CN1458165A - 一种多肽类物质及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽类物质(IV)的结构、用途和制备方法，这类多肽物质在临床上用于检测、诊断病毒性疾病。特别是艾滋病等一些由病毒引起的疾病，也可以用以用做制备药物制剂的原料，多肽类物质(IV)可以用人工合成的方法制备得到，也可以用基因重组的方法制备得到。
Description
技术领域
本发明涉及一种医药中间体化合物，特别是一种多肽类物质(IV)的化学结构及其制备方法和用途。
背景技术
多肽是一类由各种单体氨基酸，按不同的顺序排列而组成的一种链状的蛋白质类化合物。此类化合物往往具有很强的生理活性和功能的特异性。因此，在医药领域里，此类化合物常被用来作为类激素、活性酶和疫苗等应用于临床，用于检测、诊断某些疾病。或者作为原料，被用来制成某些药物制剂，应用于临床。因此，目前人们对多肽物质引起了极大的关注，中国专利也公开了许多人工合成的多肽物质及其在检测、诊断疾病中的应用。
技术内容
本发明所公布的多肽类物质(IV)，是作为一种活性物质，用于检测、诊断一些病毒性疾病，特别是艾滋病等一些由病毒引起的病症。也可以作为原料，用来生产一些药物制剂，在临床上用来检测、诊断一些由病毒引起的疾病，特别是艾滋病病毒引起的疾病。
一种多肽类物质(IV)，其特征是由多种氨基酸聚合组成，其氨基酸的排列序列为：
REPRGSDIAGTTSTLQEQI*WMTGNPP**PVG***IYKK
其中：*为氨基酸A(丙氨酸)或氨基酸N(天冬酰氨)
**为氨基酸V(缬氨酸)或氨基酸I(异亮氨酸)
***为氨基酸D(天冬氨酸)或氨基酸E(谷氨酸)多肽类物质(IV)的制备方法(一)化学合成法：
在自然界中每一种多肽或蛋白质都是由游离的氨基酸通过多肽键的形式聚合而成。在蛋白质的翻译过程中，多肽链的延伸总是由氨基端(N-端)向羧基端(C-端)进行。在化学合成开始时，往往是先将羧基端的第一个氨基酸固定到活化的树脂上，然后经过氨基基团的去保护，再将羧基端的第二个氨基酸加入到反应器中，二个氨基酸经过相互反应后即可形成肽键。然后依照多肽的氨基酸排列序列依次加入第三个、第四个氨基酸等等，直到最后一个氨基酸结合到肽链上为止。
在多肽类物质(IV)的化学合成中，每个氨基酸的氨基可以由以下化学基团加以保护：
①苄酯基(Carbobenzoxyl)
②叔-丁基羧基(t-Butyloxycarbonyl)
③甲苯磺酰基(Tosyl)
④9-亚芴基甲酯基(Fmoc：9-Fluorenylmethoxycarbonyl)多肽类物质(IV)的化学合成步骤，具体操作如下：
1、合成：先用氯乙醚将树脂活化，然后在树脂中加入第一个氨基酸(氨基已被保护)，从而固定到树脂上。经过二氯甲烷洗涤后，氨基的保护基团可以由六氢吡啶脱保护。与此同时，将第二个氨基酸经过活化后，加入到结合有第一个氨基酸的树脂中，二个氨基酸反应后即形成肽键。然后按照多肽的氨基酸排序，依次加入相应的氨基酸，重复上述的洗涤，氨基去保护，氨基酸的活化等步骤，从而使多肽链不断延长。直到最后第一个氨基酸结合到肽链上为止。
2、分离：合成后的多肽仍然与树脂结合在一起，因此分离的过程就是利用分离液将多肽类物质(IV)从树脂上游离下来。分离液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及二氟乙酸其中的一种或几种的混合物，取适量的分离液浸泡上述结合有多肽类物质(IV)的树脂，在室温下搅拌，然后经过过滤便可得到多肽类物质(IV)。游离的多肽类物质(IV)经过沉淀后，即可分离出来。
3、纯化：将分离出来的多肽类物质(IV)溶解在水或适当浓度的碱溶液中(碱可以选用：碳酸氢铵、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸钠)，然后用常规的色谱方法，即可将完整的多肽类物质(IV)进行纯化。
4、鉴定：纯化后的多肽类物质(IV)，可以通过质谱分析重新核实所合成的多肽类物质(IV)的氨基酸序列是否正确。(二)基因重组法：
将多肽类物质(IV)的基因序列利用化学合成法合成之后，克隆到预先被内切酶(BamHI和EcoRI)处理过的PGEX-2载体中。重组的质粒再转化到BL21受体菌中，然后在培养基中大量繁殖、诱导。最后将细菌离心收集，再依靠层析柱将多肽类物质(IV)与GST(谷胱甘肽-S-转移酶)的融合蛋白纯化出来。
多肽类物质(IV)可以通过凝血因子蛋白酶从GST融合蛋白上切割下来。最后再浓缩即可制得多肽类物质(IV)的纯品。
具体实施方式：多肽制备实施例一：多肽的氨基酸序列为：REPRGSDIAGTTSTLQEQIAWMTGNPPVPVGDIYKK
1、合成：首先将树脂用氯乙醚活化(用量50-100毫升/克)，然后将羧基端的第一个氨基酸的氨基用氨基保护基团(9-亚芴基甲酯基)保护起来后(用量20-100克/克)，再加入到树脂中，从而使其固定到树脂上。经过二氯甲烷洗涤后，氨基的保护基团可以用六氢吡啶(用量10-80％，最好20-40％)脱保护。与此同时，将第二个氨基酸的羧基经过HBTU[2-(1氢-苯并三唑基)-1，1，3，3-四甲基糖醛-六氟合磷酸酯{[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1，1，3，3-tetramethyluronium hexafluorophosphate]}活化和二异丙基乙胺中和后，加入到结合有第一个氨基酸的树脂中，二个氨基酸反应后即可形成肽键。然后按照多肽类物质(IV)的氨基酸排序，依次加入相应的氨基酸，重复上述的洗涤，氨基去保护，氨基酸羧基的活化等步骤，从而使多肽链不断延长。直到最后一个氨基酸结合到肽链上为止。
2、分离：合成后的多肽仍然与树脂结合在一起，因此分离的过程就是利用分离液将多肽类物质(IV)从树脂上游离下来。分离液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一种或几种的混合物，取10-80毫升的分离液浸泡上述结合有多肽类物质(IV)的树脂，在室温下搅拌1-5小时，然后经过过滤便可得到多肽类物质(IV)混合液。游离的多肽类物质(IV)经过沉淀后，即可分离出来。
3、纯化：将分离出来的多肽类物质(IV)溶解在水或10-40％的碱溶液中(碱可以选用：碳酸氢铵、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸钠)，然后用常规的液相色谱法，即可将完整的多肽类物质(IV)进行纯化。
4、鉴定：纯化后的多肽类物质(IV)，可以通过紫外分光光度法测得其浓度并可通过质谱分析重新核实所合成的多肽类物质(IV)的氨基酸序列是否正确。多肽制备实施例二：多肽的氨基酸序列为：REPRGSDIAGTTSTLQEQIAWMTGNPPVPVGEIYKK
根据上述氨基酸的序列参照下列方法制备。
1、合成：首先将树脂用氯乙醚活化(用量50-100毫升/克，并且用量可以变化±5％)，然后将羧基端的第一个氨基酸的氨基用氨基保护基团(苄酯基)保护起来后(用量10-80克/克)，再加入到树脂中，从而使其固定到树脂上。经过二氯甲烷洗涤后，氨基的保护基团可以用六氢吡啶(用量10-80％，最好20-40％)脱保护。与此同时，将第二个氨基酸的羧基经过HBTU活化和二异丙基乙胺中和后，加入到结合有第一个氨基酸的树脂中，二个氨基酸反应后即可形成肽键。然后按照多肽类物质(IV)的氨基酸排序，依次加入相应的氨基酸，重复上述的洗涤，氨基去保护，氨基酸羧基的活化等步骤，从而使多肽链不断延长。直到最后一个氨基酸结合到肽链上为止。
2、分离：合成后的多肽仍然与树脂结合在一起，因此分离的过程就是利用分离液将多肽类物质(IV)从树脂上游离下来。分离液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一种或几种的混合物，取10-80毫升的分离液浸泡上述结合有多肽类物质(IV)的树脂，在室温下搅拌1-5小时，然后经过过滤便可得到多肽类物质(IV)混合液。游离的多肽类物质(IV)经过沉淀后，即可分离出来。
3、纯化：将分离出来的多肽类物质(IV)溶解在水或10-40％的碱溶液中(碱可以选用：碳酸氢铵、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸钠)，然后用常规的液相色谱法，即可将完整的多肽类物质(IV)进行纯化。
4、鉴定：纯化后的多肽类物质(IV)，可以通过紫外分光光度法测得其浓度并可通过质谱分析重新核实所合成的多肽类物质(IV)的氨基酸序列是否正确。多肽制备实施例三：多肽的氨基酸序列为：
REPRGSDIAGTTSTLQEQIAWMTGNPPIPVGEIYKK
根据上述氨基酸的序列按下列方法制备。
1、合成：首先将树脂用氯乙醚活化(用量50-100毫升/克，并且用量可以变化±5％)，然后将羧基端的第一个氨基酸的氨基用氨基保护基团(叔-丁基羰基)保护起来后(用量10-100克/克)，再加入到树脂中，从而使其固定到树脂上。经过二氯甲烷洗涤后，氨基的保护基团可以用六氢吡啶(用量10-80％，最好20-40％)脱保护。与此同时，将第一个氨基酸的羧基经过HBTU活化和二异丙基乙胺中和后，加入到结合有第一个氨基酸的树脂中，二个氨基酸反应后即可形成肽键。然后按照多肽类物质(IV)的氨基酸排序，依次加入相应的氨基酸，重复上述的洗涤，氨基去保护，氨基酸羧基的活化等步骤，从而使多肽链不断延长。直到最后一个氨基酸结合到肽链上为止。
2、分离：合成后的多肽仍然与树脂结合在一起，因此分离的过程就是利用分离液将多肽类物质(IV)从树脂上游离下来。分离液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一种或几种的混合物，取10-80毫升的分离液浸泡上述结合有多肽类物质(IV)的树脂，在室温下搅拌1-5小时，然后经过过滤便可得到多肽类物质(IV)混合液。游离的多肽类物质(IV)经过沉淀后，即可分离出来。
3、纯化：将分离出来的多肽类物质(IV)溶解在水或10-40％的碱溶液中(碱可以选用：碳酸氢铵、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸钠)，然后用常规的液相色谱法，即可将完整的多肽类物质(IV)进行纯化。
4、鉴定：纯化后的多肽类物质(IV)，可以通过紫外分光光度法测得其浓度并可通过质谱分析重新核实所合成的多肽类物质(IV)的氨基酸序列是否正确。多肽制备实施例四：多肽的氨基酸序列为：
REPRGSDIAGTTSTLQEQIAWMTGNPPIPVGDIYKK
根据上述氨基酸的序列按下列方法制备。
1、合成：首先将树脂用氯乙醚活化(用量50-100毫升/克，并且用量可以变化±5％)，然后将羧基端的第一个氨基酸的氨基用氨基保护基团(甲苯磺酰基)保护起来后(用量20-50克/克)，再加入到树脂中，从而使其固定到树脂上。经过二氯甲烷洗涤后，氨基的保护基团可以用六氢吡啶(用量10-80％，最好20-40％)脱保护。与此同时，将第二个氨基酸的羧基经过HBTU活化和二异丙基乙胺中和后，加入到结合有第一个氨基酸的树脂中，二个氨基酸反应后即可形成肽键。然后按照多肽类物质(IV)的氨基酸排序，依次加入相应的氨基酸，重复上述的洗涤，氨基去保护，氨基酸羧基的活化等步骤，从而使多肽链不断延长。直到最后一个氨基酸结合到肽链上为止。
2、分离：合成后的多肽仍然与树脂结合在一起，因此分离的过程就是利用分离液将多肽类物质(IV)从树脂上游离下来。分离液可以采用苯酚，苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一种或几种的混合物，取10-80毫升的分离液浸泡上述结合有多肽类物质(IV)的树脂，在室温下搅拌1-5小时，然后经过过滤便可得到多肽类物质(IV)混合液。游离的多肽类物质(IV)经过沉淀后，即可分离出来。
3、纯化：将分离出来的多肽类物质(IV)溶解在水或10-40％的碱溶液中(碱可以选用：碳酸氢铵、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸钠)，然后用常规的液相色谱法，即可将完整的多肽类物质(IV)进行纯化。
4、鉴定：纯化后的多肽类物质(IV)，可以通过紫外分光光度法测得其浓度并可通过质谱分析重新核实所合成的多肽类物质(IV)的氨基酸序列是否正确。多肽制备实施例五：多肽的氨基酸序列为：
REPRGSDLAGTTSTLQEQINWMTGNPPVPVGDIYKK
根据上述氨基酸的序列按照“多肽制备实施例一”的方法制备得到。多肽制备实施例六：多肽的氨基酸序列为：
REPRGSDIAGTTSTLQEQINWMTGNPPVPVGEIYKK
根据上述氨基酸的序列，按照“多肽制备实施例二”的方法制备得到。多肽制备实施例七：多肽的氨基酸序列为：
REPRGSDIAGTTSTLQEQINWMTGNPPIPVGDIYKK
根据上述氨基酸的序列，按照“多肽制备实施例一”的方法制备得到。多肽制备实施例八：多肽的氨基酸序列为：
REPRGSDIAGTTSTLQEQINWMTGNPPIPVGEIYKK
根据上述氨基酸的序列，按照“多肽制备实施例三”的方法制备得到。多肽制备实施例九：
分别按照“多肽制备实施例一”至“多肽制备实施例八”的多肽氨基酸的排列序列，利用化学合成多肽类物质(IV)的基因序列之后，克隆到预先被内切酶处理过的PGEX-2载体中。重组的质粒再转化到受体菌中，然后在培养基中大量繁殖、诱导。最后将细菌离心收集，再依靠层析柱将多肽类物质(IV)和与其结合的蛋白质纯化出来。
多肽类物质(IV)可以通过蛋白酶从与其融合的GST(谷胱甘肽-S-转移酶)的融合蛋白上切割下来。最后再浓缩即可制得多肽类物质(IV)的纯品。
上述制备的多肽类物质(IV)在临床上可以用于检测、诊断病毒性疾病，特别是艾滋病等一些由病毒引起的疾病，也可以用作制备药物制剂的原料。
Claims (7)
1、一种多肽类物质(IV)，其特征是由多种氨基酸组成，其氨基酸的排列序列为：REPRGSDIAGTTSTLQEQI*WMTGNPP**PVG***IYKK其中：*为氨基酸A(丙氨酸)或氨基酸N(天冬酰氨)
**为氨基酸V(缬氨酸)或氨基酸I(异亮氨酸)
***为氨基酸D(天冬氨酸)或氨基酸E(谷氨酸)
2、权利要求1所述的多肽类物质(IV)，其特征是用化学方法制备得到，合成的步骤为：
(1)合成：先用氯乙醚将树脂活化，然后在树脂中加入第一个氨基酸(氨基已被保护)，从而固定到树脂上。经过二氯甲烷洗涤后，氨基的保护基团可以由六氢吡啶脱保护。与此同时，第二个氨基酸经过活化后，加入到结合有第一个氨基酸的树脂中，二个氨基酸反应后即形成肽键。然后按照多肽的氨基酸排序，依次加入相应的氨基酸，重复上述的洗涤，氨基去保护，氨基酸的活化等步骤，从而使多肽链不断延长。直到最后第一个氨基酸结合到肽链上为止。
(2)分离：合成后的多肽仍然与树脂结合在一起，因此分离的过程就是利用分离液将多肽类物质(IV)从树脂上游离下来。分离液可以采用苯酚、苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一种或几种的混合物，取适量的分离液浸泡上述结合有多肽类物质(IV)的树脂，在室温下搅拌，然后经过滤便可得到多肽类物质(IV)。游离的多肽类物质(IV)经过沉淀后，即可分离出来。
(3)纯化：将分离出来的多肽类物质(IV)溶解在水或适当浓度的碱溶液中(碱可以选用：碳酸氢铵、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸钠)，然后用常规的色谱方法，即可将完整的多肽类物质(IV)进行纯化。
(4)鉴定：纯化后的多肽类物质(IV)，可以通过质谱分析重新核实所合成的多肽类物质(IV)的氨基酸序列是否正确。
3、根据权利要求2所述的多肽类物质(IV)的化学合成方法，其特征是氨基酸的氨基可以由以下化学性基团加以保护①苄酯基(Carbobenzoxyl)②叔-丁基羰基(t-Butyloxycarbonyl)③甲苯磺酰基(Tosyl)④9-亚芴基甲酯基(Fmoc：9-Fluorenylmethoxycarbonyl)
4、根据权利要求2所述的多肽类物质(IV)的化学合成方法，其特征是在分离过程中使用的分离液可以采用苯酚、苯硫基甲烷以及三氟乙酸其中的一种或几种的混合物。
5、根据权利要求2所述的多肽类物质(IV)的化学合成方法，其特征是纯化过程的的碱溶液可以选用；碳酸氢铵、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸钠的溶液。
6、根据权利要求1所述的多肽类物质(IV)，其特征是用基因重组的方法制备得到，其制备的步骤为：
(1)将多肽类物质(IV)的基因序列利用化学合成法合成之后，克隆到预先被内切酶(BamHI和EcoRI)处理过的PGEX-2载体中。重组的质粒再转化到BL21受体菌中，然后在培养基中大量繁殖、诱导。最后将细菌离心收集，再依靠层析柱将多肽类物质(IV)与GST(谷胱甘肽-S-转移酶)的融合蛋白纯化出来。
(2)多肽类物质(IV)可以通过凝血因子蛋白酶从GST融合蛋白上切割下来。最后再浓缩即可得到多肽类物质(IV)的纯品。
7、一种权利要求1所述的多肽类物质(IV)，其用途是在临床的检测、诊断艾滋病病毒方面的应用，或者作为药物制剂的生产原料。
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| CN 02115480 CN1458165A (zh) | 2002-01-26 | 2002-01-26 | 一种多肽类物质及其制备方法和用途 |
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| CN1458165A true CN1458165A (zh) | 2003-11-26 |
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2002
- 2002-01-26 CN CN 02115480 patent/CN1458165A/zh active Pending
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