CN103848910A - 一种萨摩鲁泰的固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽合成技术领域，特别涉及一种萨摩鲁泰的固相合成方法。在本发明提供的固相合成方法中，将Gly和树脂偶联得到Gly-树脂，经第一逐步偶联氨基酸或氨基酸衍生物，得到序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂，脱除Lys的侧链保护基团，经第二逐步偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸，获得第二肽树脂，经裂解、纯化，即得。本发明提供的固相合成方法简化了操作步骤，合成周期短，成本低，减少了废液的产生，副产物少，产品收率高，利于萨摩鲁泰的大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成技术领域，特别涉及一种萨摩鲁泰的固相合成方法。
背景技术
糖尿病（diabetes）是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点，典型病例可出现多尿、多饮、多食、消瘦等表现，即“三多一少”症状，一旦控制不好会引发并发症，导致肾、眼、足等部位的衰竭病变，且无法治愈。糖尿病分为妊娠期糖尿病、特异性糖尿病、Ⅰ型糖尿病和Ⅱ型糖尿病。据国际糖尿病联盟数据显示，2007年全球约有2.46亿糖尿病患者，预计2025年将达到3.8亿，即成年人口的7.1％，其中Ⅱ型糖尿病患者约占90%。
Ⅱ型糖尿病，又名非胰岛素依赖型糖尿病（NIDDM），特点是人体自身能够产生胰岛素，但细胞无法对其作出反应，使胰岛素的效果大打折扣。Ⅱ型糖尿病主要通过口服或皮下注射降糖药治疗。针对Ⅱ型糖尿病的降糖药种类很多，胰高血糖样肽-1（GLP-1）的受体激动素是近年来研究的热点。其中，萨摩鲁泰（semaglutide）是GLP-1的受体激动素之一，是由丹麦诺和诺德公司研制的，作为一种每周服用一次的皮下注射制剂，能起到良好的降低血糖的作用，同时还具有减肥的功效，其化学表述为Nε26-{18-[N-(17-carboxyheptadecanoyl)-L-γ-glutamyl]-10-oxo-3,6,12,15-tetraoxa-9,18-diazaoctadecanoyl}-[8-(2-amino-2-propanoic acid),34-L-arginine]human glucagon-likepeptide 1(7-37)，分子式见式（Ⅰ）所示。
式Ⅰ
目前，多肽的合成主要采用固相合成法，固相合成的优点主要表现在最初的反应物和产物都是连接在固相载体上，因此可以在一个反应容器中进行所有的反应，便于自动化操作，加入过量的反应物可以获得高产率的产物，同时产物很容易分离。
然而，还没有萨摩鲁泰固相合成方法的相关报道，并且萨摩鲁泰在侧链合成过程中需要逐步偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸，由于侧链较长，致使空间位阻效应强，偶联反应难于进行，容易导致产品收率低的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种萨摩鲁泰的固相合成方法。该方法，简化了操作步骤，合成周期短，成本低，减少了废液的产生，副产物少，产品收率高，利于萨摩鲁泰的大规模生产。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种萨摩鲁泰的固相合成方法，包括如下步骤：
步骤A：将Gly和树脂偶联得到Gly-树脂；
步骤B：Gly-树脂经第一逐步偶联氨基酸或氨基酸衍生物，得到序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂；
步骤C：脱除序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂中Lys的侧链保护基团，经第二逐步偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸，获得第二肽树脂；
步骤D：取第二肽树脂经裂解、纯化，即得。
多肽固相合成法是利用树脂作为固相载体合成多肽的方法，过程为：首先将一个氨基被封闭基团保护的氨基酸共价连接在固相载体上，脱掉第一个氨基酸的氨基保护基，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。然后氨基被封闭的第二个氨基酸的羧基经过活化后，与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，这样在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度。最后脱去保护基，水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了合成好的肽。
作为优选，步骤A中树脂为2-CTC树脂或王树脂。
优选地，步骤A中偶联采用的活化剂选自DIC、HOBt和DMAP的混合液，DIEA，TMP或NMM。
作为优选，Lys的侧链保护基为mmt。
第一逐步偶联时，根据萨摩鲁泰肽序，逐步偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt）-OH，其中，Aib是丙氨酸经甲基修饰后的特殊氨基酸。
优选地，步骤B中第一逐步偶联采用的偶联剂包括缩合剂和反应溶剂，缩合剂为DIC和HOBt的混合液，PyBOP、HOBt和DIEA的混合液或HATU、HOAt和DIEA的混合液，反应溶剂为DMF、DCM、NMP或DMSO中的一种或两者以上的混合液。
作为优选，步骤C中脱除采用的试剂为TFA、TES与DCM的混合液，TFA、TES和DCM的体积比为1～5︰2～8︰93～97。
作为优选，步骤D中裂解采用的试剂为TFA、苯甲硫醚、甲硫醚和EDT的混合液，TFA、苯甲硫醚、甲硫醚和EDT的体积比为90︰5︰3︰2。
本发明提供的方法中，步骤A中树脂为2-CTC树脂时所采用的活化剂选自DIEA、TMP或NMM，树脂为王树脂时所采用的活化剂为DIC、HOBt和DMAP的混合液。
本发明还提供了一种萨摩鲁泰盐的制备方法，由本发明提供的萨摩鲁泰固相合成方法制得的萨摩鲁泰经转盐后即得；
本发明提供的萨摩鲁泰的固相合成方法，包括如下步骤：
步骤A：将Gly和树脂偶联得到Gly-树脂；
步骤B：Gly-树脂经第一逐步偶联氨基酸或氨基酸衍生物，得到序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂；
步骤C：脱除序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂中Lys的侧链保护基团，经第二逐步偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸，获得第二肽树脂；
步骤D：取第二肽树脂经裂解、纯化，即得。
作为优选，步骤A中树脂为2-CTC树脂或王树脂。
优选地，步骤A中偶联采用的活化剂选自DIC、HOBt和DMAP的混合液，DIEA，TMP或NMM。
作为优选，Lys的侧链保护基为mmt。
第一逐步偶联时，根据萨摩鲁泰肽序，逐步偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt）-OH，其中，Aib是丙氨酸经甲基修饰后的特殊氨基酸。
优选地，步骤B中第一逐步偶联采用的偶联剂包括缩合剂和反应溶剂，缩合剂为DIC和HOBt的混合液，PyBOP、HOBt和DIEA的混合液或HATU、HOAt和DIEA的混合液，反应溶剂为DMF、DCM、NMP或DMSO中的一种或两者以上的混合液。
作为优选，步骤C中脱除采用的试剂为TFA、TES与DCM的混合液，TFA、TES和DCM的体积比为1～5︰2～8︰93～97。
作为优选，步骤D中裂解采用的试剂为TFA、苯甲硫醚、甲硫醚和EDT的混合液，TFA、苯甲硫醚、甲硫醚和EDT的体积比为90︰5︰3︰2。
本发明提供的方法中，步骤A中树脂为2-CTC树脂时所采用的活化剂选自DIEA、TMP或NMM，树脂为王树脂时所采用的活化剂为DIC、HOBt和DMAP的混合液。
萨摩鲁泰转盐后获得的萨摩鲁泰盐还需要冻干，以便保存。
本发明通过固相合成法合成萨摩鲁泰，在固相载体上逐步偶联N端保护的氨基酸或氨基酸残基，然后再脱除赖氨酸的侧链保护基并逐步偶联侧链基团，固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的分离纯化步骤，简化了操作步骤，缩短了合成周期；因反应在一简单反应器皿中进行，避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失，降低了成本，减少了废液的产生，副产物少；反应过程中使用过量反应物，使其反应完全，提高最终产物的回收率。由此可见，本发明提供的方法简化了操作步骤，合成周期短，成本低，减少了废液的产生，副产物少，产品收率高，利于萨摩鲁泰的大规模生产。
附图说明
图1示本发明实施例17提供的萨摩鲁泰HPLC图谱。
具体实施方式
本发明公开了一种萨摩鲁泰的固相合成方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
说明书和权利要求书中所使用的缩写具体含义如下：
Fmoc 9-芴甲氧羰基
2-CTC树脂 2-三苯甲基氯树脂
HOBt 1-羟基苯并三唑
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐
DIEA N,N-二异丙基乙胺
DMAP 4-二甲氨基吡啶
PyBOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基
Boc 叔丁氧羰基
tBu 叔丁基
Trt 三苯甲基
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DCM 二氯甲烷
NMP N-甲基吡咯烷酮
DMSO 二甲基亚砜
DBLK 20%六氢吡啶/DMF溶液
mmt 4-甲氧基-三苯甲基
TES 三乙基硅烷
TFA 三氟乙酸
DIC 二异丙基碳二亚胺
Aib 2-氨基异丁酸
Fmoc-AEEA [2-[2-(芴甲氧羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸
Octadecandisure 十八烷二酸
本发明提供了一种萨摩鲁泰的固相合成方法，包括如下步骤：
步骤A：将Gly和树脂偶联得到Gly-树脂；
步骤B：Gly-树脂经第一逐步偶联氨基酸或氨基酸衍生物，得到序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂；
步骤C：脱除序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂中Lys的侧链保护基团，经第二逐步偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸，获得第二肽树脂；
步骤D：取第二肽树脂经裂解、纯化、冻干，即得。
在本发明提供的一些实施例中，步骤A中的树脂选用2-CTC树脂，2-CTC树脂与N端Fmoc保护的Gly偶联所采用的活化剂选自DIEA、TMP或NMM，获得Fmoc-Gly-CTC树脂，Fmoc-Gly-CTC树脂的替代度为0.1～0.25mmol/g；在本发明提供的另外一些实施例中，步骤A中的树脂选用王树脂，王树脂与N端Fmoc保护的Gly偶联所采用的活化剂为DIC、HOBt和DMAP的混合液，获得Fmoc-Gly-王树脂，Fmoc-Gly-王树脂的替代度为0.1～0.25mmol/g。
步骤B中第一逐步偶联采用的偶联剂包括缩合剂和反应溶剂，缩合剂为DIC和HOBt的混合液，PyBOP、HOBt和DIEA的混合液或HATU、HOAt和DIEA的混合液，反应溶剂为DMF、DCM、NMP或DMSO中的一种或两者以上的混合液。
在本发明提供的一些实施例中，所有氨基酸或氨基酸衍生物N端和部分氨基酸的侧链要进行保护，防止副反应的发生，其中，His N端由Boc保护基进行保护，其它的氨基酸或氨基酸衍生物N端由Fmoc保护；Lys侧链的ε-NH2通过mmt保护基进行保护，Arg的侧链胍基由pbf保护，Trp通过Boc保护基进行侧链的保护，Glu和Asp的侧链羧基通过OtBu保护基进行保护，Gln和His通过Trt保护基进行侧链的保护，Tyr的酚羟基和苏氨酸的羟基通过tBu保护基进行侧链的保护，Ser的羟基通过Trt或tBu保护基进行侧链的保护。其中，Ser采用不同的保护基Trt或tBu，是为了保证树脂的偶联效果以及最终的产品收率。
在偶联过程中，肽链的N端首先要脱除Fmoc保护基，形成自由的氨基，与下一个氨基酸或氨基酸衍生物的羧基发生缩合反应，其中，脱除Fmoc保护基所用到的试剂为DBLK，DBLK由体积比为1︰4的哌啶和DMF组成。
第一逐步偶联时，按照萨摩鲁泰的肽序依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt）-OH，得到第一肽树脂。
步骤C中脱除采用的试剂为TFA、TES与DCM的混合液，TFA、TES和DCM的体积比为1～5︰2～8︰93～97。第一肽树脂中Lys侧链的mmt保护基，再依次偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸，获得第二肽树脂。
第二肽树脂带有保护基和树脂，需要裂解除去，裂解采用的试剂为TFA、苯甲硫醚、甲硫醚和EDT的混合液，TFA、苯甲硫醚、甲硫醚和EDT的体积比为90︰5︰3︰2。
裂解后得到的萨摩鲁泰粗肽含有杂质，需要纯化，本发明采用高效液相色谱法进行萨摩鲁泰粗肽的纯化，进一步得到萨摩鲁泰精肽。
本发明还提供了一种萨摩鲁泰盐的制备方法，由本发明提供的萨摩鲁泰固相合成方法制得的萨摩鲁泰精肽经转盐后得到萨摩鲁泰盐。
多肽具有不稳定性，在自然条件下易发生分解、氧化、变性等现象，多肽的不稳定性是其制剂研究中存在的主要问题之一，因此需要提高多肽的稳定性以便贮存和使用。本发明提供的实施例中萨摩鲁泰精肽转盐生成萨摩鲁泰精肽盐，并进一步冻干，从而提高了产物的稳定性。
本发明通过固相合成法合成萨摩鲁泰，在固相载体上逐步偶联N端保护的氨基酸或氨基酸残基，然后再脱除赖氨酸的侧链保护基并逐步偶联侧链基团，固相载体共价相联的肽链处于适宜的物理状态，可通过快速的抽滤、洗涤完成中间的纯化，避免了液相肽合成中冗长的分离纯化步骤，简化了操作步骤，缩短了合成周期；因反应在一简单反应器皿中进行，避免因手工操作和物料重复转移而产生的损失，降低了成本，减少了废液的产生，副产物少；反应过程中使用过量反应物，使其反应完全，提高最终产物的回收率。由此可见，本发明提供的方法简化了操作步骤，合成周期短，成本低，减少了废液的产生，副产物少，产品收率高，利于萨摩鲁泰的大规模生产。
本发明中所用试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1替代度为0.1mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取3.27g Fmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入4.78mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入8mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.104mmol/g。
实施例2替代度为0.25mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取8.18g Fmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入11.95mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入8mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.255mmol/g。
实施例3替代度为0.15mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取替代度为0.5mmol/g的2-CTC树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取4.91g Fmoc-Gly-OH用DMF溶解，冰水浴下加入7.17mL DIEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，反应2小时后，加入8mL无水甲醇封闭1小时。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，用无水甲醇封闭30分钟，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-CTC树脂，检测替代度为0.156mmol/g。
实施例4替代度为0.1mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂的合成
称取替代度为0.5mmol/g的王树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取2.38g Fmoc-Gly-OH、1.30g HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入1.50mL DIC活化3min后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入98mg DMAP，反应2小时后，DMF洗涤3次，DCM洗3次，用80mL醋酸酐/吡啶封闭过夜，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.104mmol/g。
实施例5替代度为0.15mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂的合成
称取替代度为0.5mmol/g的王树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取3.27g Fmoc-Gly-OH、1.78g HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入2.06mL DIC活化3min后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入134mg DMAP，反应2小时后，DMF洗涤3次，DCM洗3次，用80mL醋酸酐/吡啶封闭过夜，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.158mmol/g。
实施例6替代度为0.25mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂的合成
称取替代度为0.5mmol/g的王树脂20g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取4.46g Fmoc-Gly-OH、2.43g HOBt用DMF溶解，冰水浴下加入2.81mL DIC活化3min后，加入上述装有树脂的反应柱中，5分钟后加入183mg DMAP，反应2小时后，DMF洗涤3次，DCM洗3次，用100mL醋酸酐/吡啶封闭过夜，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Gly-王树脂，检测替代度为0.247mmol/g。
实施例7序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂的制备
称取实施例3制备的替代度为0.15mmol/g的Fmoc-Gly-CTC树脂10g（1.5mmol），加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-CTC树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。取4.87g Fmoc-Arg（Pbf）-OH（7.5mmol），1.22g HOBt（9mmol），溶于体积比为1︰1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入1.41ml DIC（9mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照萨摩鲁泰主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt）-OH的偶联。其中Fmoc-Ile-OH采用PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为体积比为1︰4的DMSO与DMF混合液；Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Phe-OH采用PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为DCM；Fmoc-Gln(Trt)-OH采用PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为体积比为1︰4的DMSO与NMP混合液；Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH采用HATU/HOAt/TMP体系，反应溶剂为NMP，丝氨酸采用不同的保护基Trt和tBu是为了保证树脂的偶联效果以及最终的产品收率。将产物用DMF洗涤3次，DCM洗5次，得到序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂。
实施例8序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂的制备
称取实施例5制备的替代度为0.15mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂10g，加入反应器中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-王树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次，用茚三酮法检测树脂颜色，树脂有颜色，表示Fmoc已脱除。取4.87g Fmoc-Arg（Pbf）-OH（7.5mmol），1.22g HOBt（9mmol），溶于体积比为1︰1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入1.41ml DIC（9mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照萨摩鲁泰主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Aib-OH和Boc-His(Trt）-OH的偶联。其中Fmoc-Ile-OH采用PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为体积比为1︰4的DMSO与DMF混合液；Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Phe-OH采用PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为DCM；Fmoc-Gln(Trt)-OH采用PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为体积比为1︰4的DMSO与NMP混合液；Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH采用HATU/HOAt/TMP体系，反应溶剂为NMP，丝氨酸采用不同的保护基Trt和tBu是为了保证树脂的偶联效果以及最终的产品收率。产物用DMF洗涤3次，DCM洗5次，得到序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂。
实施例9序列如SEQ ID No.1所示的第二肽树脂的合成
取实施例7中得到的序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂（1.5mmol），每次加入预配好的脱侧链反应液100ml TFA︰TES︰DCM=1︰5︰94（V︰V），脱除10次，抽掉反应液，用茚三酮检测树脂有颜色，表示mmt已脱除。
称取Fmoc-AEEA-OH 2.89g（7.5mmol），PyBOP 3.90g（9.0mmol），HOBt 1.22g（9.0mmol），用30mL NMP溶解，冰水浴下加入2.7mL DIEA（15mmol）活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。反应结束，DBLK脱除Fmoc，DMF洗涤6次。同样方法再次偶联Fmoc-AEEA-OH。反应结束，DBLK脱除Fmoc，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Glu-OtBu 3.18g（7.5mmol），PyBOP 3.9g（9.0mmol），HOBt 1.22g（9.0mmol），用30mL二氯甲烷溶解，冰水浴下加入2.7mL DIEA（15mmol）活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。反应结束，脱除Fmoc，DMF洗涤6次。称取Octadecandisure 3.774g（12mmol），用30mL NMP溶解，冰水浴下加入0.94mL DIC（6mmol）活化3分钟，加入反应柱反应2小时。
反应结束后用甲醇收缩，真空干燥过夜。称重得到序列如SEQ ID No.1所示的第二肽树脂16.9g（树脂增重率76.9%）。
实施例10序列如SEQ ID No.1所示的第二肽树脂的合成
取实施例8中得到的序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂（1.5mmol），每次加入预配好的脱侧链反应液100ml TFA︰TES︰DCM=2︰2︰96（V︰V），脱除8次，抽掉反应液，用茚三酮检测树脂有颜色，表示mmt已脱除。。
称取Fmoc-AEEA-OH2.89g（7.5mmol），PyBOP 3.90g（9.0mmol），HOBt1.22g（9.0mmol），用30mL NMP溶解，冰水浴下加入2.7mL DIEA（15mmol）活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。反应结束，DBLK脱除Fmoc，DMF洗涤6次。同样方法再次偶联Fmoc-AEEA-OH。反应结束，DBLK脱除Fmoc，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Glu-OtBu 3.18g（7.5mmol），PyBOP 3.9g（9.0mmol），HOBt 1.22g（9.0mmol），用30mL二氯甲烷溶解，冰水浴下加入2.7mL DIEA（15mmol）活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。反应结束，脱除Fmoc，DMF洗涤6次。称取Octadecandisure 3.774g（12mmol），用30mL NMP溶解，冰水浴下加入0.94mL DIC（6mmol）活化3分钟，加入反应柱反应2小时。
反应结束后用甲醇收缩，真空干燥过夜。称重得到序列如SEQ ID No.1所示的第二肽树脂17.8g（树脂增重率86.9%）。
实施例11萨摩鲁泰粗肽的制备
取实施例9中得到的第二肽树脂，加入到250ml反应釜中，按TFA︰苯甲硫醚︰苯甲醚︰EDT=90︰5︰3︰2的体积比配制裂解试剂169ml，将裂解试剂倒入第二肽树脂中，室温反应2.5小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到1.69L无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到萨摩鲁泰粗肽5.09g，粗肽收率82.6%。MALDI-TOF︰(M+H)+=4109.3。
实施例12萨摩鲁泰粗肽的制备
取实施例10中得到的第二肽树脂，加入到250ml反应釜中，按TFA︰苯甲硫醚︰苯甲醚︰EDT=90︰5︰3︰2的体积比配制裂解试剂178ml，将裂解试剂倒入第二肽树脂中，室温反应2.5小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到1.78L无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到萨摩鲁泰粗肽5.68g，粗肽收率92.2%。MALDI-TOF︰(M+H)+=4109.6。
实施例13序列如SEQ ID No.1所示的第二肽树脂的规模化制备
取实施例5制得的替代度为0.15mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂1333.3g，加入反应器中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Gly-王树脂30分钟后，用DBLK脱除Fmoc保护，后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。取648.8g Fmoc-Arg（Pbf）-OH（1000mmol），162.1g HOBt（1200mmol），溶于体积比为1︰1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入187.6ml DIC（1200mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照萨摩鲁泰主链肽序，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys(mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH和Boc-His(Trt)-OH的偶联。其中Fmoc-Ile-OH采用PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为体积比为1︰4的DMSO与DMF混合液；Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Phe-OH采用PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为DCM；Fmoc-Gln(Trt)-OH采用PyBOP/HOBt/DIEA体系，反应溶剂为体积比为1︰4的DMSO与NMP混合液；Fmoc-Aib-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH和Fmoc-Ser(tBu)-OH采用HATU/HOAt/TMP体系，反应溶剂为NMP，丝氨酸采用不同的保护基Trt和tBu是为了保证偶联效果以及最终的产品收率。将产物用DMF洗涤3次，DCM洗5次，得到序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂。
往上述得到的第一肽树脂加入预配好的脱侧链反应液7000ml TFA︰TES︰DCM=1︰2︰97（V︰V），脱除10次，抽掉反应液，用茚三酮检测树脂有颜色，表示mmt已脱除。
称取Fmoc-AEEA-OH 385.4g（1000mmol），PyBOP 520.4g（1000mmol），HOBt 162.1g（1200mmol），用4.5LNMP溶解，冰水浴下加入347.7mL DIEA（2000mmol）活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。反应结束，DBLK脱除Fmoc，DMF洗涤6次。同样方法再次偶联Fmoc-AEEA-OH。反应结束，DBLK脱除Fmoc，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Glu-OtBu 425.6g（1000mmol），PyBOP 520.4g（1000mmol），HOBt 162.1g（1200mmol），用4.5L二氯甲烷溶解，冰水浴下加入347.7mLDIEA（2000mmol）活化3分钟，加入反应柱反应2小时，以茚三酮法检测判断反应终点。反应结束，脱除Fmoc，DMF洗涤6次。称取Octadecandisure503.2g（1600mmol），用4.5L NMP溶解，冰水浴下加入125.1mL DIC（800mmol）活化3分钟，加入反应柱反应2小时。
反应结束后用甲醇收缩，真空干燥过夜。称重得到第二肽树脂2356.9g（树脂增重率85.5%）。
实施例14序列如SEQ ID No.1所示的第二肽树脂的规模化制备
取实施例5制得的替代度为0.15mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂1333.3g，按照实施例13提供的方法和步骤，制得序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂。往上述得到的第一肽树脂加入预配好的脱侧链反应液7000ml TFA︰TES︰DCM=5︰2︰93（V︰V），再按照实施例13提供的方法和步骤得到第二肽树脂。
实施例15序列如SEQ ID No.1所示的第二肽树脂的规模化制备
取实施例5制得的替代度为0.15mmol/g的Fmoc-Gly-王树脂1333.3g，按照实施例13提供的方法和步骤，制得序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂。往上述得到的第一肽树脂加入预配好的脱侧链反应液7000ml TFA︰TES︰DCM=1︰8︰93（V︰V），再按照实施例13提供的方法和步骤得到第二肽树脂。
实施例16萨摩鲁泰粗肽的规模化制备
称取实施例13制得的全保护的第二肽树脂117.8g，加入到2L反应釜中，按TFA︰苯甲硫醚︰苯甲醚︰EDT=90︰5︰3︰2的体积比配制裂解试剂1178ml，将裂解试剂倒入第二肽树脂中，室温反应2.5小时。反应结束，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液，将滤液加入到11.78L无水乙醚中沉淀，离心，无水乙醚洗涤，并且真空干燥，得到萨摩鲁泰粗肽36.92g，粗肽收率89.9%。MALDI-TOF︰(M+H)+=4109.5。
实施例17萨摩鲁泰精肽的制备
取实施例16制得的萨摩鲁泰粗肽36.92g用25%乙腈+25%DMSO+50%水的混合溶剂1000mL溶解后，采用Waters 2545 RP-HPLC系统，波长214nm，色谱柱为50×250mm反相C8柱，柱温为50℃，常规0.1%TFA/乙腈流动相纯化，收集目的峰馏分，得到纯度大于98.5%萨摩鲁泰精肽溶液，萨摩鲁泰精肽的HPLC图谱参见图1。
实施例18萨摩鲁泰精肽盐酸盐的制备
将实施例17制得的萨摩鲁泰精肽溶液采用Waters 2545 RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C8柱，0.1%盐酸/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋转蒸发浓缩，冻干得到萨摩鲁泰盐酸盐精肽5.82g，HPLC纯度99.13％，纯化收率51.32％，总收率14.16%，萨摩鲁泰精肽的HPLC图谱与实施例17得到的结果相似。
实施例19萨摩鲁泰精肽醋酸盐的制备
将实施例17制得的萨摩鲁泰精肽溶液采用Waters 2545RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C8柱，0.2%醋酸/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋蒸浓缩，冻干得到萨摩鲁泰醋酸盐精肽6.13g，HPLC纯度99.03%，纯化收率54.05%，总收率14.92%，萨摩鲁泰精肽的HPLC图谱与实施例17得到的结果相似。
实施例20萨摩鲁泰精肽三氟醋酸盐的制备
将实施例17制得的萨摩鲁泰精肽溶液采用Waters 2545 RP-HPLC系统，色谱柱为50×250mm反相C8柱，0.1%三氟醋酸/乙腈流动相转盐，收集目的峰馏分，旋蒸浓缩，冻干得到萨摩鲁泰醋酸盐精肽6.53g，HPLC纯度99.26%，纯化收率57.58%，总收率15.89%，萨摩鲁泰精肽的HPLC图谱与实施例17得到的结果相似。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种萨摩鲁泰的固相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤A：将Gly和树脂偶联得到Gly-树脂；
步骤B：所述Gly-树脂经第一逐步偶联氨基酸或氨基酸衍生物，得到序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂；
步骤C：脱除所述序列如SEQ ID No.1所示的第一肽树脂中Lys的侧链保护基团，经第二逐步偶联2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、2-(2-(2-氨乙氧基)乙氧基)乙酸、Glu和十八烷二酸，获得第二肽树脂；
步骤D：取所述第二肽树脂经裂解、纯化，即得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述树脂为2-CTC树脂或王树脂。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中所述偶联采用的活化剂选自DIC、HOBt和DMAP的混合液，DIEA，TMP或NMM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述第一逐步偶联采用的偶联剂包括缩合剂和反应溶剂，所述缩合剂为DIC和HOBt的混合液，PyBOP、HOBt和DIEA的混合液或HATU、HOAt和DIEA的混合液，所述反应溶剂为DMF、DCM、NMP或DMSO中的一种或两者以上的混合液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中所述脱除采用的试剂为TFA、TES与DCM的混合液，所述TFA、所述TES和所述DCM的体积比为1～5︰2～8︰93～97。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤D中所述裂解采用的试剂为TFA、苯甲硫醚、甲硫醚和EDT的混合液，所述TFA、所述苯甲硫醚、所述甲硫醚和所述EDT的体积比为90︰5︰3︰2。
7.一种萨摩鲁泰盐的制备方法，其特征在于，如权利要求1～6任意一项所述的方法制得的萨摩鲁泰经转盐后即得。
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