CN109200270A - 一种能提高多肽疫苗对hpv感染肿瘤治疗效果的联合用药物及其应用 - Google Patents

一种能提高多肽疫苗对hpv感染肿瘤治疗效果的联合用药物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种能提高多肽疫苗对人乳头瘤病毒(HPV)感染引起的良性和恶性肿瘤治疗效果的联合用药物及其应用。该联合用药物包含至少(i)一种具有特异性免疫功能的多肽疫苗和(ii)包含F1、F3多肽组合物。F1、F3多肽组合物可以刺激肿瘤细胞分泌炎性因子MCP‑1，吸引炎性细胞如T细胞，NK细胞到肿瘤组织内。在小鼠体内可以抑制TC‑1肿瘤细胞生长。F1、F3多肽组合物可以提高本申请中治疗性疫苗的效率，可以延长治疗性疫苗免疫的荷瘤小鼠的生存时间。该联合用药物的多肽疫苗和F1、F3多肽组合物按各自有效剂量比例的组合联用比二者各自有效剂量单独使用效果更优，具有协同增效的作用。

Description

一种能提高多肽疫苗对HPV感染肿瘤治疗效果的联合用药物 及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体地说，涉及一种能提高多肽疫苗对HPV感染相关肿瘤治疗效果的联合用药物及其应用。
背景技术
慢性人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染可以引起多种疾病。宫颈癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌和包括口腔癌的头颈部肿瘤均可由感染HPV引起。宫颈癌是常见恶性肿瘤之一，发病率占女性肿瘤第二位，其发生与HPV、特别是16、18型HPV的持续感染密切相关。尽管用于预防HPV感染的疫苗已于2006年开始应用，但此类疫苗仅适用于从未感染的健康个体，对现症HPV感染及其所致疾病无效。目前全球每年仍有约50万新发宫颈癌病例，约20万妇女死于该病。我国已有宫颈癌患者40万人，死亡率达11.3％。外阴癌、阴茎癌、肛门癌和口腔癌亦是临床常见恶性肿瘤。
HPV编码的早期蛋白E6和E7在细胞癌变进程和维持癌细胞恶性表型方面起重要作用，成为了宫颈癌治疗性疫苗的理想靶点。
目前存在多种针对靶抗原E6和E7的治疗性疫苗，这些疫苗通过诱导细胞毒性淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，特异性杀死肿瘤或病毒感染细胞，而不伤害正常细胞，成为宫颈癌免疫防治领域的研究热点。疫苗类型包括活载体疫苗、蛋白或多肽疫苗以及核酸疫苗等，其中活载体疫苗有潜在的安全风险，多肽疫苗相对其他疫苗类型安全、稳定，易于生产。多肽疫苗一般可分为两组：特定表位短肽疫苗和合成长肽疫苗。特定表位短肽疫苗通过特定的抗原表位来确保精准的CTL反应，受HLA特异性限制，在接种疫苗之前通常需要进行HLA的初步分型，不适合大规模个体。而合成长肽疫苗，含多个抗原表位，具有广泛的免疫原性，不受HLA特异性限制，适合大规模个体。已有研究报道合成长肽疫苗在动物实验模型和临床试验中能有效地诱导抗原特异的T细胞免疫应答。
中国发明专利20161122304.8,公开了一种包含F1、F3多肽的药物组合物及F1、F3多肽的制备方法和在治疗HPV感染疾病中的应用。每份药物组合物中含F1、F3多肽或者二者的混合物为3～30μg，该组合物制备成乳剂、软膏制剂等多种常规剂型，用于治疗HPV感染引起的尖锐湿疣、宫颈癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌和口腔癌等易复发的疾病。
多肽F1，F3序列首次发表于文献S.T.Steinborner,et al.,J.Pept.Res.,1998,51,121,见第4页。
其中F1序列为:GLLSVLGSVAKHVLPHVVPVIAEHL-NH2；
F3序列为:GLFGVLGSIAKHLLPHVVPVIAEKL-NH2。
中国发明专利201810560842.0，公开了一种具有特异性免疫功能的多肽组合物、疫苗及其应用，其包括人乳头瘤病毒HPV型E7蛋白全长氨基酸序列，以及所有可能激发抗原特异性细胞免疫的抗原表位。本发明的多肽组合物，可联合Toll样受体配体和aIL10R(白细胞介素10受体抗体)，组合成一种独特的治疗性疫苗，其可诱导细胞毒性淋巴细胞，特异性杀死HPV相关的肿瘤细胞或HPV病毒感染细胞，使其配制所得的疫苗对HPV型感染相关的良性或恶性疾病，包括宫颈癌、宫颈上皮内瘤变、外阴癌、阴茎癌、肛门癌和口咽癌等有潜在的治疗作用。该申请中公开了本申请中四条多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1～4所示，同时公开了本申请中一种具有特异性免疫功能的多肽疫苗。
然而，中国发明专利20161122304.8中公开的F1、F3多肽组合物和中国发明专利201810560842.0公开的治疗性疫苗免疫单独治疗荷瘤小鼠均不能提高小鼠的生存时间。本领域技术人员需要研发一种联合用药，可以提高该治疗性疫苗的治疗效果，可以延长治疗性疫苗免疫的荷瘤小鼠的生存时间，对于拓展F1、F3多肽组合物和治疗性多肽疫苗的市场具有战略性意义。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种能提高多肽疫苗对HPV感染肿瘤治疗效果的联合用药物，所述联合用药物可以延长治疗性多肽疫苗免疫的荷瘤小鼠的生存时间。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种能提高多肽疫苗对HPV感染肿瘤治疗效果的联合用药物，包含至少(i)一种具有特异性免疫功能的多肽疫苗和(ii)包含F1、F3多肽组合物。
所述F1、F3多肽组合物为从澳大利亚树蛙皮肤分泌物提取的Caerin多肽1.1和1.9(F1、F3)多肽组合物。
作为上述方案的进一步改进，所述一种具有特异性免疫功能的多肽疫苗为包含人乳头瘤病毒HPV型E7蛋白全长氨基酸序列；所述人乳头瘤病毒HPV型E7蛋白全长氨基酸序列由四条多肽混合而成；所述四条多肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1～4所示；所述四条多肽以1:1:1:1的重量比混合。
本发明采用重叠多肽设计的方法，设计四条长肽，并按重量比组合成混合物，其包括了HPV型E7蛋白全长氨基酸序列中能激发特异性细胞免疫的几乎所有抗原表位，可激发更强更多种的CTL。
所述一种具有特异性免疫功能的多肽疫苗进一步包含Toll样受体配体和免疫佐剂；所述Toll样受体配体为TLR1～TLR9所识别的所有配体中的任一种；所述Toll样受体配体选自MPLA、PolyI:C、Imiqumod中的至少一种；所述免疫佐剂优选aIL10R。
由于多肽疫苗免疫原性弱，通常需要脂质或其他佐剂，包括趋化因子、细胞因子、Toll样受体(TLR)配体等增强疫苗的效果。
所述免疫佐剂包括可以抑制白介素10功能的任何佐剂。本发明中特别地将Toll样受体配体和/或aIL10R的组合作为对所述免疫佐剂具有特殊贡献有效物。
其中所述Toll样受体配体包括TLR1～TLR9所识别的所有配体，这样的组合如：EX+MPLA、EX+PolyI:C、EX+Imiqumod、EX+MPLA+aIL10R、EX+PolyI:C+aIL10R、EX+Imiqumod+aIL10R，EX+MPLA+PolyI:C+aIL10R、EX+MPLA+Imiqumod+aIL10R等。另外，aIL10R作为白介素阻断剂的其中一种，其较同类的其它白介素阻断剂如抗白介素10抗体、抗白介素10受体抗体、小分子抑制多肽、核苷酸等具有更为显著的效果，即本发明中优选aIL10R作为白介素阻断剂。
本发明中多肽疫苗相对于活载体疫苗、蛋白疫苗和核酸疫苗等更安全、稳定，易于生产。
本发明中合成长肽疫苗，含多个抗原表位，具有广泛的免疫原性，不受HLA特异性限制，适合大规模个体。
作为优选，所述F1、F3多肽组合物中每份药物组合物中含F1、F3多肽或者二者的混合物为3～30μg，优选5～20μg。
作为上述方案的进一步改进，所述F1、F3多肽组合物制备成适合胃肠外给药的肌内注射或皮下注射的注射液；或经皮肤穿透给药的乳剂或软膏制剂，优选乳剂或软膏制剂。
作为上述方案的进一步改进，所述一种具有特异性免疫功能的多肽疫苗通过皮下注射给药；所述包含F1、F3多肽组合物通过肿瘤内注射，剂量为30ug/次，或者通过肿瘤局部涂抹的方式给药。
本申请中治疗性疫苗的化学组分中含有HPVE7，白介素10(IL10)抑制剂(抗白介素10抗体，抗白介素10受体抗体或白介素10抑制肽和干扰素γ(IFNγ)，所述IL10受体抗体含量是300-500μg；白介素10抑制肽含量为10μg，所述IFNγ含量是5μg，以上为小鼠体内使用剂量。通过皮下注射途径给药。HPVE7多肽包括以下4条多肽：10ug/每条多肽，其氨基酸序列分别为：
SEQ ID NO 1:MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE,
SEQ ID NO 2:LNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKC,
SEQ ID NO 3:DRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR,
SEQ ID NO 4:CVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP。
本发明的目的之二在于提供一种能提高多肽疫苗对HPV感染肿瘤治疗效果的联合用药物在制备治疗对HPV型感染相关的良性或恶性疾病的药物中的应用。
作为优选，所述对HPV型感染相关的良性或恶性疾病包括并不限于宫颈癌、宫颈上皮内瘤变、外阴癌、阴茎癌、肛门癌或口咽癌中的一种。
本发明的多肽组合物疫苗，可联合Toll样受体配体和aIL10R(白细胞介素10受体抗体)，组合成一种独特的治疗性疫苗，其可诱导细胞毒性淋巴细胞，特异性杀死HPV相关的肿瘤细胞或HPV病毒感染细胞，使其配制所得的疫苗对HPV型感染相关的良性或恶性疾病，包括宫颈癌、宫颈上皮内瘤变、外阴癌、阴茎癌、肛门癌和口咽癌等有潜在的治疗作用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
本发明所提供的一种能提高多肽疫苗对HPV感染肿瘤治疗效果的联合用药物包含一种具有特异性免疫功能的多肽疫苗和包含F1、F3多肽组合物，二者按各自有效剂量比例的组合联用比二者各自有效剂量单独使用效果更优，具有协同增效的作用。
F1、F3多肽组合物可以刺激肿瘤细胞分泌炎性因子MCP-1，吸引炎性细胞如T细胞，NK细胞到肿瘤组织内。在小鼠体内可以抑制TC-1肿瘤细胞生长。F1、F3多肽组合物可以提高本申请中治疗性疫苗的效率，可以延长治疗性疫苗免疫的荷瘤小鼠的生存时间，而F1、F3多肽组合物或本申请中治疗性疫苗免疫单独治疗荷瘤小鼠均不能提高小鼠的生存时间。
当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1(图1A、图1B、图1C、图1D、图1E)是本发明实施例1所得的试验数据图。
图2是F1、F3多肽能刺激TC-1细胞分泌更多的MCP1图。
图3(图3A、图3B、图3C、图3D)是本发明实施例2所得的试验数据图。
图4(图4A、图4B、图4C、图4D)是本发明实施例3所得的试验数据图。
其中，图4A为F1、F3组合物提高治疗型疫苗效率通过吸引CD45阳性细胞到肿瘤组织内；
图4B为F1、F3组合物提高治疗型疫苗效率通过吸引CD8阳性细胞到肿瘤组织内；
图4C为F1、F3组合物提高治疗型疫苗效率通过吸引CD4阳性细胞到肿瘤组织内。
图4D为F1、F3组合物提高治疗型疫苗效率通过吸引NK细胞到肿瘤组织内。
图5为F1、F3组合物涂剂体外抑制TC-1(左)Hela(右)细胞试验图。
图6为体内试验F1、F3组合物软膏制剂抑制小鼠皮下TC-1肿瘤生长图。其中上图为肿瘤体积，下图为肿瘤重量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。
本申请中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备，均来自市售产品。本申请中所用方法，若无特别说明，均为本领域技术人员所知晓的常规方法。
本发明F1、F3多肽和组合物制剂制备参考中国发明专利20161122304.8实施例1。
本发明F1、F3多肽乳膏的制备方法如下：Poloxamer 407(分子量12600,pH 6-7.4,批号WPAK592B,BASF,德国),poloxamer 188(分子量8400,pH 6-7,批号WPAK539B,BASF,德国)；
空白凝胶制备:46克poloxamer 407，10克poloxamer 188加入到200ml蒸馏水中，放置4摄氏度，到poloxamer 407和188完全溶解；搅拌均匀，直到凝胶形成。10mg F1、或F3加入到10ml空白凝胶中。完全溶解后用0.22um滤膜过滤。
本发明所述多肽组合物(以下简称EX)中的四条多肽均通过生物技术公司采用Fmoc-Glu固相法人工合成，其粗品肽经过高效液相色谱纯化，纯度＞95％，冻干-20℃并保存备用。
实施例1：多肽组合物与不同Toll样受体配体组合，或联合aIL10R免疫
试验过程
将C57BL/6小鼠随机分为4组，第1组为EX+MPLA；第2组为EX+MPLA+Rat IgG；第3组为EX+MPLA+aIL10R；第4组为PBS对照组。
分别对4组小鼠左侧腹部皮下免疫，一周一次，共免疫2次。最后一次免疫后第6天处死小鼠，摘取小鼠脾脏，用ELISPOT方法检测疫苗诱导的抗原特异性CD8+T细胞反应。
结果表明：
1、含HPVE7全长的4个E7多肽/MPLA/抗白介素10受体抗体疫苗，比疫苗中不含白介素10受体抗体疫苗诱导产生更多的抗原特异性CD8+T细胞。结果参见图1A所示。
2、先用含HPVE7全长的4个E7多肽/MPLA，同时使用或不使用抗白介素10受体抗体，免疫C57BL/6小鼠，然后皮下接种TC-1肿瘤。结果表明含HPVE7全长的4个E7多肽/MPLA/抗白介素10受体抗体疫苗，与疫苗中不含白介素10受体抗体疫苗相比，能更好的抑制TC-1肿瘤生长。其中图1B为小鼠肿瘤大小图；图1C为小鼠生存曲线图。
3、先皮下接种TC-1肿瘤，然后免疫C57BL/6小鼠，含HPVE7全长的4个E7多肽/MPLA/抗白介素10受体抗体疫苗，与疫苗中不含白介素10受体抗体疫苗相比，抑制TC-1肿瘤生长的作用相同，仅比PBS对照组好。图1D为小鼠肿瘤大小图；图1E为小鼠生存曲线。
实施例2 F1、F3组合物能增加具有特异性免疫功能的多肽疫苗抑制TC-1肿瘤生长的作用
试验过程
1.培养在含10％小牛血清RPMI培养基中的100微升5X103TC-1细胞加入96孔细胞培养板中，分别加入5微克每毫升的F1或/和F3和对照多肽P3，经37℃含5％CO2培养过夜，取上清，用ELISA方法检测MCP-1。F1、F3组合物可以刺激TC-1细胞分泌更多的MCP1，结果参见图2。
2.先皮下接种TC-1肿瘤到C57BL/6小鼠或裸鼠，待肿瘤可以触摸到后，肿瘤内注射F1，F3组合物7次，30μg/次，Imiquimod 50μg/次，两天后处死小鼠，分离肿瘤称重。F1、F3组合物在小鼠体内能抑制TC-1肿瘤生长，结果参见图3A。F1、F3组合物在免疫缺陷小鼠(裸鼠)抑制TC-1肿瘤的能力消失。结果参见图3B。
3、皮下接种TC-1肿瘤，4天后，将小鼠分成四组：1.PBS皮下注射/PBS肿瘤内注射组；2.F1，F3肿瘤内注射组；3.HPVE7全长的4个E7多肽/MPLA/抗白介素10受体抗体皮下免疫组；4.HPVE7全长的4个E7多肽/MPLA/抗白介素10受体抗体皮下免疫加F1，F3肿瘤内注射组。免疫2次，间隔1周；F1，F3多肽在第一次面以后连续注射7天，观察C57BL/6小鼠生存形况。结果表明，F1、F3组合物可以提高疫苗抑制肿瘤生长的效率,延长荷瘤小鼠的生存时间，结果参见图3C。
4、皮下接种TC-1肿瘤，4天后，将小鼠分成3组：1.PBS皮下注射/PBS肿瘤内注射组；2.HPVE7全长的4个E7多肽/MPLA/抗白介素10受体抗体皮下免疫组+F1，F3多肽局部注射组；3。HPVE7全长的4个E7多肽/MPLA皮下免疫组+F1，F3多肽局部注射组加F1、F3组合物增加疫苗抑制TC-1肿瘤生长的作用，在使用E7/MPLA/抗白介素10受体抗体疫苗时更有效，结果参见图3D。
实施例3 F1、F3组合物提高治疗型疫苗效率的途径
试验过程
皮下接种TC-1肿瘤，4天后，将小鼠分成四组：1.PBS皮下注射/PBS肿瘤内注射组；2.F1，F3肿瘤内注射组；3.HPVE7全长的4个E7多肽/MPLA/抗白介素10受体抗体皮下免疫组；4.HPVE7全长的4个E7多肽/MPLA/抗白介素10受体抗体皮下免疫加F1，F3肿瘤内注射组。免疫2次，间隔1周；F1，F3多肽在第一次面以后连续注射7天。第二次免疫七天后，分离肿瘤，制成单细胞悬液，使用抗CD3，CD4，CD8,NK1.1,CD45抗体标记肿瘤内的CD45+,T,NK细胞，使用流式细胞仪检测。
结果表明：
1、F1、F3组合物提高治疗型疫苗效率通过吸引CD45阳性细胞到肿瘤组织内，结果见图4A。
2、F1、F3组合物提高治疗型疫苗效率通过吸引CD8阳性细胞到肿瘤组织内，结果见图4B。
3、F1、F3组合物提高治疗型疫苗效率通过吸引CD4阳性细胞到肿瘤组织内，结果见图4C。
4、F1、F3组合物提高治疗型疫苗效率通过吸引NK细胞到肿瘤组织内，结果见图4D。
实施例4 F1、F3组合物乳膏体内外抑制小鼠皮下TC-1肿瘤生长情况
试验过程
将5x103TC-1细胞或Hela细胞培养于96孔板内，加入不同浓度的F多肽或对照多肽P3，或者F多肽，P3多肽乳膏体外培养过夜，MTT方法检测F多肽，或者P多肽对TC-1，或者Hela细胞的生长抑制作用。
结果表明：F1、F3组合物乳膏体外抑制TC-1(左)Hela(右)细胞试验，结果参见图5。
试验过程
皮下接种TC-1肿瘤，4天后，将小鼠分成4组，1.PBS；2.F1、F3组；3.F1、F3药膏组；4.药膏对照组。连续肿瘤内注射7天，测量肿瘤大小，后两天后杀死小鼠，分离肿瘤称重。
结果表明，F1、F3组合物乳膏可以抑制小鼠皮下TC-1肿瘤生长(上图：肿瘤体积，下图：肿瘤重量。结果参见图6。
需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述实施例为本发明的优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的类似的工艺及所作的等效变化，而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种能提高多肽疫苗对HPV感染肿瘤治疗效果的联合用药物，包含至少(i)一种具有特异性免疫功能的多肽疫苗和(ii)包含F1、F3多肽组合物。
2.根据权利要求1所述的一种能提高多肽疫苗对HPV感染肿瘤治疗效果的联合用药物，其特征在于，所述一种具有特异性免疫功能的多肽疫苗为包含人乳头瘤病毒HPV型E7蛋白全长氨基酸序列；所述人乳头瘤病毒HPV型E7蛋白全长氨基酸序列由四条多肽混合而成；所述四条多肽以1:1:1:1的重量比混合。
3.根据权利要求2所述的一种能提高多肽疫苗对HPV感染肿瘤治疗效果的联合用药物，其特征在于，所述一种具有特异性免疫功能的多肽疫苗进一步包含Toll样受体配体和免疫佐剂；所述Toll样受体配体为TLR1～TLR9所识别的所有配体中的任一种；所述Toll样受体配体选自MPLA、PolyI:C、Imiqumod中的至少一种；所述免疫佐剂优选抗白介素10受体抗体或白介素10功能抑制肽。
4.根据权利要求1所述的一种能提高多肽疫苗对HPV感染肿瘤治疗效果的联合用药物，其特征在于，所述F1、F3多肽组合物中每份药物组合物中含F1、F3多肽或者二者的混合物为3～30μg，优选5～20μg。
5.根据权利要求4所述的一种能提高多肽疫苗对HPV感染肿瘤治疗效果的联合用药物，其特征在于，所述F1、F3多肽组合物制备成适合胃肠外给药的肌内注射或皮下注射的注射液；或经皮肤穿透给药的乳剂或软膏制剂，优选乳剂或软膏制剂。
6.根据权利要求5所述的一种能提高多肽疫苗对HPV感染肿瘤治疗效果的联合用药物，其特征在于，所述一种具有特异性免疫功能的多肽疫苗通过皮下注射给药；所述包含F1、F3多肽组合物通过肿瘤内注射，剂量为30ug/次，或者通过肿瘤局部涂抹的方式给药。
7.权利要求1至6任一项所述的一种能提高多肽疫苗对HPV感染肿瘤治疗效果的联合用药物在制备治疗对HPV型感染相关的良性或恶性疾病的药物中的应用。
8.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述对HPV型感染相关的良性或恶性疾病包括并不限于宫颈癌、宫颈上皮内瘤变、外阴癌、阴茎癌、肛门癌或头颈部肿瘤中的一种。
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