻害する上で有用である。したがって、方法は、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、１型糖尿病、ウイルス性心内膜炎、ウイルス性脳炎、関節リウマチ、グレーブス病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性筋炎および円板状エリテマトーデスなどの自己免疫性疾患のために有用である。
自己免疫性疾患においては、非特異的に活性化されたＢ細胞であってアポトーシスを起こさないものが存在する。特定の機構により拘束されないが、本発明のＣＬＩＰ阻害剤は、Ｔｒｅｇの活性化およびこれら非特異的に活性化されたＢ細胞の減少をもたらすと考えられる。一見、例えば感染の間にＢ細胞の大部分を失うことは免疫学的に危険であると考えられ得るが、Ｂ細胞は骨髄中で持続的に成熟し、少なくとも老齢になるまでは新たなＢ細胞が持続的に末梢へと出てゆくことが注目される。まとめると、自己免疫性疾患の発症の共通の特徴は、機能不全のＴｒｅｇおよびその後の抗原非特異的なＢ細胞が死ぬことができないことであると考えられる。したがって、本発明の化合物は、Ｔｒｅｇを活性化して抗原非特異的Ｂ細胞を殺傷することにより、治療的結果を提供する。また、本発明の一側面によれば、ＣＬＩＰをＭＨＣと関係して表面に有する細胞は、これらの細胞の増殖および／または活性化を引き起こし得ることも考えられる。γδＴ細胞は、一旦活性化されると、ニューロン、膵臓Ｂ細胞および心臓組織などの宿主組織上のＭＨＣと関係するＣＬＩＰを認識することができる。この認識の結果は、宿主細胞の殺傷であり得る。γδＴ細胞はまた、抗原非特異的Ｂ細胞のさらなる産生を引き起こし得、これは宿主の抗原を取り込んでさらに宿主特異的免疫応答をもたらすことができる。
「自己免疫性疾患」とは、一般的に非アナフィラキシー性過敏性反応（ＩＩ型、ＩＩＩ型および／またはＩＶ型過敏性反応）と関連し、概して、内因性および／または外因性の１または２以上の免疫原性物質に対する対象自体の体液性および／または細胞媒介性免疫応答の結果として生じる疾患を指す。かかる自己免疫性疾患は、アナフィラキシー性（Ｉ型またはＩｇＥ媒介性）の過敏性反応と関連する疾患とは区別される。
（ｖｉｉｉ）癌
一部の態様において、本発明は、癌を処置する方法を提供し、該方法は、かかる処置が望ましい対象にＣＬＩＰ阻害剤を含む組成物の治療有効量を投与することを含む。本発明の組成物は、例えば、第１、第２、第３または第４の系統の癌の処置として用いることができる。いくつかの態様において、本発明は、かかる癌のための１または２以上の従来の治療に対して不応性の対象において癌を処置するための方法（その症状を寛解させることを含む）を提供し、前記方法は、前記対象に、ＣＬＩＰ阻害剤を含む組成物の治療有効量を投与することを含む。癌は、治療に対する応答において、少なくとも癌細胞のいくつかの相当の部分が殺傷されないか、またはそれらの細胞分裂が停止しない場合に、治療に対して不応性であると決定することができる。かかる決定は、in vivoまたはin vitroのいずれかで、癌細胞に対する処置の有効性を検定するための当該分野において公知の任意の方法により、かかる文脈において「不応性」の当該分野において許容された意味を用いて、行うことができる。特定の態様において、癌細胞の数が有意に減少しないか、または増大した場合に、癌は不応性である。
出願人は特定の作用機構に拘束されないが、本発明のＣＬＩＰ阻害剤はＭＨＣクラスＩからＣＬＩＰをはずして置換し、Ｔｒｅｇの活性の下方調節および／またはγδＴ細胞などのエフェクターＴ細胞の活性化を引き起こす。Ｔｒｅｇ活性の調節性機能の下方調節は、免疫応答の抑制を妨げ、対象が癌に対して効果的なまたは増強された免疫応答を開始することを可能にする。同時に、Ｔｒｅｇ細胞は、エフェクター機能へとシフトして、抗原特異的な免疫応答をもたらすことができる。したがって、本発明のペプチドによるＣＬＩＰの置き換えは、特にペプチドが腫瘍特異的抗原と組み合わせて投与された場合に、癌に対する抗原特異的ＣＤ８＋応答の促進をもたらす。エフェクターＴ細胞の活性化はまた、癌に対する免疫応答を増強して、より効果的な処置をもたらす。
本発明は、かかる癌の処置のための存在する単剤治療に対して不応性の対象において癌を処置するための方法（その１または２以上の症状を寛解させることを含む）を提供し、前記方法は、前記対象にＣＬＩＰ阻害剤を含む組成物の治療有効量およびＣＬＩＰ阻害剤以外の１または２以上の治療剤の治療有効量を投与することを含む。本発明はまた、他の処置に対して不応性であることが証明された患者に、ＣＬＩＰ阻害剤を含む組成物を、任意の他の抗癌処置（例えば放射線治療、化学療法または手術）と組み合わせて投与することにより癌を処置するための方法を提供する。本発明はまた、癌を有し、先に１または２以上の他の癌治療を経験していることを理由として免疫抑制された患者の処置のための方法を提供する。本発明はまた、化学療法、放射線治療、ホルモン治療および／または生物学的治療／免疫治療が、毒性が高すぎる、すなわち、処置される対象にとって受容し得ないまたは耐えられない副作用をもたらすことが証明されたているかまたはその可能性がある場合の癌の処置のための代替的方法を提供する。
本発明により包含される方法により処置することができる癌として、新生物、悪性腫瘍、転移腫瘍、または癌性であると考えられるような制御されない細胞増殖により特徴づけられる任意の疾患もしくは障害が挙げられるがこれらに限定されない。癌は、原発癌であっても転移癌であってもよい。本発明にしたがって処置することができる具体的な癌は、以下に列記するものを含むがこれらに限定されない（かかる障害の総説については、Fishmanら、1985年、Medicine、第２版、J.B. Lippincott Co., Philadelphiaを参照）。
胆道癌；膀胱癌；神経膠芽腫および髄芽腫を含む脳癌；乳癌；子宮頚癌；繊毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；急性リンパ性および骨髄性白血病；多発性骨髄腫；ＡＩＤＳ関連白血病および成人Ｔ細胞白血病リンパ腫を含む血液系新生物；ボーエン病およびパージェット病を含む上皮内新生物；肝臓癌；肺癌；ホジキン病およびリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫；神経芽細胞腫；扁平上皮癌を含む口腔癌；上皮細胞、間質細胞、生殖細胞および間葉系細胞から生じるものを含む卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫および骨肉腫を含む肉腫；メラノーマ、カポジ肉腫、基底細胞癌および扁平上皮癌を含む皮膚癌；精上皮腫、非精上皮腫、奇形腫、繊毛癌などの胚性腫瘍を含む精巣癌；間質性腫瘍および生殖細胞腫瘍；甲状腺腺癌および髄様癌を含む甲状腺癌；ならびに腺癌およびウィルムス腫瘍を含む腎臓癌を含むがこれらに限定されない癌。一般的に遭遇する癌として、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌および脳癌が挙げられる。
本発明の組成物をまた、新生物または悪性腫瘍状態への進行を予防するために投与してもよい。かかる予防的使用は、新生物または癌への進行が進むことが知られているかまたは疑われる状態において、特に、過形成（hyperplasia）、異形成（metaplasia）、またはとりわけ特に形成異常（dysplasia）からなる非新生物細胞増殖が起こっている場合に（かかる異常増殖状態の概説については、RobbinsおよびAngell、1976年、Basic Pathology、第２版、W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 68-79を参照）、必要が示される。過形成は、構造または機能の著しい変化を伴わずに組織または器官における細胞数の増加を引き起こす、制御された細胞増殖の形態である。子宮内膜過形成はしばしば子宮内膜癌へと進む。異形成は、制御された細胞増殖の形態であり、ここで、成人のまたは完全に分化した細胞の１つの型が、成人の細胞の別の型を置換する。異形成は、上皮または結合組織の細胞において起こり得る。典型的な異形成は、いくらか無秩序に異形成性な上皮を生じる。形成異常は、頻繁に癌の前兆であり、主に上皮において見出される。これは、最も無秩序な形態の非新生物細胞増殖であり、個々の細胞の均一性および細胞の構築的配向性の喪失を伴う。形成異常細胞は、しばしば異常に大きな、濃く染色される核を有し、多形性を示す。形成異常は、慢性的な刺激または炎症が存在する場所において特徴的に起こり、しばしば子宮頚部、呼吸経路、口腔および胆嚢において見出される。
過形成、異形成または形成異常として特徴づけられる異常細胞増殖の存在の代わりに、またはそれに加えて、患者からの細胞サンプルによりin vivoで提示されるかまたはin vitroで提示される形質転換した表現型または悪性腫瘍の表現型の１または２以上の特徴の存在は、本発明の組成物の予防的／治療的投与の望ましさを示し得る。形質転換した表現型のかかる特徴として、形態学的変化、緩くなった基層の結合、接触阻害の喪失、足場依存性の喪失、プロテアーゼ放出、糖輸送の増大、血清要求性の低下、胎性抗原の発現、250,000ダルトンの細胞表面抗原の消失など（また、形質転換または悪性腫瘍の表現型に関連する特徴については、上記文献の８４〜９０ページを参照）が挙げられる。
特定の態様において、白板症、良性に見える上皮の過形成もしくは形成異常病変、またはボーエン病、上皮内癌（carcinoma in situ）は、予防的介入の望ましさの指標となる前腫瘍病変である。
別の態様において、線維嚢胞性疾患（嚢胞性過形成、乳腺形成異常、特に腺疾患（良性上皮過形成））は、予防的介入の指標である。
本発明の組成物の予防的使用はまた、癌を生じ得る一部のウイルス感染において必要性が示される。例えば、ヒトパピローマウイルスは子宮頚癌を生じ得（例えばHernandez-Avilaら、Archives of Medical Research（1997）28: 265-271を参照）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）はリンパ腫を生じ得（例えばHerrmannら、J Pathol (2003) 199(2): 140-5を参照）、ＢまたはＣ型肝炎ウイルスは肝臓癌を生じ得（例えばEl-Serag、J Clin Gastroenterol (2002) 35(5 Suppl 2): S72-8を参照）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）−ＩはＴ細胞白血病を生じ得（例えばMortreuxら、Leukemia (2003) 17(1): 26-38）、ヒトヘルペスウイルス−８感染は、カポジ肉腫を生じ得る（例えばKadowら、Curr Opin Investig Drugs (2002) 3(11): 1574-9を参照）。
他の態様において、１または２以上の以下の悪性腫瘍についての病因を示す患者は、本発明の組成物の有効量の投与により処置される：悪性腫瘍に関連する染色体転座（例えば、骨髄性白血病に関連するフィラデルフィア染色体、濾胞性リンパ腫についてのｔ（１４；１８）など）、家族性ポリポーシスまたはガードナー症候群（結腸癌の前兆となり得る）、良性単クローナルγグロブリン異常症（多発性骨髄腫の前兆となり得る）、メンデルの（遺伝子による）遺伝的パターンを示す癌または前癌疾患を有する個体と１親等であること（例えば、結腸の家族性ポリポーシス、ガードナー症候群、遺伝性の外骨腫、多腺性腺腫症、アミロイド産生および褐色細胞腫を伴う甲状腺髄様癌、ポイツ−ジェガース症候群、フォン・レックリングハウゼンの神経線維腫症、網膜芽細胞腫、頸動脈球腫瘍、皮膚黒色腫、眼内黒色腫、色素性乾皮症、毛細血管拡張性運動失調症、チェディアック−東症候群、白皮症、ファンコニー再生不良性貧血、ならびにブルーム症候群；RobbinsおよびAngell、1976年、Basic Pathology、第２版、W.B. Saunders Co., Philadelphia, pp. 112-113などを参照、ならびに発癌物質への暴露（例えば、喫煙、および特定の化学物質の吸入または接触）。
一つのセットの態様において、本発明は、癌が疑われるかまたは癌の症状を示す対象を処置する方法を含む。癌は、原発性、転移性、再発性または多剤耐性であってよい。一部の症例において、癌は薬剤耐性または多剤耐性である。本明細書において使用される場合、「薬剤耐性癌」とは、従来の一般に公知の癌治療に対して耐性である癌である。従来の癌治療の例として、メトトレキサート、トリメトレキサート、アドリアマイシン、タキソテール、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パミドロン酸二ナトリウム、アナストロゾール、エキセメスタン、シクロホスファミド、エピルビシン、トレミフェン、レトロゾール、トラスツズマブ、メゲストロール、タモキシフェン、パクリタキセル、ドセタキセル、カペシタビン、酢酸ゴセレリンなどの薬剤による癌の処置が挙げられる。「多剤耐性癌」とは、１より多い型またはクラスの癌薬剤に耐性である、すなわち、第１の作用機構を有する第１の薬物、および第２の作用機構を有する第２の薬物に耐性であることが可能な癌である。
本発明の一成分は、本発明の組成物を投与することにより、癌に対する免疫応答の増強を促進することを含む。化合物は、癌特異的免疫応答をさらに促進するために、癌抗原と組み合わせて投与してもよい。「癌抗原」とは、本明細書において用いられる場合、腫瘍または癌細胞の表面に結びついており、抗原提示細胞の表面においてＭＨＣ分子との関連において発現された場合に免疫応答を惹起することができる、ペプチドまたは炭水化物などの化合物である。好ましくは、抗原は、癌細胞の細胞表面に発現する。なおより好ましくは、抗原は、正常細胞により発現されないか、少なくとも癌細胞におけるものと同じレベルまでは発現しないものである。例えば、いくつかの癌抗原は正常細胞においては正常ではサイレントであり（すなわち、発現されず）、いくつかは分化の特定の段階においてのみ発現し、他のものは胚性および胎性の抗原などとして一時的に発現する。他の癌抗原は、癌遺伝子（例えば、活性化ras癌遺伝子）、抑制遺伝子（例えば変異p53）、内部欠失または染色体転座の結果として生じる融合タンパク質などの変異細胞の遺伝子によりコードされる。なお他の癌抗原は、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルス上に運搬されるものなどのウイルス遺伝子によりコードされている場合がある。正常細胞および癌細胞における癌抗原の発現差異は、癌細胞を標的化するために活用することができる。本明細書において用いられる場合、「癌抗原」と「腫瘍抗原」とは、交換可能に用いられる。
癌ワクチン中に存在するものまたは癌免疫治療を準備するために用いられるものなどの癌抗原は、Cohenら、1994年、Cancer Research, 54:1055において記載されるように、粗癌細胞抽出物から、または組み換え技術を用いて抗原を部分的に精製することにより、または既知の抗原のde novo合成により、調製することができる。癌抗原は、特定の抗原の免疫原性部分の形態で用いてもよく、または一部の場合においてはホールセル（殺菌したもの）を抗原として用いてもよい。かかる抗原は、単離しても、組み換えにより、または当該分野において公知の任意の他の手段により調製してもよい。
癌抗原の例として、MAGE、MART-1/Melan-A、gp100、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−C017−1A/GA733、癌胎児抗原（ＣＥＡ）およびその免疫原性エピトープCAP-1およびCAP-2、etv6、aml1、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその免疫原性エピトープPSA-1、PSA-2およびPSA-3、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、MAGE−ファミリーの腫瘍抗原（例えば、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2（MAGE-B2）、MAGE-Xp3（MAGE-B3）、MAGE-Xp4（MAGE-B4）、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4、MAGE-C5）、GAGE−ファミリーの腫瘍抗原（例えば、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、GAGE-9）、BAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、チロシナーゼ、p53、MUCファミリー、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニン、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン37、Ｉｇ−イディオタイプ、p15、gp75、GM2およびGD2ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質などのウイルス産生物、Smadファミリーの腫瘍抗原、lmp-1、P1A、ＥＢＶにコードされる核抗原（EBNA）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、SSX-1、SSX-2（HOM-MEL-40）、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1およびCT-7、ならびにc-erbB-2が挙げられるがこれらに限定されない。このリストは限定することを意味しない。
抗癌治療の別の形態は、例えば癌細胞の細胞表面抗原に特異的な抗体を投与することを含む。一態様において、抗体は、リブタキシン（Ributaxin）、ハーセプチン、リツキシマブ、クアドラメッツ、パノレックス（Panorex）、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、オンコリム（Oncolym）、SMART M195、ATRAGEN、オバレックス（Ovarex）、ベキサール（Bexxar）、LDP-03、ior t6、MDX-210、MDX-11、MDX-22、OV103、3622W94、抗VEGF、ゼナパックス（Zenapax）、MDX-220、MDX-447、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-1、CEACIDE、プレターゲット（Pretarget）、NovoMAb-G2、TNT、グリオマブ（Gliomab）−Ｈ、GNI-250、EMD-72000、リンフォサイド（LymphoCide）、CMA 676、モノファーム（Monopharm）−Ｃ、4B5、ior egf.r3、ior c5、BABS、抗FLK-2、MDX-260、ANA Ab、SMART 1D10 Ab、SMART ABL 364 AbおよびImmuRAIT-CEAからなる群より選択される。他の抗体として、抗CD20抗体、抗CD40抗体、抗CD19抗体、抗CD22抗体、抗HLA-DR抗体、抗CD80抗体、抗CD86抗体、抗CD54抗体および抗CD69抗体が挙げられるがこれらに限定されない。これらの抗体は市販されており、またはde novoで合成することができる。
一態様において、本発明の方法は、１または２以上の他の形態の癌の処置と組み合わせて、例えば抗癌剤、化学療法、放射線療法などと組み合わせて（例えば同時に、または全体的な処置手順の一部として）用いてもよい。用語「癌の処置」とは、本明細書において用いられる場合、化学療法、放射線療法、アジュバント治療、ワクチン投与、またはこれらの方法の任意の組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。癌の処置の変化し得るパラメーターとして、投与量、投与のタイミングまたは治療の期間が挙げられるがこれらに限定されず、癌の処置は、投与量、タイミングまたは期間において変化し得る。癌のための別の処置は手術であり、これは単独でまたは先の処置方法のいずれかと組み合わせて利用することができる。有用であることが知られているか、または使用されてきたか、または現在癌の予防もしくは処置のために用いられている任意の薬剤または治療（例えば、化学療法、手術、ホルモン治療および／または生物学的治療／免疫治療）を、本明細書において記載される本発明の方法にしたがって本発明の組成物と組み合わせて用いることができる。医学の分野の当業者は、対象のための適切な処置を決定することができる。
かかる薬剤（すなわち抗癌剤）の例として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アルキル化剤（例えばナイトロジェンマスタード類、例えば、クロラムブシル、シクロフォスファミド、イソファミド（Isofamide）、メクロルエタミン、メルファラン、ウラシルマスタードを含むがこれらに限定されないＤＮＡ相互作用剤（DNA-interactive agent）；チオテパなどのアジリジン；ブスルファンなどのメタンスルホネートエステル類；カルマスティン、ロムスチン、ストレプトゾシンなどのニトロソウレア類；シスプラチン、カルボプラチンなどの白金錯体；マイトマイシンおよびプロカルバジン、ダカルバジンおよびアルトレタミンなどの生体内還元性アルキル化剤; ＤＮＡ鎖切断剤、例えばブレオマイシン；挿入性（inercalating）トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、アムサクリン、 ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロンなどの挿入剤（Intercalator）、ならびにエトポシドおよびテニポシドなどの非挿入剤（nonintercalator）；非挿入性（noninercalating）トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばエトポシドおよびテニポシド；ならびにＤＮＡ副溝結合物、例えばプリカマイシン；メトトレキサートおよびトリメトキサレートなどの葉酸アンタゴニストを含むがこれらに限定されない代謝拮抗薬；フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、CB3717、アザシチジンおよびフロクスウリジンなどのピリミジンアンタゴニスト類；メルカプトプリン、６−チオグアニン、ペントスタチンなどのプリンアンタゴニスト類；シタラビンおよびフルダラビンなどの糖修飾アナログ；ならびにヒドロキシウレアなどのリボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；コルヒチン、ビンクリスチンおよびビンブラスチンを含むがこれらに限定されないチューブリン相互作用剤、両方のアルカロイド類ならびにパクリタキセルおよびシトキサン；
エストロゲン類、結合型エストロゲン類ならびにエチニルエストラジオールおよびジエチルスチルベストロール、クロルトリアニセン（Chlortrianisen）およびイデネストロール（Idenestrol）を含むがこれらに限定されないホルモン剤；ヒドロキシプロゲステロンカプロアート、メドロキシプロゲステロンおよびメゲストロールなどのプロゲスチン類；ならびにテストステロン、プロピオン酸テストステロンなどのアンドロゲン類；フルオキシメステロン、メチルテストステロン；副腎皮質ホルモン剤、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾロン；黄体形成ホルモン（leutinizing hormone）放出ホルモン剤または性腺刺激ホルモン放出ホルモンアンタゴニスト類、例えば酢酸リュープロリドおよび酢酸ゴセレリン；タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤、フルタミドなどの抗アンドロゲン剤を含むがこれらに限定されない抗ホルモン抗原；ならびにミトタンおよびアミノグルテチミドなどの抗副腎剤；ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γおよびウテログロビン（米国特許第5,696,092号）を含むがこれらに限定されないサイトカイン；
ＶＥＧＦを阻害する薬剤（例えば、他の中和抗体（Kim et al., 1992; Presta et al., 1997; Sioussat et al., 1993; Kondo et al., 1993; Asano et al., 1995、米国特許第5,520,914号）、可溶性受容体コンストラクト（Kendall and Thomas, 1993; Aiello et al., 1995; Lin et al., 1998; Millauer et al., 1996）、チロシンキナーゼ阻害剤（Siemeister et al., 1998、米国特許第5,639,757号および同第5,792,771号）、VEGFまたはVEGF受容体に対するアンチセンス戦略、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイム（Saleh et al., 1996; Cheng et al., 1996; Ke et al., 1998; Parry et al., 1999）を含むがこれらに限定されない抗血管新生剤；WO 98/16551に記載されるようなアンタゴニスト特性を有するＶＥＧＦのバリアント；他の化学物質クラスの化合物、例えば、米国特許第5,972,922号に記載されるような血管新生抑制性の４，９（１１）−ステロイド類およびＣ２１−酸素化ステロイド類などのステロイド類；米国特許第5,712,291号および同第5,593,990号において記載されるようなサリドマイドおよび関連する化合物、前駆体、アナログ、代謝物および加水分解生成物；トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）および血小板因子４（ＰＦ４）；インターフェロン類およびメタロプロテイナーゼ阻害剤；組織メタロプロテイナーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ）；抗浸潤性因子、レチノイン酸およびパクリタキセル（米国特許第5,716,981号）；AGM-1470（Ingber et al., 1990）；サメ軟骨抽出物（米国特許第5,618,925号）；アニオン性ポリアミドまたはポリウレアオリゴマー類（米国特許第5,593,664号）；オキシインドール誘導体（米国特許第5,576,330号）；エストラジオール誘導体（米国特許第5,504,074号）；チアゾロピリミジン誘導体（米国特許第5,599,813号）；ならびにLM609（米国特許第5,753,230号）；
bcr-abl、bcl-2（bcl-1、cyclin D1とは異なる；GenBankアクセッション番号M14745、X06487；米国特許第5,650,491号；および同第5,539,094号）、ならびにBcl-x1、Mcl-1、Bak、A1、A20を含むファミリーのメンバー、ならびにアンチセンスヌクレオシド配列（米国特許第5,650,491号；同第5,539,094号；および同第5,583,034号）を含むがこれらに限定されないアポトーシス誘導剤；免疫毒素および凝固リガンド（coaguligand）、腫瘍ワクチン、ならびに抗体。
本発明の方法にしたがって用いることができる抗癌剤の具体例として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール（acodazole hydrochloride）；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン;アンボマイシン（ambomycin）;酢酸アメタントロン;アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アンスラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン（asperlin）；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン（azotomycin）；バチマスタット；ベンゾデパ（benzodepa）；ビカルタミド；塩酸ビサントレン；ジメシル酸ビスナフィド（bisnafide dimesylate）；ビゼレシン（bizelesin）；硫酸ブレオマイシン；ブレキナールナトリウム（brequinar sodium）；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド（caracemide）；カルベチマー（carbetimer）；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン（carubicin hydrochloride）；カルゼレシン（carzelesin）；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン（cirolemycin）；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール（crisnatol mesylate）；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン（dezaguanine）；
メシル酸デザグアニン（dezaguanine mesylate）；ジアジクォン（diaziquone）；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；ズアゾマイシン（duazomycin）；エダトレキセート；塩酸エフロミチン（eflomithine hydrochloride）；エルサミトルシン(elsamitrucin)；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン （epipropidine）；塩酸エピルビシン；エルブロゾール（erbulozole）；塩酸エソルビシン（esorubicin hydrochloride）；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン（etoprine）；塩酸ファドロゾール；ファザラビン（fazarabine）；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン（flurocitabine）；ホスキドン（fosquidone）；ホスキドンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム（lometrexol sodium）；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン（losoxantrone hydrochloride）；マソプロコール；マイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン（mitocarcin）；ミトクロミン；ミトジリン（mitogillin）；ミトマルシン（mitomalcin）；ミトマイシン；ミトスペル（mitosper）；ミトーテン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；
ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ（pegaspargase）；ペリオマイシン（peliomycin）；ペンタムスチン（pentamustine）；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド（perfosfamide）；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン（piroxantrone hydrochloride）；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン（prednimustine）；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン（riboprine）；ログレトイミド（rogletimide）；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルホサートナトリウム（sparfosate sodium）；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル（sulofenur）；タリソマイシン（talisomycin）；テコガランナトリウム；テガフール；塩酸テロキサントロン（teloxantrone hydrochloride）；テモポルフィン；テニポシド；テルオキシロン（teroxirone）；テストラクトン；チアミプリン（thiamiprine）；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン（trestolone acetate）；リン酸トリシリビン（triciribine phosphate）；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール（tubulozole hydrochloride）；ウラシルマスタード；ウレデパ（uredepa）；バプレオチド（vapreotide）；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシナート（vinglycinate sulfate）；硫酸ビンロイロシン（vinleurosine sulfate）；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン（vinrosidine sulfate）；硫酸ビンゾリジン（vinzolidine sulfate）；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン（zorubicin hydrochloride）。
他の抗癌剤としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：20-epi-1,25ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；血管新生阻害剤；抗背方化形態形成タンパク質（anti-dorsalizing morphogenetic protein）−１；ara-CDP-DL-PTBA；BCR/ABLアンタゴニスト；CaRest M3；CARN 700；カゼインキナーゼ阻害剤(ICOS)；クロトリマゾール；コリスマイシン （collismycin）Ａ；コリスマイシン（collismycin）Ｂ；コンブレタスタチンＡ４；クランベシジン８１６；クリプトフィシン８；キュラシンＡ；デヒドロジデムニン（dehydrodidemnin）Ｂ；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール、ズオカルマイシン（duocarmycin）ＳＡ；カハラリドＦ；ラメラリン（lamellarin）−Ｎトリアセテート；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リソクリンアミド（lissoclinamide）７；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；Ｏ６−ベンジルグアニン；プラセチン（placetin）Ａ；プラセチン（placetin）Ｂ；白金錯体；白金化合物；白金トリアミン錯体；レニウムRe 186エチドロネート；ＲＩＩレチンアミド；ルビギノン（rubiginone）Ｂ１；SarCNU；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；老化誘導阻害剤１；スピカマイシンＤ；タリムスチン（tallimustine）；５−フルオロウラシル；トロンボポイエチン；甲状腺刺激ホルモン；バリオリンＢ；サリドマイド；ベラレソール；ベラミン（veramine）；ベルジン（verdin）類；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン（vitaxin）；ザノテロン（zanoterone）；ゼニプラチンおよびジラスコルブ。
本発明はまた、Ｘ線、ガンマ線および癌細胞を破壊するための他の放射線ソースの使用を含む放射線治療と組み合わせた、ＣＬＩＰ阻害剤を含む組成物の投与を包含する。好ましい態様において、放射線処置は、放射線が遠隔のソースから向けられる外照射または遠隔療法として投与される。他の好ましい態様において、放射線処置は、放射線ソースが体内の癌細胞または腫瘍塊の近傍に位置される内照射療法または近接照射療法として投与される。
特定の態様において、癌の型に依存して適切な抗癌レジメンが選択される。例えば、卵巣癌を有する患者に、ＣＬＩＰ阻害剤を含む組成物の予防または治療有効量を、以下を含むがこれらに限定されない卵巣癌治療のために有用な１または２以上の他の薬剤の予防または治療有効量と組み合わせて投与してもよい：Ｐ３２治療などの腹腔内放射線治療、全腹部および骨盤の放射線治療、シスプラチン、パクリタキセル（タキソール）またはドセタキセル（タキソテール）とシスプラチンまたはカルボプラチンとの組合せ、シクロホスファミドとシスプラチンとの組合せ、シクロホスファミドとカルボプラチンとの組合せ、５−ＦＵとロイコボリン、エトポシド、リポソームドキソルビシン、ゲムシタビンまたはトポテカンとの組合せ。特定の態様において、プラチナ不応性疾患を有する患者のために、本発明の組成物の予防または治療有効量を、タキソールの投与と組み合わせて投与する。さらなる態様は、不応性癌を有する患者の処置であり、以下の投与を含む：プラチナ不応性である疾患を有する患者におけるイホスファミド、シスプラチンに基づく組み合わせレジメンの不成功の後のサルベージ化学療法としてのヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、および腫瘍において検出可能レベルの細胞質エストロゲン受容体を有する患者におけるタモキシフェン。
癌治療ならびにそれらの投与量、投与の経路および推奨される用法は、当該分野において公知であり、Physician's Desk Reference（56版、2002年）などの文献において記載されている。
（ｉｘ）アルツハイマー病
本発明の胸腺由来ペプチドはまた、アルツハイマー病を処置する上で有用である。アルツハイマー病は、認知性および非認知性の精神神経症状により特徴づけられる変性脳障害であり、６５歳を超える患者について痴呆の全ての症例のおよそ６０％の原因である。精神的症状は、アルツハイマー病において共通であり、多くの患者において精神障害（幻覚および妄想）が存在する。アルツハイマー病の精神病性症状は、ドーパミンまたはアセチルコリンの濃度のシフトに関与する可能性があり、これはドーパミン作動性／コリン作動性のバランスを増大させ、それにより精神病性行動をもたらし得る。例えば、ドーパミン放出の増大は、統合失調症の陽性症状の原因であり得ることが提案されてきた。これは、ドーパミン作動性／コリン作動性のバランスの陽性方向への（positive）崩壊をもたらし得る。アルツハイマー病においては、コリン作動性ニューロンの減少は、アセチルコリン放出を効果的に減少させ、ドーパミン作動性／コリン作動性のバランスの陰性方向への（negative）崩壊をもたらす。実際に、統合失調症の精神障害を軽減するために用いられる抗精神病剤はまた、アルツハイマー病患者における精神障害を緩和する上でも有用である。
（ｘ）アレルギー性疾患
本発明の胸腺由来ペプチドはまた、アレルギー性疾患を処置する上で有用である。「アレルギー状態を有する対象」とは、アレルゲンに対する応答におけるアレルギー性反応を現在経験しているか、または以前に経験した対象を指す。「アレルギー状態」または「アレルギー」とは、物質（アレルゲン）に対する後天性過敏症を指す。アレルギー状態として、湿疹、アレルギー性鼻炎または鼻感冒、花粉症、アレルギー性結膜炎、喘息、ペットアレルギー、蕁麻疹（urticaria）（蕁麻疹（hives））および食物アレルギー、アトピー性皮膚炎を含む他のアトピー性状態；アナフィラキシー；薬物アレルギー；ならびに血管浮腫が挙げられるがこれらに限定されない。
アレルギーは、典型的には、アレルゲンに対する特定のクラスの免疫グロブリンであるＩｇＥからの抗体の産生と関連する、特発性の状態である。一般的な空気中のアレルゲンに対するＩｇＥ媒介性応答の発達はまた、喘息の発症への素因を示す因子である。好塩基球（血中を循環している）または肥満細胞（固体組織全体に分散している）の表面上のＩｇＥ Ｆｃ（ＦｃεＲ）に結合した特定のＩｇＥにアレルゲンが遭遇すると、細胞が活性化し、ヒスタミン、セロトニンおよび脂質メディエーターなどのメディエーターの産生および放出をもたらす。
アレルギー反応は、ＩｇＥ型の組織感作免疫グロブリンが外因性アレルゲンと反応したときに起こる。ＩｇＥ抗体は、肥満細胞および／または好塩基球に結合し、これらの特殊化した細胞は、抗体分子の末端に架橋しているアレルゲンによってそうするように刺激された場合にアレルギー反応の化学メディエーター（血管作用性アミン）を放出する。ヒスタミン、血小板活性化因子、アラキドン酸代謝物、およびセロトニンは、最もよく知られたヒトにおけるアレルギー反応のメディエーターである。ヒスタミンおよび他の血管作用性アミンは、通常は肥満細胞および好塩基性リンパ球内に貯蔵されている。肥満細胞は動物組織全体に拡散され、好塩基球は血管系内を循環する。これらの細胞は、ヒスタミンを製造し、その放出を誘発するＩｇＥ結合を含む特定の順序のイベントが起こらない限りは、細胞内に貯蔵する。
最近、Ｔｒｅｇ依存性の末梢性寛容における肥満細胞についての役割が提案されている。Li-Fan Luら、Nature、Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance 442, 997-1002（2006年８月３１日）。健康状態および疾患におけるアレルゲンに対する免疫応答は、アレルゲン特異的ＴＲｅｇ細胞とアレルゲン特異的ＴＨ２細胞との間のバランスの結果であることが提案されている。ＴＲｅｇ細胞の分裂は、ＴＨ２型前炎症性サイトカインの産生を抑制し、アレルゲン特異的なＩｇＧ４およびＩｇＡ抗体の産生を誘導し、そしてアレルギーのエフェクター細胞を抑制する。本発明の化合物は、Ｔｒｅｇを調節するために有用であり、したがって、アレルギーおよび喘息の処置において有用である。
アレルギー性反応の症状は、体内におけるＩｇＥが抗原と反応する場所に依存して変化する。反応が呼吸上皮に沿って起こる場合、症状は一般に、くしゃみ、咳および喘息性反応である。食物アレルギーの場合のように相互作用が消化管内で起こる場合、腹部疼痛および下痢が一般的である。例えばアレルギー性の対象への蜂刺傷またはペニシリンの投与の後の全身性アレルギー反応は、重篤となる場合があり、しばしば生命を脅かす。
「喘息」は、本明細書において用いられる場合、炎症および気道の狭小化ならびに吸入された病原体に対する気道の反応性の増大により特徴づけられる、呼吸器系のアレルギー性障害を指す。喘息の症状として、気流の閉塞から生じる喘鳴、息切れ、胸部絞扼感および咳の再発性のエピソードが挙げられる。喘息に関連する気道の炎症は、気道上皮の裸出、基底膜下のコラーゲン沈着、浮腫、肥満細胞の活性化、好中球、好酸球およびリンパ球を含む炎症性細胞の浸潤などの多数の生理学的変化の観察を介して検出することができる。気道の炎症の結果として、喘息患者は、しばしば気道の応答性亢進、気流の制限、呼吸器症状および疾患の慢性化を経験する。気流の制限として、急性気管支収縮、気道浮腫、粘液栓形成、および気道リモデリング、しばしば気管支閉塞をもたらす特徴が挙げられる。喘息の一部の症例において、基底膜下線維症（sub-basement membrane fibrosis）が起こり得、肺機能の持続的な異常をもたらす。
喘息は、炎症性細胞、メディエーター、ならびに気道に存在する他の細胞および組織の間の複雑な相互作用から生じる可能性がある。肥満細胞、好酸球、上皮細胞、マクロファージおよび活性化Ｔ細胞は、全て、喘息に関連する炎症プロセスにおいて重要な役割を果たす。Djukanovic Rら（1990）Am Rev Respir Dis 142:434-457。これらの細胞は、局所組織に対して直接的にまたは間接的に作用し得る、予め生成されたかまたは新たに合成されたメディエーターの分泌を介して気道の機能に影響を及ぼし得ると考えられる。Ｔリンパ球の亜集団（Ｔｈ２）が、選択的サイトカインを放出して疾患の慢性化を確立することにより、気道におけるアレルギー性炎症を調節する上で重要な役割を果たすことが認識されている。Robinson DS et al. (1992) N Engl J Med 326:298-304。
喘息は、発症における異なる段階において生じる複合障害であり、症状の程度に基づいて、急性、亜急性または慢性として分類することができる。急性炎症性応答は、気道への細胞の初期の動員と関連する。亜急性炎症性応答は、細胞の動員ならびに常在性細胞の活性化を伴い、より持続的なパターンの炎症を引き起こす。慢性炎症性応答は、持続的なレベルの細胞の損傷および進行中の修復プロセスにより特徴づけられ、これは、気道における持続的な異常をもたらし得る。
「喘息を有する対象」は、気道の炎症および狭小化ならびに吸入された病原体に対する気道の反応性の増大により特徴づけられる呼吸器系の障害を有する対象である。喘息の開始と関連する因子として、アレルゲン、低温、運動、ウイルス感染およびＳＯ２が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の組成物はまた、抗アレルギー治療と組み合わせて投与してもよい。アレルギーを治療または予防する従来の方法は、アレルギー医薬の使用または脱感作治療に関与してきた。アレルギーを治療または予防するための一部の進化した治療は、抗ＩｇＥ抗体を中和することの使用を含む。抗ヒスタミン剤またはアレルギー反応の化学メディエーターの作用を遮断する他の薬物は、アレルギー症状の重篤度を調節することを補助するが、アレルギー反応を予防するものではなく、その後のアレルギー反応に対して効果を有さない。脱感作治療は、アレルゲンに対するＩｇＧ型の応答を誘導するために、小用量のアレルゲンを、通常は皮下注射により、投与することにより行われる。ＩｇＧ抗体の存在は、ＩｇＥ抗体の誘導から生じるメディエーターの産生を中和することを補助すると考えられている。最初に、対象を、重篤な反応を誘導することを回避するために非常に小用量のアレルゲンで処置し、ゆっくりと用量を増大する。この型の治療は、対象にアレルギー応答を引き起こす化合物を実際に投与し、重篤なアレルギー反応が生じる可能性があるため、危険である。
アレルギー医薬として、抗ヒスタミン剤、副腎皮質ステロイド類およびプロスタグランジン誘導因子が挙げられるがこれらに限定されない。抗ヒスタミン剤は、肥満細胞または好中球によるヒスタミン放出に対抗する化合物である。これらの化合物は、当該分野において周知であり、アレルギーの処置のために一般的に用いられる。抗ヒスタミン剤として、アクリバスチン、アステミゾール、アザタジン、アゼラスチン、ベータタスチン（betatastine）、ブロムフェニラミン、ブクリジン、セチリジン、セチリジンアナログ、クロルフェニラミン、クレマスチン、CS 560、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デクサクロルフェニラミン、エバスチン、エピナスチン、フェキソフェナジン、HSR 609、レボカバスチン、ロラタジン、メトスコポラミン、ミゾラスチン、ノルアステミゾール（norastemizole）、フェニンダミン、プロメタジン、ピリラミン、テルフェナジンおよびトラニラストが挙げられるがこれらに限定されない。副腎皮質ステロイド類として、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、フルニソリド、フルチカゾンプロピオネートおよびトリアムシノロンが挙げられるがこれらに限定されない。
本発明の組成物はまた、喘息治療と組み合わせて投与してもよい。喘息を処置または予防するための従来の方法は、抗アレルギー治療（上に記載する）および吸入される薬剤を含む多数の他の薬剤の使用に関与してきた。喘息の処置のための医薬は、一般に、迅速救済（quick-relief）医薬および長期制御医薬の２つのカテゴリーに分けられる。喘息患者は、持続性喘息の制御を達成および維持するために、長期制御医薬を毎日服用する。長期制御医薬として、副腎皮質ステロイド類、クロモグリク酸ナトリウムおよびネドクロミルなどの抗炎症剤；長期作用性β２−アゴニストおよびメチルキサンチンなどの長期作用性気管支拡張薬；ならびにロイコトリエン修飾因子が挙げられる。迅速救済医薬として、短期作用性β２アゴニスト、抗コリン剤および全身性副腎皮質ステロイド類が挙げられる。喘息の医薬として、ＰＤＥ−４阻害剤、気管支拡張薬／β−２アゴニスト類、Ｋ＋チャネル開口薬、ＶＬＡ−４アンタゴニスト類、ニューロキンンアンタゴニスト類、トロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）合成阻害剤、キサンチン、アラキドン酸アンタゴニスト類、５−リポキシゲナーゼ阻害剤、ＴＸＡ２受容体アンタゴニスト類、ＴＸＡ２アンタゴニスト類、５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質の阻害剤、およびプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。気管支拡張薬／β２アゴニスト類は、気管支の拡張または平滑筋の弛緩を引き起こす化合物のクラスである。気管支拡張薬／β２アゴニスト類として、サルメテロール、サルブタモール、アルブテロール、テルブタリン、D2522／フォルモテロール、フェノテロール、ビトルテロール、ピルブテロール、メチルキサンチン類およびオルシプレナリンが挙げられるがこれらに限定されない。
（ｘｉ）ＣＬＩＰ阻害剤活性の特徴づけおよび実証
本発明にしたがって用いられるＣＬＩＰ阻害剤の活性は、当該分野において公知の任意の方法により決定することができる。一態様において、ＣＬＩＰ阻害剤の活性は、当該分野において公知であり、本明細書において参考として組み込まれるYamanaka、2001年、Microbiol Immunol 2001; 45(7): 507-14において記載されるＳＣＩＤマウスモデルまたはヒト腫瘍移植片を有するヌードマウスなどの癌動物モデル、感染性疾患または他の障害の動物モデルを含むがこれらに限定されない、多様な実験動物モデルを用いることにより決定される。
ＣＬＩＰ阻害剤の活性を試験する多様なin vitroおよびin vivoアッセイが、ＣＬＩＰ阻害剤の精製プロセスにおいて用いられる。本発明のプロトコルおよび組成物はまた、好ましくは、ヒトにおける使用の前に所望の治療または予防活性についてin vitroで、そしてその後in vivoで試験される。
例えば、好ましくは選択的な様式において、ＣＬＩＰ阻害剤はＭＨＣに結合する。本明細書において用いられる場合、用語「選択的結合」および「特異的結合」は交換可能に用いられ、ペプチドが、無関係なタンパク質よりも高いアフィニティーでＭＨＣおよびそのフラグメントに結合する能力を指す。
ペプチドを、当該分野において公知の標準的な結合アッセイまたは例において記載する実験的なコンピューターによるアッセイを用いて、それらのＭＨＣに結合する能力について試験してもよい。好適なアッセイの例として、ＭＨＣを表面（マルチウェルプレート中のウェルにおけるものなど）に固定し、次いで標識したペプチドと接触させてもよい。ＭＨＣに結合する（そしてしたがって表面上にそれ自体が固定される）ペプチドの量を、次いで定量して、特定のペプチドがＭＨＣに結合するか否かを決定してもよい。あるいは、表面に結合しないペプチドの量を測定してもよい。このアッセイのバリエーションにおいて、ペプチドを、直接的にＭＨＣ発現細胞に結合するそれらの能力について試験してもよい。
治療における使用のための化合物は、ヒトにおいて試験する前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどにおけるものを含むがこれらに限定されない好適な動物モデル系において試験することができる。Hannら、2001年、Curr Opin Cell Biol 2001 December; 13(6): 778-84に記載されるように、当該分野において公知であって広く用いられている主要な動物モデルとしてマウスが挙げられるがこれに限定されない。
一態様において、Ｓ−１８０細胞株（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８、バッチＦ４８０５）を、腫瘍モデルとして選択する。なぜならば、同じ株が動物および培養（血清含有条件および無血清条件の両方において）の両方において増殖することができるからである。腫瘍は、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ）において、組織培養物から得られる細胞懸濁液の注射により確立する。マウス１個体あたりおよそ１×１０６〜３×１０６の細胞を腹腔内注射する。腫瘍は、腹腔内の複数の部位で複数の固形小塊として発達し、１０〜１５日間の間に殆どの動物の死を引き起こした。腫瘍の増殖が進行するとともに、動物の生存をモニタリングすることに加えて、それらの状態を定量的に評価し、以下の段落において記載するように、腫瘍インデックスを作成するために用いる。
腫瘍モデル実験における薬物活性の概算を確立するために、動物の観察的試験ならびにそれらの生存状態を組み合わせるインデックスを開発することができる。例えば、マウスを週１回または２回、腹腔内Ｓ１８０腫瘍の存在、確立および最終的な進行について触診する。以下の尺度にしたがって、これらのマウスにおいて腫瘍の発達および進行を評価する：「０」−−腫瘍が触診されない；「１」−−初期腫瘍が存在すると見られる；サイズは小さい（〜１ｍｍ）；腹部の膨張はない；「２」−−腫瘍が確立されたと見られる；いくらかの腹部の膨張；明確な悪液質はない；「３」−−腫瘍が十分に確立している；顕著な腹部の膨張；動物が悪液質を示す；および「４」−−動物が死亡する。処置群についてのインデックス値は、群における個々のマウスのインデックスの平均である。
ＨＩＶのin vitroおよび動物のモデルもまた記載されてきた。例えば、いくつかの動物モデルが、McCune J. M.、AIDS RESEARCH：Animal Models of HIV-1 Disease、Science、1997年１２月１９日：第278巻第5346号、pp. 2141-2142およびK Uberlaら、PNAS、Animal model for the therapy of acquired immunodeficiency syndrome with reverse transcriptase inhibitors、1995年８月２９日、第92巻第18号、8210-8214において記載される。Uberlaらは、ＲＴ阻害剤によるＨＩＶ−１感染の治療のための動物モデルの開発を記載する。研究において、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）のＲＴが、ＨＩＶ−１のＲＴにより置き換えられた。ＳＩＶ／ＨＩＶ−１ハイブリッドウイルスに感染したマカクが、ＡＩＤＳ様の症状および病態を発症したことが実証された。著者らは、「キメラウイルスによるマカクの感染は、新規のＲＴ阻害剤のin vivoでの効力、薬物耐性の出現および逆転、薬物耐性ウイルスによる感染の治療、ならびに組み合わせ治療の効力を研究するための有用なモデルであると考えられる」と結論付けた。
さらに、当業者に公知の任意のアッセイを、本明細書において開示される組み合わせ治療の癌および／または感染性疾患の処置または予防についての予防的および治療的有用性を評価するために用いることができる。
（ｘｉｉ）抗体および他のＣＬＩＰ阻害剤との組合せ
いくつかのの側面において、本発明は、抗ＣＬＩＰ結合分子および抗ＨＬＡ結合分子ならびにＢ細胞結合分子を含む方法およびキットを提供する。結合分子として、本発明のペプチドに加えて、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、および低分子が挙げられる。ＣＬＩＰ結合分子およびＨＬＡ結合分子は、細胞の表面上のＣＬＩＰ分子およびＨＬＡにそれぞれ結合する。結合分子とは、本明細書において、単離された分子であってＣＬＩＰおよびＨＬＡなどの分子に選択的に結合するものを指す。ＣＬＩＰおよびＨＬＡに選択的に結合する分子は、本明細書において用いられる場合、ＣＬＩＰおよびＨＬＡと相互作用する分子、例えば低分子、ペプチド、抗体、フラグメントを指す。いくつかのの態様において、分子はペプチドである。
ペプチドは、最小でも、ＣＬＩＰおよびＨＬＡに結合する領域を含む。ＣＬＩＰおよびＨＬＡ結合領域は、いくつかのの態様において、既知のまたは市販の抗体のＣＬＩＰおよびＨＬＡ結合領域に由来するか、または代替的にこれらはかかる領域の機能的に等価なバリアントである。
ＣＤ２０などの他のＢ細胞表面分子に結合する抗体もまた、本発明のこの側面の中に包含される。ヒトにおける使用のために承認された抗ＣＤ２０抗体は、キメラ抗ＣＤ２０抗体Ｃ２Ｂ８（リツキシマブ；RITUXAN, IDEC Pharmaceuticals, San Diego, Calif.; Genentech, San Francisco, Calif.）である。機構により拘束されることは望まないが、かかる抗体はＢ細胞の殺傷を補助するので、本発明の良好な補助的療法である。
用語「抗体」とは、本明細書において最も広い意味において用いられ、特に、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成される多選択性抗体（例えば二選択性抗体）、抗体フラグメント（所望の生物学的活性を示す限りにおいて）、およびｓｃＦｖなどの抗体様分子を含む。ネイティブな抗体とは、通常、二個の同一の軽（Ｌ）鎖および二個の同一の重（Ｈ）鎖を含むヘテロ四量体の糖タンパク質を指す。各々の重鎖および軽鎖は、規則的に間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続く多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）を、他方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第１の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が、重鎖と軽鎖との可変ドメインの間の接合部分を形成すると考えられる。
多数のＣＬＩＰおよびＨＬＡ抗体は、研究目的のために市販されている。可変ドメインの特定の部分は、抗体の間で配列が広範に異なり、各々の特定の抗体のその特定の抗原への結合および特異性において用いられる。しかし、可変性は、抗体の可変領域全体にわたって均等に分配されてはいない。それは、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方において、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）または「超可変領域」と称される３個または４個のセグメントにおいて集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と称される。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインの各々は、４個または５個のＦＲ領域を含み、ほぼβシート立体配置の形をとり、ＣＤＲ（βシート構造を連結し、いくつかの場合においてはβシートの部分を形成するループを形成する）により連結される。各々の鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域により近接して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabatら、NIH Publ. No. 91-3242、第Ｉ巻、647-669頁（1991）を参照）。定常ドメインは必ずしも直接的に抗体を抗原に結合させることに関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与などの、多様なエフェクター機能を示す。
超可変領域またはＣＤＲは、本明細書において用いられる場合、抗体の可変領域中の極めて配列可変性の高い小領域を定義し、これは抗原結合部位を形成し、抗原特異性の主要な決定因子である。一定義によれば、これらは、軽鎖可変領域における残基（Kabat命名法）２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）、および重鎖可変領域における残基（Kabat命名法）３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、９５−１０２（Ｈ３）であり得る（Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第５版、Public Health Service、National Institute of Health、Bethesda、Md.（1991年））。
「完全な」抗体は、抗原結合可変領域、ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、ネイティブ配列の定常ドメイン（例えば、ヒトネイティブ配列定常ドメイン）であっても、そのアミノ酸配列バリアントであってもよい。好ましくは、完全な抗体は、１または２以上のエフェクター機能を有する。
抗体フラグメントの製造のための多様な技術が開発されてきた。伝統的には、これらのフラグメントは、完全な抗体のタンパク質分解性の消化を介して誘導された（例えばMorimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); and Brennan et al., Science, 229:81 (1985)を参照）。しかし、これらのフラグメントは、現在、組み換え宿主細胞により直接的に産生させることができる。例えば、抗体フラグメントは、抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを直接的にE. coliから回収して、化学的にカップリングしてＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成してもよい（Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組み換え宿主細胞培養物から直接的に単離することができる。
「抗体フラグメント」は、完全な抗体の部分、好ましくは完全な抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディー；単鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成された多選択性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」フラグメントと称される各々が単一の抗原結合部位を有する２個の同一の抗原結合フラグメント、ならびに、残りの、その名称がその容易に結晶化する能力を反映する「Ｆｃ」フラグメントが生成される。ペプシン処理により、２個の抗原結合部位を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られ、これはなお抗原を架橋することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、強固な非共有的に結びつく１つの重鎖と１つの軽鎖可変ドメインとの二量体からなる。各可変ドメインの３個のＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面において抗原結合部位を規定するのは、この立体配置においてである。集合的に、６個のＣＤＲが抗原結合特異性を抗体に寄与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）ですら、結合部位全体よりも低いアフィニティーではあるものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における、抗体のヒンジ領域からの１または２以上のシステインを含む数個の残基の付加により、Ｆａｂと異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’についての本明細書における命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元来は、それらの間にヒンジのシステインを有する一対のＦａｂ’フラグメントとして生成された。抗体フラグメントの他の化学カップリングもまた公知である。
用語「Ｆｃ領域」とは、完全な抗体のパパイン消化により生成され得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端を定義するために用いられる。Ｆｃ領域は、ネイティブな配列のＦｃ領域であってもバリアントのＦｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常は、およそＣｙｓ２２６の位置またはおよそＰｒｏ２３０の位置のアミノ酸残基から、Ｆｃ領域のカルボキシル末端まで伸長するものと定義される。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般にＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの２個の定常領域を含み、随意にＣＨ４ドメインを含む。「Ｆｃ領域鎖」により、本明細書において、Ｆｃ領域の２本のポリペプチド鎖の一方を意味する。
「ヒンジ領域」およびそのバリエーションは、本明細書において用いられる場合、当該分野において公知の意味を含み、これは例えばJanewayら、Immuno Biology: the immune system in health and disease、（Elsevier Science Ltd., NY）（第４版、1999年）において説明される。
免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、異なるクラスに割り当てることができる。５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニットの構造および３次元立体配置は周知である。
あらゆる脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（Κ）およびラムダ（λ）と称される２つの明確に分けられる型の一つに割り当てることができる。
本明細書において有用であるペプチドは、単離されたペプチドである。本明細書において用いられる場合、用語「単離された」とは、言及された材料が、そのネイティブな環境、例えば細胞から取り除かれることを意味する。したがって、単離された生物学的材料は、一部または全ての細胞成分、すなわちネイティブな材料が天然に存在する細胞の成分（例えば細胞質または膜の成分）を含まなくてもよい。単離されたペプチドは、実質的に純粋であり、本質的に、天然またはin vivoの系においてそれらが結合し得る他の物質を、それらの意図される用途のために実用的及び適切である程度まで含まなくてもよい。特に、ペプチドは、例えば医薬の製造またはシークエンシングにおいて有用であるために、十分に純粋であり、十分な程度にそれらの宿主細胞の他の生物学的構成要素を含まない。本発明の単離されたペプチドは、医薬製剤において薬学的に許容可能なキャリアと混合され得るので、ペプチドは、製剤の重量のうちほんの僅かなパーセンテージしか含まない場合がある。ペプチドは、しかし、生体システムにおいてそれらが関連し得る物質から実質的に分離されているという点において、実質的に純粋である。
タンパク質または核酸への言及における用語「精製された」とは、所望の物質の、実務家が精製された物質を所望の目的のために用いることを可能にするために十分な程度までの、汚染物質からの分離を指す。好ましくは、これは、少なくとも１桁の規模、より好ましくは２桁または３桁の規模の精製、最も好ましくは出発材料または天然の材料の４桁または５桁の規模の精製が達成されたことを意味する。特定の態様において、精製された胸腺由来ペプチドは、全タンパク質または核酸の少なくとも６０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％である。これは重量％である場合がある。特定の態様において、精製された胸腺由来ペプチドは、例えばドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動またはアガロースゲル電気泳動によりアッセイされる場合、均一まで精製される。
ＣＬＩＰおよびＨＬＡ結合分子は、好ましくは選択的な様式において、ＣＬＩＰおよびＨＬＡに結合する。本明細書において用いられる場合、用語「選択的結合」および「特異的結合」は、交換可能に用いられ、ペプチドがＣＬＩＰおよびＨＬＡならびにこれらのフラグメントに、非ＣＬＩＰおよびＨＬＡ誘導化合物よりも高いアフィニティーで結合する能力を指す。すなわち、ＣＬＩＰおよびＨＬＡに対して選択的に結合するペプチドは、非ＣＬＩＰおよびＨＬＡ誘導化合物に、それらがＣＬＩＰおよびＨＬＡならびにそれらのフラグメントに結合するのと同じ程度および同じアフィニティーでは結合しない。ただし、ＣＬＩＰおよびＨＬＡと同じ様式においてＣＬＩＰおよびＨＬＡ結合ペプチドに結合する炭水化物のペプチド模倣物または抗イディオタイプ抗体の可変領域などの、ＣＬＩＰおよびＨＬＡの模倣物とするように製造された交差反応性の抗原または分子を例外とする。一部の態様において、ＣＬＩＰおよびＨＬＡ結合分子は、専らＣＬＩＰおよびＨＬＡならびにこれらのフラグメントに結合する。
「単離された抗体」とは、本明細書において用いられる場合、他の細胞物質（例えば、抗体を産生する細胞から分離された）から、または本発明の診断または治療方法のいずれかにおけるそれらの使用を邪魔する他の物質から、実質的に物理的に分離された抗体を指す。好ましくは、単離された抗体は、均一な抗体の集合（例えばモノクローナル抗体の集合）において存在する。単離された抗体の組成物は、しかし、これらに限定されるものではないが薬学的に許容可能なキャリア、アジュバントなどの他の成分と組み合わせることができる。
一態様において、本発明において有用なＣＬＩＰおよびＨＬＡペプチドは、ＣＬＩＰおよびＨＬＡに対して特異的な、単離された完全な可溶性モノクローナル抗体である。本明細書において用いられる場合、用語「モノクローナル抗体」とは、同一のエピトープ（すなわち抗原決定因子）に対して特異的に結合する免疫グロブリンの均一な集合を指す。
他の態様において、ペプチドは抗体フラグメントである。当該分野において周知であるように、抗体分子のほんの小さな部分であるパラトープが、抗体のそのエピトープへの結合に関与する（一般的に、Clark, W.R.（1986）The Experimental Foundations of Modern Immunology、Wiley & Sons, Inc., New York；Roitt, I.（1991）Essential Immunology、第７版、Blackwell Scientific Publications, Oxford；およびPier GB, Lyczak JB, Wetzler LM（編）、Immunology, Infection and Immunity（2004）第１版、American Society for Microbiology Press, Washington D.C.を参照）。例えば抗体のｐＦｃ’およびＦｃ領域は、補体カスケードのエフェクターであり、食細胞上のＦｃ受容体への結合を媒介し得るが、抗原結合には関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素により切断された抗体、またはｐＦｃ’領域なしに精製された抗体は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントと命名され、完全な抗体の両方の抗原結合部位を保持する。単離されたＦ（ａｂ’）２フラグメントは、その２つの抗原結合部位により、二価モノクローナルフラグメントとして言及される。同様に、Ｆｃ領域が酵素により切断された抗体、またはＦｃ領域なしで生成された抗体は、Ｆａｂフラグメントと命名され、完全な抗体分子の抗原部位の１つを保持する。さらに進むと、Ｆａｂフラグメントは、共有結合した抗体軽鎖とＦｄ（重鎖可変領域）と呼ばれる抗体重鎖の一部とからなる。Ｆｄフラグメントは、抗体特異性の主要な決定因子であり（単一のＦｄフラグメントが、１０個までの異なる軽鎖と、抗体特異性を変化させることなく結びつき得る）、Ｆｄフラグメントは、単離物においてエピトープ結合能力を保持する。
用語Ｆａｂ、Ｆｃ、ｐＦｃ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖは、標準的な免疫学的意味のいずれかかにより用いられる（Klein, Immunology（John Wiley, New York, NY, 1982）；Clark, W.R.（1986）The Experimental Foundations of Modern Immunology（Wiley & Sons, Inc., New York）；Roitt, I.（1991）Essential Immunology、第７版（Blackwell Scientific Publications, Oxford）；およびPier GB, Lyczak JB, Wetzler LM,（編）Immunology, Infection and Immunity（2004）第１版、American Society for Microbiology Press, Washington D.C.）。
本発明の抗ＣＬＩＰおよびＨＬＡ抗体は、さらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含んでもよい。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含む、キメラの免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）が、所望の特異性、アフィニティーおよび能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置き換えられた、ヒト免疫グロブリン（レシピエントの抗体）を含む。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基により置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエントの抗体においても輸入されるＣＤＲまたはフレームワークの配列においても見出されない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンのものに対応するＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全て、およびＦＲ領域の全てまたは実質的に全てが、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、および典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は最適にはまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む（Jonesら、Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannら、Nature, 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biot, 2:593-596 (1992)）。
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトのソースから導入された１または２以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「輸入」残基として言及され、これらは、典型的には、「輸入」可変ドメインから取り入れられる。ヒト化は、本質的には、Winterおよび同僚らの方法に従って（Jonesら、Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら、Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら、Science, 239:1534-1536 (1988)）、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列でヒト抗体の対応する部分を置換することにより行うことができる。したがって、かかる「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ないものが非ヒト種からの対応する配列により置換されているキメラ抗体である（米国特許第4,816,567号）。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基および場合によってはいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体における類似の部位からの残基により置換されたヒト抗体である。
多様な形態のヒト化抗体またはアフィニティー成熟抗体が企図される。例えば、ヒト化抗体またはアフィニティー成熟抗体は、Ｆａｂなどの抗体フラグメントであってもよく、これは、イムノコンジュゲートを生成するために、任意に１または２以上の細胞傷害性薬剤と抱合する。あるいは、ヒト化抗体またはアフィニティー成熟抗体は、完全なＩｇＧ１抗体などの完全な抗体であってもよい。
ヒト化の替わりに、ヒト抗体を生成することができる。「ヒト抗体」は、ヒトにより産生された、および／またはヒト抗体を製造するための任意の方法を用いて製造された抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。例えば、いまや、免疫により内因性免疫グロブリン産生の不在下においてヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合型欠損は、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらす。かかる生殖系列変異マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの転移は、抗原チャレンジによるヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551（1993）；Jakobovitsら、Nature, 362:255-258（1993）；Bruggermannら、Year in Immuno., 7:33（1993）；および米国特許第5,591,669号、同第5,589,369号および同第5,545,807号を参照。
ヒトモノクローナル抗体はまた、Borrebaeckらに発行された米国特許第5,567,610号、Ostbergに発行された米国特許第565,354号、Bakerらに発行された米国特許第5,571,893号、Kozber, J. Immunol. 133: 3001 (1984)、Brodeurら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, p. 51-63（Marcel Dekker, Inc, new York, 1987）およびBoerner ら、J. Immunol., 147: 86-95（1991）において開示されるものなどの、当該分野において公知の方法のいずれにより作製してもよい。
本発明はまた、単鎖可変領域フラグメント（ｓｖＦｃ）の使用を包含する。単鎖可変領域フラグメントは、短い連結ペプチドを用いることにより軽鎖および／または重鎖可変領域を連結することにより作製される。十分な可橈性および長さを有する任意のペプチドを、ｓｃＦｖにおけるリンカーとして用いることができる。通常リンカーは、免疫原性を殆ど有さないか全く有さないように選択される。連結ペプチドの一例は、複数のＧＧＧＧＳ残基であり、これは一つの可変領域のカルボキシ末端と別の可変領域のアミノ末端とを架橋する。他のリンカー配列もまた用いることができる。
重鎖または軽鎖の全てまたは任意の部分を、任意の組み合わせにおいて用いることができる。典型的には、可変領域全体がｓｃＦｖに含まれる。例えば、軽鎖可変領域を重鎖可変領域と連結してもよい。あるいは、軽鎖可変領域の一部を重鎖可変領域またはその一部に連結してもよい。また企図されるのは、重鎖可変領域が目的の抗体からのものであり、軽鎖可変領域が別の免疫グロブリンからのものである、ｓｃＦｖである。
ｓｃＦｖは、任意の、例えばＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨの順序で組み立てることができる。特定の発現系において、これらの二つの立体配置の発現のレベルに差異が存在する場合があり、この場合においては、これらの形態の一方が好ましい場合がある。（Ｘ）−リンカー−（Ｘ）−リンカー−（Ｘ）などのタンデムなｓｃＦｖもまた作製することができ、ここでＸは、目的の抗体からのポリペプチドであるか、またはこれらのポリペプチドと他のポリペプチドとの組合せである。別の態様において、単鎖抗体ポリペプチドは、リンカーポリペプチドを有さないか、または短い非可橈性のリンカーのみを有する。可能な立体配置は、ＶＬ−ＶＨおよびＶＨ−ＶＬである。連結は短すぎて鎖内のＶＬとＶＨとの間の相互作用を可能にすることができず、鎖は、各々の末端においてＶＬ／ＶＨ抗原結合部位とホモ二量体を形成する。かかる分子は、当該分野において「ダイアボディー」として言及される。
単鎖可変領域は、組み換えにより、または合成により製造することができる。合成によるｓｃＦｖの製造のために、自動シンセサイザーを用いることができる。組み換えによるｓｃＦｖの製造のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞などの真核細胞、またはE. coliなどの原核細胞のいずれかの、好適な宿主細胞に導入してもよく、発現したタンパク質を標準的なタンパク質精製技術を用いて単離してもよい。
用語「ダイアボディー」は、２個の抗原結合部位を有する小さい抗体フラグメントを指し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖における２つのドメインの間でペアを作ることを可能にするためには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインとペアを作るよう強制され、２個の抗原結合部位を作る。ダイアボディーは、例えばEP 404,097；WO 93/11161；およびHollingerら、Proc. Natl. Acad Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)において、より詳細に記載される。
本明細書におけるモノクローナル抗体は、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種から誘導されたかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であるが、一方、鎖の残りは、別の種から誘導されたかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに、所望の生物学的活性を示す限りにおいて、かかる抗体のフラグメントを含む。
抗体を含むペプチドは、そのＣＬＩＰおよびＨＬＡに結合する能力について、当該分野において公知の標準的な結合アッセイを用いて試験することができる。好適なアッセイの例として、ＣＬＩＰおよびＨＬＡを、表面（マルチウェルプレートのウェルにおけるものなど）上に固定して、次いで、標識されたペプチドと接触させてもよい。ＣＬＩＰおよびＨＬＡに結合する（およびしたがってそれ自体が表面上に固定される）ペプチドの量を次いで定量して、特定のペプチドがＣＬＩＰおよびＨＬＡに結合するか否かを決定することができる。あるいは、表面に結合しないペプチドの量を測定してもよい。このアッセイのバリエーションにおいて、ペプチドを、そのＣＬＩＰおよびＨＬＡを発現する細胞に直接的に結合する能力について、試験することができる。
本発明はまた、ＣＬＩＰおよびＨＬＡに結合する低分子を包含する。かかる結合分子は、ファージディスプレイ法（例えばHartら、J. Biol. Chem. 269:12468（1994）において記載される方法）などの従来のスクリーニング方法により同定することができる。Hartらは、新規のペプチドリガンドを同定するための繊維状ファージディスプレイライブラリーを報告する。一般に、例えばＭ１３またはｆｄファージを用いるファージディスプレイライブラリーは、前述の参考文献において記載されるもののような従来の手順を用いて調製される。ライブラリーは、一般に、４〜８０アミノ酸残基を含むインサートを提示する。インサートは、任意に、完全に変性（degenerate）した、または偏ったペプチドのアレイを表わす。適切な結合特性を有するリガンドは、その表面に標的分子に結合するリガンドを発現するファージを選択することにより得られる。これらのファージを、次いで、最も有用な結合特性を有するペプチドリガンドを発現するファージを同定するために、数サイクルの再選択に供する。典型的には、最良の結合特性（例えば最大のアフィニティー）を示すファージを、核酸分析によりさらに特徴づけし、ファージ表面に発現されるペプチドの特定のアミノ酸配列を、最適な結合を達成するための発現ペプチドの最適な長さにおいて同定する。ファージディスプレイペプチドまたは抗体ライブラリーはまた、Brissette Rら、Curr Opin Drug Discov Devel. 2006年５月；9(3):363-9において記載される。
あるいは、結合分子は、コンビナトリアルライブラリーから同定することができる。多くの型のコンビナトリアルライブラリーが記載されてきた。例えば、米国特許第5,712,171号（これは、化学分子の足場骨格を有する複数の分子コンストラクトを形成することにより、合成分子コンストラクトのアレイを構築し、論理的に順序付けされたアレイにおける分子の少なくとも１か所を改変するための方法を記載する）；同第5,962,412号（これは、特定の生理化学的特性を有するポリマーを作製するための方法を記載する）；および同第5,962,736号（これは特別にアレイ化された化合物を記載する）。
他の結合分子は、当業者により、本明細書において記載されるガイダンスにしたがって同定され得る。ライブラリー技術は、ＣＬＩＰおよびＨＬＡに結合してその機能を妨害する小ペプチドを含む低分子を同定するために用いることができる。アンタゴニスト同定のためにライブラリーを用いることの一つの利点は、小さい反応容積（すなわち、合成およびスクリーニング反応において）における、サイズが小さい数百万個の異なる推定される候補の容易な操作である。ライブラリーの別の利点は、アンタゴニスト類を合成する能力であり、これは、非ペプチド部分の場合は特に、天然に存在するソースを用いる他の方法では達成することができない可能性がある。
低分子コンビナトリアルライブラリーもまた、作製することができる。低分子有機化合物のコンビナトリアルライブラリーは、１または２以上の多様性の点において互いに異なる緊密に関連したアナログの集合であり、有機技術により複数段階のプロセスを用いて合成される。コンビナトリアルライブラリーは、莫大な数の低分子有機化合物を含む。１つの型のコンビナトリアルライブラリーは、化合物のアレイを生成する平行合成法により調製される。「化合物のアレイ」とは、本明細書において用いられる場合、デカルト座標におけるそれらの空間的アドレスにより同定することができる化合物の集合であり、各々の化合物が共通の分子心および１または２以上の可変な構造多様性エレメントを有するように配置されている。かかる化合物アレイ中の化合物は、別々の反応容器中で平行して生成され、各々の化合物がその空間的アドレスにより同定され、追跡される。平行合成混合物および平行合成法の例は、1995年７月１３日に公開されたＰＣＴ公開特許出願W095/18972、ならびに1998年１月２７日に付与された米国特許第5,712,171号およびその対応するＰＣＴ公開特許出願W096/22529において提供され、これらは本明細書において参考として組み込まれる。
本明細書において記載されるＣＬＩＰおよびＨＬＡ結合分子は、本明細書においてより詳細に記載されるように、単独で、または検出剤もしくは細胞傷害剤などの他の分子と組み合わせて、本発明の検出および処置方法において用いることができる。
典型的には、成分の一つは、通常は、検出可能な標識を含むか、検出可能な標識に共役または抱合されている。検出可能な標識は、その存在を直接的または間接的に確認することができる部分である。一般に、標識の検出は、標識によるエネルギーの放出に関与する。標識は、特定の波長の光子もしくは他の原子の粒子を放出するおよび／または吸収するその能力により直接的に検出することができる（例えば放射活性、発光、光学密度または電気密度など）。標識は、それ自体が特定の波長の光を放出または吸収する別の部分に結合する能力、それを補充する能力、および一部の場合においてはそれを切断する能力により、間接的に検出することができる（例えばＦＬＡＧエピトープなどのエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素タグなど）。間接的検出の例は、基質を可視性の生成物へと切断する第１の酵素標識の使用である。酵素は、化学物質、ペプチドまたは核酸分子の性質のものであってよいが、これらに限定されない。他の検出可能な標識として、Ｐ３２もしくはＨ３などの放射活性アイソトープ、蛍光色素などの発光マーカー、光学もしくは電子密度マーカーなど、またはＦＬＡＧエピトープもしくはＨＡエピトープなどのエピトープタグ、ビオチン、アビジン、および西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素タグが挙げられる。標識は、その合成の間、またはその後で、ペプチドと結合させることができる。当業者に公知の多数の異なる標識および標識の方法が存在する。本発明において用いることができる標識の型の例として、酵素、放射性アイソトープ、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物および生物発光化合物が挙げられる。当業者は、本明細書において記載されるペプチドのための他の好適な標識を知っているか、または慣用的な実験を用いてそれを確認することができる。さらに、これらの標識の本発明のペプチドへの共役または抱合は、当業者に一般的な標準的技術を用いて行うことができる。
より高い感受性をもたらす別の標識技術は、本明細書において記載される分子を低分子量ハプテンへ共役させることからなる。これらのハプテンは、次いで、第２の反応により特に改変することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、またはジニトロフェノール、ピリドキサールなどのハプテン、または特異的な抗ハプテン抗体と反応することができるフルオレセインを用いることは一般的である。
抗体またはそのフラグメントを含むペプチドの検出可能な標識への抱合は、とりわけ診断アッセイにおけるかかる薬剤の使用を容易にする。別のカテゴリーの検出可能な標識として、例えば磁気共鳴画像（ＭＲＩ）：Ｇｄ（ＤＯＴＡ）；核医学について：２０１Ｔｌ、γ放出放射性核種９９ｍＴｃ；ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）について：ポジトロン放出アイソトープ、（１８）Ｆ−フルオロデオキシグルコース（（１８）ＦＤＧ）、（１８）Ｆ−フルオライド、銅−６４、ガドジアミド、および２０３ＰｂなどのＰｂ（ＩＩ）の放射性アイソトープ；１１１Ｉｎ、などの診断およびイメージングの標識（一般にin vivo検出可能標識として言及される）が挙げられる。
本明細書において記載される抱合または修飾は、慣用的な化学を使用し、この化学は本発明の一部を形成するものではなく、この化学は化学の分野における当業者に周知である。保護基、ならびにモノ−およびヘテロ二官能性リンカーなどの既知のリンカーの使用は、文献において十分に解説されており、ここでは繰り返さない。
本明細書において用いられる場合、「抱合」とは、任意の生理化学的手段により安定して互いに結合している２つの実体を意味する。結合の性質が、いずれの実体の有効性をも実質的に損なうことがないようものであることが重要である。これらのパラメーターを考慮して、当業者に公知の任意の共有結合または非共有結合型結合が使用される。一部の態様において、共有結合が好ましい。非共有結合型抱合として、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジン複合体形成などの抗アフィニティー相互作用ならびに他のアフィニティー相互作用が挙げられる。かかる結合の手段および方法は、当業者に周知である。
標識および他のアッセイ成分の性質に依存して、標識を検出するために多様な方法を用いることができる。例えば、標識は、固体の基質に結合している間に検出しても、または固体の基質からの分離の後で検出してもよい。標識は、光学または電子密度、放射活性放出、非放射活性エネルギー移動などを介して直接的に検出しても、抗体抱合体、ストレプトアビジン−ビオチン抱合体などにより間接的に検出してもよい。標識を検出するための方法は、当該分野において周知である。
抱合体はまた、化学療法剤、トキシン（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物に由来する酵素的に活性なトキシン、またはそれらのフラグメント、または低分子トキシン）などの細胞傷害剤、あるいは放射活性アイソトープ（すなわち放射性抱合体（radioconjugate））に抱合された抗体を含む。本発明の抗体に抱合されることができる他の抗腫瘍剤として、ＢＣＮＵ、ストレプトゾシン、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第5,053,394号、同第5,770,710号において記載される集合的にLL-E33288複合体として知られる薬剤のファミリー、ならびにエスペラマイシン（米国特許第5,877,296号）が挙げられる。抱合体において用いることができる酵素的に活性なトキシンおよびそのフラグメントとして、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（Pseudomonas aeruginosaからのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンタンパク質、Phytolaca americanaタンパク質（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）、ニガウリ（momordica charantia）の阻害剤、クルシン、クロチン、オフィシナリスの阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）およびトリコテシン類が挙げられる。
細胞の選択的な破壊のために、抗体は、高放射活性原子を含んでもよい。多様な放射活性アイソトープが、放射性抱合抗体の生成のために利用可能である。および例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射活性アイソトープが挙げられる。抱合体を検出のために用いる場合、それは、シンチグラフィー研究のための放射活性原子、例えばｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄などの、核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像（磁気共鳴画像（ｍｒｉ）としても知られる）のためのスピンラベルを含んでもよい。
放射性または他の標識を、公知の方法において抱合体に組み込むことができる。例えば、水素の位置においてフッ素−１９を含む好適なアミノ酸前駆体を用いて、ペプチドを生合成するかまたは化学アミノ酸合成により合成してもよい。ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１などの標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して結合させることができる。イットリウム−９０は、リジン残基を介して結合させることができる。IODOGEN法（Frakerら（1978）Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57）は、ヨウ素−１２３を組み込むために用いることができる。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」（Chatal、CRC Press 1989）は、他の方法を詳細に記載する。
抗体と細胞傷害剤との抱合体は、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（iminothiolane：ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（アジプイミド酸（adipimidate）ジメチルＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート類（トルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの多様な二官能性タンパク質共役剤を用いて作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら、Science 238:1098（1987）において記載されるように製造することができる。炭素−１４標識１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレン トリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合体のための例示的なキレート剤である。WO94/11026を参照。リンカーは、細胞における細胞傷害薬の放出を促進する「切断可能なリンカー」であってもよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Chariら、Cancer Research 52:127-131（1992）；米国特許第5,208,020号）が用いられ得る。
さらに、本発明のペプチドは、解糖阻害剤および／またはハロゲン化アルキルエステルと組み合わせて投与してもよい。解糖阻害剤および／またはハロゲン化アルキルエステルはまた、ＣＬＩＰを細胞表面上のＭＨＣから置換するＣＬＩＰ活性阻害剤としても機能する。好ましい解糖阻害剤は、本明細書において２−デオキシ−Ｄ−グルコースとして定義される２−デオキシグルコース化合物、および２−デオキシ−Ｄ−グルコースのホモログ、アナログおよび／または誘導体である。左旋体は一般的ではなく、２−デオキシ−Ｄ−グルコースが好ましいが、用語「２−デオキシグルコース」は、とりわけ、２−デオキシ−Ｄ−グルコースおよび２−デオキシ−Ｌ−グルコース、またはこれらの混合物を包含することを意図している。
本発明において有用な２−デオキシグルコース化合物の例は：２−デオキシ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｌ−グルコース；２−ブロモ−Ｄ−グルコース、２−フルオロ−Ｄ−グルコース、２−ヨード−Ｄ−グルコース、６−フルオロ−Ｄ−グルコース、６−チオ−Ｄ−グルコース、７−グリコシルフルオライド、３−フルオロ−Ｄ−グルコース、４−フルオロ−Ｄ−グルコース、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの１−Ｏ−プロピルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの１−Ｏ−トリデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの１−Ｏ−ペンタデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの３−Ｏ−プロピルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの３−Ｏ−トリデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの３−Ｏ−ペンタデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの４−Ｏ−プロピルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの４−Ｏ−トリデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの４−Ｏ−ペンタデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの６−Ｏ−プロピルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの６−Ｏ−トリデシルエステル、２−デオキシ−Ｄ−グルコースの６−Ｏ−ペンタデシルエステル、および５−チオ−Ｄ−グルコース、ならびにこれらの混合物である。
本明細書において特に有用な解糖阻害剤は、式：
Figure 2011502964
 を有し、
ここで：Ｘは、ＯまたはＳ原子を表わし；Ｒ１は、水素原子またはハロゲン原子を表わし；Ｒ２は、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、チオール基またはＣＯ−Ｒ６を表わし；ならびに、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、各々、ヒドロキシル基、ハロゲン原子またはＣＯ−Ｒ６を表わし、ここで、Ｒ６は、１〜２０個の炭素原子のアルキル基を表わし、ならびに、ここで、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５の少なくとも２つは、ヒドロキシル基である。ハロゲン原子は好ましくはＦであり、Ｒ６は好ましくはＣ３〜Ｃ１５アルキル基である。好ましい解糖阻害剤は、２−デオキシ−Ｄ−グルコースである。かかる解糖阻害剤は、２００４年６月１１日にM. K. Newellらにより出願された出願番号第10/866,541において詳細に記載され、その開示は本明細書において参考として組み込まれる。
本発明の一部の態様において、ファーマコン（pharmacon）として解糖阻害剤とハロゲン化アルキルエステルとの組合せを投与することにより、ＣＬＩＰを取り除くことができる。組み合わせは好ましくは、プロドラッグとして作用する単一の二官能性化合物として組み合わされ、これは、１または２以上の生理学的に利用可能なエステラーゼにより加水分解される。生理学的条件における多様なエステラーゼの全体的なアベイラビリティのおかげで、解糖阻害剤とハロゲン化アルキルエステルとを組み合わせることにより、エステルを形成することができる。プロドラッグは、生理学的に利用可能なエステラーゼによりその２つの機能的形態へと加水分解される。
他の特定の態様において、ハロゲン化アルキルエステルは、式：Ｒ７ ｍＣＨ１−ｍＸ２Ｒ８ ｎＣＯＯＹを有し、ここで、Ｒ７は、メチル、エチル、プロピルまたはブチルであり、ｍおよびｎは、各々０または１であり、Ｒ８はＣＨまたはＣＨＣＨであり、Ｘは、例えば独立して塩素、臭素、ヨウ素およびフッ素から選択されるハロゲンである。別個の化合物として用いられる場合、Ｙは、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム、アンモニウムおよび置換アンモニウムなどのアルカリ金属またはアルカリ土類金属イオンであり、ここで、置換基は、１〜４個の炭素原子のモノ−またはジ−低級アルキルラジカルおよびエチレンジアンモニウムである。解糖阻害剤と組み合わされてプロドラッグとして用いられる場合、Ｙは、以下の方法および材料のセクションにおいて記載されるように、解糖阻害剤とエステル化される。
好ましいプロドラッグは、ジクロロ酢酸のエステル化により製造されるものであり、以下の構造により例示される：
Figure 2011502964
特定の態様において、対象を処置するための方法は、対象に、本明細書において記載されるペプチドに加えて、ＣＬＩＰ分子、ＨＬＡ−ＤＯ、ＨＬＡ-ＤＭの発現のレベルを低下させるために、アンチセンスＲＮＡｉまたはｓｉＲＮＡなどの低分子干渉核酸分子などの核酸の有効量を投与することを含む。ＣＬＩＰ分子、ＨＬＡ−ＤＯおよびＨＬＡ−ＤＭのヌクレオチド配列は、全て当該分野において周知であり、当業者により、確立した技術を用いて、適切なｓｉＲＮＡ分子を生成するための以下に記載するガイダンスと組み合わせて用いることができる。かかる方法は以下により詳細に記載される。
本発明は、例えば以下を含む低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）として言及される低分子核酸分子の使用を特徴とする：マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子。本発明のｓｉＮＡは、未修飾であっても化学修飾されていてもよい。本発明のｓｉＮＡは、本明細書において議論されるように、化学的に合成しても、ベクターから発現させても、酵素により合成してもよい。本発明はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により細胞における遺伝子発現または活性を調節することができる、多様な化学修飾された合成低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。化学修飾されたｓｉＮＡは、例えばin vivoでのヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大を介して、および/または細胞取り込みの改善を介して、ネイティブなｓｉＮＡ分子の多様な特性を改善する。さらに、複数の化学修飾を有するｓｉＮＡは、そのＲＮＡｉ活性を保持することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は、多様な治療用途のために有用な試薬および方法を提供する。
血清のリボヌクレアーゼによるその分解を妨げる修飾（塩基、糖および/またはリン酸）を有する化学的に合成された核酸分子は、その効力を増強することができる（例えば、Ecksteinら、国際公開WO 92/07065；Perraultら、1990年、Nature 344, 565；Piekenら、1991年、Science 253, 314；UsmanおよびCedergren、1992年、Trends in Biochem. Sci. 17, 334；Usmanら、国際公開WO 93/15187；ならびにRossiら、国際公開WO 91/03162；Sproat、米国特許第5,334,711号；ならびにBurginら、上記を参照；これらの全ては、本明細書における核酸分子の塩基、リン酸および/または糖部分となる多様な化学修飾を記載する）。細胞におけるそれらの有効性を増強する修飾、およびオリゴヌクレオチド合成の時間を短縮し化学物質の要求性を低減するための核酸分子からの塩基の除去が望ましい（全てのこれらの刊行物は、本明細書において参考として組み込まれる）。
核酸分子に導入することができる糖、塩基およびリン酸修飾であってそのヌクレアーゼ安定性および有効性の著しい増強を伴うものを記載するいくつかの例が、当該分野において存在する。例えば、オリゴヌクレオチドは、安定性を増強し、および／または生物学的活性を増強するために、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基修飾（概説についてはUsman and Cedergren, 1992, TIBS. 17, 34; Usman et al., 1994, Nucleic Acids Symp. Ser. 31, 163; Burgin et al., 1996, Biochemistry , 35, 14090を参照）による修飾により修飾される。核酸分子の糖修飾は、当該分野において広範に記載されている（例えば、Ecksteinら、ＰＣＴ国際公開WO 92/07065；Perrault et al. Nature, 1990, 344, 565 568; Pieken et al. Science, 1991, 253, 314317; Usman and Cedergren, Trends in Biochem. Sci., 1992, 17, 334 339; Usmanら、PCT国際公開WO 93/15187; Sproat、米国特許第5,334,711号、ならびにBeigelman et al., 1995, J. Biol. Chem., 270, 25702; Beigelmanら、ＰＣＴ国際公開WO 97/26270；Beigelmanら、米国特許第5,716,824号；Usmanら、分子は１または２以上の化学修飾を含む）。
一態様において、二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の一方は、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に同一のヌクレオチド配列を含む。別の態様において、鎖の一方は、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に対して実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。別の態様において、ｓｉＮＡ分子の各々の鎖は、約１９〜約２３個のヌクレオチドを含み、各々の鎖は、他方の鎖のヌクレオチドに対して相補的な少なくとも約１９個のヌクレオチドを含む。
本発明の一部の態様において、ｓｉＮＡは、ゲノムに組み込まれた導入遺伝子またはプラスミドベースの発現ベクターによりコードされ、これから発現される、ｓｈＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ−ｍｉｒまたはマイクロＲＮＡ分子である。したがって、本発明の一部の態様において、ｍＲＮＡの発現またはマイクロＲＮＡの活性を阻害することができる分子は、低分子干渉核酸をコードする導入遺伝子またはプラスミドベースの発現ベクターである。かかる誘導遺伝子および発現ベクターは、細胞においてこれらのｓｈＲＮＡの発現を駆動して機能的なｓｉＲＮＡをもたらすために、ポリメラーゼＩＩまたはポリメラーゼＩＩＩのいずれかのプロモーターを用いることができる。前者のポリメラーゼは、誘導性および組織特異的な発現系を含む古典的なタンパク質発現戦略の使用を可能にする。本発明の一部の態様において、導入遺伝子および発現ベクターは、組織特異的プロモーターにより制御される。他の態様において、導入遺伝子および発現ベクターは、テトラサイクリン誘導性の発現系などの誘導性プロモーターにより制御される。
本発明の一部の態様において、本発明の低分子干渉核酸は、哺乳動物細胞において、哺乳動物の発現ベクターを用いて発現される。組み換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を行うことができるものであってもよい（例えば、核酸を発現させるために、組織特異的調節エレメントが用いられる）。組織特異的調節エレメントは、当該分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例として、ミオシン重鎖プロモーター、アルブミンプロモーター、リンパ系特異的プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーターおよび乳腺特異的プロモーターが挙げられる。発達により調節されるプロモーター、例えばマウスhoxプロモーターおよびａ−フェトプロテインプロモーター、もまた包含される。
用いることができる他の阻害剤分子として、遺伝子、ＲＮＡ転写物またはタンパク質における配列に向けられた、リボザイム、ペプチド、ＤＮＡザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、抗体、ならびにこれらのアプタマーおよび修飾された形態が挙げられる。アンチセンスおよびリボザイム抑制戦略は、遺伝子産物の発現の低下により、または変異の部位における変異転写物の切断により、腫瘍の表現系の逆転をもたらしてきた（Carter and Lemoine Br. J. Cancer. 67(5):869-76, 1993; Lange et al., Leukemia. 6(11):1786-94, 1993; Valera et al., J. Biol. Chem. 269(46):28543-6, 1994; Dosaka-Akita et al., Am. J. Clin. Pathol. 102(5):660-4, 1994; Feng et al., Cancer Res. 55(10):2024-8, 1995; Quattrone et al., Cancer Res. 55(1):90-5, 1995; Lewin et al., Nat Med. 4(8):967-71, 1998）。例えば、膀胱癌細胞におけるH-Ras変異に標的化されたリボザイムを用いて、新生物の復帰突然変異（reversion）が得られた（Feng et al., Cancer Res. 55(10):2024-8, 1995）。リボザイムはまた、変異遺伝子の遺伝子発現を阻害する手段、および標的化トランススプライシングにより変異を修正する手段の両方として、提案されている（Sullenger and Cech Nature 371(6498):619-22, 1994; Jones et al., Nat. Med. 2(6):643-8, 1996）。リボザイム活性は、例えば、非特異的核酸結合タンパク質または促進性オリゴヌクレオチド（facilitator oligonucleotide）の使用により、増強することができる（Herschlag et al., Embo J. 13(12):2913-24, 1994; Jankowsky and Schwenzer Nucleic Acids Res. 24(3):423-9,1996）。多標的（multitarget）リボザイム（連結されたものまたはショットガン）は、リボザイムの遺伝子抑制についての有効性を改善する手段として提案されている（Ohkawa et al., Nucleic Acids Symp Ser. (29):121-2, 1993）。
三重らせんのアプローチもまた、配列特異的遺伝子抑制のために研究されてきた。三重らせん形成オリゴヌクレオチドは、いくつかの場合において、配列特異的な様式において結合することが見出されている（Postel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88(18):8227-31, 1991; Duval-Valentin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89(2):504-8, 1992; Hardenbol and Van Dyke Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(7):2811-6, 1996; Porumb et al., Cancer Res. 56(3):515-22, 1996）。同様に、ペプチド核酸は、遺伝子発現を阻害することが示されている（Hanvey et al., アンチセンス Res. Dev. 1(4):307-17, 1991; Knudsen and Nielson Nucleic Acids Res. 24(3):494-500, 1996; Taylor et al., Arch. Surg. 132(11):1177-83, 1997）。小溝結合ポリアミド類は、配列特異的な様式においてＤＮＡ標的に結合することができ、したがって、将来のＤＮＡレベルでの抑制について有用な低分子を表わす可能性がある（Trauger et al., Chem. Biol. 3(5):369-77, 1996）。さらに、ドミナントネガティブ変異ペプチドおよび抗体を用いるタンパク質レベルでの干渉により抑制が得られた（Herskowitz Nature 329(6136):219-22, 1987; Rimsky et al., Nature 341(6241):453-6, 1989; Wright et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86(9):3199-203, 1989）。いくつかの場合において、抑制戦略は、同時にタンパク質を低下させることなくＲＮＡレベルの低下をもたらしたが、一方、他の場合において、ＲＮＡの低下は、タンパク質の低下により反映された。
用いることができる抑制戦略の多様なアレイは、標的、例えばＣＬＩＰまたはＨＬＡ−ＤＯに対して選択することができるＤＮＡおよび／またはＲＮＡアプタマーの使用を含む。抑制のためのアプタマーと併せてアプタマーに基づく抑制に不応性であるかまたは部分的に不応性である修飾された置き換え遺伝子およびコードされるタンパク質を用いる抑制および置き換えを、本発明において用いることができる。
（ｘｉｉｉ）投与レジメン
本発明の予防および/または治療プロトコルの毒性および有効性を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死性である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効である用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療インデックスであり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表わすことができる。大きな治療インデックスを示す予防および／または治療剤が好ましい。毒性の副作用を示す予防および／または治療剤は、用いることができるが、非感染細胞に対して起こりえる損傷を最小化し、それにより副作用を軽減するために、かかる薬剤を患部組織へ標的化する送達系を設計するために注意が必要である。
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、予防および／または治療剤のヒトにおける使用のための投与量の範囲を処方する上で用いることができる。かかる薬剤の投与量は、好ましくは、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあり、毒性を殆ど有さないか、または全く有さない。投与量は、使用される剤形および利用される投与の経路に依存して、この範囲内において変化し得る。本発明の方法において用いられる任意の薬剤について、治療有効用量は、最初に細胞培養アッセイから概算することができる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養において決定したように、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために処方することができる。かかる情報を、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために用いることができる。血漿におけるレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
特定の態様において、医薬組成物は、例えば活性化合物の少なくとも約０．１％を含み得る。他の態様において、活性化合物は、単位の重量の約２％〜約７５％、または例えば約２５％〜約６０％、およびその中で導くことができる任意の範囲を構成し得る。
本明細書において記載される化合物の対象の用量は、典型的には、約０．１μｇ〜１０，０００ｍｇ、より典型的には約１μｇ／日〜８００ｍｇ、および最も典型的には約１０μｇ〜１００μｇの範囲である。対象の体重に関して言及すると、典型的な投与量は、１投与当たり、約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ミリグラム／ｋｇ／体重またはそれより多くまでの範囲、およびその中で導くことができる任意の範囲である。本明細書において列記される数から導くことができる範囲の非限定的な例において、上記の数に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲を投与することができる。絶対量は、同時の処置、用量の数、ならびに、年齢、身体条件、サイズおよび体重を含む個々の患者のパラメーターを含む、多様な要因に依存する。これらは、当業者に周知の要因であり、慣用的な実験より多くを用いることなく取り組むことができる。一般に、最大用量、すなわち健全な医学的判断にしたがう最大の安全な用量を用いることが好ましい。
本発明の分子の複数投薬もまた企図される。いくつかの例において、本発明の分子が別の治療剤、例えば抗ＨＩＶ剤とともに投与される場合、分子もしくは抗ＨＩＶ剤のいずれかの治療投与量未満、または両方の治療投与量未満が、ＨＩＶを有するかまたはＨＩＶを発症する危険性がある対象の処置において用いられる。２つのクラスの薬物を一緒に用いる場合、抗ＨＩＶ剤は、所望の治療結果をもたらすために、治療用量未満（sub-therapeutic dose）において投与することができる。「治療用量未満」とは、本明細書において用いられる場合、他方の薬剤の不在下において投与される場合に、対象において治療結果をもたらす投与量よりも低い投与量を指す。したがって、抗ＨＩＶ剤の治療用量未満は、本発明の分子の投与の不在下においては、対象において所望の治療結果をもたらさないものである。抗ＨＩＶ剤の治療用量は、ＨＩＶの処置について、医学の分野において周知である。これらの投与量は、Remington’s Pharmaceutical Sciencesなどの参考文献；ならびに、医学専門家により感染性疾患、癌、自己免疫性疾患、アルツハイマー病および移植片拒絶の処置のためのガイダンスとして信頼される多数の他の医学文献において広範に記載されている。ペプチドの治療投与量もまた、当該分野において記載されている。
（ｘｉｖ）投与、製剤
本明細書において記載されるＣＬＩＰ阻害剤は、本明細書においてより詳細に記載されるように、本発明の検出および処置方法において、単独で、または検出剤もしくは細胞傷害剤などの他の分子と組み合わせて用いることができる。
典型的には、成分の一つは、通常は、検出可能な標識を含むか、検出可能な標識に共役または抱合されている。検出可能な標識は、その存在を直接的または間接的に確認することができる部分である。一般に、標識の検出は、標識によるエネルギーの放出に関与する。標識は、特定の波長の光子もしくは他の原子の粒子を放出するおよび／または吸収するその能力により直接的に検出することができる（例えば放射活性、発光、光学密度または電気密度など）。標識は、それ自体が特定の波長の光を放出または吸収する別の部分に結合する、それを補充する、および一部の場合においてはそれを切断する能力により、間接的に検出することができる（例えばＦＬＡＧエピトープなどのエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素タグなど）。間接的検出の例は、基質を可視性の生成物へ切断する第１の酵素標識の使用である。酵素は、化学物質、ペプチドまたは核酸分子の性質のものであってよいが、これらに限定されない。他の検出可能な標識として、Ｐ３２もしくはＨ３などの放射活性アイソトープ、蛍光色素などの発光マーカー、光学もしくは電子密度マーカーなど、またはＦＬＡＧエピトープもしくはＨＡエピトープなどのエピトープタグ、ビオチン、アビジン、および西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素タグが挙げられる。標識は、その合成の間、またはその後で、ペプチドと結合させることができる。当業者に公知の多数の異なる標識および標識の方法が存在する。本発明において用いることができる標識の型の例として、酵素、放射性アイソトープ、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物および生物発光化合物が挙げられる。当業者は、本明細書において記載されるペプチドのための他の好適な標識を知っているか、または慣用的な実験を用いてそれを確認することができる。さらに、これらの標識の本発明のペプチドへの共役または抱合は、当業者に一般的な標準的技術を用いて行うことができる。
より高い感受性をもたらす別の標識技術は、本明細書において記載される分子を低分子量ハプテンへ共役させることからなる。これらのハプテンは、次いで、第２の反応により特に改変することができる。例えば、アビジンと反応するビオチン、またはジニトロフェノール、ピリドキサールなどのハプテン、または特異的な抗ハプテン抗体と反応することができるフルオレセインを用いることは一般的である。
ペプチドの検出可能な標識への抱合は、とりわけ診断アッセイにおけるかかる薬剤の使用を容易にする。別のカテゴリーの検出可能な標識として、例えば磁気共鳴画像（ＭＲＩ）：Ｇｄ（ＤＯＴＡ）；核医学について：２０１Ｔｌ、γ放出放射性核種９９ｍＴｃ；ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）について：ポジトロン放出アイソトープ、（１８）Ｆ−フルオロデオキシグルコース（（１８）ＦＤＧ）、（１８）Ｆ−フルオライド、銅−６４、ガドジアミド、および２０３ＰｂなどのＰｂ（ＩＩ）の放射性アイソトープ；１１１Ｉｎ、などの診断およびイメージングの標識（一般にin vivo検出可能標識として言及される）が挙げられる。
本明細書において記載される抱合または修飾は、慣用的な化学を使用し、この化学は本発明の一部を形成するものではなく、この化学は化学の分野における当業者に周知である。保護基、ならびにモノ−およびヘテロ二官能性リンカーなどの既知のリンカーの使用は、文献において十分に解説されており、ここでは繰り返さない。
本明細書において用いられる場合、「抱合」とは、任意の生理化学的手段により安定して互いに結合している２つの実体を意味する。結合の性質が、いずれの実体の有効性をも実質的に損なうことがないようなものであることが重要である。これらのパラメーターを考慮して、当業者に公知の任意の共有結合または非共有結合型結合が使用される。一部の態様において、共有結合が好ましい。非共有結合型抱合として、疎水性相互作用、イオン性相互作用、ビオチン−アビジンおよびビオチン−ストレプトアビジン複合体形成などの抗アフィニティー相互作用ならびに他のアフィニティー相互作用が挙げられる。かかる結合の手段および方法は、当業者に周知である。
標識および他のアッセイ成分の性質に依存して、標識を検出するために多様な方法を用いることができる。例えば、標識は、固体の基質に結合している間に検出しても、または固体の基質からの分離の後で検出してもよい。標識は、光学または電子密度、放射活性放出、非放射活性エネルギー移動などを介して直接的に検出しても、抗体抱合体、ストレプトアビジン−ビオチン抱合体などにより間接的に検出してもよい。標識を検出するための方法は、当該分野において周知である。
抱合体はまた、ＣＤ４、ｇｐ１２０またはｇｐ２１などの別のペプチドに抱合されたペプチドを含む。ＣＤ４、ｇｐ１２０およびｇｐ２１ペプチドは全て、当該分野において公知である。
本発明の活性剤は、自己免疫性疾患、ウイルス感染、細菌感染、ＨＩＶ感染、アルツハイマー病、移植片拒絶および癌などの傷害を処置するための有効量で対象に投与される。「有効量」とは、例えば、所望の生物学的効果を実現するために必要または十分な量である。「ＨＩＶを処置するための有効量」とは、例えば、（ｉ）宿主細胞によるＨＩＶの取り込みを予防する、および／または（ｉｉ）ＨＩＶ感染のさらなる発達を阻害する、すなわち、その発達を停止させるかまたは遅延させるために必要な量であり得る。自己免疫性疾患を処置するために必要な量は、ペプチド処置の不在下におけるレベルと比較した場合にＴＨ細胞の減少を予防または阻害するために十分な量であり得る。本発明の一部の側面によれば、有効量とは、単独でまたは別の医薬と組み合わせての本発明の化合物の量であって、疾患の処置または予防のいずれかにおいて、組み合わせたか、または共投与されたか、または単独で投与された場合に、疾患に対して治療的応答をもたらすものである。生物学的効果とは、疾患から生じる症状の寛解および／または絶対的な除去であり得る。別の態様において、生物学的効果とは、例えば疾患の症状の不在により証拠づけられるような、疾患の完全な抑止である。
本明細書において記載される疾患の処置における本発明の化合物の有効量は、用いられる特定の化合物、化合物の送達の様式、およびそれが単独で用いられるかまたは組み合わせにおいて用いられるかに依存して変化し得る。任意の特定の用途のための有効量はまた、処置されている疾患、投与されている特定の化合物、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重篤度などの要因に依存して変化し得る。
当業者は、本発明の特定の分子の有効量を、過度の実験を必要とすることなく、経験的に決定することができる。本明細書において提供される教示と組み合わせて、多様な活性化合物の中から選択し、効力、相対的バイオアベイラビリティ、患者の体重、副作用の重篤度、および好ましい投与の様式などの要因を重みづけすることにより、実質的な毒性を引き起こさないがなお特定の対象を処置するために全体的に有効である、有効な予防的または治療的処置レジメンを計画することができる。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア中に溶解または分散された、１または２以上の薬剤の有効量を含む。句「薬学的または薬理学的に許容可能」とは、例えば適切な場合にはヒトなどの動物に投与された場合に、有害な、アレルギー性の、または他の不都合な反応をもたらさない、分子的実体および組成物を指す。さらに、動物（例えばヒト）への投与のために、製剤が、ＦＤＡ生物学的基準局（Office of Biological Standards）により要求される無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の標準に適合すべきであることが理解される。化合物は、一般に、ヒトへの投与に好適である。この用語は、化合物または組成物が、無毒性かつ十分に純粋であり、したがって、ヒトへの投与の前に当該化合物または組成物のさらなる操作が必要でないことを必要とする。
本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容可能なキャリア」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染色剤、当業者に公知であるような材料およびそれらの組み合わせ（例えば本明細書において参考として組み込まれるRemington’s Pharmaceutical Sciences（1990）を参照）を含む。従来のキャリアが活性成分と不適合である場合を除いて、治療剤または医薬組成物におけるその使用が企図される。
薬剤は、それが、固体、液体またはエアロゾルのいずれの形態において投与されるのか、および、注射などの投与の経路のために無菌である必要があるか否かに依存して、異なる型のキャリアを含んでもよい。本発明は、静脈内、皮内、動脈内、病巣内、腫瘍内、頭蓋内、関節内、前立腺内（intraprostaticaly）、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、水疱内（intravesicularlly）、経粘膜、心膜内、臍帯血内（intraumbilically）、眼内、経口、局所（topically）、局所（locally）、吸入（例えばエアロゾル吸入）、注射、注入、持続注入、局所的灌流、標的細胞を直接的に浸漬する、カテーテル経由、洗浄（lavage）経由、クリーム中、脂質組成物（例えばリポソーム）中で、または当業者に公知であるように、他の方法もしくは前述のものの任意の組み合わせにより（例えば本明細書において参考として組み込まれるRemington’s Pharmaceutical Sciences（1990）を参照）、投与される。特定の態様において、腹腔内注射が企図される。
いずれの場合においても、組成物は、１または２以上の成分の酸化を遅延させるために、多様な抗酸化剤を含んでもよい。さらに、パラベン（例えばメチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない多様な抗菌剤および抗真菌剤などの保存剤により、微生物の作用の予防をもたらすことができる。
薬剤は、遊離の塩基、中性、または塩の形態において、組成物中に処方される。薬学的に許容可能な塩は、酸付加塩、例えば、タンパク質性の組成物の遊離のアミノ基により形成されるもの、あるいは例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸などの有機酸により形成されたもの、を含む。遊離のカルボキシル基により形成される塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは水酸化第２鉄などの無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインなどの有機塩基から誘導することができる。
組成物が液体の形態である態様において、キャリアは、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド類、植物油、リポソーム）およびこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により；例えば液体ポリオールもしくは脂質などのキャリア中での分散により要求される粒子サイズの維持により；例えばヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用により；またはかかる方法の組み合わせにより、維持することができる。多くの場合において、糖、塩化ナトリウムまたはこれらの組み合わせなどの等張剤を含むことが好ましい。
本発明の組成物は、直接用いても、好適なアジュバントおよび／またはキャリアと混合してもよい。好適なアジュバントとして、リン酸アルミニウムまたは塩酸アルミニウムなどのアルミニウム塩アジュバント、リン酸カルシウムナノ粒子（BioSante Pharmaceuticals, Inc.）、ＺＡＤＡＸＩＮＴＭ、ヌクレオチドｐｐＧｐｐおよびｐｐｐＧｐｐ、殺菌Bordetella pertussisまたはその成分、Corenybacterium由来Ｐ４０成分、コレラ毒素、およびマイコバクテリアの全体または部分、ならびにISCOM（DeVriesら、1988；Moreinら、199＆Lovgrenら、1991）が挙げられる。当業者は、医薬の使用のために適切な、またはヒトにおける使用に好適なキャリアに精通している。
以下は、ＣＬＩＰ阻害剤の製剤、投与量および投与スケジュールの例である。個体に、８ｍｇの組成物（好ましくは生理学的に許容可能な溶液中に４ｍｇ／ｍｌの組成物を含む２ｍｌの製剤）を含む筋肉内または皮下注射、または患者の体重１ｋｇあたり５７μｇのＣＬＩＰ阻害剤を投与する。各々の処置経過は、１６回の注射からなる；１週間あたり２回の連続した日における注射を８週間にわたり行う。患者の疾患状態を、以下の記載する手段によりモニタリングする。最後の注射の３ヶ月後、患者がまだ疾患を罹患している場合、処置レジメンを繰り返す。処置レジメンを、満足な結果が得られる、例えば疾患の進行の停止もしくは遅延、疾患の軽減または治癒が得られるまで、繰り返すことができる。
組成物は、単独で製剤化しても、疾患状態に対して特異的な抗原と、および任意にアジュバントと組み合わせて製剤化してもよい。アジュバントは、例えばデポー効果（depo effect）を作り出すアジュバント、免疫刺激アジュバント、およびデポー効果を作り出し免疫系を刺激するアジュバントを含み、全身性または粘膜性アジュバントであってもよい。デポー効果を作り出すアジュバントとして、水酸化アルミニウム、乳液ベースの製剤、鉱物油、非鉱物油、油中水型乳液、水中油型乳液、MontanideのアジュバントSeppic ISAシリーズ、MF-59およびPROVAXが挙げられる。免疫刺激性アジュバントであるアジュバントとして、例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、サポニン、ＰＣＰＰポリマー、リポ多糖の誘導体、ＭＰＬ、ＭＤＰ、ｔ−ＭＤＰ、ＯＭ−１７４およびリーシュマニア伸長因子が挙げられる。デポー効果を作り出し免疫系を刺激するアジュバントとして、例えば、ISCOMS、SB-AS2、SB-AS4、非イオン性ブロック共重合体、およびSAF（Syntex Adjuvant Formulation）が挙げられる。最終的な製剤の例：最終組成製剤の１ｍｌが以下を含むことができる：４ｍｇの組成物、０．０１６ＭのＡｌＰ０４（または０．５ｍｇのＡ１３＋）、０．１４ＭのＮａＣｌ、０．００４ＭのＣＨ３ＣＯＯＮａ、０．００４ＭのＫＣ１、ｐＨ６．２。
本発明の組成物は、多様な方法において、異なるクラスのレシピエントに投与することができる。
本発明の化合物は、直接的に組織に投与することができる。直接組織投与は、直接注射により達成することができる。化合物は、１回で投与してもよく、あるいは、複数の投与において投与してもよい。複数回投与する場合、化合物を異なる経路を介して投与してもよい。例えば、第１（または最初の数回）の投与を直接患部組織へ行ってもよく、一方、後の投与は全身であってもよい。
本発明の製剤は、薬学的に許容可能な溶液中で投与され、これは、慣用的に、薬学的に許容可能な濃度の塩、緩衝化剤、保存剤、適合性のキャリア、アジュバント、および随意の他の治療成分を含むことができる。
本発明の方法にしたがって、化合物を、医薬組成物中で投与することができる。一般に、医薬組成物は、本発明の化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む。ペプチド、モノクローナル抗体および抗体フラグメントのための薬学的に許容可能なキャリアは、当業者に周知である。本明細書において用いられる場合、薬学的に許容可能なキャリアとは、活性成分の生物学的活性の有効性、例えばペプチドが標的、すなわちＨＩＶの表面分子に結合する能力に干渉しない、非毒性の材料を意味する。
薬学的に許容可能なキャリアとして、希釈剤、充填剤、塩、緩衝化剤、安定化剤、可溶化剤、および当該分野において周知である他の材料が挙げられる。特にペプチドのための例示的な薬学的に許容可能なキャリアは、米国特許第5,211,657号に記載される。かかる製剤は、慣用的に、塩、緩衝化剤、保存剤、適合性のキャリア、および随意の他の治療剤を含むことができる。医薬において用いられる場合、塩は、薬学的に許容可能なものであるべきであるが、薬学的に許容可能でない塩も、その薬学的に許容可能な塩を製造するために適宜用いることができ、本発明の範囲から除外されない。かかる薬理学的および薬学的に許容可能な塩として、以下の酸から製造されるものが挙げられるがこれらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。また、薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩などのアルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩から製造することができる。
本発明の化合物は、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、吸入剤および注射、ならびに経口、非経口または外科的投与のための通常の方法などの、固体、半固体、液体、または気体の形態の製剤へと製剤化することができる。本発明はまた、インプラントなどの局所投与のために製剤化された医薬組成物を包含する。
経口投与のために好適な組成物は、カプセル、錠剤、ロゼンジなどの、各々が予め決定された量の活性剤を含む、分離された単位として提示することができる。他の組成物として、シロップなどの水性の液体または非水性の液体中の懸濁液、エリキシル剤または乳液が挙げられる。
経口投与のために、化合物は、活性化合物を当該分野において周知の薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせることにより、容易に製剤化することができる。かかるキャリアは、本発明の化合物を、処置される対象による経口による消化のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化することを可能にする。経口での使用のための医薬製剤は、固体の賦形剤として、得られる混合物を随意に粉砕し、錠剤または糖衣錠のコアを得るために望ましい場合には好適な助剤を投与した後に、顆粒の混合物を処理し、得ることができる。好適な賦形剤は、特に、乳糖、ショ糖、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、馬鈴薯デンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース製剤である。所望の場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を添加してもよい。随意に、経口製剤はまた、内部の酸性状態を中和するために、食塩水または緩衝液中で製剤化してもよく、あるいは、いかなるキャリアも用いずに投与してもよい。
糖衣錠のコアは、好適なコーティングを備える。この目的のために、濃縮糖溶液を用いることができ、これは、随意に、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。錠剤または糖衣錠のコーティングに、同定のため、または活性化合物の用量の異なる組み合わせを特徴づけるために、染料または色素を添加してもよい。
経口で用いることができる医薬製剤は、ゼラチン製の押し込み式（push-fit）カプセル、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどの可塑化剤とから製造されるソフト密封カプセルを含む。押し込み式カプセルは、乳糖などの充填剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意に安定化剤との混合物中に、活性成分を含む。ソフトカプセルにおいては、活性化合物は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコール類などの好適な液体中に溶解または懸濁することができる。さらに安定化剤を添加してもよい。経口投与のために製剤化されたマイクロスフェアもまた用いることができる。かかるマイクロスフェアは、当該分野において十分に定義されている。経口投与のための全ての製剤は、かかる投与のために好適な投与量におけるものであるべきである。
口腔内投与のために、組成物は、従来の様式における錠剤またはトローチ剤（lozenges）の形態をとり得る。
吸入による投与のために、本発明による使用のための化合物は、エアロゾルスプレー製剤の形態において、加圧パックまたはネブライザーから、好適な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または好適な気体の使用により、適宜送達することができる。加圧エアロゾルの場合において、投与単位は、計量した量を送達するための弁を提供することにより決定することができる。吸入器（inhaler）または吸入器（insufflator）における使用のための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物と乳糖またはデンプンなどの好適な粉末基剤との粉末混合物を含んで製剤化することができる。エアロゾル送達系を調製するための技術は、当業者に公知である。一般に、かかる系は、活性剤の生物学的特性を著しく損なわない成分を利用するべきである（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第１８版、1990年、pp 1694-1712における、SciarraおよびCutie、「Aerosols」を参照；参考として援用される）。当業者は、エアロゾルを製造するための多様なパラメーターおよび条件を、過度の実験を用いることなく容易に決定することができる。
化合物は、全身へ送達することが望ましい場合には、注射による、例えばボーラス注射または持続注入による、非経口投与のために製剤化することができる。注射のための製剤は、単位投与形態において、例えばアンプルにおいて、または複数用量用容器において、保存剤を添加して提供することができる。組成物は、懸濁液、溶液、または油性または水性のビヒクル中の乳液などの形態をとり得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化用の薬剤を含有し得る。
非経口投与のための製剤として、滅菌の水性または非水性の溶液、懸濁液および乳液が挙げられる。非水性の溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル類である。水性のキャリアとして、生理食塩水（saline）及び緩衝化媒質（buffered media）を含む、水、アルコール性／水性溶液、乳液または懸濁液が挙げられる。非経口のビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または硬化油が挙げられる。静脈内ビヒクルとして、水分および栄養補充液、電解質補充液（リンゲルブドウ糖液に基づくものなど）などが挙げられる。例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤もまた存在してもよい。低用量は、静脈内投与などの他の形態の投与からもたらされる。適用した初期用量において対象にでの応答が不十分である場合、より高い用量（または他のより局所的な送達経路による、有効に高い用量）を、患者の耐容性が許容する範囲まで用いることができる。１日あたりの複数用量は、化合物の適切な全身レベルを達成するために企図される。
なお他の態様において、好ましいビヒクルは、哺乳動物レシピエントへの移植に好適である生適合性の微粒子またはインプラントである。この方法により有用な例示的な生体内分解性のインプラントは、PCT国際出願第PCT/US/03307号（公開番号WO 95/24929、表題「Polymeric Gene Delivery System」、1994年３月１５日に出願された米国出願第213,668号に対して優先権を主張する）において記載される。WO 95/24929は、生物学的高分子を含有するための、生適合性の、好ましくは生分解性の、ポリマーマトリックスを記載する。ポリマーマトリックスは、対象における薬剤の持続放出を達成するために用いることができる。本発明の一側面によれば、本明細書において記載される薬剤は、PCT/US/03307に記載される生適合性の、好ましくは生分解性の、ポリマーマトリックス中にカプセル化されるかまたは分散される。ポリマーマトリックスは、好ましくは、マイクロスフェアなどの微粒子（薬剤が固体のポリマーマトリックス全体に分散される）またはマイクロカプセル（薬剤がポリマーシェルのコア中に貯蔵される）の形態である。薬剤を含有するためのポリマーマトリックスの他の形態として、フィルム、コーティング、ゲル、インプラントおよびステントが挙げられる。ポリマーマトリックスデバイスのサイズおよび組成は、マトリックスデバイスが移植される組織において好ましい放出動態をもたらすために選択される。ポリマーマトリックスデバイスのサイズは、さらに、用いられる送達の方法、典型的には組織中への注射または懸濁液のエアロゾルによる鼻および／または肺の領域中への投与、に従って選択される。ポリマーマトリックスの組成は、好ましい分解速度を有するように、およびまた、デバイスが血管、肺、または他の表面へ投与された場合の移植の有効性をさらに増大するために、生体粘着性の材料により形成されるように選択することができる。マトリックスの組成はまた、分解しないでむしろ長期間にわたる拡散により放出するように選択することができる。
非生分解性および生分解性の両方のポリマーマトリックスを、本発明の薬剤の対象への送達のために用いることができる。生分解性マトリックスが好ましい。かかるポリマーは、天然または合成のポリマーであってよい。合成ポリマーが好ましい。ポリマーは、一般には、数時間から１年またはそれより長いオーダーにおける、放出が所望される期間に基づいて選択される。典型的には、約数時間から３〜１２ヶ月間の範囲の期間にわたる放出が最も望ましい。ポリマーは、任意に、その重量の約９０％までの水を吸収することができるハイドロゲルの形態であり、さらに任意に、多価イオンまたは他のポリマーに架橋されている。
一般に、本発明の薬剤は、生体内分解性インプラントを用いて、拡散により、またはより好ましくはポリマーマトリックスの分解により、送達することができる。生分解性送達系を形成するために用いることができる例示的な合成ポリマーとして、以下が挙げられる：ポリアミド類、ポリカーボネート類、ポリアルキレン類、ポリアルキレングリコール類、ポリアルキレンオキシド類、ポリアルキレンテレフタラート類、ポリビニルアルコール類、ポリビニルエーテル類、ポリビニルエステル類、ポリビニルハライド類、ポリビニルピロリドン、ポリグリコリド類、ポリシロキサン類、ポリウレタン類およびこれらの共重合体、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース類、セルロースエーテル類、セルロースエステル類、ニトロセルロース類、アクリルおよびメタクリルエステル類の共重合体、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酢酸酪酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、カルボキシルエチルセルロース、セルローストリアセテート、硫酸セルロースナトリウム塩、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、ポリ（オクタデシルアクリレート）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンテレフタラート）、ポリ（ビニルアルコール類）、酢酸ポリビニル、塩化ポリビニル、ポリスチレンならびにポリビニルピロリドン。
非生分解性ポリマーの例として、エチレンビニルアセテート、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド類、これらの共重合体および混合物が挙げられる。
生分解性ポリマーの例として、乳酸およびグリコール酸のポリマー、ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル類、ポリウレタン類、ポリ（酪酸）、ポリ（吉草酸）およびポリ（ラクチド−コカプロラクトン（cocaprolactone））などの合成ポリマー、ならびにアルギナートおよびデキストランおよびセルロースを含む他の多糖類、コラーゲンなどの天然ポリマー、これらの化学誘導体（置換、化学基の付加、例えばアルキル、アルキレン、ヒドロキシル化、酸化、および当業者により慣用的に行われる他の修飾）、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミン類、ならびに疎水性タンパク質、これらの共重合体および混合物が挙げられる。一般に、これらの材料は、酵素による加水分解、またはin vivoでの水への暴露、表面もしくはバルクでの腐食のいずれかにより分解する。
特に重要な生体粘着性ポリマーとして、その教示が本明細書において援用されるH.S. Sawhney, C.P. PathakおよびJ.A. HubellによりMacromolecules, 1993, 26, 581-587において記載される生体内分解性ハイドロゲル、ポリヒアルロン酸、かゼイン、ゼラチン、グルテン、ポリ無水物、ポリアクリル酸、アルギナート、キトサン、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチルメタクリレート）、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリ（イソブチルメタクリレート）、ポリ（ヘキシルメタクリレート）、ポリ（イソデシルメタクリレート）、ポリ（ラウリルメタクリレート）、ポリ（フェニルメタクリレート）、ポリ（メチルアクリレート）、ポリ（イソプロピルアクリレート）、ポリ（イソブチルアクリレート）、およびポリ（オクタデシルアクリレート）が挙げられる。
他の送達系として、時間放出（time-release）、遅延放出または持続放出送達系を挙げることができる。かかる系により、化合物の繰り返しの投与を避けることができ、対象および医師にとっての利便性を高める。多数の型の放出系が当業者に利用可能である。これらは、ポリ（ラクチド−グリコリド）, コポリシュウ酸（copolyoxalate）、ポリカプロラクトン類、ポリエステルアミド類、ポリオルトエステル類、ポリヒドロキシ酪酸およびポリ無水物などのポリマーに基づく系を含む。薬物を含有する前述のポリマーのマイクロカプセルは、例えば、米国特許第5,075,109号に記載される。送達系はまた、コレステロールなどのステロール類、コレステロールエステル類および脂肪酸またはモノ−、ジ−およびトリグリセリド類などの天然の脂肪を含む脂質；ハイドロゲル放出系；サイラスティック系；ペプチドベースの系； ロウコーティング；従来の結合剤および賦形剤を用いる圧縮錠剤；部分的に融合したインプラントなどである非ポリマーの系を含む。具体例として、（ａ）米国特許第4,452,775号、同第4,675,189号および同第5,736,152号において記載されるもののような、マトリックス中の形態において血小板を減少させる薬剤が含有される腐食性の系、ならびに（ｂ）米国特許第3,854,480号、同第5,133,974号および同第5,407,686号において記載されるような、活性成分が制御された速度でポリマーから浸透する拡散系が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、ポンプをベースとするハードウェア送達系を用いてもよく、これらの一部は移植のために適応される。
長期持続放出インプラントの使用は、慢性疾患または再発癌の処置のために特に好適である場合がある。長期放出とは、本明細書において用いられる場合、インプラントが、少なくとも３０日間、好ましくは６０日間にわたり活性成分を治療的レベルで送達するために構築および準備されていることを意味する。長期持続放出インプラントは、当業者に周知であり、上記の放出系の一部を含む。
ペプチドまたは抗体の治療用製剤は、所望の程度の純度を有するペプチドまたは抗体を、随意に薬学的に許容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤と混合することにより（Remington’s Pharmaceutical Sciences、第１６版、Osol, A.編（1980））、凍結乾燥製剤または水溶液の形態において、貯蔵のために調製することができる。許容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、使用される投与量および濃度においてレシピエントにとって非毒性であり、リン酸、クエン酸および他の有機酸などの緩衝化剤；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（１０残基未満）のポリペプチド；アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
ペプチドは、細胞またはヒト対象などの対象に、単独でまたは好適なキャリアとともに、直接投与してもよい。あるいは、ペプチドは、細胞にin vitroでまたはin vivoで、ペプチドを発現する核酸を細胞に送達することにより送達してもよい。本発明の核酸分子を細胞内へ導入するために、核酸分子がin vitroまたはin vivoのいずれで宿主に導入されるかに依存して、多様な技術を用いることができる。かかる技術として、核酸分子−リン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥと結びついた核酸分子のトランスフェクション、目的の核酸分子を含む前述のウイルスによるトランスフェクションまたは感染、リポソーム媒介トランスフェクションなどが挙げられる。特定の用途について、核酸分子を特定の細胞に標的化することが望ましい。かかる場合において、本発明の核酸分子を細胞内へ送達するために用いられるビヒクル（例えばレトロウイルスまたは他のウイルス；リポソーム）は、それらに結合した標的化分子を有することができる。
例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上の受容体に対するリガンドを、核酸分子送達ビヒクルに結合させる化合物またはその中に組み込むことができる。とくに好ましいのは、モノクローナル抗体である。本発明の核酸分子の送達のためにリポソームを使用する場合、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、標的化のために、および／または取り込みを容易にするために、リポソーム製剤中に組み込んでもよい。かかるタンパク質として、特定の細胞型に対して指向性のキャプシドタンパク質またはそのフラグメント、周期において内部移行を行うタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的化し、細胞内半減期を増大するタンパク質などが挙げられる。当業者により知られるように、ポリマー送達系もまた、核酸分子を細胞内へ首尾よく送達するために用いられてきた。かかる系は、核酸分子の経口送達すら可能にする。
本発明のペプチドはまた、哺乳動物細胞において哺乳動物発現ベクターを用いて直接発現させてもよい。かかるベクターを、細胞または対象に送達することができ、ペプチドは細胞または対象内で発現される。組み換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を行うことができるものであってもよい（例えば、核酸を発現させるために、組織特異的調節エレメントが用いられる）。組織特異的調節エレメントは、当該分野において公知である。好適な組織特異的プロモーターの非限定的な例として、ミオシン重鎖プロモーター、アルブミンプロモーター、リンパ系特異的プロモーター、ニューロン特異的プロモーター、膵臓特異的プロモーターおよび乳腺特異的プロモーターが挙げられる。発達により調節されるプロモーター、例えばマウスhoxプロモーターおよびα−フェトプロテインプロモーター、もまた包含される。
本明細書において用いられる場合、「ベクター」とは、宿主細胞における発現のために制限酵素切断およびライゲーションにより所望の配列を挿入することができる多数の核酸分子のいずれであってもよい。ベクターは、典型的には、ＤＮＡからなるが、ＲＮＡベクターもまた利用可能である。ベクターとして、プラスミド、ファージミドおよびウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターとは、所望のＤＮＡ配列を、調節配列に作動的に連結されてＲＮＡ転写物として発現されることができるように、制限酵素切断およびライゲーションにより挿入することができるものである。本発明の一部の態様において、核酸分子を送達するためのウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルスを含むポックスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルスならびにＴｙウイルス様粒子からなる群より選択される。外因性核酸を送達するために用いられてきたウイルスおよびウイルス様粒子の例として、複製欠損アデノウイルス（例えば、Xiang et al., Virology 219:220-227, 1996; Eloit et al., J. Virol. 7:5375-5381, 1997; Chengalvala et al., Vaccine 15:335-339, 1997）、改変レトロウイルス（Townsend et al., J. Virol. 71:3365-3374, 1997）、非複製型レトロウイルス（Irwin et al., J. Virol. 68:5036-5044, 1994）、複製欠損セムリキ森林熱ウイルス（Zhao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3009-3013, 1995）カナリアポックスウイルスおよび高度に弱毒化されたワクシニアウイルス誘導体（Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11349-11353, 1996）、非複製型ワクシニアウイルス（Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11341-11348, 1996）、複製型ワクシニアウイルス（Moss, Dev. Biol. Stand. 82:55-63, 1994）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Davis et al., J. Virol. 70:3781-3787, 1996）、シンドビスウイルス（Pugachev et al., Virology 212:587-594, 1995）ならびにＴｙウイルス様粒子（Allsopp et al., Eur. J. Immunol 26:1951-1959, 1996）が挙げられる。好ましい態様において、ウイルスベクターはアデノウイルスである。
特定の用途のための別の好ましいウイルスは、アデノ随伴ウイルス、二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、広範な細胞型および種に感染することが可能であり、複製欠損型へと操作することができる。これはさらに、熱および脂質溶媒安定性、造血細胞を含む多様な系統の細胞における高い伝達頻度、重複感染阻害の欠失、したがって複数の系列の伝達が可能であることなどの利点を有する。アデノ随伴ウイルスは、ヒト細胞のＤＮＡ中へ部位特異的な様式において組み込まれることができ、これにより、挿入変異の可能性および挿入された遺伝子発現の変異性を最小化することができる。さらに、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、組織培養物において、選択的圧力の不在下において１００回より多くの継代を続けており、このことは、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みが相対的に安定なイベントであることを示唆する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外の様式においても機能することができる。
一般に、他の好ましいウイルスベクターは、必須でない遺伝子が目的の遺伝子により置き換えられている非細胞変性の真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスとして、その生活環がゲノムのウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写とその後のプロウイルスの宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを伴う、レトロウイルスが挙げられる。アデノウイルスおよびレトロウイルスは、ヒト遺伝子治療の治験について承認されている。一般に、レトロウイルスは、複製欠損（すなわち、所望のタンパク質の合成をおこなうことはできるが、感染性粒子を作ることはできない）である。かかる遺伝子的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、効率の高い遺伝子のin vivoでの伝達のための一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを生成するための標準的なプロトコル（外因性遺伝子材料のプラスミドへの組み込み、パッケージング細胞株のプラスミドによるトランスフェクション、パッケージング細胞株による組み換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の回収、および標的細胞のウイルス粒子による感染の工程を含む）は、Kriegler, M.、「Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual」、 W.H. Freeman Co., New York（1990）およびMurry, E.J.編、「Methods in Molecular Biology」、第７巻、Humana Press, Inc., Clifton, New Jersey（1991）において提供される。ベクターの使用を介した送達に加えて、本発明の核酸は、ベクターを用いずに、例えば、「ネイキッド」の核酸送達として、当業者に公知の方法を用いて、細胞に送達することができる。
（ｘｖ）ペプチドの調製（精製、組み換え、ペプチド合成）
精製方法
本発明のＣＬＩＰ阻害剤は、例えば胸腺組織から、生成することができる。ＣＬＩＰ阻害剤を精製する上で、沈殿による分離、吸着による分離（例えば、カラムクロマトグラフィー、膜吸着剤、ラジカルフローカラム、バッチ吸着、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、無機吸着剤、疎水性吸着材、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー）、または溶液中での分離（例えば、ゲル濾過、電気泳動、液相分配、界面活性剤分配、有機溶媒抽出および限外濾過）を含むがこれらに限定されない、当該分野において公知の任意の技術を用いることができる。Scopes、PROTEIN PURIFICATION, PRINCIPLES AND PRACTICE、第３版、Springer（1994）を参照。その全文が本明細書において参考として組み込まれる。
前述のとおり、ＴＮＰは、典型的には、新たに安楽死させた、すなわち安楽死から４時間またはそれ未満の、サル、ゴリラ、チンパンジー、モルモット、ウシ、ウサギ、イヌ、マウスおよびラットなどの哺乳動物の胸腺細胞から精製される。かかる方法はまた、本発明のペプチドの製剤を調製するためにも用いられる。胸腺細胞からの核を、当該分野において公知の方法を用いて単離する。これらのリジンリッチなヒストン画分の一部を、本明細書により参考として組み込まれる米国特許第4,415,553号のペプシン分解法を用いて抽出する。トリプシン分解、パパイン分解、ＢｒＣＮ分解などの他の分解法は、ＣＬＩＰ阻害剤を抽出する上では有効ではないと考えられる。単離物のタンパク質リッチフラグメントを、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。例えば、ＣＬＩＰ阻害剤は、標準的なプロトコルを用いて、仔ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの任意の哺乳動物の胸腺からの抽出物にサイズ排除手法を行うことにより、単離することができる。例えば、胸腺抽出物は、Handら（1967）Biochem. BioPhys. Res. Commun. 26:18-23；Handら（1970）Experientia 26:653-655；またはMoudjouら（2001）J Gen Virol 82:2017-2024のプロトコルを用いて得ることができる。類似の方法を、例のセクションにおいてより詳細に記載する。
得られたサイズ選択されたタンパク質溶液から、ＣＤ４、ｇｐ１２０およびｇｐ４１の少なくとも１つに対する連続結合により、ＣＬＩＰ阻害剤を精製する。精製は、例えばMoritzら（1990）FEBS Lett. 275:146-50；Heckerら（1997）Virus Res. 49:215-223；McInerneyら（1998）J. Virol. 72:1523-1533およびPoumbouriosら（1992）AIDS Res. Hum. Retroviruses 8:2055-2062において記載されるようなアフィニティークロマトグラフィーを介して、達成することができる。
必要である場合は、ヒトへの投与のために好適な組成物を得るために、さらなる精製を行ってもよい。付加的な精製方法の例は、数例を挙げると、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、質量分析、等電点電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相クロマトグラフィーおよび電気泳動である。これらの技術は標準的かつ周知であり、Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編、John Wiley and Sons、New York；Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications、第２版、1998年、JansonおよびRyden編、Wiley-VCH；ならびにProtein Purification Protocols、第２版2003年、Cutler編、Humana Pressなどの研究手引書において見出すことができる。
ペプチドの組み換え生成
当該分野において公知の方法を利用して、組み換えによりＣＬＩＰ阻害剤を生成することができる。ＣＬＩＰ阻害剤をコードする核酸を、宿主細胞における増殖および発現のために、発現ベクター中に挿入することができる。
発現コンストラクトとは、本明細書において用いられる場合、適切な宿主細胞におけるＣＬＩＰ阻害剤の発現を可能にする１または２以上の調節領域に作動的に結びついた、ＣＬＩＰ阻害剤またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を指す。「作動的に結びついた」とは、調節領域と発現されるべきＣＬＩＰ阻害剤の配列とが、転写、および最終的には翻訳を可能にするように、連結され、位置される結びつきを指す。
ＣＬＩＰ阻害剤の転写に必要な調節領域は、発現ベクターにより提供することができる。適合性の宿主−コンストラクト系において、ＲＮＡポリメラーゼなどの細胞の転写因子は、発現コンストラクト上の調節領域に結合して、修飾されたＣＬＩＰ阻害剤の配列の宿主生物における転写に影響を及ぼす。遺伝子発現に必要な調節領域の正確な性質は、宿主細胞毎に異なり得る。一般に、ＲＮＡポリメラーゼに結合して作動的に結びついた核酸配列の転写を促進することができるプロモーターが必要とされる。かかる調節領域は、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの転写および翻訳の開始に関与する５’非コード配列を含み得る。コード配列に対して３’側の非コード領域は、転写終結コドンおよびポリアデニル化部位などの転写終結調節配列を含み得る。
プロモーターなどの調節性機能を有するＤＮＡ配列をＣＬＩＰ阻害剤に結合させるために、または、ＣＬＩＰ阻害剤をベクターのクローニング部位へ挿入するために、適切な適合する制限酵素切断部位を提供するリンカーまたはアダプターを、当該分野において周知の技術（Wuら、1987年、Methods in Enzymol, 152: 343-349）により、ｃＤＮＡの末端にライゲーションする。制限酵素による切断の後で、平滑末端を作製するために、ライゲーションの前に１本鎖ＤＮＡ末端を消化または補充することによる修飾を行ってもよい。あるいは、所望の制限酵素部位を含むプライマーを用いたＰＣＲの使用によるＤＮＡの増幅により、所望の制限酵素部位をＤＮＡのフラグメントに導入してもよい。
調節領域に作動的に結びついたＣＬＩＰ阻害剤センス配列を含む発現コンストラクトを、さらなるクローニングなしに、ＣＬＩＰ阻害剤の発現および産生のために、適切な宿主細胞中へ直接導入することができる。例えば、米国特許第5,580,859号を参照。発現コンストラクトはまた、例えば相同組み換えによりＣＬＩＰ阻害剤の配列の宿主細胞への組み込みを容易にするＤＮＡ配列を含んでもよい。この例においては、宿主細胞において増殖およびＣＬＩＰ阻害剤を発現させるために、適切な宿主細胞に好適な複製起点を含む発現ベクターを使用する必要はない。
プラスミド、コスミド、ファージ、ファージミドまたは改変ウイルスを含むがこれらに限定されない多様な発現ベクターを用いることができる。かかる宿主−発現系は、それにより目的のコード配列が産生され、その後に精製されるビヒクルを表わすが、また、適切なヌクレオチドコード配列によりトランスフェクトされた場合にＣＬＩＰ阻害剤をin situで発現する細胞も表わす。これらは、ＣＬＩＰ阻害剤コード配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例えばE. coliおよびB. subtilis）などの微生物；ＣＬＩＰ阻害剤コード配列を含む組み換え酵母発現ベクターにより形質転換された酵母（例えばSaccharomyces、Pichia）；ＣＬＩＰ阻害剤コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ＣＬＩＰ阻害剤コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したかもしくは組み換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）により形質転換された植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノムから誘導されたプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスからのプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組み換え発現コンストラクトを含む哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０および３Ｔ３細胞）を含むがこれらに限定されない。好ましくは、Escherichia coliなどの細菌細胞および真核細胞が、組み換えＣＬＩＰ阻害剤分子の発現のため、特に全組み換えＣＬＩＰ阻害剤分子の発現のために、用いられる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞を、サイトメガロウイルスの主要中間型初期遺伝子（major intermediate early gene）からのプロモーターエレメントを含むベクターとともに、ＣＬＩＰ阻害剤の効果的発現のために用いることができる（Foecking et al., 1986, Gene 45: 101;およびCockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2）。
細菌の系において、多数の発現ベクターを、発現されるＣＬＩＰ阻害剤分子についての意図された用途に依存して、有利に選択することができる。例えば、ＣＬＩＰ阻害剤分子の医薬組成物の製造のために大量のかかるＣＬＩＰ阻害剤を生成する場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質生成物の発現を行うベクターが望ましい場合がある。かかるベクターとして、ＣＬＩＰ阻害剤コード配列をＰＣＲ反応物から直接ライゲーションして、融合タンパク質が精製されるようにlac Zコード領域にフレーム挿入することができる、E. coli発現ベクターpCR2.1 TOPO（Invitrogen）；pINベクター（Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509）などが挙げられるが、これに限定されない。pFLAG（Sigma）、pMAL（NEB）およびpET（Novagen）のような一連のベクターもまた、外来ポリペプチドをＦＬＡＧペプチド、ｍａｌＥ−またはＣＢＤ−タンパク質との融合タンパク質として発現させるために用いることができる。これらの組み換えタンパク質は、正しい折りたたみと成熟化のために周辺質の空間へと導かれ得る。融合した部分は、発現タンパク質のアフィニティー精製のために用いることができる。エンテロキナーゼのような特定のプロテアーゼのための切断部位により、ＡＰＲを切断することが可能になる。pGEXベクターもまた、外来ポリペプチドを５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために用いることができる。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、溶解した細胞から、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合と、その後の遊離のグルタチオンの存在下における溶出により、容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出されるように、トロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
昆虫の系において、外来遺伝子を発現するための多くのベクターを用いることができ、例えばAutographa californica核多角体ウイルス（AcNPV）を、外来遺伝子を発現するためのベクターとして用いることができる。ウイルスはSpodoptera frugiperda細胞などの細胞内で増殖する。ＣＬＩＰ阻害剤コード配列を、個別に、ウイルスの必須でない領域中（例えばポリヘドリン遺伝子）へクローニングし、AcNPVプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下におくことができる。
哺乳動物の宿主細胞において、多数のウイルスに基づく発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、目的のＣＬＩＰ阻害剤コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび三分子リーダー配列（tripartite leader sequence）にライゲーションすることができる。このキメラ遺伝子を、次いで、in vitroまたはin vivoの組み換えによりアデノウイルスのゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの必須でない領域（例えば領域Ｅ１およびＥ３）における挿入は、感染宿主において生存可能でありＣＬＩＰ阻害剤を発現することができる組み換えウイルスを生じる（例えばLogan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 355-359を参照）。特定の開始シグナルもまた、挿入されたＣＬＩＰ阻害剤コード配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルとして、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列の読み枠と一致していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然または合成の両方の多様なものに由来するものであってよい。適切な転写エンハンサーエレメント、転写終結因子などの包含により、発現の効率を増強することができる（例えばBittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 51-544を参照）。
さらに、挿入配列の発現を調節する、または所望される特定の様式において遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする、宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のかかる修飾（例えばグリコシル化）およびプロセッシング（例えば切断）は、タンパク質の機能のために重要である場合がある。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセッシングおよび修飾についての特徴および特異的な機構を有する。適切な細胞株および宿主系を、発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確実にするために選択することができる。この目的のために、正しい一次転写物のプロセッシングおよび遺伝子産物の翻訳後修飾（例えば遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化）のための細胞機構を有する真核生物の宿主細胞を用いることができる。かかる哺乳動物宿主細胞として、ＰＣ１２、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（内因的にいかなる免疫グロブリン鎖も産生しないマウスミエローマ細胞株）、ＣＲＬ７０３０およびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。細菌または酵母の系における発現は、翻訳後修飾がＣＬＩＰ阻害剤の活性のために必須ではないことが明らかになった場合に用いることができる。
正しくプロセッシングされたＣＬＩＰ阻害剤の長期の高収率産生のために、細胞における安定した発現が好ましい。ＣＬＩＰ阻害剤を安定に発現する細胞株は、選択マーカーを含むベクターを用いて操作することができる。例として、限定することなく、発現コンストラクトの導入の後で、操作された細胞を、濃縮培地中で１〜２日間生育してもよく、その後選択培地へ切り替える。発現コンストラクト中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、任意に、細胞が安定してその染色体中に発現コンストラクトを組み込み、培養中で増殖して細胞株へと増殖（expand）することを可能にする。かかる細胞は、ＣＬＩＰ阻害剤を継続的に発現しつつ、長期間培養されることができる。
以下を含むがこれらに限定されない多数の選択系を用いることができる：抗生物質耐性（ジェネテシンまたはG-418に対する耐性を付与するNeo（Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95；Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596；Mulligan, 1993, Science 260: 926-932；およびMorgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217; May, 1993, TIB TECH 11 (5): 155-2 15）；ゼオシンに対する耐性のためのZeo；ブラストサイジンに対する耐性のためのBsdなどのマーカー）；代謝拮抗薬耐性（メトトレキサートに対する耐性を付与するDhfr、Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527などのマーカー）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するgpt（Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072）；ならびにハイグロマイシンに対する耐性を付与するhygro（Santerre et al., 1984, Gene 30: 147）。さらに、tk−、hgprt−またはaprt−細胞を含むがこれらに限定されない変異細胞株を、チミジンキナーゼ、ヒポキサンチン、グアニン−またはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼのための対応する遺伝子を含むベクターと組み合わせて用いることができる。組み換えＤＮＡ技術の一般的に当該分野において公知の方法を、所望の組み換えクローンを選択するために慣用的に適用することができ、かかる方法は、例えば、Ausubelら編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY（1993）；Kriegler、Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual、Stockton Press、NY（1990）；およびDracopoliら編、Current Protocols in Human Genetics、John Wiley & Sons、NY（1994）の第１２章及び１３章；Colberre-Garapinら、1981年、J. Mol. Biol. 150: 1において記載されている。
組み換え細胞を、温度、インキュベーション時間、光学密度および培地組成の標準的な条件下において培養することができる。しかし、組み換え細胞の増殖のための条件は、ＣＬＩＰ阻害剤の発現のためのものと異なる場合がある。ＣＬＩＰ阻害剤の産生を増強するために、改変された培養条件および培地もまた用いることができる。当該分野において公知のあらゆる技術を、ＣＬＩＰ阻害剤を産生するための至適条件を確立するために適用することができる。
ペプチド合成
組み換え技術によりＣＬＩＰ阻害剤またはそのフラグメントを生成するための代替は、ペプチド合成である。例えば、ＣＬＩＰ阻害剤全体、またはＣＬＩＰ阻害剤の一部に対応するペプチドを、ペプチド合成機を用いて合成することができる。従来のペプチド合成または当該分野において周知の他の合成プロトコルを用いることができる。
ＣＬＩＰ阻害剤またはその一部のアミノ酸配列を有するペプチドを、固相ペプチド合成により、Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149により記載されるものと類似の手順を用いて合成することができる。合成の間に、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸を、そのＣ末端により結合した成長するポリペプチド鎖に、および不溶性ポリマー支持体、すなわちポリスチレンビーズに、段階的に添加する。ペプチドは、Ｎ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬を反応させることにより活性化されたＮ−α−保護アミノ酸のα−カルボキシル基に結合することにより合成される。遊離のアミノ基の活性化カルボキシルへの結合は、ペプチド結合形成をもたらす。最も一般的に用いられるＮ−α−保護基として、酸不安定性であるBoc、および塩基不安定性であるFmocが挙げられる。適切な化学、樹脂、保護基、保護アミノ酸および試薬は、当該分野において周知であり、本明細書においては詳細には議論しない（Athertonら、1989年、Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach、IRL PressおよびBodanszky、1993年、Peptide Chemistry, A Practical Textbook、第２版、Springer-Verlagを参照）。
得られたＣＬＩＰ阻害剤またはそのフラグメントの精製は、ゲル浸透を用いる調製ＨＰＬＣ、分配および／またはイオン交換クロマトグラフィーなどの、従来の手順を用いて達成される。適切なマトリックスおよび緩衝液の選択は、当該分野において周知であり、本明細書においては詳細には議論しない。
（ｘｖｉ）製品
本発明はまた、製品を包含し、これは成分の任意の１つまたは集合を指す。本発明の一部の態様において、製品はキットである。製品は、１または２以上の容器中の、医薬または診断グレードの本発明の化合物を含む。製品は、本発明の化合物の使用を促進するまたは記載する指示書またはラベルを含んでもよい。
本明細書において用いられる場合、「促進される」とは、感染症、癌、自己免疫性疾患、移植片拒絶またはアルツハイマー病の処置に関して本発明の組成物に関連する、教育の方法、病院および他の臨床の指示、医薬の販売を含む製薬工業の活動、ならびにあらゆる広告または書面、口頭およびあらゆる形式の電子通信を含む他の促進活動を含む、営業を行う全ての方法を包含する。
「指示」とは、促進物の成分を明示することができ、典型的には、本発明の組成物のパッケージ上の、またはそれと関連した書面の指示書を含む。指示はまた、あらゆる様式において提供されるあらゆる口頭または電子的指示を含んでもよい。
したがって、本明細書において記載される薬剤は、本発明の一部の態様において、治療、診断または研究の用途におけるそれらの使用を容易にするために、医薬または診断または研究用のキットに組み立てられてもよい。キットは、本発明の組成物を収納する１または２以上の容器、および使用のための指示書を含んでもよい。特に、かかるキットは、本明細書において記載する１または２以上の薬剤を、意図される治療用途およびそれらの薬剤の正しい投与を記載する指示書と共に含んでもよい。特定の態様において、キット中の薬剤は、医薬製剤の形態であってもよく、特定の用途のため、および薬剤の投与の方法のために好適な投与量であってもよい。
キットは、本明細書において記載される方法の医師による使用を容易にするために設計されてもよく、多数の形態をとることができる。キットの組成の各々は、適用可能である場合には、液体の形態において（例えば溶液において）、または固体の形態（例えば乾燥粉末）において、提供することができる。特定の態様において、一部の組成物は、例えば、キットと共に提供されてもされなくてもよい好適な溶媒または他の種（例えば、水または細胞培養培地）の添加により、構成可能（constitutable）または処理可能（processable）（例えば活性形態へ）であってもよい。本明細書において用いられる場合、「指示」は、指示および／または促進の成分を定義することができ、典型的には、本発明のパッケージ上の、またはそれに関連した書面の指示書を含む。指示はまた、使用者が、指示がキットと関連することを明確に認識するように、視聴覚的（例えばビデオテープ、ＤＶＤなど）、インターネット、および／またはウェブに基づく通信などの、あらゆる形態において提供されるあらゆる口頭または電気的指示を含んでもよい。書面の指示書は、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府の機関により規定された様式におけるものであってもよく、この指示書はまた、ヒトへの投与についての製造、使用または販売の当該機関の承認を反映するものであってもよい。
キットは、本明細書において記載される成分のあらゆる１または２以上を１または２以上の容器中に含むことができる。一例として、一態様において、キットは、キットの成分の１または２以上と試料とを混合するための、および対象へ適用するための指示書を含んでもよい。キットは、本明細書において記載される薬剤を収納する容器を含む。薬剤は無菌で調製され、シリンジ中に梱包され、保冷で出荷されてもよい。あるいは、これはバイアルまたは他の容器中に貯蔵のために収納されてもよい。第２の容器が無菌で調製された他の薬剤を有していてもよい。あるいは、キットは、予め混合された活性成分を含み、シリンジ、バイアル、チューブまたは他の容器中で出荷されてもよい。
キットは、ブリスターパウチ、収縮包装パウチ、真空密封可能パウチ、密封可能な熱形成トレイ、または類似のパウチもしくはトレイの形態などの多様な形態を有することができ、パウチ中に緩く包装された付属品、１または２以上のチューブ、用基、箱またはバッグを含むことができる。キットは、付属品が添加された後に滅菌してもよく、これにより、容器中の個々の付属物を他の方法で開封することを可能にする。キットは、放射線滅菌、熱滅菌、または当該分野において公知の他の滅菌方法などの、任意の適切な滅菌技術を用いて滅菌することができる。キットはまた、特定の用途に依存して、他の成分、例えば、容器、細胞培地、塩、緩衝化剤、試薬、シリンジ、針、殺菌剤を適用または除去するためのガーゼなどの布、使い捨てグローブ、投与の前の薬剤の支持体など、を含んでもよい。
キットの組成物は、任意の好適な形態として、例えば溶液または乾燥粉末として、提供することができる。組成物が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、好適な溶媒の添加により再構成することができる。好適な溶媒もまた提供される。液体形態の組成物が好適である場合、液体形態は、濃縮されていても、そのまま使用できるものであってもよい。溶媒は、化合物および使用または投与の様式に依存する。薬物組成物のための好適な溶媒は、周知であり、文献において利用可能である。溶媒は、化合物および使用または投与の様式に依存する。
一つの態様のセットにおいて、キットは、バイアル、チューブなどの１または２以上の容器手段を厳重に閉じ込められた状態で受けるために区分されたキャリア手段を含んでもよく、容器手段の各々は、方法において用いられる別々の要素の１つを含む。例えば、容器の１つは、アッセイのための陽性対照を含んでもよい。さらに、キットは、他の成分、例えばアッセイにおいて有用な緩衝化剤のための容器を含んでもよい。
本発明はまた、完成した、包装された、およびラベルされた医薬製品を包含する。この製品は、適切な単位投与形態を、ガラスバイアルまたは気密的に密封される他の容器などの適切な容器（vessel）または容器（container）中に含む。非経口投与のために好適な投与形態の場合、活性成分は滅菌され、無粒子性溶液として投与のために好適である。言い換えると、本発明は、非経口の溶液および凍結乾燥の粉末の両方を包含し、各々は無菌であり、後者は注射の前の再構成に好適である。あるいは、単位投与形態は、経口、経皮、局所または粘膜送達のために好適な固体である。
好ましい態様において、単位投与形態は、静脈内、筋肉内または皮下送達のための好適である。したがって、本発明は、各々の送達経路に好適な、好ましくは無菌の溶液を包含する。
別の好ましい態様において、本発明の組成物は、レシチン、タウロコール酸、およびコレステロールを含むがこれらに限定されない生適合性界面活性剤と共に；またはガンマグロブリンおよび血清アルブミンを含むがこれらに限定されない他のタンパク質と共に、容器中に貯蔵される。より好ましくは、本発明の組成物は、ヒトでの使用のためにヒト血清アルブミンと共に貯蔵され、獣医学的使用のためにウシ血清アルブミンと共に貯蔵される。
任意の医薬製品について、梱包材および容器は、貯蔵および出荷の間の製品の安定性を保護するために設計される。さらに、本発明の製品は、使用のための指示書、および問題の疾患または障害を適切に予防または処置する方法について医師、技師または患者に助言する他の情報の材料を含む。言い換えれば、製品は、実際の用量、モニタリングの手順（平均絶対リンパ球数、腫瘍細胞数、および腫瘍サイズをモニタリングするための方法など）、ならびに他のモニタリングの情報を含むがこれらに限定されない、投与レジメンを支持または示唆する指示手段を含む。
より具体的には、本発明は、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、スプレー器、吸入器、静脈内（ｉ．ｖ．）バッグ、エンベロープなどの梱包材；および前記梱包材中に含まれる医薬剤の少なくとも１単位の投与形態を含む製品を提供する。本発明はまた、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、スプレー器、吸入器、静脈内（ｉ．ｖ．）バッグ、エンベロープなどの梱包材；および前記梱包材中に含まれる各医薬剤の少なくとも１単位の投与形態を含む製品を提供する。本発明はさらに、箱、ボトル、チューブ、バイアル、容器、スプレー器、吸入器、静脈内（ｉ．ｖ．）バッグ、エンベロープなどの梱包材；および前記梱包材中に含まれる各医薬剤の少なくとも１単位の投与形態を含む製品を提供する。本発明はさらに、好ましくは無菌の形態の製剤の注射のための針またはシリンジ、および／または包装されたアルコールパッドを含む製品を提供する。
特定の態様において、製品は、梱包材ならびに前記梱包材中に含有される医薬剤および指示書を含み、ここで、前記医薬剤は、ＣＬＩＰ阻害剤またはその誘導体、フラグメント、ホモログ、アナログ、および薬学的に許容可能なキャリアであり、前記指示書は、癌、感染性疾患、例えばＨＩＶ、自己免疫性疾患、移植片拒絶またはアルツハイマー病を有する対象を予防、処置または管理するための投与レジメンを示す。別の態様において、製品は、梱包材ならびに前記梱包材中に含有される医薬剤および指示書を含み、ここで前記医薬剤は、ＣＬＩＰ阻害剤またはその誘導体、フラグメント、ホモログ、アナログ、ＣＬＩＰ阻害剤またはその誘導体、フラグメント、ホモログ、アナログ以外の予防または治療剤、および薬学的に許容可能なキャリアであり、前記指示書は、癌、感染性疾患、例えばＨＩＶ、自己免疫性疾患、移植片拒絶またはアルツハイマー病を有する対象を予防、処置または管理するための投与レジメンを示す。別の態様において、製品は、梱包材ならびに前記梱包材中に含有される２種の医薬剤および指示書を含み、ここで、前記第１の医薬剤は、ＣＬＩＰ阻害剤またはその誘導体、フラグメント、ホモログ、アナログ、および薬学的に許容可能なキャリアであり、前記第２の医薬剤は、ＣＬＩＰ阻害剤またはその誘導体、フラグメント、ホモログ、アナログ以外の予防または治療剤であり、前記指示書は、癌、感染性疾患、例えばＨＩＶ、自己免疫性疾患、移植片拒絶またはアルツハイマー病を有する対象を予防、処置または管理するための投与レジメンを示す。
（ｘｖｉｉ）治療的モニタリング
選択された処置パラメーター、例えば、用量、スケジュール、アジュバントの選択など、の妥当性を、処置プログラムの経過の間に患者からの血清のアリコートを採取して抗体および／またはＴ細胞のタイターをアッセイすることにより決定する。Ｔ細胞のタイターは、従来の方法によりモニタリングする。例えば、Ｔリンパ球は、Bach, F.、Contemporary Topics in Immunology、第２巻：Thymus Dependency、p. 189、Plenum Press、New York、1973年；Hoffman, T. & Kunkel, H. G.およびKaplan, M. E.ら（両方の論文は、In vitro Methods in Cell Mediated and Tumor Immunity、B. R. Bloom & R. David編、Academic Press, New York (1976)中にある）において記載されるように、Ｅ−ロゼット形成により検出することができる。さらに、ウイルス負荷を測定することができる。
さらに、患者の臨床的状態を、所望の効果、例えばＴ細胞数の増加および／または体重増加について、モニタリングすることができる。不適当な効果が達成されている場合、患者をさらなる処置によりブーストしてもよく、処置パラメーターを、本発明の組成物および／または他の活性剤の量を増大させること、または投与の経路を変化させることなどにより、改変してもよい。
本発明のＣＬＩＰ阻害剤組成物による免疫治療の、新生物疾患の発達および進行に対する効果を、以下を含むがこれらに限定されない当業者に公知の任意の方法によりモニタリングすることができる：ａ）細胞性免疫の評価としての過敏性の遅延；ｂ）in vitroでの細胞溶解性Ｔリンパ球の活性；ｃ）腫瘍特異的抗原、例えば癌胎児性（ＣＥＡ）抗原のレベル；ｄ）コンピューター断層造影（ＣＴ）スキャンなどの技術を用いての腫瘍の形態の変化；ｅ）高リスクの対象における特定の癌についてのリスクの推定バイオマーカーのレベルの変化；およびｆ）超音波画像を用いての腫瘍の形態の変化。
全ての腫瘍についてのユニークな腫瘍抗原を検出することは可能ではないかもしれないが、多くの腫瘍がそれらを正常細胞から区別する抗原を提示する。モノクローナル抗体試薬は、抗原の単離および生化学的特徴づけを可能にし、診断的に、形質転換された細胞の形質転換されていない細胞からの区別のために、および形質転換細胞の細胞系統の定義のために、貴重なものとなっている。最も十分に特徴づけされているヒト腫瘍関連抗原は、癌胎児性抗原である。これらの抗原は、胚発生の間に発現するが、正常な成人組織においては不在であるか、非常に検出が困難である。原型の抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）であって、これは胎児の腸およびヒト結腸癌において見出されるが正常成人結腸細胞においては見出されない糖タンパク質である。ＣＥＡは、結腸癌細胞から脱落し、血清中で見出されるので、初めは、血清中のこの抗原の存在は、結腸癌について患者をスクリーニングするために用いることができると考えられた。しかし、膵臓癌および乳癌などの他の腫瘍を有する患者もまた、ＣＥＡの血清レベルが上昇している。したがって、治療を行っている癌患者におけるＣＥＡレベルの下降および上昇をモニタリングすることは、腫瘍の進行および処置に対する応答を予測するために有用であることが証明された。
いくつかの他の癌胎児抗原が、ヒトの腫瘍を診断およびモニタリングするために有用である。例えばアルファ−フェトタンパク質は、アルファ−グロブリンであり、通常では胎児の肝臓および卵黄嚢細胞から分泌され、肝臓癌および胚性細胞腫瘍を有する患者の血清中で見出され、疾患状態のマーカーとして用いることができる。
ＣＴは、癌の正確なステージングのための最良の技術であり続ける。ＣＴは、転移の検出について、あらゆる他のイメージング技術より感受性が高く特異的であることを証明した。
特定の癌のリスクについての推定のバイオマーカーのレベルは、本発明の分子複合体の効果をモニタリングするために測定される。例えば、前立腺癌についてのリスクが高い対象において、血清の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）を、Brawer, M. K., et. al., 1992, J. Urol., 147: 841-845, and Catalona, W. J., et al., 1993, JAMA, 270: 948-958により記載される手順により測定する。あるいは、結腸癌についてのリスクを有する対象において、上記のセクション5.10.3に記載されるようにＣＥＡを測定し、乳癌のリスクが高い対象において、エストラジオールの１６−ヒドロキシル化を、Schneider, J. et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 3047-3051により記載される手順により測定する。
超音波画像は、癌の正確なステージングのための代替的な最良の技術であり続ける。
ＣＬＩＰ阻害剤の単独でまたは別の治療（別の治療剤または予防剤を含む）と組み合わせてのあらゆる有害効果も、好ましくはまたモニタリングされる。癌の処置または感染性疾患の処置の間の化学療法の有害効果の例として、早発性および遅発性の下痢および膨満などを含むがこれらに限定されない胃腸毒性；悪心；嘔吐；食欲不振；白血球減少；貧血；好中球減少症；無力症；腹部疝痛；発熱；疼痛；体重減少；脱水；脱毛症；呼吸困難；不眠；眩暈、粘膜炎、口内乾燥、および腎不全、ならびに便秘症、神経および筋肉の効果、一時的または持続性の腎臓および膀胱への損傷、インフルエンザ様症状、体液貯留、ならびに一時的または持続性の不妊症が挙げられるがこれらに限定されない。放射線療法からの有害効果として、疲労、口渇および食欲の喪失が挙げられるがこれらに限定されない。
他の有害効果として、早発性および遅発性の下痢および膨満などを含むがこれらに限定されない胃腸毒性；悪心；嘔吐；食欲不振；白血球減少；貧血；好中球減少症；無力症；腹部疝痛；発熱；疼痛；体重減少；脱水；脱毛症；呼吸困難；不眠；眩暈、粘膜炎、口内乾燥、および腎不全が挙げられる。生物学的治療／免疫治療からの有害効果として、投与の部位における発疹または膨化、発熱、悪寒および疲労などのインフルエンザ様症状、消化管の問題ならびにアレルギー性反応が挙げられるがこれらに限定されない。ホルモン治療からの有害効果として、悪心、受精能の問題、抑うつ、食欲の喪失、眼の問題、頭痛、および体重変動が挙げられるがこれらに限定されない。典型的に患者により経験されるさらなる望ましくない効果が多数あり、当該分野において公知である。多くは、Physicians' Desk Reference（第５６版、2002年）に記載される。
以下の例は、本発明の実施の具体例を説明するために提供され、本発明の範囲を限定することを意図されるものではない。当業者に明らかであるように、本発明は、多様な組成物および方法において用途を見出す。
例
例１：ＣＬＩＰ阻害剤の同定
ＣＬＩＰをはずして置換することができるペプチドを、コンピューターに基づく分析を用いて同定した。したがって、「理想的な」ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドの例を、本発明にしたがって生成した。ＭＨＣクラスＩＩとＣＬＩＰとの間の結合相互作用の分析を、ＭＨＣクラスＩＩに結合してＣＬＩＰをはずして置換し得る他の分子を同定するために用いた。本明細書において記載される方法は、ペプチド配列を、Singh, H.およびRaghava, G.P.S.（2001）、「ProPred: prediction of HLA-DR binding sites.」Bioinformatics、17(12), 1236-37において記載されるような定量的マトリックスを用いて抗原配列中のＭＨＣクラスＩＩ結合領域を予測するソフトウェアに供給することに基づく。
ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲは多様な長さのペプチドに結合し得るため、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲ−ＣＬＩＰ結合の分析を行った。ＨＬＡ−ＤＲのアルファ鎖は、ＨＬＡ−ＤＲのベータ鎖よりも多型性がはるかに低いため、ＨＬＡ−ＤＲのベータ鎖（以下、ＨＬＡ−ＤＲＢ）をより詳細に研究した。５１個の一般的なアレルについてベータに結合するペプチドが公的に入手可能である。ＨＬＡのアレルの概説は、Cano, P.ら、「Common and Well-Documented HLA Alleles」、Human Immunology 68, 392 - 417（2007）にある。ペプチド結合データに基づいて、５１個の一般的なＨＬＡ−ＤＲＢアレルそれぞれについての予測マトリックスを作成した。マトリックスは、http://www.imtech.res.in/raghava/propred/page4.htmlから入手することができ、ウェブサイトから表４／付録Ａに複製される。分析方法は、利用可能なＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド予測サーバー（オープンソース）を用いて達成し、これはまた、http://www.imtech.res.in/raghava/propredにてオンラインで得ることができる。このウェブサイトに記載されているようなアルゴリズムの概説は、Sturniolo. Tら（Sturniolo. T., Bono. E., Ding. J., Raddrizzani. L., Tuereci. O., Sahin. U., Braxenthaler. M., Gallazzi. F., Protti. M.P., Sinigaglia. F., Hammer. J., Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand database using DNA microarrays and virtual HLA class II matrices. Nat. Biotechnol. 17. 555-561(1999)）に記載される。以下のマトリックスを分析のために用いた。
Figure 2011502964
これらのマトリックスは、ペプチドの各位置における各アミノ酸の重要性を重みづけする。重要なアンカー残基は、非常に制限されたアミノ酸のセットを結合のために必要とする。他の位置は重要性がより低いが、なおＭＨＣ結合に影響を及ぼす。２個の位置は結合に全く影響を及ぼさないように見られる。
ヒトＭＨＣ分子のデータベースは、ウェブサイト上にImMunoGeneTics（http://www.ebi.ac.uk/imgt）により含められている。このサイトは、全ての脊椎動物種のＭＨＣに特化した、統合されたデータベースの集合を含む。IMGT/HLAは、ＨＬＡとして言及されるヒトＨＭＣの配列についてのデータベースである。IMGT/HLAデータベースは、ＷＨＯのＨＬＡ系の因子についての命名委員会（Nomenclature Committee For Factors of the HLA System）についての全ての公式な配列を含む。
表３を参照して、本発明のペプチドにおける予測されるＭＨＣクラスＩＩ結合領域と、ＣＬＩＰの予測されるＭＨＣクラスＩＩ結合領域との比較を示す。９マー（最小の長さ）について、開始は第１の位置である。ＣＬＩＰは数個の突出するアミノ酸を有する。ＨＬＡ−ＤＲに対するヒトインバリアント鎖の一部であるＣＬＩＰペプチドのアミノ酸配列は（配列番号１）であり、これは、１文字のシステムにおいてＭＲＭＡＴＰＬＬＭ、３文字の略号においてＭｅｔ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｍｅｔの配列を有する。このペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲアレルに結合することに関して一種の「よろず屋（jack of all trades）」である。典型的なペプチドは、数個のアレルに良好に結合し、他には非常に弱くしか結合しない。これは、これがＤＲアレルの様に多型性でないが、それが与えられたアレルがいずれであっても適合する必要があることを考慮すると、よく意味をなす。ＭＨＣの多型の免疫および進化による選択が、異なる集団において特定のアレルを提供する。
ＨＬＡ−ＤＲに結合するための最小のペプチドの長さは、９アミノ酸である。しかし、オープンな結合溝のいずれの側に突出するアミノ酸が存在してもよい。一部のよく研究されたペプチドについて、ＮおよびＣ末端の両方における付加的な突出するアミノ酸は、結合を増強し得ることが知られている。本明細書において使用される予測マトリックスは、これらを考慮しないが、多様なアミノ酸を９マーのペプチドの各々の側に添加することは、本発明の一側面である。
ペプチド結合データに基づいて、５１個の一般的なＨＬＡ−ＤＲＢアレルの各々について予測マトリックスが作成された。これらのマトリックスは、ペプチドの各位置における各アミノ酸の重要性を重みづけする。重要なアンカー残基は、非常に制限されたアミノ酸のセットを結合のために必要とする。他の位置は重要性がより低いが、なおＭＨＣ結合に影響を及ぼす。最後に、２個の位置は結合に全く影響を及ぼさないように見られる。
理想的なペプチドの大まかな予測を行うために、５１個のアレルを平均化し、各位置における最良のアミノ酸を選択し、ＦＲＩＭ［Ａｎｙ］ＶＬ［Ａｎｙ］Ｓ（配列番号６）を得た。アルゴリズムを実行し、かかるペプチドをＣＬＩＰと比較するために、両方の［Ａｎｙ］の位置においてアラニンを用い、配列番号１を得た。これは、１文字の系においてＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）、３文字の略号においてＰｈｅ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ（配列番号２）の配列を有する。一般に、アラニンは無害であるので、置換の良好な選択肢である。これらの位置は、可溶性などの他の目的のために最適化してもよい。
表３を再び参照すると、各行は、ＨＬＡ−ＤＲアレルを表わし、各ペプチドについてのスコアが示される。ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）がＣＬＩＰ（配列番号１）よりも高いスコアを有したアレルは、明らかである。全てのアレルにわたる平均スコアを、配列の右に示す。ＣＬＩＰについては、それは4.3156862275であり、はずして置換するペプチド（配列番号２）については、それは6.266666667である。このことは、配列番号２は、ＣＬＩＰをはずして置換する能力が高いことを示す。
例２〜９は、2008年１月２８日に出願された、発明者としてKaren Newell、Evan NewellおよびJoshua Cabreraが挙げられた米国出願第12/011,643号から複製される。これは、本発明の背景を提供するためにのみ、本明細書において含められる。実験は、本願の発明者として挙げられるKaren NewellおよびEvan Newellの発明を反映する。
例２：コクサッキーウイルス感染後のＢ細胞のアポトーシス
コクサッキーウイルス感染の過程において、その後の自己免疫性の続発症なしにウイルスから回復する動物は、in vivoでの感染の間に高いパーセンテージの脾臓のＢ細胞のアポトーシスを有する（図１）。コクサッキーウイルス媒介性の自己免疫性疾患に対して感受性である動物は、少なくとも急性感染の間にも自己免疫性症状の前の期間の間にもアポトーシスを起こさない、非特異的に活性化されたＢ細胞を有し、このことは、自己免疫性疾患の発症における共通の特徴が非特異的に活性化されたＢ細胞が死滅しないことであることを示す。
例３：ＨＩＶ疾患における活性化Ｂ細胞は、ＮＫ細胞の活性化を媒介する
本発明者らは、実験的に、ＣＤ４０会合（ＣＤ４０リガンドを有する線維芽細胞）と組み換えＩＬ−４中での培養との組合せを用いて、抗原非依存的な様式において、末梢血ヒトＢ細胞のポリクローナルな活性化を誘導した。本発明者らは、活性化されたＢ細胞を単離し、それらを自家の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）との共培養へと戻した。５日間の共培養の後で、本発明者らは、ＰＢＭＣ培養物中の活性化されたＮＫ細胞のパーセンテージの著しい増加（ＮＫ細胞が生存したＰＢＭＣの２５〜５０％を占める：図２ａ）、および活性化Ｂ細胞の劇的なアポトーシスによる喪失（図２ｂ）を観察した。これらのデータは、ＨＩＶ疾患における抗原非依存的に活性化されたＢ細胞が最初にＮＫ細胞を活性化することを示す。
例４：抗原非依存的Ｂ細胞活性化は、ＮＫ細胞の活性をもたらす
ＮＫ細胞の活性化およびポリクローナル性のＢ細胞活性化をもたらす抗原非依存的な活性化シグナルをＢ細胞に提供するＨＩＶ感染の要素を試験する。
抗原非依存的なＢ細胞の活性化：ヒトＢ細胞：５個体の正常および５個体のＨＩＶ感染成人ドナーから、標準的なフィコール・ハイパック密度勾配技術を用いてＰＢＭＣを調製する。照射された（７５Ｇｙ）ヒトＣＤ４０Ｌでトランスフェクトされたマウス線維芽細胞（ＬＴＫ−ＣＤ４０Ｌ）を、６ウェルプレート（BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ）に、０．１×１０６細胞／ウェルの濃度で、ＲＰＭＩ完全培地中に置き、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養する。ＰＢＳで２回洗浄した後、２×１０６細胞／ウェルのＰＢＭＣを、組み換えヒトインターロイキン−４（ｒｈＩＬ−４；４ｎｇ／ｍＬ；Peprotech, Rocky Hill, NJ）の存在下でＬＴＫ−ＣＤ４０Ｌと、または、１０％ヒトＡＢ血清（Gemini Bio-Product, Woodland, CA）を補充した完全ダルベッコ培地（Invitrogen）中で精製されたＨＩＶから誘導されたｇｐ１２０タンパク質と、共培養する。培養細胞を、新たに調製され照射されたＬＴＫ−ＣＤ４０Ｌ細胞と共に３〜５日間毎に新しいプレートに移動する。使用する前に、死んだ細胞をＣＤ４０−Ｂ細胞からフィコール密度遠心分離により除去し、その後ＰＢＳで２回洗浄する。この画分の生存率は＞９９％であると予測され、細胞の＞９５％が、このプロトコルを用いて、２週間の培養の後で９５％より高い純度でＣＤ１９＋およびＣＤ２０＋であるＢ細胞であることが示された。このプロトコルは＞９９％の生存率をもたらし、細胞の＞９５％が、２週間の培養の後で９５％より高い純度でＣＤ１９＋およびＣＤ２０＋であるＢ細胞であることが示された。
活性化Ｂ細胞を、自家のＰＢＭＣと１：１０の比で共培養し、５日間培養する。収集した細胞を、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ４およびＣＤ８に対する蛍光色素共役抗体（BD Pharmingen）で染色する。細胞をフローサイトメトリーで分析して、共培養から得られたＮＫ細胞のパーセンテージ（ＣＤ５６＋、ＣＤ３−のパーセンテージ）を決定し、非感染試料と感染試料とを比較する。ＮＫ細胞を、ＮＫ殺傷リガンド（NK killing ligand）であるＫＩＲ３ＤＳ１、ＮＫＧ２Ｄ、ＦａＬまたはＰＤ１について対比染色する。同様に、生存する大きいおよび小さいＣＤ１９＋細胞のパーセントを、フローサイトメトリーで定量する。
ＨＩＶにおけるＢ細胞活性化：活性化ＮＫまたはＣＤ３ Ｔ細胞がポリクローナル性Ｂ細胞活性化を促進するか否かを決定するために、本発明者らは、相反的な共培養実験を行う。ここで、本発明者らは、意図的にＮＫまたはＣＤ３＋Ｔ細胞を活性化し、自家ドナーからのＰＢＭＣと１：１０で共培養する。ＰＢＭＣは、ＨＩＶ感染または非感染成人ドナーから、標準的なフィコール・ハイパック密度勾配技術を用いて調製する。ＮＫまたはＣＤ３＋Ｔ細胞を活性化するために、ＰＢＭＣを、１０％のＦＣＳ、１ｍＭのペニシリン、１ｍＭのGlutamaxおよび１％Ｗ／Ｖのグルコースを含むＲＰＭＩ中で、２．０〜４．０×１０６／ｍＬで、１：４０，０００のＯＫＴ３、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２と共に、または刺激なし（休止）で、３日間培養する。３日間の刺激の後で、非接着性のＰＢＭＣを収集し、免疫細胞のサブセットを、ＭＡＣＳ技術により製造者のプロトコルに従って（Miltenyi Biotec, Auburn CA）精製する。簡単に述べると、ＮＫ細胞を、第１にＣＤ５６＋多選別キットを用いて選択し、その後ビーズから放出させ、抗ＣＤ３ビーズで枯渇させる。Ｔ細胞は、各々の個々のサブセットの単離のための抗ＣＤ４または抗ＣＤ８ビーズを用いて、または用いないで、非接着性ＰＢＭＣをＣＤ５６ビーズで枯渇させることにより得る。細胞画分の純度を、各々の実験について、ＣＤ５６、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１４抗体を用いるフローサイトメトリーにより確認する。５日間の培養の後で、本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて、活性化のマーカーとしてのＣＤ１９＋、ＣＤ４、ＣＤ８、ＮＫ、ＣＤ３およびＣＤ６９の相対的変化を決定する。
本発明者らは、共培養実験からのＮＫ細胞を、キラー細胞の機能の指標であるＫＩＲ３ＤＳ１、ならびにＮＫＧ２Ｄリガンド、ＰＤ１およびＦａｓＬを含む他のキラー細胞リガンドについて試験する。
マウスＢ細胞の抗原非依存的な活性化。マウスの脾臓を、Ｃ５７Ｂｌ６マウスから取り除き、赤血球を緩衝化塩化アンモニウムを用いて除去し、Ｔ細胞を抗Ｔ細胞抗体カクテル（ＨＯ１３、ＧＫ１．５および３０Ｈ１２）および補体により枯渇させる。Ｔ細胞枯渇脾細胞を洗浄し、パーコール密度勾配遠心分離を用いて分画する。本発明者らは、Ｂ細胞を１．０７９／１．０８５ｇ／ｍｌの密度界面で単離し（休止Ｂ細胞）、洗浄して残ったパーコールを除去する。細胞を、Ｂ細胞上のＬＰＳ、またはＴＬＲ２のアンタゴニストであるトリ−パルミトイル−Ｓ−グリセリル−システイニル−Ｎ−末端（Ｐａｍ（３）Ｃｙｓ）の存在下において培養する。活性化Ｂ細胞を、全脾臓細胞と、１：１０のＢ細胞：全脾臓細胞の比で共培養する。５日間の培養の後で、残留している細胞を、マウスＣＤ５６、ＣＤ３、Ｂ２２０、ＣＤ４およびＣＤ８を発現するものを含む細胞サブセットの増殖について分析する。これらの細胞表面分子を、フローサイトメトリーで分析する。ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞を、ＮＫＧ２Ｄおよび他の死誘導性受容体について対比染色する。
例５：ＮＫ細胞は活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を殺傷する。
ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞活性化の結果として、活性化されたＣＤ４ Ｔ細胞を標的として溶解する能力、およびＣＤ４ Ｔ細胞標的の変化を試験する。
ヒトＮＫおよびＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化：ＰＢＭＣを、ＨＩＶ感染または非感染成人ドナーから、標準的なフィコール・ハイパック密度勾配技術を用いて調製した。ＮＫおよびＣＤ３＋Ｔ細胞を、本明細書において開示されるように活性化して単離した。Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、慣用的に８０〜９５％の純度であり、単球の混入は１％未満である。ＯＫＴ３により刺激されたＰＢＭＣ中のＴ細胞活性化を、３Ｈ−チミジン組み込みを用いるアッセイにより確認する。ＮＫ細胞を、サイズおよび粒度の増大をフローサイトメトリーで、ＣＤ５６＋およびＣＤ３−の染色によりフローサイトメトリーで、ならびに、十分に確立されたＮＫ標的のクロム放出により測定される溶解活性により、確認する。本発明者らは、十分に確立されたＮＫ細胞標的または本明細書において開示される非特異的に活性化されたＢ細胞を、５１−クロムと共にロードする。本発明者らは、標的細胞の死の尺度としてクロムの放出を用いる。
マウスＮＫおよびＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化：本発明者らは、本明細書において開示されるように脾細胞を単離する。赤血球枯渇脾臓細胞を、組み換えマウスＩＬ−２中で、または１４５．２Ｃ１１（抗マウスＣＤ３、Pharmingen）と共に、３日間培養する。刺激の後で細胞を収集し、Cell-ect Isolationキットを用いて、ＮＫ、ＣＤ４またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかについて精製する。次いで、細胞を、５１−クロム標識された十分に確立したＮＫ細胞標的、または５１−クロム標識された本明細書において開示される非特異的に活性化されたＢ細胞と、共培養する。
例６：慢性的に活性化されたＨＩＶ感染（またはＨＩＶ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞）は、活性化キラー細胞の細胞間標的である。
慢性的に活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＨＩＶ感染から生じる慢性的な免疫刺激の結果として、キラー細胞に対して特に感受性となる。
本発明者らは、本明細書において開示されるように、ＮＫ細胞を非感染またはＨＩＶ感染個体からＣＤ５６＋多選択キットを用いて単離する。本発明者らは、本明細書において開示されるように、細胞をＩＬ−２中で活性化する。本発明者らは、これらの細胞を、１：１０の比で自家ドナーからのＰＢＭＣに戻し添加して、共培養実験を行う。共培養の前に、本発明者らは、ＨＩＶ感染および非感染ドナーからのＮＫ細胞を、キラー細胞の機能の指標であるＫＩＲ３ＤＳ１、ＦａｓＬおよびＮＫＧ２Ｄリガンドを含む、死誘導性の受容体：リガンドとキラーのペアについて試験した。平行して、本発明者らは、共培養の前後のＨＩＶ感染または非感染ドナーの自家ドナーからのＰＢＭＣを染色した。
例７：ＴＮＰ混合物は、モデルＢ細胞株からＣＬＩＰをはずして置換する。
胸腺核タンパク質混合物に対する応答におけるモデルＢ細胞株（DaudiおよびRaji）の表面からのＣＬＩＰ除去・置換の動態を決定した。
結果を、ヒストグラム分析で表わす（図３）。Ｙ軸は、相対的ＦＩＴＣ蛍光を反映するＸ軸に対する、５０００個の生存細胞の細胞数を表わす。示すとおり、アイソタイプ対照染色からのヒストグラムと、特定の染色を反映するヒストグラムとの間の距離は、生存RajiおよびDaudi細胞の集団における細胞表面ＣＬＩＰのレベルの尺度である。
３時間において、両方の細胞株において、本発明者らは、ＣＬＩＰに対するアイソタイプの染色の比が減退したことにより、２００マイクログラム／ｍｌのＴＮＰ混合物が検出可能な細胞表面ＣＬＩＰの減少を引き起こすことの証拠を見出した。
２４時間において、効果はより低く、検出可能なＣＬＩＰの増大を引き起こす場合があった。注目すべきことに、２４時間で顕著に、ＴＮＰ混合物は２００マイクログラム／ｍＬの濃度でＢ細胞株の死を引き起こし、４８時間までには、２００マイクログラムで処置された細胞の全てが死滅し、５０マイクログラムの濃度もまた、著しい毒性をもたらした。
３時間において、２００マイクログラムＴＮＰ／ｍｌによる処置は、トリパンブルー排除により決定した場合に、２．５倍の死細胞の数であった。フローサイトメトリー実験における細胞死は、前方対側方の散乱の変化（前方の散乱の減少、側方の散乱の増加）により決定される。
材料および方法
細胞培養条件：RajiおよびDaudi細胞株を、American Type Culture Collectionから購入し、解凍し、１０％のウシ胎児血清、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、HEPES緩衝剤、ｌ−グルタミンおよび２−ＭＥを含む標準的な補助剤を添加したRPMI 1640培地中で生育した。
プロトコル：細胞を、１２ウェルのプレートに、Daudi細胞についてはおよそ０．５×１０６／ウェル、Raji細胞については１．０×１０６／ウェルを含む、全容積３ｍｌで播種した。処置群は、対照として未処置のもの；５０マイクログラム／ｍｌのＴＮＰ混合物；２００マイクログラム／ｍｌのＴＮＰ混合物；５０マイクログラムの対照ウシアルブミン；またはタンパク質対照として２００マイクログラム／ｍｌのウシアルブミンを含んだ。
細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２およびおよそ９２％の湿度を含む大気中で、インキュベートした。細胞を、３、２４、および４８時間インキュベートした。各時点において、その実験時間からの細胞を収集し、細胞表面のＣＬＩＰ（ＭＨＣクラスＩＩ定常ペプチド、ヒト）の発現のフローサイトメトリー分析のために、市販（Becton/Dickinson/PHarmingen）の抗ヒトＣＬＩＰ−ＦＩＴＣ（カタログ番号555981）により染色した。
収集した細胞を、１：１００希釈のＦＩＴＣ−抗ヒトＣＬＩＰまたはアイソタイプ対照を必要とする標準的な染色手順を用いて染色した。２５分間の氷上での染色の後で、細胞をＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄し、１００マイクロリットル中に再懸濁し、４００マイクロリットルのＰＢＳを含む染色チューブに加えた。試料を入手し、Coulter Excel Flow Cytometerにおいて分析した。
例８：ＭＫＮ１（ｂｉｏＣＬＩＰ）は、細胞表面のＣＬＩＰおよびＣＤ７４のレベルを変化させる。
ＭＫＮ１（ｂｉｏＣＬＩＰ）が細胞表面のＣＬＩＰおよびＣＤ７４のレベルを変化させる能力を、RajiまたはDaudi細胞を用いて決定した。
データを、Ｙ軸が、ＣＬＩＰまたはＣＤ７４に対する抗体のいずれかによる相対的なＦＩＴＣ蛍光を反映するＸ軸に対する、５０００個の生存細胞の細胞数を表わすヒストグラムにより分析した。アイソタイプ対照の染色からのヒストグラムと、特定の染色を反映するヒストグラムとの間の距離は、生存RajiまたはDaudi細胞の集団を染色する場合の、細胞表面のＣＬＩＰまたはＣＤ７４のレベルの尺度である。
本発明者らの結果は、ＭＫＮ１（ｂｉｏＣＬＩＰ）による処置は、細胞表面のＣＬＩＰおよびＣＤ７４のレベルを変化させることを示す。
材料および方法：
細胞培養条件：RajiおよびDaudi細胞株を、American Type Culture Collectionから購入し、解凍し、１０％のウシ胎児血清、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、HEPES緩衝剤、ｌ−グルタミンおよび２−ＭＥを含む標準的な補助剤を添加したRPMI 1640培地中で生育した。
プロトコル：細胞を、１２ウェルのプレートに、Daudi細胞についてはおよそ０．５×１０６／ウェル、Raji細胞については０．５×１０６／ウェルを含む、全容積３ｍｌで播種した。処置群は、対照として未処置のもの；合成された化合物の報告されたモル濃度に基づいた最終濃度５０マイクロモルのＭＫＮ３およびＭＫＮ５を含んだ。
ペプチド１：ＭＫＮ．１（１９マー）Ｎ末端にビオチン＝ビオチン化ＣＬＩＰ
ＳＧＧ ＧＳＫ ＭＲＭ ＡＴＰ ＬＬＭ ＱＡＬ Ｙ（配列番号５）
５〜１０ｍｇが＞９５％の純度で得られた（ELIM Pharmaceuticals）
細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２およびおよそ９２％の湿度を含む大気中で、インキュベートした。細胞を、２４および４８時間インキュベートした。各時点において、その実験時間からの細胞を収集し、細胞表面のＣＬＩＰ（ＭＨＣクラスＩＩ定常ペプチド、ヒト）の発現のフローサイトメトリー分析のために、市販（Becton/Dickinson/Pharmingen）の抗ヒトＣＬＩＰ−ＦＩＴＣ（カタログ番号555981）対ストレプトアビジンにより、ＣＤ７４に対しては、市販（Becton/Dickinson/Pharmingen）の抗ヒトＣＤ７４ ＦＩＴＣ抗体を用いて、染色した。
収集した細胞を、１：１００希釈のＦＩＴＣ−抗ヒトＣＬＩＰもしくはＣＤ７４抗体（ＦＩＴＣ、Pharmingen、カタログ番号554647）またはアイソタイプ対照を必要とする標準的な染色手順を用いて染色した。２５分間の氷上での染色の後で、細胞をＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄し、１００マイクロリットル中に再懸濁し、４００マイクロリットルのＰＢＳを含む染色チューブに加えた。試料を入手し、Coulter Excel Flow Cytometerにおいて分析した。
例９：２−デオキシグルコースおよびジクロロ酢酸は、Ｂ細胞表面のＣＬＩＰの除去を引き起こす。
２−デオキシグルコースおよびジクロロ酢酸がＢ細胞表面のＣＬＩＰに影響を及ぼす能力を決定した。
結果を、ヒストグラム分析において表わす（図４）。Ｙ軸は、ＣＬＩＰに対するいずれかの抗体による相対的ＦＩＴＣ蛍光を反映するＸ軸に対する、５０００個の生存細胞の細胞数を表わす。アイソタイプ対照染色からのヒストグラムと、特定の染色を反映するヒストグラムとの間の距離は、生存RajiおよびDaudi細胞の集団を示すように染色した場合の、細胞表面ＣＬＩＰのレベルの尺度である。
本発明者らの結果は、等モルの量の２−デオキシグルコースおよびジクロロ酢酸による処置は、最適には４８時間において、両方のＢ細胞株からの細胞表面ＣＬＩＰを減少する（取り除く）ことを示す。
材料および方法：
細胞培養条件：RajiおよびDaudi細胞株を、American Type Culture Collectionから購入し、解凍し、１０％のウシ胎児血清、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、HEPES緩衝剤、ｌ−グルタミンおよび２−ＭＥを含む標準的な補助剤を添加したRPMI 1640培地中で生育した。
プロトコル：細胞を、１２ウェルのプレートに、Daudi細胞についてはおよそ０．５×１０６／ウェル、Raji細胞については０．５×１０６／ウェルを含む、全容積３ｍｌで播種した。処置群は、対照として未処置のもの；合成された化合物の報告されたモル濃度に基づいた最終濃度５０マイクロモルのＭＫＮ３およびＭＫＮ５を含んだ。
細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２およびおよそ９２％の湿度を含む大気中で、インキュベートした。細胞を、４、２４、および４８時間、２デオキシグルコースおよびジクロロ酢酸の、１ｍｇ／ｍｌの各々の化合物の存在下または不在下において、インキュベートした。各時点において、その実験時間からの細胞を収集し、細胞表面のＣＬＩＰ（ＭＨＣクラスＩＩ定常ペプチド、ヒト）の発現のフローサイトメトリー分析のために、市販（Becton/Dickinson/PHarmingen）の抗ヒトＣＬＩＰ−ＦＩＴＣ（カタログ番号555981）により染色した。
収集した細胞を、１：１００希釈のＦＩＴＣ−抗ヒトＣＬＩＰ（ＦＩＴＣ、Pharmingen、カタログ番号555981）またはアイソタイプ対照を必要とする標準的な染色手順を用いて染色した。２５分間の氷上での染色の後で、細胞をＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄し、１００マイクロリットル中に再懸濁し、４００マイクロリットルのＰＢＳを含む染色チューブに加えた。試料を入手し、Coulter Excel Flow Cytometerで分析した。
例１０：競合ペプチドは細胞表面のＣＤ１ｄの発現を誘導する。
合成ペプチドがＣＬＩＰペプチドの結合と競合して細胞表面のＣＤ１ｄの発現をもたらす能力を決定した。
結果：図５に示す結果は、ヒストグラム分析で表わす。Ｙ軸は、細胞に結合したビオチン化ペプチドに高いアフィニティーで結合するストレプトアビジン−ＰＥ（eBioscience、カタログ番号12-4317）に対する相対的ＦＩＴＣ蛍光を反映するＸ軸に対する、５０００個の生存細胞の細胞数を表わす。示すとおり、アイソタイプ対照染色からのヒストグラムと、特定の染色を反映するヒストグラムとの間の距離は、細胞表面ＣＤ１ｄのレベルの尺度である。
４時間において、両方の細胞株において、ビオチン化合成ペプチドが、４時間の時点のヒトＢ細胞株、RajiおよびDaudi、に対して高いアフィニティーで結合したことの顕著な証拠が観察された。より低い結合が２４時間において観察される。細胞を、ＦＩＴＣ−抗ＣＤ１ｄで対比染色し、処置およびビオチン化ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）の結合は、両方の細胞株において、４時間において少しばかり、２４時間において僅かにより高く、細胞表面のＣＤ１ｄの発現をもたらすことを見出した。
方法：
細胞培養条件：RajiおよびDaudi細胞株を、American Type Culture Collectionから購入し、解凍し、１０％のウシ胎児血清、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、HEPES緩衝剤、ｌ−グルタミンおよび２−ＭＥを含む標準的な補助剤を添加したRPMI 1640培地中で生育した。
プロトコル：細胞を、１２ウェルのプレートに、Daudi細胞についてはおよそ１．５×１０６／ウェル、Raji細胞については３．０×１０６／ウェルを含む、全容積３ｍｌで播種した。処置群は、対照として未処置のもの、および、合成された化合物の報告されたモル濃度に基づいて最終濃度５０マイクロモルのビオチン化ＦＲＩＭＶＡＬＡＳ（配列番号２）（ＭＫＮ５としてもまた言及される）を含んだ。
細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２およびおよそ９２％の湿度を含む大気中で、インキュベートした。細胞を、４および２４時間インキュベートした。各時点において、その実験時間からの細胞を収集し、細胞表面のＣＤ１ｄの発現のフローサイトメトリー分析のために、ＰＥ抗ヒトＣＤ１ｄ（eBioscience、クローン51.5、カタログ番号12-00016-71）による染色により染色した。
収集した細胞を、１：１００希釈のＰＥ抗ヒトＣＤ１ｄを必要とする標準的な染色手順を用いて染色した。２５分間の氷上での染色の後で、細胞をＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄し、１００マイクロリットル中に再懸濁し、４００マイクロリットルのＰＢＳを含む染色チューブに加えた。試料を入手し、Coulter Excel Flow Cytometerにおいて分析した。
例１１：ＣＬＩＰ阻害剤ペプチドのＭＨＣクラスＩＩへの結合。
上記のコンピューターによるモデルを用いて同定されたペプチドのいくつかを、ＭＨＣクラスＩＩへの結合について分析した。
方法：
細胞培養条件：RajiおよびDaudi細胞株を、American Type Culture Collectionから購入し、解凍し、１０％のウシ胎児血清、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、HEPES緩衝剤、ｌ−グルタミンおよび２−ＭＥを含む標準的な補助剤を添加したRPMI 1640培地中で生育した。
プロトコル：細胞を、１２ウェルのプレートに、Daudi細胞についてはおよそ０．５×１０６／ウェル、Raji細胞については１．０×１０６／ウェルを含む、全容積３ｍｌで播種した。処置群は、対照として未処置のもの；５マイクロモルの、図の説明および各図において記載される合成ペプチドを含んだ。
細胞を、３７℃で、５％ＣＯ２およびおよそ９２％の湿度を含む大気中で、インキュベートした。細胞を、２４時間インキュベートした。その時点において、細胞を収集し、細胞表面のＣＬＩＰ（ＭＨＣクラスＩＩ定常ペプチド、ヒト）の発現のフローサイトメトリー分析のために染色し、ＭＨＣクラスＩＩ／ＨＬＡ−ＤＲに対する蛍光色素共役抗体で、市販（Becton/Dickinson/PHarmingen）の抗ヒトＣＬＩＰ−ＦＩＴＣ（カタログ番号555981）およびヒトＨＬＡ−ＤＲに対する抗体を用いることにより、対比染色した。
収集した細胞を、１：１００希釈のＦＩＴＣ−抗ヒトＣＬＩＰおよび抗ヒトＨＬＡ−ＤＲまたはそれらのそれぞれのアイソタイプ対照を必要とする標準的な染色手順を用いて染色した。２５分間の氷上での染色の後で、細胞をＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄し、９６ウェルプレートにおいて１００マイクロリットル中に再懸濁した。試料を入手し、Beckman Coulter Quantaフローサイトメーターにおいて分析した。
結果：
データを図１０に示す。１０Ａおよび１０Ｇは、未処置（１０Ａ）またはＤＭＳＯ（１０Ｇ）を含む対照である。図１０Ｂは、５ｕＭのＭＫＮ．３による処置を含む。図１０Ｃは、５ｕＭのＭＫＮ．４による処置を含む。図１０ｄは、５ｕＭのＭＫＮ．６による処置を含む。図１０Ｅは、５ｕＭのＭＫＮ．８による処置を含む。図１０Ｆは、５ｕＭのＭＫＮ．１０による処置を含む。
図１０Ａ〜１０Ｇにおけるデータは、細胞表面のＣＬＩＰ対ＨＬＡ−ＤＲの結合の競合的阻害を説明する。各図において、右上のドットプロットは、ＨＬＡ−ＤＲおよびＣＬＩＰの両方を発現する細胞を表わす。右下の象限において、図は、ＨＬＡ−ＤＲについて陽性であるがＣＬＩＰについて陰性である細胞を表わす。各図において、左下の象限は、両方の染色について陰性である細胞を表わす。各ドットプロットの左上の象限にあるのは、ＣＬＩＰについて陽性であるがＨＬＡ−ＤＲについて陰性である細胞である。全ての場合において、各象限における細胞のパーセンテージを計算することができる。各々の場合において、適切なペプチドによる処置の後で、ＨＬＡ−ＤＲを有する細胞のパーセンテージ（右下の象限）はペプチド処置に続いて増大する。
例１２：ＣＬＩＰ阻害剤ペプチドおよびＴＮＰ抽出物によるＴｒｅｇの活性化
上記のコンピューターによるモデルを用いて同定されたペプチドおよびＴＮＰ抽出物を、Ｔｒｅｇの活性化について分析した。
方法：
細胞培養。全ての腫瘍細胞を、完全ＲＰＭＩ培地（１０％ウシ胎児血清、グルタミン、ベータ−メルカプトエタノール、および抗生物質を補充されたもの）中での培養で生育した。
フローサイトメトリーおよび細胞表面染色：細胞を、採取し、計数し、１０６細胞／１００μｌで、フローサイトメトリー分析のための調製物中に再懸濁した。細胞を、細胞表面ＣＬＩＰについて、１：１００希釈の抗ヒトＣＬＩＰ（Pharmingen）を用いて染色した。細胞をまた、細胞表面ＨＬＡ−ＤＲについて、１：１００希釈の抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗体（Pharmingen）を用いて染色した。簡単に述べると、細胞を、上記の抗体のいずれかと共に、単独でまたは一緒に、３０分間氷上で暗室においてインキュベートした。これらを、５％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ中で１回洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。Beckman Coulter Quanta MPL（Coulter, Hialeah, Florida）においてデータを入手し、FlowJoソフトウェア（Tree Star Inc., California）で分析した。Quanta MPLフローサイトメーターは、単一励起波長（４８８ｎｍ）、ならびに染色された細胞を分析するために用いるＰＥ（５７５ｎｍ）およびＦＩＴＣ（５２５ｎｍ）のためのバンドフィルターを有していた。各試料の集団を、細胞のサイズ（電子容積（electronic volume）、ＥＶ）および複雑度（側方散乱（side scatter）、ＳＳ）について分類し、目的の集団をゲート（gate）し、１０，０００個の細胞を用いて評価した。フローサイトメトリーのデータを記載する各図は、少なくとも４個の複製実験のうちの１つを表わす。
細胞の計数：細胞を収集して、１ｍＬのＲＰＭＩ培地中に再懸濁した。Ａ ５０μＬのトリパンブルー（Sigma chemicals）、２％のＦＢＳを補充した４５μＬのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、および５μＬの細胞懸濁液を用いることにより、１：２０希釈の細胞懸濁液を作製した。生存細胞を、血球計数器を用いて計数し、以下の計算を用いて細胞数を決定した：細胞の平均数×希釈率×１０４。
染色のための細胞の調製：染色プロトコルのために、０．５×１０６〜１．０×１０６個の細胞を用いた；全ての染色を、９６ウェルＵ底染色プレート中で行った。細胞を、３００×ｇで５分間遠心分離して収集し、ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／２％ＦＢＳ中に染色のために再懸濁した。細胞を、ラベルした９６ウェルプレートのウェルにおいて、１００μＬのＰＢＳ／２％ＦＢＳ中に播種した。
統計学的分析、パーセント、および幾何学的平均値：
パーセント：ゲーティング（gating）は、Cell Questソフトウェアにより提供されるツールであり、特定の細胞集団の分析を可能にする。生存細胞および死亡細胞の両方の集団の周りのゲーティングにより、各集団における細胞数のパーセントを得た。ゲートが描かれた後で、死細胞のパーセント値を、死細胞の数を全細胞の数で割り、１００を掛けることにより計算した。
標準誤差：実験を３回行った場合、平均値の標準誤差を、Excelプログラム（Microsoft）を用いて決定した。これは、いくつかの図において見られるエラーバーのために得られる値を同定する。
幾何学的平均蛍光：データをCell Questソフトウェアにおいて分析する場合、プロットされた各ヒストグラムについての幾何学的平均値が得られる。染色された試料を対照（アイソタイプまたは未染色）に対してプロットした後、両方のヒストグラムのピークについて幾何学的平均蛍光値を得た。染色された対照試料を試料から引き算して、対照のものを超える染色された試料の実際の蛍光を同定した。
結果：
データを図１１に示す。試験ペプチドはＴｒｅｇ活性化を実証した。
例１３：ＴＬＲアクチベーターはＣＬＩＰ−ＭＨＣ ＨＬＡの結びつきを促進し、ＣＬＩＰ阻害剤ペプチドはＴＬＲアクチベーターにより促進されたＣＬＩＰ−ＭＨＣ ＨＬＡ結びつきを低下させる。
方法
細胞の調製：マウスを頸椎脱臼により安楽死させた。脾臓およびリンパ節を取り除いた。組織を細胞ストレイナーを通してミンチ状にし、単細胞懸濁液を得た。緩衝化塩化アンモニウムを用いて赤血球を溶解し、その後、リン酸緩衝化食塩水を添加して遠心分離し、塩化アンモニウムを洗い流した。そしてトリパンブルー除外を用いて細胞を計数し、生存細胞対死細胞の区別を決定し、組織当たりの細胞の数を決定した。
処置：脾臓およびリンパ節の細胞を、in vitroで多様な刺激（ＴＬＲアクチベーター：ＣｐＧ ＯＤＮ（Alexis）、ＬＰＳ（Sigma）、ＰｏｌｙＩ：Ｃ（BD Pharmagen）、Ｐａｍ３Ｃｙｓ（Genway）；ＩＬ−４（BD Pharmagen）、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（BD Pharmagen）、ＩＬ−４および抗ＣＤ４０抗体の両方ならびにＯｓｐＡおよびＯｓｐＣ（Genway））で処置し、細胞を示した時間にわたり培養した。細胞を、１０％のウシ胎児血清、ゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ピルビン酸ナトリウム、HEPES緩衝剤、ｌ−グルタミンおよび２−ＭＥを含む標準的な補助剤、ならびに（示してある場合は）上で列記した刺激剤を添加したRPMI 1640培地中で生育した。細胞を３７℃で５％ＣＯ２およびおよそ９２％の湿度を含む大気中でインキュベートした。細胞を、３、２４、および４８時間インキュベートした。各時点において、その実験時間からの細胞を収集し、細胞表面のＣＬＩＰ（ＭＨＣクラスＩＩ定常ペプチド／ＩＡｂ、Santa Cruz）の発現のフローサイトメトリー分析のために、市販（Becton/Dickinson/PHarmingen）の抗マウスＣＬＩＰ／ＩＡｂペプチド、抗マウスＢ２２０、抗マウスＣＤ４、抗マウスＣＤ８、および抗マウスＦｏｘＰ３（全てBecton/Dickinson/Pharmingenから市販されている）を用いることにより染色した。収集した細胞を、１：１００希釈のＦＩＴＣ−抗マウスＣＬＩＰ／ＩＡｂまたはアイソタイプ対照を必要とする標準的な染色手順を用いて染色した。２５分間の氷上での染色の後で、細胞をＰＢＳ／ＦＣＳで洗浄し、１００マイクロリットル中に再懸濁し、４００マイクロリットルのＰＢＳを含む染色チューブに加えた。試料を入手し、Coulter Excel Flow Cytometerにおいて分析した。データをFloJoソフトウェアを用いて分析した。
結果
ＣＬＩＰの存在下または不在下における、全Ｂ細胞の死および単独またはＭＫＮ３と組み合わせたＴＬＲアクチベーター（ＣｐＧ ＯＤＮ）で処置された細胞中のＣＬＩＰ陽性のＢ細胞の死の％を含む、Ｂ細胞死を評価した。結果を図１２に示す。図１２は、一方の側において全Ｂ細胞死の％を表わし（菱形はＣｐＧ ＯＤＮ単独を表わし、正方形はＣｐＧ ＯＤＮ＋ＭＫＮ３を表わす）、他方の側においてＣＬＩＰ＋Ｂ細胞死の％を表わす（三角形はＣｐＧ ＯＤＮおよびＣＬＩＰ単独を表わし、ＸはＣｐＧ ＯＤＮ＋ＭＫＮ３およびＣＬＩＰを表わす）、二重のＹ軸を有する線グラフである。データは、ＣｐＧ ＯＤＮがＢ細胞死の初期の増大を引き起こすことを明らかにし、これは７２時間後に横這いとなると考えられる。ＣｐＧ ＯＤＮ＋ＭＫＮ３のデータは、ＭＫＮ３がＢ細胞死の増大を予防することができることを示す。
脾臓対リンパ節におけるＣＬＩＰ陽性Ｂ細胞の変化もまた評価した。図１３は、一方の側において脾臓におけるＣＬＩＰ＋Ｂ細胞数の％を表わし（実線を伴う明灰色正方形はＣｐＧ ＯＤＮ単独を表わし、実線を伴う暗灰色正方形はＣｐＧ ＯＤＮ＋ＭＫＮ３を表わす）、他方の側においてリンパ節におけるＣＬＩＰ＋Ｂ細胞数の％を表わす（破線を伴う菱形はＣｐＧ ＯＤＮ単独を表わし、破線を伴う明灰色正方形はＣｐＧ ＯＤＮ＋ＭＫＮ３を表わす）、二重のＹ軸を有する線グラフである。脾臓およびリンパ節の両方において、ペプチドをＣｐＧ ＯＤＮと共に細胞へ添加することにより、より少ないＣＬＩＰ陽性Ｂ細胞がもたらされる。
ＣＬＩＰ陽性Ｂ６．１２９培養Ｂ細胞（Ｈ−２ｂハプロタイプ）およびＨ２Ｍ−／−（Ｃ３Ｈ ＨｅＪマウスからのもの）培養Ｂ細胞もまた、多数の異なるＴＬＲアクチベーターによる処置の存在下または不在下において試験した。データを図１４Ａおよび１４Ｂに示す。図中に示されるように、いくつかのＴＬＲアクチベーターは、ＣＬＩＰ＋Ｂ細胞のレベルを誘導することができた。
例１４：ＨＩＶ感染ヒトの末梢血およびリンパ節中のＣＤ２０＋、ＣＬＩＰ＋Ｂ細胞
方法：３個体の正常（ＨＩＶ陰性）および４個体のＨＩＶ陽性ヒト対象から、末梢血試料を得た。
結果：対象の特徴を、図１５における表に示す。図１５Ａは、ＣＤ２０＋ＣＬＩＰ＋Ｂ細胞の量を平均蛍光強度として表わす線グラフである。図１５Ｂおよび１５Ｃは、図１５Ａ（１２１−１）においてＳＵＢ １２１と命名された患者のリンパ節（ＬＮ）および末梢血（ＷＢ）中の、異なる型のＣＬＩＰ＋細胞のパーセンテージを表わす棒グラフである。末梢血よりもリンパ節において、より多くのＣＬＩＰ＋細胞が見出された。
例１５：ＨＬＡアレルのＣＬＩＰへの結合および置き換えへの対抗能力は、ＨＩＶ疾患の進行の速度と直接的に比例する。
方法：ＨＬＡアレルとＡＩＤＳの進行の速度との間の相関は、Borghans , J. A. M., HLA Alleles Associated with Slow Progression to AIDS; Truly Prefer to Present HIV-1 p24, 2007において記載された。さらに、Gaoらは、ＨＬＡアレル中のアミノ酸の変化の効果およびＡＩＤＳへの進行の速度を記載する（NEJM 344:12）。これらの研究から、本発明者らは、０．２未満のｐ値および３．５％より高い集団頻度を有する全てのアレルを選択した。コンピューターのエラーにより、ＨＬＡ−Ｃｗ１６の使用が妨げられた。したがって、１４個のアレルが、さらなる分析のために利用可能であった。Gauらは、２桁のアレルの名称を報告した。これらを４桁の名称へ変換するために、Borghansにおいて行われているように、各々の人種について最も一般的なアレルを用いた（リスクファクターを、以下の表に示す）。
NetMHCpan（http://www.cbs.dtu.dk/services/）（これは、そのアミノ酸配列に基づいて任意のアレルを予測することができる）を、次いで、以下に記載するように、各ペプチドの結合アフィニティーを予測するために用いた。他のプログラムもまた用いてもよい。入力した配列は：１．ヒトＣＬＩＰ、２．ヒトインバリアント鎖、３．ｆｒｉｍａｖｌａｓ（配列番号２）、およびＴＮＰ混合物の全配列であった。プログラムは、全ての可能な連続した９アミノ酸を評価し、各アレルについてのスコアを示す。より高いスコアはより強固な予測される結合を示す。データを以下の最良予測値（Best Predictors）とラベルされた表に示す。１４個の対象アレルの各々について、最良の９アミノ酸ペプチドからのスコアを、ＨＩＶ進行リスクファクターに対してプロットした。次いで、プロットを、Excelを用いて線に当てはめた（図１６）。
次に、分析を、ＨＬＡ−Ｂアレルにのみ限定した（データは示さず）。ＣＬＩＰについて、傾きは−０．１５であり、標準誤差は０．１３である。主な寄与は、Ｂ２７０５に対する強力な結合が強く予測されることである（高いスコアはより良好な結合を予測する）。古典的なＣＬＩＰの登録物（ＭＲＭＡＴＰＬＬＭ）は、この場合において最良の結合物であり、これは、インバリアント鎖中のあらゆる他の候補ペプチドよりも良好である。これをさらに調査するために、２個の特定のＣＬＩＰの登録物：ＭＲＭ．．．およびＭＡＴＰ．．．を比較した。これらの９マーを、別々に分析し、別々にプロットした（示さず）。
リスクファクターの特徴を、以下の表に示す。
Figure 2011502964
Figure 2011502964
Figure 2011502964
Figure 2011502964
最良予測値
Figure 2011502964
結果
図１６は、ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）に対するアフィニティーに基づく、より速いＡＩＤＳへの進行についてのリスクを表わすグラフである。図１６のＸ軸はリスクファクターであり、Ｙ軸は予測される結合スコアである（より高いものはより強固な結合相互作用を予測する）。正の傾きは、速い疾患の進行が強固な結合と相関することを意味する。負の傾きは、強固な結合が遅い疾患の進行と相関することを意味する。
例１６：ＴＬＲリガンドによる活性化の後の脾臓対リンパ節の細胞性およびＣＬＩＰ＋Ｂ細胞を評価するためのin vivo研究
方法
in vivoでの実験。Ｂ６．１２９マウス（Ｈ−２ｂハプロタイプ）またはＣ３Ｈ ＨｅＪマウス（Ｈ−２ｋ）のマウスに、図において示すとおり、多様なｔｏｌｌリガンド（ＣｐＧ ＯＤＮ、Ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ、ＬＰＳ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＯｓｐＡまたはＯｓｐＣ：これらの全ては、およそ５マイクログラム／マウス２５ｇまでの濃度で用いた）を腹腔内注射した。ペプチドを、マウス１個体あたり５マイクログラムの濃度で同時に注射した。脾臓およびリンパ節を、注射後の示した時間に収集し、上記のとおり細胞ストレイナーを通して処理し、上記のとおり染色した。
結果
図１７は、単独でまたはＭＫＮ３ペプチドの存在下においてin vivoで投与されたＴＬＲリガンド（ＣｐＧ ＯＤＮについてのデータを示し、他のデータは示さない）の結果を表わす線グラフのセットである。データは、in vitroのデータのように、ＴＬＲアクチベーターが、ＣＬＩＰ＋Ｂ細胞と同様、より高い脾臓およびリンパ節の細胞性をもたらし、ペプチドの存在が細胞性およびＣＬＩＰ＋Ｂ細胞を、in vivoにおいて減少させることを示す。
本明細書において記載されるデータを考慮すると、ＨＩＶがＣＤ４細胞に感染した場合、細胞はＣＬＩＰ陽性になると考えられる。ウイルス複製の相当の部分がリンパ節において起こることが知られている。
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 閾値は、「最良のスコアの天然ペプチドのパーセンテージ」として定義される。例えば、１％の閾値は、最良のスコアの天然ペプチドの１％に属する任意の所与のタンパク質配列におけるペプチドを予測する。対応する閾値よりも高いかまたは同等のスコアを有するペプチドを、結合物として予測する。
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本発明の少なくとも一態様のいくつかの側面をこのように記載したが、当業者にとって、多様な変更、改変および改善が容易に生じることが理解されるべきである。かかる変更、改変および改善は、本開示の一部であることを意図され、本発明の精神および範囲の内にあることを意図される。したがって、前述の記載および図は、単なる例である。

Claims (81)

  1. Ｘ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＸ６Ｘ７（配列番号３）を含む単離されたペプチドであって、ここで各Ｘはアミノ酸であり、ここでＲはアルギニン、Ｌはロイシンであり、ここで少なくともＸ２およびＸ３の１つはメチオニンであり、ここで前記ペプチドはＮ−ＭＲＭＡＴＰＬＬＭ−Ｃではなく、ここで前記ペプチドはＣＬＩＰ置換物である、前記ペプチド。
  2. Ｘ１がフェニルアラニンである、請求項１に記載のペプチド。
  3. Ｘ２がイソロイシンである、請求項１に記載のペプチド。
  4. Ｘ３がメチオニンである、請求項１に記載のペプチド。
  5. Ｘ４がアラニンである、請求項１に記載のペプチド。
  6. Ｘ５がバリンである、請求項１に記載のペプチド。
  7. Ｘ６がアラニンである、請求項１に記載のペプチド。
  8. Ｘ７がセリンである、請求項１に記載のペプチド。
  9. Ｎおよび／またはＣ末端において１〜５個のアミノ酸をさらに含む、請求項１に記載のペプチド。
  10. Ｘ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＸ６Ｘ７（配列番号３）のＣ末端において１〜５個のアミノ酸を有する、請求項９に記載のペプチド。
  11. Ｘ１ＲＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＬＸ６Ｘ７（配列番号３）のＮ末端において１〜５個のアミノ酸を有する、請求項９に記載のペプチド。
  12. ＦＲＩＭＸ４ＶＬＸ６Ｓ（配列番号６）を含み、ここでＸ４およびＸ６が任意のアミノ酸である、請求項１に記載のペプチド。
  13. Ｘ４およびＸ６がアラニンである、請求項１に記載のペプチド。
  14. ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）を含む、請求項１に記載のペプチド。
  15. 本質的にＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）からなる、請求項１に記載のペプチド。
  16. ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）からなる、請求項１に記載のペプチド。
  17. Ｎ−ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ−Ｃ（配列番号７）を含む、請求項１に記載のペプチド。
  18. ９〜２０個のアミノ酸を有する、請求項１に記載のペプチド。
  19. ９〜２０個のアミノ酸を有する、請求項１４に記載のペプチド。
  20. 環式である、請求項１に記載のペプチド。
  21. 非環式である、請求項１に記載のペプチド。
  22. ＰＥＧ化されている、請求項１に記載のペプチド。
  23. ＦＲＩＭＡＶＬＡＳ（配列番号２）を含む、単離されたペプチド。
  24. 請求項１〜２３のいずれか一項に記載のペプチドおよびキャリアを含む組成物。
  25. キャリアがリポソームである、請求項２４に記載の組成物。
  26. リポソームがステルスリポソームである、請求項２５に記載の組成物。
  27. キャリアが粒子である、請求項２４に記載の組成物。
  28. 粒子がナノ粒子である、請求項２７に記載の組成物。
  29. キャリアが低密度粒子である粒子である、請求項２７に記載の組成物。
  30. キャリアが経粘膜吸収促進剤である、請求項２４に記載の組成物。
  31. ウイルス感染を処置するための方法であって、ウイルスに感染しているかまたはウイルス感染の危険性がある対象に、ＣＬＩＰ阻害剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を投与することを含む、前記方法。
  32. ＣＬＩＰ阻害剤がＭＨＣクラスＩＩのＣＬＩＰ阻害剤である、請求項３１に記載の方法。
  33. 対象がBorrelia burgdorferiに感染している、請求項３１または３２に記載の方法。
  34. 対象が肝炎ウイルスに感染している、請求項３１または３２に記載の方法。
  35. 対象がヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に感染している、請求項３１または３２に記載の方法。
  36. 対象がヒト免役不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染している、請求項３１または３２に記載の方法。
  37. 寄生虫感染を処置するための方法であって、寄生虫に感染しているかまたは寄生虫感染の危険性がある対象に、ＣＬＩＰ阻害剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を投与することを含む、前記方法。
  38. ＣＬＩＰ阻害剤がＭＨＣクラスＩＩのＣＬＩＰ阻害剤である、請求項３７に記載の方法。
  39. 対象がリーシュマニアに感染している、請求項３７または３８に記載の方法。
  40. 対象がマラリアに感染している、請求項３７または３８に記載の方法。
  41. 細菌感染を処置するための方法であって、細菌に感染しているかまたは細菌感染の危険性がある対象に、ＣＬＩＰ阻害剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を投与することを含む、前記方法。
  42. ＣＬＩＰ阻害剤がＭＨＣクラスＩのＣＬＩＰ阻害剤である、請求項４１に記載の方法。
  43. 癌を処置するための方法であって、癌を有する対象に、ＣＬＩＰ阻害剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を投与することを含む、前記方法。
  44. ＣＬＩＰ阻害剤がＭＨＣクラスＩのＣＬＩＰ阻害剤である、請求項４３に記載の方法。
  45. 癌抗原を投与することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
  46. 投与が週２回である、請求項４３に記載の方法。
  47. 週２回の投与が連続した日におけるものである、請求項４６に記載の方法。
  48. 投与が、経口、非経口、皮下、静脈内、鼻内、肺、筋肉内および粘膜投与の少なくとも１つである、請求項４７に記載の方法。
  49. 自己免疫性疾患を処置するための方法であって、自己免疫性疾患を有する対象に、ＣＬＩＰ阻害剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を投与することを含む、前記方法。
  50. ＣＬＩＰ阻害剤がＭＨＣクラスＩＩのＣＬＩＰ阻害剤である、請求項４９に記載の方法。
  51. 自己免疫疾患が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、関節リウマチ、グレーブス病、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性筋炎、円板状エリテマトーデス、クローン病、シェーグレン症候群、ライター症候群、リウマチ性関節炎、重症筋無力症、川崎病、セリアック病、グッドパスチャー症候群、または再生不良性貧血である、請求項４９または５０に記載の方法。
  52. 細胞または組織移植片を有する対象を処置するための方法であって、細胞または組織移植片を有する対象に、ＣＬＩＰ阻害剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を投与することを含む、前記方法。
  53. ＣＬＩＰ阻害剤がＭＨＣクラスＩＩのＣＬＩＰ阻害剤である、請求項５２に記載の方法。
  54. 移植組織または細胞が、心臓、肺、腎臓、皮膚、角膜、肝臓、神経型の組織または細胞、造血または胚性幹細胞を含む幹細胞である、請求項５３に記載の方法。
  55. ＣＬＩＰが請求項１〜２３のいずれか一項に記載のものである、請求項５３に記載の方法。
  56. アレルギー性疾患を処置するための方法であって、アレルギー性疾患を有する対象に、ＣＬＩＰ阻害剤および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物を投与することを含む、前記方法。
  57. ＣＬＩＰ阻害剤がＭＨＣクラスＩＩのＣＬＩＰ阻害剤である、請求項５６に記載の方法。
  58. アレルギー性疾患が喘息である、請求項５６または５７に記載の方法。
  59. ＨＩＶに感染した対象を処置するための方法であって：
    対象に、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のペプチドを、前記対象のＣＬＩＰ分子発現細胞においてＣＬＩＰをはずして置換するために有効な量で投与すること
    を含む、前記方法。
  60. 細胞の表面からＣＬＩＰをはずして置換するための方法であって、細胞の表面からＣＬＩＰをはずして置換するべき対象に、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のペプチドを投与することを含む、前記方法。
  61. ＣＬＩＰ阻害剤による処置に対して感受性である対象を同定するための方法であって、対象のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルを決定すること、およびＣＬＩＰ阻害剤が前記ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルからＣＬＩＰをはずして置換するために有効であるか否かを決定することを含み、ここで、前記ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルが前記ＣＬＩＰ阻害剤と結びつく場合、前記対象は前記ＣＬＩＰ阻害剤による処置に対して感受性である、前記方法。
  62. 対象をＣＬＩＰ阻害剤で処置する方法であって、対象のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルを決定すること、および前記対象にＣＬＩＰ阻害剤を細胞の表面からＣＬＩＰをはずして置換するための有効量で投与することを含む、前記方法。
  63. ＣＬＩＰ阻害剤を同定するための方法であって、予測されるペプチド結合スコアを作成するために、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルのアミノ酸予測マトリックスを、ペプチドへの結合について分析すること、前記予測されるペプチド結合スコアを予測されるＣＬＩＰ結合スコアと比較すること、を含み、ここで、前記予測されるペプチド結合スコアが予測されるＣＬＩＰ結合スコアより高いかまたは等価である場合、ペプチドがＣＬＩＰ阻害剤である、前記方法。
  64. 方法がＭＨＣ特異的ＣＬＩＰ阻害剤を同定するための方法であり、単一のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲについて単一のアミノ酸予測マトリックスを用いる、請求項６３に記載の方法。
  65. 方法が複数のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲについての予測マトリックスのセットについて行われ、平均予測ペプチドスコアが作成される、請求項６３に記載の方法。
  66. 対象特異的ＣＬＩＰ阻害剤を同定するための方法であって、対象特異的ＣＬＩＰ阻害剤を同定するために、対象のＭＨＣクラスＩＩアレルを決定すること、および前記ＭＨＣクラスＩＩアレルに基づいてＣＬＩＰ阻害剤であるペプチドを決定することを含む、前記方法。
  67. ペプチドが、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩアレルとの所定の関係に基づいて決定される、請求項６６に記載の方法。
  68. ペプチドが、予測されるペプチド結合スコアを作成するためにＭＨＣクラスＩＩアレルの予測マトリックスをペプチドへの結合について分析すること、前記予測されるペプチド結合スコアを予測されるＣＬＩＰ結合スコアと比較すること、により決定され、ここで、前記予測されるペプチド結合スコアが前記予測されるＣＬＩＰ結合スコアよりも高いかまたは等価である場合、前記ペプチドは対象特異的ＣＬＩＰ阻害剤である、請求項６６に記載の方法。
  69. 疾患特異的ＣＬＩＰ阻害剤を同定するための方法であって、疾患特異的ＣＬＩＰ阻害剤を同定するために、疾患について優性のＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルを決定すること、および前記ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルに基づいてＣＬＩＰ阻害剤であるペプチドを決定することを含む、前記方法。
  70. ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルに基づいてＣＬＩＰ阻害剤であるペプチドを決定することが、予測されるペプチド結合スコアを作成するために、ＭＨＣクラスＩＩ ＨＬＡ−ＤＲアレルのアミノ酸予測マトリックスをペプチドへの結合について分析すること、および、前記ペプチド中の各々の位置についての最高スコアに基づいてペプチドを選択することにより達成される、請求項６９に記載の方法。
  71. 選択されたペプチドについての予測されるペプチド結合スコアを予測されるＣＬＩＰ結合スコアと比較することをさらに含み、ここで、前記予測されるペプチド結合スコアが前記予測されるＣＬＩＰ結合スコアよりも高いかまたは等価である場合、前記ペプチドはＣＬＩＰ阻害剤である、請求項６９に記載の方法。
  72. コンピューターにより実行される、標的タンパク質結合ペプチドを同定するための方法であって：
    類似の結合部位を有する少なくとも２つの標的タンパク質について、結合部位についてのデータポイントのアミノ酸予測マトリックスを準備すること、ここで、前記予測マトリックスは、アミノ酸を表わす第１軸および結合部位の位置番号を表わす第２軸を有し、ここで各データポイントは、その結合部位の位置番号でのアミノ酸についてのスコアを表わす、
    前記少なくとも２つの標的タンパク質についての前記アミノ酸予測マトリックス中の各データポイントについての平均スコアを準備すること、ならびに
    結合ペプチドの各々の部位についてゼロまたはそれより大きなスコアを有するアミノ酸を選択することにより、各データポイントについての平均スコアに基づいて結合ペプチドを決定すること
    を含む、前記方法。
  73. 結合ペプチドが、最高平均スコアに基づいて決定される、請求項７２に記載のコンピューターにより実行される方法。
  74. アミノ酸予測マトリックスが、類似の結合部位を有する全ての標的タンパク質について準備される、請求項７２に記載のコンピューターにより実行される方法。
  75. 少なくとも２つの標的タンパク質が、遺伝子のアレルに対応する、請求項７２に記載のコンピューターにより実行される方法。
  76. 少なくとも２つの標的タンパク質が、ＭＨＣクラスＩＩに対応する、請求項７２に記載のコンピューターにより実行される方法。
  77. 少なくとも２つの標的タンパク質が、ＭＨＣクラスＩに対応する、請求項７２に記載のコンピューターにより実行される方法。
  78. 請求項７６に記載のコンピューターにより実行される方法であって、結合ペプチドについての予測されるペプチド結合スコアを作成すること、および前記予測されるペプチド結合スコアを予測されるＣＬＩＰ結合スコアと比較することをさらに含み、ここで、前記予測されるペプチド結合スコアが前記予測されるＣＬＩＰ結合スコアよりも高いかまたは等価である場合、前記ペプチドはＣＬＩＰ阻害剤である、前記方法。
  79. コンピューターにより実行される、標的タンパク質結合ペプチドを同定するための方法であって：
    類似の結合部位を有する少なくとも２つの標的タンパク質についてのアミノ酸予測マトリックスのセットにおける各データポイントについての平均スコアをコンピューター計算すること、ここで、前記予測マトリックスは、アミノ酸を表わす第１軸および結合部位の位置番号を表わす第２軸を有し、ここで、各データポイントは、その結合部位の位置番号におけるアミノ酸についてのスコアを表わす、ならびに
    結合ペプチドの各部位についてゼロまたはそれより大きなスコアを有するアミノ酸を選択することにより、各データポイントについての平均スコアに基づいて結合ペプチドを決定すること
    を含む、前記方法。
  80. 各データポイントについての平均スコアの結果を表示すること、それにより、少なくとも１つの結合ペプチドのアミノ酸配列を出力することをさらに含む、請求項７９に記載のコンピューターにより実行される方法。
  81. １または２以上のプロセッサにおいて実行可能な指示をコードするコンピューター可読媒体であって、前記指示は、実行される場合、標的タンパク質結合ペプチドを自動的に同定する方法を実施し、前記方法は、
    類似の結合部位を有する少なくとも２つの標的タンパク質についてのアミノ酸予測マトリックスのセットにおける各データポイントについての平均スコアを計算すること、ここで、前記予測マトリックスは、アミノ酸を表わす第１軸および結合部位の位置番号を表わす第２軸を有し、ここで、各データポイントは、その結合部位の位置番号におけるアミノ酸のスコアを表わす、ならびに
    結合ペプチドの各々の部位についてゼロまたはそれより大きなスコアを有するアミノ酸を選択することにより、各データポイントについての平均スコアに基づいて結合ペプチドを決定すること
    の動作を含む、前記媒体。
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