KR20090094854A - Ａｐｐ에 대한 ｄｒ６의 결합을 억제하는 ｄｒ６ 항체, 및 신경학적 질환의 치료에 있어서의 그의 용도 - Google Patents

Ａｐｐ에 대한 ｄｒ６의 결합을 억제하는 ｄｒ６ 항체, 및 신경학적 질환의 치료에 있어서의 그의 용도 Download PDF

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Abstract

알츠하이머병을 비롯한 신경학적 질환을 치료하는데 사용하기 위한 DR6 길항제를 포함하는 방법 및 조성물을 제공한다. DR6 길항제는 포유동물 뉴런 세포 또는 조직의 성장, 재생 또는 생존을 향상시키는 항-APP 항체, 항-DR6 항체, DR6 면역어드헤신 및 DR6 변이체 (이들의 융합 단백질)를 포함한다.
DR6 길항제, 알츠하이머병, 신경학적 질환, 조성물, 항-APP 항체, 항-DR6 항체, DR6 면역어드헤신

Description

ＡＰＰ에 대한 ＤＲ６의 결합을 억제하는 ＤＲ６ 항체, 및 신경학적 질환의 치료에 있어서의 그의 용도 {DR6 ANTIBODIES INHIBITING THE BINDING OF DR6 TO APP, AND USES THEREOF IN TREATING NEUROLOGICAL DISORDERS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 그 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 가출원 60/871,528 (2006년 12월 22일 출원), 및 가출원 60/900,848 (2007년 2월 12일 출원)의 미국 특허법 35 USC 119(e) 하의 우선권을 주장하면서 37 CFR 1.53(b)(1) 하에 출원된 정규 출원이다.
본 발명은 일반적으로 예를 들어 DR6과 그의 동족체 (cognate) 리간드인 APP 사이의 상호작용을 억제하는 DR6 길항제를 사용하여 신경학적 질환을 치료하는 방법, 및 상기 방법에 유용한 DR6 길항제 조성물에 관한 것이다. 선택적인 실시태양에서, DR6 길항제, 예를 들어 DR6 수용체 항체, DR6 수용체 변이체, DR6 수용체 면역어드헤신 (immunoadhesin) 또는 APP 항체가 알츠하이머 (Alzheimer) 병의 치료를 포함하여 신경학적 질환의 치료에 사용된다.
종양 괴사 인자 (TNF) 수퍼패밀리에 속하는 다양한 리간드 및 수용체가 당업계에서 확인되었다. 상기 리간드에는 종양 괴사 인자-알파 ("TNF-알파"), 종양 괴 사 인자-베타 ("TNF-베타" 또는 "림포톡신-알파"), 림포톡신-베타 ("LT-베타"), CD30 리간드, CD27 리간드, CD40 리간드, OX-40 리간드, 4-1BB 리간드, LIGHT, Apo-1 리간드 (Fas 리간드 또는 CD95 리간드로도 언급됨), Apo-2 리간드 (Apo2L 또는 TRAIL로도 언급됨), Apo-3 리간드 (TWEAK로도 언급됨), APRIL, OPG 리간드 (RANK 리간드, ODF, 또는 TRANCE로도 언급됨), 및 TALL-1 (BlyS, BAFF 또는 THANK로도 언급됨)가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Ashkenazi, Nature Review, 2:420-430 (2002)]; [Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998)]; [Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000)]; [Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411]; [Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001)]; [Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995)]; [Schmid et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986)]; [Dealtry et al., Eur. J. Immunol., 17:689 (1987)]; [Pitti et al., J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1996)]; [Wiley et al., Immunity, 3:673-682 (1995)]; [Browning et al., Cell, 72:847-856 (1993)]; [Armitage et al. Nature, 357:80-82 (1992)], 1997년 1월 16일 공개된 WO 97/01633; 1997년 7월 17일 공개된 WO 97/25428; [Marsters et al., Curr. Biol., 8:525-528 (1998)]; [Chicheportiche et al., Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997)]; [Hahne et al., J. Exp. Med., 188:1185-1190 (1998)]; 1998년 7월 2일 공개된 WO98/28426; 1998년 10월 22일 공개된 WO98/46751; 1998년 5월 7일 공개된 WO/98/18921; [Moore et al., Science, 285:260-263 (1999)]; [Shu et al., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999)]; [Schneider et al., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999)]; [Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)] 참조).
상기 TNF 패밀리 리간드에 의해 매개된 다양한 세포 반응의 유도는 일반적으로 특정 세포 수용체에 대한 그의 결합에 의해 개시된다. 지금까지 확인된 TNF 수용체 수퍼패밀리의 멤버에는 TNFR1, TNFR2, p75-NGFR, TACI, GITR, CD27, OX-40, CD30, CD40, HVEM, Fas (Apo-1 또는 CD95로도 언급됨), DR4 (TRAIL-R1로도 언급됨), DR5 (Apo-2 또는 TRAIL-R2로도 언급됨), DR6 (TR9로도 언급되고, 문헌에 TNF 수용체 수퍼패밀리 멤버 21 또는 TNFRSF21로서도 알려짐), DcR1, DcR2, 오스테오프로테게린 (OPG), RANK 및 Apo-3 (DR3 또는 TRAMP로도 언급됨)이 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Ashkenazi, Nature Reviews, 2:420-430 (2002)]; [Ashkenazi and Dixit, Science, 281:1305-1308 (1998)]; [Ashkenazi and Dixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260 (2000)]; [Golstein, Curr. Biol., 7:750-753 (1997) Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411]; [Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001)]; [Gruss and Dower, Blood, 85:3378-3404 (1995)]; [Hohman et al., J. Biol. Chem., 264:14927-14934 (1989)]; [Brockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127-3131 (1990)]; 1991년 3월 20일 공개된 EP 417,563; [Loetscher et al., Cell, 61:351 (1990)]; [Schall et al., Cell, 6:361 (1990)]; [Smith et al., Science, 248: 1019-1023 (1990)]; [Lewis et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830-2834 (1991)]; [Goodwin et al., Mol. Cell. Biol., 11:3020-3026 (1991)]; [Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989)]; [Mallett et al., EMBO J., 9:1063-1068 (1990)]; [Anderson et al., Nature, 390:175-179 (1997)]; [Chicheportiche et al., J. Biol. Chem., 272:32401-32410 (1997)]; [Pan et al., Science, 276:111-113 (1997)]; [Pan et al., Science, 277:815-818 (1997)]; [Sheridan et al., Science, 277:818-821 (1997)]; [Degli-Esposti et al., J. Exp. Med., 186:1165-1170 (1997)]; [Marsters et al., Curr. Biol., 7:1003-1006 (1997)]; [Tsuda et al., BBRC, 234:137-142 (1997)]; [Nocentini et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94:6216-6221 (1997)]; [vonBulow et al., Science, 278:138-141 (1997)]; [Johnson et al., Cell, 47:545-554 (1986)]; [Radeke et al., Nature, 325:593-597 (1987)]; [Pan et al., FEBS Lett., 431:351-356 (1998)] 참고).
대부분의 상기 TNF 수용체 패밀리 멤버는 세포외, 막횡단 및 세포내 구역을 포함하여 세포 표면 수용체의 전형적인 구조를 공유하지만, 다른 멤버는 막횡단 및 세포내 도메인이 결여된 가용성 단백질로서 자연에서 발견된다. 전형적인 TNFR의 세포외 부분은 NH2-말단으로부터 출발하는 다수의 시스테인-풍부 도메인 (CRD)의 반복적인 아미노산 서열 패턴을 포함한다.
리간드 및 수용체의 TNF 패밀리에 대해서는, 일반적으로, 예를 들어 문헌 [Wallach, Cytokine Reference, Academic Press, 2000, pages 377-411]; [Locksley et al., Cell, 104:487-501 (2001)]; [Ware, Cytokine & Growth Factor Reviews, 14:181-184 (2003)]; [Liu et al., Immunity, 15(1):23-34 (2001)] 및 [Bossen et al., J Biol Chem. 281 (20): 13964-71 (2006)]을 참조한다.
DR6 수용체 ("TR9"로도 문헌에 언급되고; TNF 수용체 수퍼패밀리 멤버 21 또는 TNFRSF21로도 문헌에 알려짐)로 불리는 TNFR 패밀리 멤버가 4개의 세포외 시스테인-풍부 모티프 및 세포질 사멸 도메인 구조를 갖는 타입 I 막횡단 수용체로서 문헌에 기재되었다 ([Pan et al., FEBS Lett., 431:351-356 (1998)]; 미국 특허 6,358,508; 6,667,390; 6,919,078; 6,949,358 참조). 특정한 형질감염된 세포주에서 DR6이 과다발현되면 NF-kB 및 JNK 모두의 세포자멸 (apoptosis) 및 활성화가 유도된다고 보고되었다 (Pan et al., FEBS Letters, 431:351-356 (1998)). DR6-결여 마우스 모델에서, T 세포는 실질적으로 JNK 활성화가 손상되었고, DR6(-/-) 마우스에 단백질 항원을 시험접종할 때, 그의 T 세포는 과다증식하고 Th2 반응을 향한 고도의 편향성을 보이는 것으로 밝혀졌다 (Th1 분화는 그와 동등한 정도로 영향받지는 않았다) (Zhao et al., J. Exp. Med., 194:1441-1448 (2001)). 또한, DR6의 표적화된 붕괴는 시험관 내에서 T 헬퍼 2 (Th2) 분화를 향상시키는 것으로 보고되었다 (Zhao et al., 상기 문헌). B-세포 매개 병태의 조절에 있어서 DR6 아고니스트 또는 길항제의 상이한 용도가 2005년 3월 31일 공개된 US 2005/0069540에 기재되었다.
DR6 수용체는 천식의 OVA-유도 마우스 모델에서 기도 염증의 조절시에 기능을 수행할 수 있다 (Venkataraman et al., Immunol. Lett., 106:42-47 (2006)).
실험적 자가면역 뇌척수염의 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 (MOG (35-55))-유도 모델을 사용하여, DR6-/- 마우스가 야생형 (WT)의 한배 새끼에 비해 CNS 질병의 발병과 진행 모두에 대해 크게 저항성임이 밝혀졌다. 따라서, DR6이 백혈구 침윤의 조절에 관련될 수 있고, 실험적 자가면역 뇌척수염의 유도 및 진행에서 기능할 수 있다 (Schmidt et al., J. Immunol., 175:2286-2292 (2005)).
다양한 TNF 리간드 및 수용체 패밀리 멤버가 다양한 생물학적 활성 및 특성을 갖는 것으로 확인되었지만, 상기 리간드 및 수용체가 신경학적으로 관련된 기능에 관여하는 것으로 보고된 바는 없다. 예를 들어, 2004년 8월 26일 공개된 WO2004/071528에는 척수 손상을 치료하기 위해 뮤린 모델에서 CD95 (Fas) 리간드/수용체 복합체를 억제하는 것이 기재되어 있다.
<발명의 개요>
본 발명의 실시태양에서, 단리된 사멸 수용체 6 ("DR6") 길항제가 제공된다. 본원에 개시된 길항제의 특정 실시태양은 DR6과 하나 이상의 그의 동족체 리간드(들) 사이의 상호작용을 억제하거나 차단한다. 바람직한 실시태양에서, 본원에 개시된 DR6 길항제는 DR6과 그의 동족체 리간드인 아밀로이드 전구체 단백질 ("APP") 사이의 상호작용을 억제하거나 차단한다. DR6 길항제의 실시태양은 항체, 예를 들어 DR6 또는 APP 항체를 포함할 수 있다. 상기 DR6 길항제 항체는 예를 들어, 모노클로날 항체, 키메라 (chimeric) 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체일 수 있다. 본 발명의 특정 실시태양에서, DR6 길항제는 DR6 세포외 도메인 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하는 항-DR6 항체를 포함할 수 있고, 임의로 도 1A의 아미노산 1-349 또는 42-349를 포함하는 DR6 폴리펩티드에 결합할 수 있다. 별법으로, DR6 길항제는 APP 폴리펩티드에 결합하는 항-APP 항체를 포함할 수 있고, 임의로 도 1B (서열 6)의 아미노산 66-81을 포함하는 APP 폴리펩티드에 결합할 수 있다.
또한, 고려되는 DR6 길항제는 DR6 면역어드헤신, DR6 변이체, DR6 단편, 그의 공유 변형된 형태, 또는 그의 융합 단백질, 및 소분자 길항제를 포함한다. 예로서, DR6 길항제는 페길화 (pegylated) DR6 또는 이종 서열, 예를 들어 에피토프 태그, 항체 단편, 예를 들어 인간 Fc, 또는 류신 지퍼에 융합된 DR6의 가용성 세포외 도메인 형태를 포함할 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시태양은 또한 DR6 폴리펩티드 및/또는 APP 폴리펩티드를 APP에 대한 DR6의 결합이 억제되는 조건 하에 하나 이상의 DR6 길항제에 노출시키는 것을 포함하는, APP에 대한 DR6의 결합을 억제하거나 차단하는 방법을 포함한다. 상기 방법에 사용되는 전형적인 DR6 길항제는 DR6 또는 APP, 및 가용성 DR6 폴리펩티드에 결합하는 항체를 포함한다. 임의로, DR6 길항제는 DR6과 APP 사이의 결합을 억제하는 그의 능력을 관찰함으로써 상기 방법에 사용하기 위해 선택된다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 상기 방법은 예를 들어 세포자멸의 억제 및/또는 시험관내 조직 배양액에서 뉴런 세포의 성장 및/또는 생존의 향상을 위해 사용된다. 상기 방법은 한 종류의 DR6 길항제 분자 또는 2 종류 이상의 DR6 길항제의 조합의 사용을 고려한다.
본 발명의 실시태양은 또한 포유동물에게 유효량의 DR6 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 뉴런 세포 또는 조직의 성장 또는 재생 또는 생존을 향상시키기 위한 방법을 제공한다. 선택적인 실시태양에서, DR6 길항제의 투여는 상기 포유동물에서 뉴런 세포 또는 조직의 성장을 향상시키고 세포 사멸 및 변성을 차단한다. 뉴런 세포 또는 조직은 예를 들어, 운동 뉴런, 감각 뉴런, 연합 (commissural) 뉴런, 축삭, 미세아교세포, 및/또는 희소돌기아교세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, 상기 방법에 사용되는 DR6 길항제는 APP에 결합하고 DR6에 결합하는 그의 능력을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 상기 방법에 사용되는 DR6 길항제는 DR6에 결합하고 APP에 결합하는 그의 능력을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 별법으로, DR6 길항제는 DR6 면역어드헤신, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 비단백질성 중합체에 연결된 DR6 폴리펩티드, 또는 DR6 폴리펩티드 변이체를 포함할 수 있다. 방법에 사용되는 DR6 면역어드헤신은 면역글로불린의 Fc 구역에 융합된 가용성 DR6 수용체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 DR6 길항제는 소분자를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시태양은 포유동물에게 유효량의 DR6 길항제를 투여하는 것을 포함하는 신경학적 질환의 치료 방법을 제공한다. 선택적인 실시태양에서, 이 방법은 포유동물에서 알츠하이머병의 치료를 포함한다. 상기 방법에 사용되는 DR6 길항제는 APP에 결합하고 DR6에 결합하는 그의 능력을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, DR6 길항제는 DR6 항체를 포함할 수 있다. 별법으로, DR6 길항제는 DR6 면역어드헤신, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 비단백질성 중합체에 연결된 DR6 폴리펩티드, DR6 항체 또는 DR6 변이체를 포함할 수 있다. 방법에 사용되는 DR6 면역어드헤신은 면역글로불린의 Fc 구역에 융합된 가용성 DR6 수용체를 포함할 수 있다. 이 방 법에 사용되는 항-DR6 항체는 도 1A의 아미노산 1-349 또는 42-349를 포함하는 DR6 수용체에 결합할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시태양은 환자로부터 샘플을 얻고, 서열 1의 DR6 폴리펩티드 서열과 상이한 폴리펩티드 서열을 갖는 DR6 폴리펩티드 변이체의 존재에 대해 샘플을 시험하는 것을 포함하는, 신경학적 질환이 존재하거나 또는 신경학적 질환에 걸리기 쉬운 환자의 진단 방법을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법에서, 폴리펩티드 변이체는 서열 1의 DR6 폴리펩티드 서열에 대해 관찰된 친화도와 상이한 APP 폴리펩티드에 대한 친화도를 갖는 것으로서 확인된다.
또한, 본 발명의 실시태양은 APP에 대한 DR6의 결합을 억제하는 관심있는 분자를 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 관심있는 분자의 존재 또는 부재 하에 DR6 및 APP를 합한 후; 상기 관심있는 분자의 존재 하에서 APP에 대한 DR6의 결합의 억제를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 임의로, 상기 방법은 세포 표면 상에 DR6를 발현하는 포유동물 세포를 사용하여 수행하고; DR6 활성화 또는 신호 전달의 억제를 검출하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 실시태양은 상기 방법에 의해 확인된 분자를 추가로 포함한다. 임의로, 관심있는 분자는 APP에 결합하는 항체, DR6에 결합하는 항체 또는 가용성 DR6 폴리펩티드이다.
또한, 본 발명의 실시태양은 APP 리간드, DR6 수용체에 특이적으로 결합할 수 있고/있거나 DR6 및/또는 그의 리간드(들) 및/또는 보조 수용체와 연관된 생물학적 활성을 조정할 수 있고, 다양한 신경학적 질환의 치료에 유용한 항체를 제공한다. 특정 실시태양에서, DR6 폴리펩티드의 세포외 도메인 서열에 특이적으로 결 합하는 항체가 제공한다 (아래 실시예에서 추가로 설명됨). 전형적인 항체는 APP 또는 DR6에 결합하고 DR6과 APP 사이의 결합을 억제하는 그의 능력에 대해 추가로 선택되는 항체이다. 임의로, 항체는 모노클로날 항체이다. 임의로, 모노클로날 항체는 각각 ATCC에 기탁 번호 PTA-8095, PTA-8094 또는 PTA-8096으로 기탁된 하이브리도마에 의해 분비된 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7 항체를 포함한다.
또한, 각각 ATCC 기탁 번호 PTA-8095, PTA-8094 또는 PTA-8096으로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7 모노클로날 항체가 결합하는 에피토프와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 하나의 측면에서, 본 발명은 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7 항체를 포함하는 항-DR6 항체는 DR6에 대해 적어도 동일한 친화도를 보이고/보이거나 항체 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7과 적어도 동일한 생물학적 활성 및/또는 효능을 보인다.
또다른 실시태양에서, 모노클로날 항체 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7를 생산하고 ATCC에 각각 기탁 번호 PTA-8095, PTA-8094 또는 PTA-8096으로서 기탁된 하이브리도마 세포주, 및 ATCC에 각각 기탁 번호 PTA-8095, PTA-8094 또는 PTA-8096으로서 기탁된 하이브리도마에 의해 분비된 모노클로날 항체 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7이 제공된다.
또한, DR6 폴리펩티드에 결합하고 ATCC 기탁 번호 PTA-8095, PTA-8094 또는 PTA-8096으로서 기탁된 하이브리도마에 의해 생산된 모노클로날 항체의 상기 DR6 폴리펩티드에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 포함하는, 단리된 항-DR6 모노클로날 항체가 제공된다. 또한, DR6 폴리펩티드에 특이적으로 결합하고, (a) ATCC에 각각 기탁 번호 PTA-8095, PTA-8094 또는 PTA-8096으로서 기탁된 하이브리도마에 의해 분비된 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7 항체로부터 유도된 서열을 포함하는 키메라 또는 인간화 항-DR6 항체가 제공된다. 임의로, 상기 항체는 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7 항체로부터 유도된 중쇄, 경쇄 또는 가변 구역을 포함할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 항-DR6 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 상기 핵산 분자를 포함하는 숙주세포, 및 항체 및 항체 단편을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본원에서 규정된 DR6 길항제(들) 및 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 담체는 제약상 허용되는 담체일 수 있고, 조성물은 추가의 물질(들)을 추가로 포함할 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 용기 및 상기 용기에 담긴, 본 발명의 DR6 길항제를 포함하는 조성물을 포함하는 제품에 관한 것이다. 제품은 시험관 내에서 및 생체 내에서 DR6 길항제를 사용하기 위한 사용설명서를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 사용설명서는 신경학적 질환의 치료에 관한 것이다.
관련 측면에서, 본 발명의 실시태양은 제1 용기, 상기 용기 상의 라벨, 및 상기 용기 내에 담긴 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 상기 키트에서, 조성물은 적어도 하나의 종류의 포유동물 뉴런 세포에서 세포자멸을 억제하기에 효과적인 DR6 길항제를 포함하고, 상기 용기 상의 라벨, 또는 상기 용기에 포함된 포장 삽입물은 조성물이 적어도 하나의 종류의 포유동물 뉴런 세포에서 세포자멸을 억제하기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다. 임의로, 키트는 추가의 성분, 예를 들어 제약상 허용되는 버퍼를 포함하는 제2 용기; 및/또는 적어도 하나의 종류의 포유동물 뉴런 세포에서 세포자멸을 억제하기 위해 DR6 길항제를 사용하기 위한 사용설명서를 포함한다.
본 발명은 알츠하이머병의 치료에 사용하는 것을 포함하여 포유동물에서 신경학적 질환의 치료에 사용하기 위한 의약의 제조를 위한, 본원에서 설명되는 DR6 길항제 및 조성물의 용도를 추가로 제공한다.
도 1A는 인간 DR6 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (도 1A-1, 서열 2), 그의 유도된 아미노산 서열 (도 1A-2, 서열 1) 및 그의 도메인 구조의 개략도 (도 1A-3)를 보여준다. DR6 개략도에서, 추정 신호 펩티드, 시스테인 풍부 도메인 모티프, 막횡단 도메인, 및 사멸 도메인을 포함하는 도메인 경계가 표시된다. 이 개략도에서, 추정 신호 펩티드, 시스테인 풍부 도메인 모티프, 막횡단 도메인, 및 사멸 도메인의 추정 도메인 경계가 표시된다. 도 1B는 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) cDNA의 695 이소형의 뉴클레오티드 서열 (도 1B-1, 서열 5) 및 그의 유도된 아미노산 서열 (도 1B-2, 서열 6)을 보여준다. 도 1C는 인간 아밀로이드 전구체 단백질의 751 이소형의 아미노산 서열 (서열 7)을 보여준다. 도 1D는 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) cDNA의 770 이소형의 뉴클레오티드 서열 (도 1D-1, 서열 8) 및 그의 유도된 아미노산 서열 (도 1D-2, 서열 9)을 보여준다. 예를 들어, UniProtKB/Swiss-prot entry P05067 및 각각 Isoform ID P05067-1, Isoform ID P05067-4 및 Isoform ID P05067-8에 관련된 것을 포함하여 연관된 개시내용 참조 ( http://expasy.org/uniprot/P05067 ).
도 2A는 DR6이 발생 단계 E10.5 - E12.5에서 척수의 운동 및 연합 뉴런 및 후근신경절 (dorsal root ganglion) 뉴런을 포함하여 발생하는 중추 신경계에서 강하게 발현됨을 보여준다. 도 2B는 축삭 및 세포체 상에서 발현된 DR6 단백질을 보여준다. 도 2C는 분화하는 뉴런에서 발현된 DR6 mRNA를 보여준다.
도 3은 등쪽 척수 체외이식편 (dorsal spinal cord explant) 생존 분석에서 축삭 변성 및 뉴런 세포 사멸의 개략도를 보여주고; RNA 간섭 siRNA 물질을 GFP-발현 플라스미드와 함께 전기천공에 의해 배아 연합 뉴런 내로 도입하는 것이 표시된다.
도 4A는 작은 간섭 RNA에 의한 DR6 발현의 억제가 등쪽 척수 생존 분석에서 연합 축삭 변성을 차단하고 뉴런 세포 사멸을 억제함을 보여준다. 도 4B는 DR6 siRNA에 의해 차단된 변성 표현형을 구조하는 RNAi-내성 DR6 cDNA를 보여준다.
도 5는 길항 DR6 항체가 등쪽 척수 생존 분석에서 축삭 변성 및 뉴런 세포 사멸의 차단을 돕는다는 것을 보여준다.
도 6은 c-Jun N-말단 키나제 (JNK)의 약리학적 억제에 의한 DR6 하류에서의 세포내 신호 전달의 하향조절이 체외이식편 생존 분석에서 축삭 변성 및 뉴런 세포 사멸을 억제함을 보여주는 뉴런의 기계적인 개략도 및 사진을 보여준다.
도 7은 생체외 전체 배아 배양에서 척수 운동 및 중간뉴런 (interneuron)의 생존에 대한 길항 DR6 항체의 신경 보호 효과를 보여준다.
도 8은 DR6의 손실이 DR6 결실 배아의 척수 및 후근신경절에서 뉴런 세포 사멸을 감소시킴을 보여주는, 절단된 카스파제 3 항체로 면역염색된 E15.5 경수 절편의 사진을 제시한다.
도 9A는 절단된 카스파제-3을 발현하는 E15.5 DR6 KO 배아로부터 뉴런 세포의 정량을 보여주고, 이것은 DR6 +/- 한배 새끼 대조군 (DR6 het)에 비해 DR6-결실 배아에서 뉴런 세포 사멸의 약 50％ 감소를 제시한다. 도 9B는 DR6이 운동 축삭 변성에 필요함을 보여주는 세포의 사진을 제시하고, 이것은 신경영양성 성장 인자의 존재 및 부재 하에 정상 및 DR6 녹-아웃 (knock-out) 마우스의 비교로 확인된다. 도 9C는 손상-유도된 축삭 변성이 DR6 녹-아웃 마우스에서 지연됨을 보여주는 세포의 사진을 제시한다.
도 10A는 항-DR6 항체가 다양한 영양 인자 결핍 뉴런의 신경 성장 인자 (NGF) 공급 중단에 따른 축삭 변성을 억제함을 보여주는 뉴런의 사진을 제시한다. 도 10B는 연합, 감각 및 운동 뉴런에서 세포자멸성 세포체의 TUNEL 염색 시각화로부터의 추가의 사진 데이타를 제시하고, 이것은 항-DR6 항체가 다양한 영양 인자 결핍 뉴런의 변성을 억제함을 보여준다.
도 11A는 연합 축삭 변성이 DR6-Fc에 의해 지연될 수 있음을 보여주는 연합 뉴런의 사진을 제시한다. 도 11B는 NGF 공급 중단에 의해 유도된 감각 축삭 변성이 DR6-Fc에 의해 지연될 수 있음을 보여주는 감각 뉴런의 사진을 제시한다.
도 12A는 DR6-AP를 사용하여, 축삭 상의 DR6 결합 부위의 시각화를 보여주는 뉴런의 사진을 제시한다. 도 12B는 DR6 리간드 결합 부위가 NGF 결핍 후에 축삭으 로부터 상실됨을 보여주는, NGF 존재 및 부재 하에서의 뉴런의 사진을 제시한다. 도 12C는 베타 세크레타제 (BACE) 억제제가 NGF 공급 중단 후에 감각 축삭으로부터 DR6-AP 결합 부위의 소실을 차단할 수 있음을 보여주는, 발생 단계 E12.5에서 BAX 결실 감각 축삭 연구의 사진을 제시한다.
도 13A는 뉴런 세포로부터의 폴리펩티드를 DR6-AP (상단 좌측) 또는 항-N-APP 항체 (상단 우측)로 프로빙하고, 또한 폴리펩티드를 (1) DR6에 결합하는 그의 능력에 대해 선택한 후; (2) 항-N-APP 항체 (하단, "DR6-ECD 풀-다운 (pull-down)")로 프로빙하는 다양한 웨스턴 (Western) 블로팅 절차로부터 얻은 데이타의 사진을 제시한다. 상기 데이타를 통해 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)이 DR6 엑토도메인 (ectodomain)-회합 리간드로서 확인된다. 도 13B는 DR6-AP로 프로빙된 축삭 조건화 배지에서 DR6 리간드 (APP 폴리펩티드 포함)의 시각화를 허용하는 다양한 블로팅 (blotting) 실험으로부터 얻은 데이타의 사진이다. 상기 블로팅 데이타를 통해 35 kDa의 N-말단 APP를 포함하여 많은 APP 폴리펩티드 및 C99-APP 및 C83/C89 APP 폴리펩티드를 확인한다.
도 14A는 APP 엑토도메인의 탈락 (shedding)이 NGF 결핍 후에 조기에 발생함을 보여주는 뉴런의 사진을 제시한다. 도 14B는 DR6 엑토도메인이 배양된 세포에 의해 생산된 APP에 결합함을 보여주는 세포의 사진을 제시한다. 도 14C는 DR6이 감각 축삭 상의 N-APP에 대한 주요 수용체이고, APP 결합 부위가 DR6 결실 마우스의 뉴런 세포에서 유의하게 결핍됨을 보여주는 세포의 사진을 제시한다. 도 14D는 DR6 기능-차단 항체가 DR6 엑토도메인과 N-APP 사이의 상호작용을 붕괴시킴을 보여 주는 세포의 사진을 제시한다.
도 15A는 N-말단 APP에 대한 폴리클로날 항체가 연합 축삭 분석에서 축삭 변성을 차단함을 보여주는 뉴런의 사진을 제시한다. 도 15B는 N-말단 APP에 대한 폴리클로날 항체 및 22C11 항-APP 모노클로날 항체가 NGF 제거에 의해 유도된 국소 축삭 변성을 억제함을 보여주는 뉴런의 사진을 제시한다. 도 15C는 β-세크레타제 (BACE) 활성의 억제에 의해 차단된 축삭 변성이 N-APP의 첨가에 의해 구제될 수 있음을 보여주는 뉴런의 사진을 제시한다. 도 15D는 RNAi에 의한 APP 제거가 뉴런 세포를 N-APP에 의해 유도된 사멸에 대해 감작시킴을 보여주는 뉴런의 사진을 제시한다.
도 16A는 DR6 기능이 N-APP 유도 축삭 변성에 필요하지만, Abeta에 의해 촉발된 변성에는 필요하지 않음을 보여주는 뉴런의 사진을 제시한다. 도 16B는 기능 차단 DR6 항체가 Abeta에 의해 촉발된 축삭 변성을 차단하지 못함을 보여주는 뉴런의 사진을 제시한다.
도 17A는 축삭 변성이 JNK 및 상류의 카스파제-8의 억제에 의해 지연되지만 하류의 카스파제-3에 의해서는 지연되지 않음을 보여주는 뉴런의 사진을 제시한다. 도 17B는 카스파제-3이 세포체에서, 카스파제-6이 축삭에서 기능함을 보여주는, E12.5 체외이식편 배양액으로부터의 운동 뉴런의 사진을 제시한다. 도 17C는 카스파제-3이 축삭 변성에 필요하지 않지만, BAX는 필요함을 보여주는 감각 뉴런의 사진을 제시한다. 도 17D는 카스파제-3이 세포체에서 기능하고, 카스파제-6이 축삭에서 기능함을 보여주는 연합 뉴런의 사진을 제시한다.
본원에서 설명되고 언급되는 기술 및 과정은 일반적으로 당업자가 잘 이해하고 있고, 통상적인 방법, 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y]에 기재된 널리 사용되는 분자 클로닝 방법을 사용하여 통상적으로 이용된다. 적절한 경우, 시판되는 키트 및 시약의 사용을 수반하는 과정은 달리 언급되지 않으면 제조사에 의해 규정된 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 일반적으로 수행된다.
본 발명의 방법 및 분석을 설명하기 전에, 본 발명이 물론 변할 수 있는, 본원에서 설명되는 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구성체 및 시약으로 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 것으로서 단지 첨부되는 청구의 범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
본원 명세서 및 첨부되는 청구의 범위에서 사용되는 단수 형태인 부정관사 ("a"), "및" 및 정관사 ("the")는 달리 분명하게 문맥에서 언급되지 않으면 복수 형태를 포함함을 알아야 한다. 따라서, 예를 들어 "유전자 변형"은 복수의 유전자 변형을 포함하고, "프로브"의 언급은 하나 이상의 프로브 및 당업자에게 공지된 그의 동등물 등에 대한 언급을 포함한다. 명세서 및 첨부되는 청구의 범위에서 언급되는 모든 숫자 (예를 들어 아미노산 22-81, 1-354 등)는 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 언급되는 모든 간행물은 그 간행물이 그와 관련하여 언급되는 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 본원에서 언급되는 간행물은 본원의 출원일 이전의 그의 개시 내용에 대해 인용된다. 여기서, 그 어느 것도 본 발명자들이 본 발명의 최우선일 또는 우선일에 의해 간행물보다 선행한다고 말하는 것이 아님을 이해하여야 한다. 또한, 실제 공개일은 제시된 것과 상이할 수 있고, 별도의 확인을 필요로 할 수 있다.
I. 정의
용어 "아밀로이드 전구체 단백질" 또는 "APP"는 APP pre-mRNA에 의해 코딩되는 다양한 폴리펩티드 이소형, 예를 들어 각각 도 1B-1D에 제시된 APP695, APP751 및 App770 이소형 (APP pre-mRNA의 선택적으로 스플라이싱된 전사체로부터 번역된 이소형), 및 APP 이소형의 번역후 프로세싱된 부분을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, APP 유전자로부터 전사된 APP pre-mRNA는 선택적인 엑손 스플라이싱을 거쳐 많은 이소형을 생성시킨다 (예를 들어, [Sandbrink et al., Ann NY Acad. Sci. 777: 281-287 (1996)]; 및 PubMed NCBI 단백질 로커스 기탁 번호 P05067과 관련한 정보 참조). 상기 선택적인 엑손 스플라이싱은 695, 751, 및 770개 아미노산의 3개의 주요 이소형을 생성시킨다 (예를 들어, [Kang et al., Nature 325: 733-736 (1987)]; [Kitaguchi et al., Nature 331: 530-532 (1988)]; [Ponte et al., Nature 331: 525-527 (1988)]; 및 [Tanzi et al., Nature 331: 528-532 (1988)] 참조). 상기 이소형 중 2개의 이소형 (App751 및 APP770)은 세린 프로테아제 억제제의 쿠니츠 (Kunitz) 패밀리 (KPI)에 고도로 상동성인 56개 잔기 삽입체를 함유하고, 보편적으로 널리 발현된다. 이와 대조적으로, KPI 모티프가 결여된 보다 짧은 이소형인 APP695는 신경계, 예를 들어 뉴런 및 아교 세포에서 우세하게 발현되고, 이 때문에 종종 "뉴런 APP"로 불린다 (예를 들어, 문헌 [Tanzi et al., Science 235: 880-884 (1988)]; [Neve et al., Neuron 1: 669-677 (1988)]; 및 [Haas et al., J. Neurosci 11: 3783-3793 (1991)] 참조). 695, 751 및 770을 포함하는 APP 이소형은 유의한 번역후 프로세싱 사건을 겪는다 (예를 들어, [Esch et al. 1990 Science 248:1122-1124]; [Sisodia et al. 1990 Science 248:492-495] 참조). 예를 들어, 상기 각각의 이소형은 다양한 세크레타제 및/또는 세크레타제 복합체에 의해 절단되고, 이에 의해 APP 엑토도메인을 함유하는 N-말단 분비된 폴리펩티드 (sAPPα 및 sAPPβ)를 포함하는 APP 단편이 생성된다. 알파-세크레타제 또는 별법으로 베타-세크레타제에 의한 절단을 통해 각각 가용성 N-말단 APP 폴리펩티드인 sAPPα 및 sAPPβ가 생성되어 세포 외로 방출되고, 대응하는 막-앵커링된 (anchored) C-말단 단편인 C83 및 C99가 유지된다. 감마-세크레타제에 의한 C83의 후속적인 프로세싱에 의해 P3 폴리펩티드가 생성된다. 이는 주요 분비 경로이고, 아밀로이드 형성성 (amyloidogenic)이 아니다. 별법으로, C99의 프레세닐린/니카스트린-매개된 감마-세크레타제 프로세싱은 아밀로이드 베타 폴리펩티드, 즉 아밀로이드-베타 40 (Abeta40) 및 아밀로이드-베타 42 (Abeta42), 아밀로이드 플라크 (plaque)의 주요 성분, 및 세포독성 C-말단 단편, 감마-CTF (50), 감마-CTF (57) 및 감마-CTF (59)를 방출시킨다. 증거는 각각의 절단 사건의 상대적인 중요성이 세포 종류에 의해 결정됨을 제안한다. 예를 들어, 비-뉴런 세포는 Abeta 서열 내의 APP를 절단하여 Abeta의 형성을 방지하는 α-세크레타제 경로(들)에 의해 APP를 우선적으로 프로세싱한다 (예를 들어, [Esch et al. 1990 Science 248:1122-1124]; [Sisodia et al. 1990 Science 248:492-495] 참조). 이와 대조적으로, 뉴런 세포는 β-세크레타제 경로(들)에 의해 APP695의 훨씬 더 큰 부분을 프로세싱하고, 적어도 2개의 효소 클래스의 조합 활성에 의해 무손상 Abeta를 생성시킨다. 뉴런 세포에서, β-세크레타제(들)은 Abeta 도메인의 아미노 말단에서 APP695를 절단하여 별개의 N-말단 단편 (sAPPβ)을 방출한다. 또한, γ-세크레타제(들)은 카르복시 말단의 선택적인 부위에서 APP를 절단하여 40 (Abeta40) 또는 42개 아미노산 길이 (Abeta42)의 Abeta 종을 생성시킨다 (예를 들어, [Seubert et al. 1993 Nature 361:260-263]; [Suzuki et al. 1994 Science 264:1336-1340]; 및 [Turner et al. 1996 J. Biol. Chem. 271:8966-8970] 참조).
본원에서 사용될 때 용어 "APP", "APP 단백질" 및 "APP 폴리펩티드"는 천연 APP 서열 및 APP 변이체 및 그의 프로세싱된 단편을 포함한다. 상기 용어는 인간을 포함하여 다양한 포유동물에서 발현된 APP를 포함한다. APP는 다양한 인간 조직 계통에서 자연 발생하는 바와 같이 내인성으로 발현될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 발현될 수 있다. "천연 서열 APP"는 자연에서 유도되는 APP와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 (예를 들어, 695, 751 및 770 이소형 또는 그의 프로세싱된 부분)를 포함한다. 따라서, 천연 서열 APP는 인간을 포함하는 임의의 포유동물로부터 자연 발생하는 APP의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 천연 서열 APP는 자연에서 단리될 수 있거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열 APP"는 구체적으로 자연 발생하는 프로세싱된 및/또는 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열을 함유하는 가용성 형태), 자연 발생하는 변이체 형태 (예를 들어, 선택적으로 스플라이싱된 및/또는 단백질 분해 방식으로 프로세싱된 형태) 및 자연 발생하는 대립유전자 변이체를 포함한다. APP 변이체는 천연 서열 APP의 단편 또는 결실 돌연변이체를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시태양에서 유용한 APP 폴리펩티드는 상기에서 및 다음 비-제한 실시예에서 설명되는 것을 포함한다. 상기 예시적인 형태를 본 발명의 다양한 실시태양에서 사용하기 위해 선택할 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, APP 폴리펩티드는 전장 APP 이소형, 예를 들어 도 1B-1D에 도시된 APP695 및/또는 APP751 및/또는 APP770 이소형을 포함한다. 본 발명의 다른 실시태양에서, APP 폴리펩티드는 APP의 번역후 프로세싱된 이소형, 예를 들어 세크레타제, 예를 들어 α-세크레타제, β-세크레타제 또는 γ-세크레타제에 의해 절단된 APP 폴리펩티드 (예를 들어 가용성 N-말단 단편, 예를 들어 sAPPα 또는 sAPPβ)를 포함한다. 본 발명의 관련 실시태양에서, 하나 이상의 특이적인 도메인, 예를 들어 N-말단 엑토도메인 (예를 들어, [Quast et al., FASEB J. 2003; 17 (12): 1739-41] 참조), 헤파린 결합 도메인 (예를 들어, [Rossjohn et al., Nat Struct Biol. 1999 Apr; 6 (4): 327-31] 참조), 구리 타입 II (예를 들어, [Hesse et al., FEBS Letters 349(1): 109-116 (1994)] 참조) 또는 쿠니츠 프로테아제 억제제 도메인 (예를 들어, [Ponte et al., Nature; 331 (6156): 525-7 (1988)] 참조)을 포함하는 APP 폴리펩티드가 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, APP 폴리펩티드는 본원에 개시된 DR6 길항제, 예를 들어 항체 또는 DR6 면역어드헤신에 의해 인식되는 에피토프, 예를 들어 APP695의 아미노산 22-81을 포함하는 것으로 관찰된 서열, 즉 모노클로날 항체 22C11에 의해 결합되는 에피토프를 포함하는 서열을 포함한다 (예를 들어, [Hilbich et al., Journal of Biological Chemistry, 268(35): 26571-26577 (1993)] 참조).
본 발명의 특정 실시태양에서, APP 폴리펩티드, 예를 들어 특정 N-말단 또는 C-말단 아미노산을 포함하지 않는 APP 폴리펩티드 (예를 들어 실시예 12에 논의된 인간 재조합 N-APP 폴리펩티드), 쿠니츠 프로테아제 억제제 도메인을 포함하지 않는 APP 폴리펩티드 (예를 들어 APP695), 또는 알츠하이머 베타 아밀로이드 단백질 (Abeta) 서열을 포함하지 않는 APP 폴리펩티드 (예를 들어 Aβ40 및/또는 Aβ42 서열을 포함하지 않는 폴리펩티드인 sAPPβ)는 하나 이상의 특이적인 도메인 또는 서열을 포함하지 않는다 (예를 들어 [Bond et al., J. Struct Biol. 2003 Feb; 141 (2): 156-70] 참조). 본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명의 실시태양에서 사용되는 APP 폴리펩티드는 하나 이상의 도메인 또는 서열은 포함하지만 다른 도메인 또는 서열은 포함하지 않는다. 예를 들어, APP 폴리펩티드는 N-말단 엑토도메인 (또는 DR6 길항제, 예를 들어 모노클로날 항체 22C11에 의해 결합되는 것으로 관찰된 적어도 그의 일부)을 포함하지만, 하나 이상의 세크레타제 절단 부위에 대해 C-말단인 도메인 또는 서열, 예를 들어 베타 아밀로이드 (Abeta) 서열 (예를 들어 sAPPα 또는 sAPPβ)을 포함하지 않는다.
용어 "세포외 도메인", "엑토도메인" 또는 "ECD"는 본질적으로 막횡단 및 세포질 도메인이 존재하지 않는 APP의 형태를 의미한다. 통상적으로, 가용성 ECD는 1％ 미만의 상기 막횡단 및 세포질 도메인을 가질 것이고, 바람직하게는 0.5％ 미만의 상기 도메인을 가질 것이다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 확인된 임의의 막횡단 도메인(들)은 소수성 도메인 종류를 확인하기 위해 당업계에서 통상 사용되는 기준에 따라 확인됨이 이해될 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계는 상이할 수 있지만, 가장 가능하게는 초기에 확인된 도메인의 어느 한 말단에 약 5개 이하의 아미노산만큼 상이할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, ECD는 막횡단 및 세포질 또는 세포내 도메인이 존재하지 않는 (및 막 결합되지 않은) 폴리펩티드의 가용성 세포외 도메인 서열로 이루어질 것이다.
용어 "APP 변이체"는 도 1B-1D에 도시된 아미노산 서열을 갖는 인간 APP와 적어도 약 80％, 바람직하게는 적어도 약 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 보다 바람직하게는 적어도 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 가장 바람직하게는 적어도 약 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아래에서 규정되는 APP 폴리펩티드, 또는 그의 가용성 단편, 또는 그의 가용성 세포외 도메인을 의미한다. 상기 변이체는 예를 들어 다른 종으로부터의 변이체를 포함하여, 하나 이상의 아미노산 잔기가 도 1B-1D의 전장 또는 성숙 서열의 N- 또는 C-말단에 부가되거나 이로부터 결실된 APP 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 내부 서열 또는 도메인에 삽입되거나 결실된 APP 폴리펩티드를 포함하지만, 천연-서열 APP 폴리펩티드는 포함하지 않는다.
"DR6" 또는 "DR6 수용체"는 그의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 각각 1A-1 - 1A-2에 나타낸, 당업계에서 언급되는 수용체를 포함한다. 문헌에 "DR6" 또는 "TR9"로 언급되는 TNF 수용체 패밀리 멤버에 대한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열이 기재되어 있다 ([Pan et al., Science, 276:111-113 (1997)]; 미국 특허 6,358,508; 6,667,390; 6,919,078; 6,949,358 참조). 인간 DR6 수용체는 추정 신호 서열 (아미노산 1-41), 세포외 도메인 (아미노산 42-349), 막횡단 도메인 (아미노산 350-369), 이어서 세포질 도메인 (아미노산 370-655)을 갖는 655개 아미노산의 단백질 (도 1A-2 참조)이다. 본원에서 사용될 때, 용어 "DR6 수용체"는 천연 서열 수용체 및 수용체 변이체를 포함한다. 상기 용어는 인간을 포함하는 다양한 포유동물에서 발현되는 DR6 수용체를 포함한다. DR6 수용체는 다양한 인간 조직 계통에서 자연 발생하는 바와 같이 내인성으로 발현될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 발현될 수 있다. "천연 서열 DR6 수용체"는 자연에서 유도되는 DR6 수용체와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 DR6 수용체는 인간을 포함하는 임의의 포유동물로부터 자연 발생하는 DR6 수용체의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 천연 서열 DR6 수용체는 자연에서 단리될 수 있거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열 DR6 수용체"는 구체적으로 자연 발생하는 수용체의 말단절단된 (truncated) 또는 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열을 함유하는 가용성 형태), 자연 발생하는 변이체 형태 (예를 들어, 선택적으로 스플라이싱된 형태) 및 자연 발생하는 대립유전자 변이체를 포함한다. 수용체 변이체는 천연 서열 DR6 수용체의 단편 또는 결실 돌연변이체를 포함할 수 있다.
용어 "세포외 도메인" 또는 "ECD"는 본질적으로 막횡단 및 세포질 도메인이 존재하지 않는 DR6 수용체의 형태를 의미한다. 통상적으로, 가용성 ECD는 1％ 미만의 상기 막횡단 및 세포질 도메인을 가질 것이고, 바람직하게는 0.5％ 미만의 상기 도메인을 가질 것이다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 확인된 임의의 막횡단 도메인(들)은 소수성 도메인 종류를 확인하기 위해 당업계에서 통상 사용되는 기준에 따라 확인됨이 이해될 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계는 상이할 수 있지만, 가장 가능하게는 초기에 확인된 도메인의 어느 한 말단에 약 5개 이하의 아미노산만큼 상이할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, ECD는 막횡단 및 세포질 또는 세포내 도메인이 존재하지 않는 (및 막 결합되지 않은) 폴리펩티드의 가용성 세포외 도메인 서열로 이루어질 것이다.
용어 "DR6 변이체"는 도 1A에 도시된 추정된 아미노산 서열을 갖는 인간 DR6와 적어도 약 80％, 바람직하게는 적어도 약 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 보다 바람직하게는 적어도 약 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 가장 바람직하게는 적어도 약 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아래에서 규정되는 DR6 폴리펩티드, 또는 그의 가용성 단편, 또는 그의 가용성 세포외 도메인을 의미한다. 상기 변이체는 예를 들어 다른 종으로부터의 변이체를 포함하여, 하나 이상의 아미노산 잔기가 도 1A의 전장 또는 성숙 서열의 N- 또는 C-말단에 부가되거나 이로부터 결실된 DR6 폴리펩티드, 또는 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 내부 서열 또는 도메인에 삽입되거나 결실된 DR6 폴리펩티드를 포함하지만, 천연-서열 DR6 폴리펩티드는 포함하지 않는다. 임의로, DR6 변이체는 10개 이하의 보존적 아미노산 치환이 존재하는, 도 1A의 아미노산 1-349 또는 42-349를 포함하는 DR6 수용체의 가용성 형태를 포함한다. 바람직하게는, 상기 변이체는 아래에서 규정되는 바와 같이 DR6 길항제로서 작용한다.
용어 "DR6 길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 시험관 내에서, 계 내에서 (in situ), 생체 내에서 또는 생체 외에서 뉴런 세포 또는 조직에서 그의 동족체 리간드, 바람직하게는, 그의 동족체 리간드 APP에 결합하거나 또는 하나 이상의 세포내 신호(들) 또는 세포내 신호 전달 경로(들)을 활성화시키는 DR6 수용체의 능력을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화하는 임의의 분자를 포함한다. 예로서, DR6 길항제는 뉴런 세포 또는 조직에서 하나 이상의 세포내 신호(들) 또는 세포내 신호 전달 경로(들)을 활성화시키는 DR6 수용체의 능력을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시켜 뉴런 세포 또는 조직에서 세포자멸 또는 세포 사멸을 야기할 수 있다. DR6 길항제는 동족체 리간드의 DR6에 대한 결합, DR6과 그의 동족체 리간드 (예를 들어 APP) 사이의 복합체의 형성, DR6 수용체의 올리고머화, DR6 수용체와 이종 보조 수용체 사이에 복합체의 형성, 동족체 리간드의 DR6 수용체/이종 보조 수용체 복합체에 대한 결합, 또는 DR6 수용체, 이종 보조 수용체와 그의 동족체 리간드 사이의 복합체의 형성의 차단, 억제, 또는 중화를 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 메카니즘에 의해 DR6을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 작용을 수행할 수 있다. DR6 길항제는 직접 또는 간접 방식으로 기능할 수 있다. 본 발명에서 고려되는 DR6 길항제는 APP 항체, DR6 항체, 면역어드헤신, DR6 면역어드헤신, DR6 융합 단백질, DR6의 공유 변형된 형태, DR6 변이체 및 그의 융합 단백질, 또는 DR6의 보다 큰 올리고머 (이량체, 응집체) 또는 DR6의 단독중합체 또는 이종중합체 형태, 소분자, 예를 들어 JNK 신호 전달 케스케이드의 약리학적 억제제, 예를 들어 Jun N-말단 키나제 JNK 활성의 소분자 및 펩티드 억제제, 신호 전달 경로에서 JNK의 상류에서 기능하는 단백질 키나제 MLK 및 MKK 활성의 약리학적 억제제, JNK의 스캐폴드 (scaffold) 단백질 JIP-1에 대한 결합의 약리학적 억제제, JNK의 그의 기질, 예를 들어 c-Jun 또는 AP-I 전사 인자 복합체에 대한 결합의 약리학적 억제제, 그의 기질, 예를 들어 JNK 결합 도메인 (JBD) 펩티드 및/또는 JNK의 기질 결합 도메인 및/또는 JNK 기질 인산화 부위를 포함하는 펩티드 억제제의 JNK-매개된 인산화의 약리학적 억제제, ATP의 JNK에 대한 결합을 차단하는 소분자, 및 기질의 JNK에 대한 결합을 차단하는 소분자를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
DR6 길항제가 뉴런 세포 또는 조직에서 하나 이상의 세포내 신호(들) 또는 세포내 신호 전달 경로(들)을 활성화시키는 DR6 수용체의 능력을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는지를 결정하기 위해서, 예를 들어, 다양한 뉴런 세포 또는 조직에 대한 (실시예에서 설명되는 바와 같이) 및 뇌졸중/뇌 허혈의 생체 내 모델, 신경변성 질병의 생체 내 모델, 예를 들어 파킨슨 (Parkinson) 병의 마우스 모델; 알츠하이머병의 마우스 모델; 근위축성 측삭 경화증 ALS의 마우스 모델; 척수 근육 위축증 SMA의 마우스 모델; 국소 및 전뇌 허혈의 마우스/래트 모델, 예를 들어 통상적인 경동맥 폐색증 모델 또는 중대 뇌동맥 폐색증 모델; 또는 생체 외에서의 전체 배아 배양액에서의 DR6 길항제의 효과(들)을 평가하기 위한 분석을 실시할 수 있다. 예를 들어 아래에서 설명하거나 또는 당업계에 공지되고 문헌에 기재된 바와 같이 공지의 시험관내 또는 생체내 분석 포맷으로 다양한 분석을 실시할 수 있다 (예를 들어, [McGowan et al., TRENDS in Genetics, 22:281-289 (2006)]; [Fleming et al., NeuroRx, 2:495-503 (2005)]; [Wong et al., Nature Neuroscience, 5:633-639 (2002)] 참조). DR6 길항제가 뉴런 세포 또는 조직에서 하나 이상의 세포내 신호(들) 또는 세포내 신호 전달 경로(들)을 활성화시키는 DR6 수용체의 능력을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는지를 결정하기 위한 분석의 하나의 실시태양은 DR6 길항제 또는 잠재적인 DR6 길항제 (즉, 관심있는 분자)의 존재 또는 부재 하에 DR6 및 APP를 합한 후; 상기 DR6 길항제 또는 잠재적인 DR6 길항제의 존재 하에 APP에 대한 DR6의 결합의 억제를 검출하는 것을 포함한다.
"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 용어 "핵산"은 이중 가닥 핵산 분자의 하나의 가닥 또는 두 가닥 모두를 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.
"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 구역, 프로모터 서열, 다른 제어 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 구역 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.
용어 "아미노산" 및 "아미노산들"은 모든 자연 발생 L-알파-아미노산을 의미한다. 상기 정의는 노르류신, 오르니틴 및 호모시스테인을 포함하는 의미를 갖는다. 아미노산은 단일문자 또는 3문자 명명법으로 확인된다.
Asp D 아스파르트산 Ile I 이소류신
Thr T 트레오닌 Leu L 류신
Ser S 세린 Tyr Y 티로신
Glu E 글루탐산 Phe F 페닐알라닌
Pro P 프롤린 His H 히스티딘
Gly G 글라이신 Lys K 라이신
Ala A 알라닌 Arg R 아르기닌
Cys C 시스테인 Trp W 트립토판
Val V 발린 Gln Q 글루타민
Met M 메티오닌 Asn N 아스파라긴
도면에서, 특정 다른 단일문자 또는 3문자 명명법을 사용하여 서열 내의 제시된 위치에서 2 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드를 언급 및 확인할 수 있다.
본원에 개시된 다양한 펩티드 또는 단백질을 설명하기 위해 사용될 때 "단리된"은 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 일반적으로 펩티드 또는 단백질의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 펩티드 또는 단백질은 (1) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 또는 (3) 질량 분광기 또는 펩티드 매핑 (mapping) 기술에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 물질은 그의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 펩티드 또는 단백질을 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 펩티드 또는 단백질은 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 확인된 서열에 대해 "아미노산 서열 동일성 비율 (％)"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우 최대 서열 동일성 비율을 달성하도록 갭 (gap)을 도입시킨 후, 참조 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 본원에서 정의되고, 임의의 보존적 치환은 서열 동일성의 일부로 간주하지 않는다. 아미노산 서열 동일성 비율을 결정하기 위한 정렬은 비교되는 전장 서열에 걸친 최대 정렬의 달성에 필요한 할당 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있는, 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 달성할 수 있다. 본원의 목적을 위해, 아미노산 동일성 비율값은 그 소스 코드가 미국 저작국 (United States Copyright Office, 미국 워싱턴 디. 씨. 20559)에서 사용자 제출서류로 출원되어 미국 저작권 TXU510087 하에 등록된 제넨테크, 인크. (Genentech, Inc.) 소유의 서열 비교 컴퓨터 프로그램인 ALIGN-2를 사용하여 얻을 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 (미국 캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코)로부터 공개적으로 입수가능하다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
혼성화 반응의 "엄격성"은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있고, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도 및 염 농도에 따라 경험적으로 계산된다. 일반적으로, 프로브가 길수록 적절한 어닐링을 위해 더 높은 온도가 필요하고, 프로브가 짧으면 보다 낮은 온도가 필요하다. 혼성화는 일반적으로 상보성 가닥이 그의 융점 미만의 환경에 존재할 때 변성 DNA가 재어닐링되는 능력에 따라 결정된다. 프로브와 혼성화 서열 사이의 요구되는 동일성 정도가 클수록 사용될 수 있는 상대적 온도가 더 높다. 그 결과, 보다 높은 상대 온도는 반응 조건을 보다 엄격하게 만들고, 보다 낮은 온도는 덜 엄격하게 만드는 경향이 있다. 혼성화 반응의 엄격성의 추가의 상세한 내용 및 설명에 대해서는 문헌 [Ausubel et al.. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)]을 참조한다.
본원에서 정의되는 "고엄격성 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도의 사용; 50℃의 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1％ 소듐 도데실 술페이트; (2) 혼성화 동안 변성제의 사용; 50％ (v/v) 포름아미드 + 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ Ficoll/O.1％ 폴리비닐피롤리돈/5O mM 인산나트륨 버퍼 (pH 6.5) + 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨 (42℃); 또는 (3) 42℃의 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 및 55℃의 50％ 포름아미드를 사용한 세척, 이어서 55℃의 EDTA 함유 0.1 x SSC로 구성된 고엄격성 세척과 함께 50％ 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1％ 피로인산나트륨, 5 x 덴하르트 (Denhardt) 용액, 초음파 처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1％ SDS, 및 10％ 덱스트란 술페이트 (42℃)의 사용으로 확인된다.
"중등 엄격성 조건"은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989]에 기재된 바와 같이 확인할 수 있고, 20％ 포름아미드, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x 덴하르트 용액, 10％ 덱스트란 술페이트, 및 20 mg/ml 변성 전단 처리 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃에서의 철야 인큐베이션, 이어서 약 37-50℃의 1 x SSC를 사용한 필터의 세척을 포함한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등의 조정 방법을 인식할 것이다.
용어 "프라이머" 또는 "프라이머들"은 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.
용어 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체 내에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 예를 들어, 원핵생물에 적합한 제어 서열은 프로모터, 임의로 작동유전자 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 예비 서열 또는 분비 리더용 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비 단백질로서 발현될 경우 폴리펩티드용 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 줄 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 위치할 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접함을 의미하고, 분비 리더의 경우 인접하고 리딩 페이스 (reading phase)로 존재한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 상기 부위가 존재하지 않을 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상의 용례에 따라 사용된다.
본원에서 사용될 때 용어 "표지"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅되거나 융합되고, 컨쥬게이팅되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변경을 촉매할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역어드헤신"은 이종 단백질 ("어드헤신")의 "결합 특이성"을 면역글로불린 불변 도메인의 효과기 기능과 조합한 항체 유사 분자를 나타낸다. 구조적으로, 면역어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 이외의 (즉, "이종"인) 다른 목적하는 결합 특이성을 갖는 아미노산 서열과 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합체를 포함한다. 면역어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 일반적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접한 아미노산 서열이다. 면역어드헤신 내의 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린, 예를 들어 IgG-1, IgG-2, IgG-3, 또는 IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM으로부터 얻을 수 있다.
"DR6 수용체 항체", "DR6 항체", 또는 "항-DR6 항체"는 적어도 하나의 형태의 DR6 수용체, 바람직하게는 인간 DR6 수용체, 예를 들어 도 1A에 제시된 DR6 서열 또는 그의 세포외 도메인 서열에 결합하는 항체를 넓은 의미로 언급하기 위해 사용된다. 임의로, DR6 항체는 이종 서열 또는 분자에 융합되거나 연결된다. 바람직하게는, 이종 서열은 항체가 보다 고차원의 또는 올리고머 복합체를 형성하는 것을 허용하거나 돕는다. 용어 "항-DR6 항체" 및 그의 문법적 동등물은 구체적으로 아래 실시예 섹션에서 설명되는 DR6 모노클로날 항체를 포함한다. 임의로, DR6 항체는 DR6 수용체에 결합하지만, 종양 괴사 인자 패밀리의 임의의 추가의 수용체 (예를 들어, DR4, DR5, TNFR1, TNFR2, Fas)에는 결합하거나 교차반응하지 않는다. 임의로, 본 발명의 DR6 항체는 BIAcore 결합 분석으로 측정시에 약 0.067 nM 내지 약 0.033 μM의 농도에서 DR6 수용체에 결합한다.
용어 "항-APP 항체", "APP 항체" 및 문법적 동등물은 넓은 의미로 사용되고, 적어도 하나의 형태의 APP, 바람직하게는 인간 APP, 예를 들어 본원에서 구체적으로 설명되는 APP 폴리펩티드 이소형에 결합하는 항체를 의미한다. 바람직하게는, APP 항체는 DR6 길항제 항체이다. 예를 들어, 본원에 개시된 DR6 길항제의 제조 및/또는 확인 방법에서, APP의 하나 이상의 이소형 및/또는 그의 일부가 동물 (예를 들어, 모노클로날 항체 생성 방법의 일부로서의 마우스)을 면역화시키기 위해 면역원으로서 및/또는 화합물의 라이브러리 (예를 들어 재조합 항체 라이브러리)를 스크리닝하기 위해 프로브로서 사용될 수 있다. 본 발명의 실시태양에 유용한 전형적인 APP 폴리펩티드는 다음과 같은 비-제한적인 실시예를 포함한다. 이들 예시적인 형태는 본 발명의 다양한 실시태양에서 사용하기 위해 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, APP 폴리펩티드는 전장 APP 이소형, 예를 들어 도 1에 제시된 APP695 및/또는 APP751 및/또는 APP770 이소형을 포함한다. 본 발명의 다른 실시태양에서, APP 폴리펩티드는 APP의 번역후 프로세싱된 이소형, 예를 들어 세크레타제, 예를 들어 α-세크레타제, β-세크레타제 또는 γ-세크레타제에 의해 절단된 APP 폴리펩티드 (예를 들어 가용성 N-말단 단편, 예를 들어 sAPPα 또는 sAPPβ)를 포함한다. 본 발명의 관련 실시태양에서, 하나 이상의 특이적인 도메인, 예를 들어 N-말단 엑토도메인 (예를 들어, [Quast et al., FASEB J. 2003; 17 (12): 1739-41] 참조), 헤파린 결합 도메인 (예를 들어, [Rossjohn et al., Nat Struct Biol. 1999 Apr; 6 (4): 327-31] 참조), 구리 타입 II (예를 들어, [Hesse et al., FEBS Letters 349(1): 109-116 (1994)] 참조) 또는 쿠니츠 프로테아제 억제제 도메인 (예를 들어, [Ponte et al., Nature; 331 (6156): 525-7 (1988)] 참조)을 포함하는 APP 폴리펩티드가 선택될 수 있다. 본 발명의 일부 실시태양에서, APP 폴리펩티드는 본원에 개시된 DR6 길항제, 예를 들어 항체 또는 DR6 면역어드헤신에 의해 인식되는 에피토프, 예를 들어 APP695의 아미노산 22-81을 포함하는 것으로 관찰된 서열, 즉 모노클로날 항체 22C11에 의해 결합되는 에피토프를 포함하는 서열을 포함한다 (예를 들어, [Hilbich et al., Journal of Biological Chemistry, 268(35): 26571-26577 (1993)] 참조). 본 발명의 특정 실시태양에서, APP 폴리펩티드, 예를 들어 특정 N-말단 또는 C-말단 아미노산을 포함하지 않는 APP 폴리펩티드 (예를 들어 실시예 12에 논의된 인간 재조합 N-APP 폴리펩티드), 쿠니츠 프로테아제 억제제 도메인을 포함하지 않는 APP 폴리펩티드 (예를 들어 APP695), 또는 알츠하이머 베타 아밀로이드 단백질 (Abeta) 서열을 포함하지 않는 APP 폴리펩티드 (예를 들어 Aβ40 및/또는 Aβ42 서열을 포함하지 않는 폴리펩티드인 sAPPβ)는 하나 이상의 특이적인 도메인 또는 서열을 포함하지 않는다 (예를 들어 [Bond et al., J. Struct Biol. 2003 Feb; 141 (2): 156-70] 참조). 본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명의 실시태양에서 사용되는 APP 폴리펩티드는 하나 이상의 도메인 또는 서열은 포함하지만 다른 도메인 또는 서열은 포함하지 않는다. 예를 들어, APP 폴리펩티드는 N-말단 엑토도메인 (또는 DR6 길항제, 예를 들어 모노클로날 항체 22C11에 의해 결합되는 것으로 관찰된 적어도 그의 일부)을 포함하지만, 하나 이상의 세크레타제 절단 부위에 대해 C-말단인 도메인 또는 서열, 예를 들어 베타 아밀로이드 (Abeta) 서열 (예를 들어 sAPPα 또는 sAPPβ)을 포함하지 않는다. 임의로, 항-APP 항체는 DR6에 대한 APP 폴리펩티드의 결합을 억제하고, 본원에서 설명된 바와 같이 및/또는 정량적 세포-기반 결합 분석으로 측정시에 10 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml의 농도에서 APP 폴리펩티드에 결합할 것이다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.
"항체 단편"은 바람직하게는 그의 항원 결합 또는 가변 구역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 디아바디 (diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
"천연 항체"는 대체로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결의 수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄에서 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 사슬내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 이어서 많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인 (VL)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는다. 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인에 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인에 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 내의 서열에서 크게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용됨을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지 않는다. 이것은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 초가변 구역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 보다 보존도가 큰 부분은 프레임워크 구역 (FR)으로 언급된다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결부를 형성하고 일부 경우에 β-시트 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 구역에 의해 연결되는, 주로 β-시트 형태를 취하는 4개의 FR을 각각 포함한다. 각 사슬 내의 초가변 구역은 FR에 의해 매우 근접하게 함께 유지되고, 다른 사슬의 초가변 구역과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합에 직접 관여하지 않지만, 상이한 효과기 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)에서 항체의 참여를 보인다.
항체를 파파인으로 분해하면, 각각 단일 항원 결합 부위를 갖는, "Fab" 단편으로 언급되는 2개의 동일한 항원 결합 단편 및 잔여 "Fc" 단편이 생성되고, 이 명칭은 그의 쉽게 결정화되는 능력을 반영한다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 구역은 긴밀하게 비공유 회합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 구성된다. 상기 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 초가변 구역은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 규정한다. 종합적으로, 6개의 초가변 구역은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 초가변 구역만을 포함하는 Fv의 절반)도 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도이지만 항원을 인식하여 결합할 능력을 갖는다.
Fab 단편도 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 구역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 적어도 하나의 유리 티올기를 포함하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이의 힌지 시스테인을 갖는 한쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 당업계에 공지되어 있다.
임의의 척추동물종의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2개의 분명하게 상이한 종류의 하나로 분류될 수 있다.
그들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 상이한 클래스로 배정될 수 있다. 무손상 항체의 5가지 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 추가로 나누어질 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ로 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 잘 알려져 있다.
"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 내에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 요구되는 구조를 형성하게 하는 VH 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대해서는, 문헌 [Plueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 의미하고, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬 (VH-VL) 내의 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인은 다른 사슬의 상보성 도메인과 페어링하여 2개의 항원 결합 부위를 생성시키게 된다. 디아바디는 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 상세하게 기재되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 말하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수도 있는, 가능한 자연 발생 변이체를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 특이성이 높고, 단일 항원 부위에 대해 작용한다. 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 작용하는 상이한 항체를 일반적으로 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제에 비해, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 작용한다. 그의 특이성에 추가하여, 모노클로날 항체는 하이브리도마 배양에 의해 합성되고 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 변경 표현 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로서 생각하지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어 미국 특허 4,816,567 참조)에 의해 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 ([Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)])에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 요구되는 생물학적 활성을 보이는 한, 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성이고 사슬(들)의 나머지는 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 종류 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린) 및 상기 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 4,816,567; 및 [Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]). 본원에서 목적하는 키메라 항체는 비인간 영장류 (예, 구세계 원숭이, 예를 들어 개코원숭이, 붉은털 원숭이 또는 사이노몰거스 원숭이)에서 유래한 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 구역 서열을 포함하는 "프리머타이즈드 (primatized)" 항체를 포함한다 (미국 특허 5,693,780).
비인간 (예, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수여자의 초가변 구역의 잔기가 요구되는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비인간종 (공여 항체), 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류의 초가변 구역의 잔기로 치환된 인간 면역글로불린 (수여 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 구역 (FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기로 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수여 항체 또는 공여 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변경은 항체 성능을 보다 개선하기 위한 것이다. 일반적으로, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 하나, 일반적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비인간 면역글로불린의 초가변 루프에 대응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR에 대응한다. 인간화 항체는 또한 임의로 적어도 일부의 면역글로불린 불변 구역 (Fc), 일반적으로 인간 면역글로불린의 불변 구역을 포함할 것이다. 보다 상세한 내용에 대해서는, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "초가변 구역"은 항원 결합에 필요한 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 초가변 구역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3); [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]) 및/또는 "초가변 루프"로부터의 잔기 (예를 들어, 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인의 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3); [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)])를 포함한다. "프레임워크 구역" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 규정되는 바와 같은 초가변 구역 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기이다.
목적하는 항원에 "결합하는" 항체는 항체가 항원을 발현하는 세포를 표적화하기 위한 치료체 또는 진단제로서 유용하도록 충분한 친화도 및/또는 결합력으로 항원에 결합할 수 있는 것이다.
본 발명의 목적을 위해, "면역요법"은 비컨쥬게이팅된 또는 "네이키드 (naked)" 항체일 수 있거나, 또는 이종 분자(들) 또는 약제(들), 예를 들어 하나 이상의 세포독성제(들)과 컨쥬게이팅되거나 융합되어 "면역컨쥬게이트"를 생성시킬 수 있는 항체를 사용하여 포유동물 (바람직하게는 인간 환자)을 치료하는 방법을 의미할 것이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 항체는 (1) 로우리 (Lowry) 방법에 의해 측정시에 항체의 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵 (spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질할 때까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 한 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로 단리된 항체는 하나 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "태깅된 (tagged)"은 "태그 폴리펩티드"에 융합된 항체 또는 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 의미한다. 태그 폴리펩티드는 항체가 작용할 수 있는 에피토프를 제공하거나 일부 다른 기능, 예를 들어 일반적으로 항체 또는 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧게 올리고머화하는 능력 (예를 들어 류신 지퍼 도메인을 갖는 펩티드에서 발생)을 제공할 수 있는 잔기를 갖는다. 또한, 태그 폴리펩티드는 바람직하게는 태그 특이적 항체가 다른 에피토프에는 실질적으로 교차반응하지 않도록 매우 특유하다. 적합한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 적어도 6개의 아미노산 잔기, 보통 약 8 내지 약 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는, 약 10 내지 약 20개의 잔기)를 갖는다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 구역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하고 상기 수용체의 대립 유전자 변이체 및 선택적으로 스플라이싱된 형태를 포함하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체를 포함하는 것이다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이들은 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 포함한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 포함한다 ([Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)] 참고). FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)]; [Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994)]; 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]에 개시되어 있다. 미래에 확인되는 것을 포함하여 다른 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다. 또한, 이 용어는 모체 IgG의 태아로의 전달에 작용하는 신생아의 수용체 FcRn를 포함한다 ([Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)]). 본원에서 FcR은 다형성, 예를 들어 IgG1에 결합하는 수용체의 구역에 위치하는 아미노산 위치 158에 페닐알라닌 (F) 또는 발린 (V)을 생성시키는 FcγRIIIa를 코딩하는 유전자의 유전적 이형성을 포함한다. 동종접합성 발린 FcγRIIIa (FcγRIIIa-158V)는 동종접합성 페닐알라닌 FcγRIIIa (FcγRIIIa-158F) 또는 이종접합성 (FcγRIIIa-158F/V) 수용체에 비해 인간 IgG1에 대해 보다 높은 친화도를 갖고 시험관 내에서 증가된 ADCC를 매개하는 것으로 밝혀졌다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리올"은 다가 알콜 화합물을 넓게 의미한다. 폴리올은 예를 들어 임의의 수용성 폴리(알킬렌 옥사이드) 중합체일 수 있고, 직쇄 또는 분지쇄를 가질 수 있다. 바람직한 폴리올은 하나 이상의 히드록실 위치에서 화학기, 예를 들어 1 내지 4개의 탄소를 갖는 알킬기로 치환된 것을 포함한다. 일반적으로, 폴리올은 폴리(알킬렌 글리콜), 바람직하게는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG)이다. 그러나, 당업자는 다른 폴리올, 예를 들어, 폴리(프로필렌 글리콜) 및 폴리에틸렌-폴리프로필렌 글리콜 공중합체를 본원에서 설명되는 PEG에 대한 컨쥬게이션 기술을 사용하여 이용될 수 있음을 알 것이다. 폴리올은 당업계에 공지된 것 및 예를 들어 상업적으로 이용가능한 공급처, 예를 들어 넥타(등록상표) 코퍼레이션 (Nektar® Corporation)으로부터 입수가능한 것을 포함한다.
용어 "컨쥬게이트"는 함께 결합 또는 연결되는 것을 의미하기 위해 그의 가장 넓은 정의에 따라 본원에서 사용된다. 분자는 결합된 것처럼 작용 또는 기능할 때 "컨쥬게이팅된" 것이다.
표현 "유효량"은 목적하는 질환 또는 병태의 예방, 개선 또는 치료에 효과적인 물질 (예를 들어 DR6 길항제 등)의 양을 의미한다. 본 발명의 DR6 길항제가 변성 신경학적 질환 진행의 지연 또는 정지 또는 손상된 뉴런 세포 또는 조직의 복구 향상 및 적절한 신경 기능 회복에 유용할 것으로 생각된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는", "치료" 및 "요법"은 치료 요법, 예방 요법 및 억제 요법을 의미한다. 연속적인 치료 또는 투여는 1일 이상의 치료 중단 없이 적어도 1일을 기준으로 한 치료를 의미한다. 간헐적 치료 또는 투여, 또는 간헐 방식의 치료 또는 투여는 연속적이 아니라 특성상 주기적인 치료를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "질환"은 일반적으로 본원에서 설명되는 DR6 길항제를 사용한 치료에 의해 개선되는 임의의 병태를 의미한다. 질환은 만성 및 급성 질환, 및 포유동물을 문제되는 질환에 걸리기 쉽게 만드는 병리학적 상태를 포함한다.
"뉴런 세포 또는 조직"은 일반적으로 운동 뉴런, 연합 뉴런을 포함하고 이로 제한되지 않는 중간뉴런, 후근신경절 뉴런을 포함하고 이로 제한되지 않는 감각 뉴런, 흑색질의 도파민 (DA) 뉴런, 선조체 DA 뉴런, 피질 뉴런, 뇌간 뉴런, 척수 중간뉴런 및 운동 뉴런, 해마의 CA1 추체 뉴런을 포함하고 이로 제한되지 않는 해마 뉴런, 및 전뇌 뉴런을 의미한다. 본원에서 용어 뉴런 세포 또는 조직은 세포체, 축삭(들) 및 수상돌기(들)로 이루어진 뉴런 세포, 및 상기 뉴런 세포의 일부를 형성할 수 있는 축삭(들) 또는 수상돌기(들)을 의미하고자 의도한 것이다.
"신경학적 질환"은 신경변성 병태, 중추 또는 말초 신경계의 기능이상 또는 뉴런 세포 또는 조직의 괴사 및/또는 세포자멸을 특징으로 하는 뉴런 세포 또는 조직 손상, 및 영양 인자 결핍과 연관된 뉴런 세포 또는 조직 손상을 의미하고자 본원에서 사용된다. 신경변성 질병의 예는 가족성 및 산발성 근위축성 측삭 경화증 (각각 FALS 및 ALS), 가족성 및 산발성 파킨슨병, 헌팅턴 (Huntington) 병 (헌팅턴 무도병), 가족성 및 산발성 알츠하이머병, 척수 근육 위축증 (SMA), 시신경병증, 예를 들어 녹내장 또는 망막 변성, 당뇨병 신경병증, 또는 황반 변성을 수반하는 관련 질병, 내이 감각 세포 또는 뉴런의 변성에 의한 난청, 간질, 벨 (Bell) 마비, 17번 염색체 연관 파킨슨병 수반 전측두엽성 치매 (FTDP-17), 다발경화증, 미만성 뇌 피질 위축, 루이 소체 (Lewy-body) 치매, 피크 (Pick) 병, 트리뉴클레오티드 반복 질병, 프리온 질환, 및 샤이-드래거 (Shy-Drager) 증후군을 포함한다. 뉴런 세포 또는 조직의 손상 또는 상해는 뉴런 세포 또는 조직의 생존 또는 적절한 기능을 손상시키는 다양한 상이한 원인으로부터 발생할 수 있고, 예를 들어 전뇌 및 국소 뇌 허혈 (뇌졸중)에서와 같이 (일시적으로 또는 영구적으로) 혈류를 제한하는 허혈 상태에 의한 급성 및 비-급성 손상; 예를 들어 뇌 조직 또는 척수의 절개 또는 절단; 뉴런 조직 내의 병변 또는 반 (plaque); 세포의 성장 및 생존을 위해 필요한 영양 인자(들)의 결핍; 신경독소, 예를 들어 화학치료제에 대한 노출; 및 다른 질병 상태, 예를 들어 만성 대사성 질병, 예를 들어 당뇨 또는 신장 기능장애에 수반하는 것을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
"대상" 또는 "환자"는 인간을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "포유동물"은 인간, 소, 말, 개 및 고양이를 포함하는, 포유동물로서 분류된 임의의 포유동물을 의미한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 포유동물은 인간이다.
II . 본 발명의 예시적인 방법 및 물질
이전의 연구는 신경계 발생 동안 세포 사멸의 현상을 조사하였다 ([Hamburger et al., J. Neurosci., 1:60-71 (1981)]; [Oppenheim, Ann. Rev. Neurosci., 14:453-501 (1991)]; [O'Leary et al., J. Neurosci., 6:3692-3705 (1986)]; [Henderson et al., Nature, 363:266-270 (1993)]; [Yuen et al., Brain Dev., 18:362-368 (1996)]). 뉴런 세포의 사멸은 다양한 신경학적 질환, 예를 들어 가족성 및 산발성 근위축성 측삭 경화증 (각각 FALS 및 ALS), 가족성 및 산발성 파킨슨병, 헌팅턴 병, 가족성 및 산발성 알츠하이머병 및 척수 근육 위축증 (SMA)의 발생 및/또는 진행에서 일정한 기능을 수행하는 것으로 생각된다 (Price et al., Science, 282:1079-1083 (1998)).
본 발명자들은 놀랍게도 DR6 (TNFR 패밀리의 멤버)이 뇌 피질, 해마, 운동 뉴런 및 척수의 중간뉴런을 비롯한 배아 및 성체 중추 신경계 내에서 많이 발현된다는 것을 발견하기에 이르렀다. 아래 실시예에 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 DR6이 뉴런 세포 생존 또는 사멸의 조절자로서 역할을 할 수 있는지를 검사하기 위해 다양한 실험 분석을 실시하였다. 연합 뉴런은 그의 생존을 위해 그의 중간체 표적인 척수의 마루판 (floorplate) 중 하나로부터의 영양 지지에 의존적이다. 시험관 내 체외이식편 배양액 내에서, 본 발명자들은 RNA 간섭에 의한 DR6 발현의 억제가 연합 뉴런의 축삭 변성을 차단하였음을 발견하였다. 항-DR6 모노클로날 항체를 또한 등쪽 척수 생존 분석으로 시험하였고, DR6-특이적 항체인 3F4.4.8; 4B6.9.7; 및 1E5.5.7에 의한 DR6 수용체 신호 전달의 억제가 시험관내 체외이식편 배양액에서 연합 뉴런의 축삭 변성을 방지한 것으로 결정되었다. DR6은 JNK의 활성화를 통해 신호를 전달하는 것으로 문헌에 보고되어 있다 ([Pan et al., 상기 문헌 1998]; [Zhao et al., 상기 문헌 2001]). 따라서, 축삭 변성에서 DR6-JNK 신호 전달의 역할을 조사하기 위해, 연합 뉴런 내의 JNK 신호 전달 경로가 펩티드 억제제인 L-JNK-I에 의해 차단된 등쪽 척수 생존 분석을 실시하였다. 상기 JNK 신호 전달의 억제는 부분적으로 등쪽 척수 생존 분석에서 축삭 변성을 차단하였다. 따라서, DR6은 적어도 부분적으로 JNK 경로를 통해 축삭 과정 변성의 신호를 전달하는 것으로 생각된다. 발생에서 뉴런 세포 사멸의 조절에서 DR6의 생리학적 역할을 보다 잘 이해하기 위해, 전체 배아 배양 시스템에서 항-DR6 항체에 의해 DR6 신호 전달을 차단하였다. 놀랍게도, 특정 DR6-특이적 항체에 의한 DR6 신호 전달의 억제는 상기 시스템에서 자연 발생하는 발생 세포의 사멸에 대해 척수 뉴런을 보호하였다. 따라서, DR6 길항제, 예를 들어 DR6 길항제 항체는 신경학적 질환, 예를 들어 신경변성 질병 (예를 들어, ALS, SMA, 알츠하이머병, 및 파킨슨병, FTDP-17, 헌팅턴 병) 및 뇌졸중에서 일어나는 뉴런 세포 사멸을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. DR6이 생체 내에서 진정한 세포자멸 촉진성 수용체로서 기능하는지를 조사하기 위해서, 본 발명자들은 발생 단계 E15.5에서 DR6 녹-아웃 배아의 표현형을 분석하였다. 뉴런 세포 생존의 음성 조절자로서의 DR6의 제안된 역할과 일치하게, DR6 이형접합성 한배 새끼 대조군에 비해 뉴런 세포 사멸의 약 40％ 내지 50％ 감소가 DR6 결실 척수 및 후근신경절에서 검출되었다.
본 발명자들은 또한 놀랍게도 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)이 DR6 수용체의 동족체 리간드이고, 또한 APP가 DR6 수용체를 통해 축삭 변성을 촉발시키는 기능을 수행하는 것을 발견하였다. 아밀로이드 전구체 단백질은 이전에 완전히 이해되지 않았지만 알츠하이머병에서 일부 기능을 수행하는 것으로 가정되었다 ([Selkoe, J. Biol. Chem. 271:18295 (1996)]; [Scheuner; et al., Nature Med. 2:864 (1996)]; [Goate, et al., Nature 349:704 (1991)]).
DR6 길항제가 다양한 신경학적 질환의 치료에 특히 유용할 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명은 유효량의 DR6 길항제의 투여를 포함하는, 포유동물에서 DR6 활성을 억제, 차단 또는 중화하기 위한 DR6 길항제 조성물 및 방법을 제공한다. 바람직하게는, 사용되는 DR6 길항제의 양은 축삭 변성 및 뉴런 세포 사멸 차단에 효과적인 양일 것이다. 이것은 예를 들어 아래에서 설명되는 방법 및 실시예에 따라 달성될 수 있다.
상기 방법에 사용될 수 있는 DR6 길항제는 DR6 및/또는 APP 면역어드헤신, DR6 및/또는 APP를 포함하는 융합 단백질, DR6 및/또는 APP의 공유 변형된 형태, DR6 및/또는 APP 변이체, 그의 융합 단백질, 및 DR6 및/또는 APP 항체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 길항제 제조에 사용될 수 있는 다양한 기술이 본원에서 설명된다. 예를 들어, DR6 및 APP 폴리펩티드의 제조 방법 및 기술이 설명된다. DR6 및 APP 폴리펩티드의 추가의 변형, 및 DR6 및 APP에 대한 항체도 설명된다.
본원에 개시된 본 발명은 많은 실시태양을 갖는다. 본 발명은 APP에 대한 DR6의 결합이 억제되는 조건 하에 DR6 폴리펩티드 및/또는 APP 폴리펩티드를 하나 이상의 DR6 길항제에 노출시키는 것을 포함하는, APP에 대한 DR6의 결합을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 관련 실시태양은 DR6 폴리펩티드 및 APP 폴리펩티드를 DR6 또는 APP에 결합하는 단리된 길항제와 합하는 것을 포함하는, 서열 1의 아미노산 1-655을 포함하는 DR6 폴리펩티드 및 서열 6의 아미노산 66-81을 포함하는 APP 폴리펩티드 (예를 들어 sAPPβ)의 결합을 억제하는 방법을 제공하고, 여기서 단리된 길항제는 APP에 결합하는 항체, DR6에 결합하는 항체 및 서열 1의 아미노산 1-354를 포함하는 가용성 DR6 폴리펩티드 중의 적어도 하나로부터 선택되고; 단리된 길항제는 APP에 대한 DR6의 결합이 억제되도록 DR6 및 APP의 결합을 억제하는 그의 능력에 대해 선택된다.
임의로, 상기 방법에서, 하나 이상의 DR6 길항제는 DR6에 결합하는 항체 (예를 들어, DR6에 결합하는 항체는 각각 ATCC 기탁 번호 PTA-8095, PTA-8094 또는 PTA-8096으로서 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7 모노클로날 항체의 결합을 경쟁적으로 억제한다), 서열 1의 아미노산 1-354를 포함하는 가용성 DR6 폴리펩티드 (예를 들어, DR6 면역어드헤신), 또는 APP에 결합하는 항체 (예를 들어 모노클로날 항체 22C11)로부터 선택된다. 본 발명의 특정 실시태양에서, DR6 길항제는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 비-단백질성 중합체에 연결된, DR6에 결합하는 항체, APP에 결합하는 항체 또는 가용성 DR6 폴리펩티드이다.
상기 방법의 선택적인 실시태양에서, DR6 폴리펩티드는 하나 이상의 포유동물 세포 (예를 들어, 연합 뉴런 세포, 감각 뉴런 세포 또는 운동 뉴런 세포)의 세포 표면 상에 발현되고, 상기 하나 이상의 DR6 길항제의 결합은 DR6 활성화 또는 신호 전달을 억제한다. 본 발명의 하나의 그러한 실시태양에서, 방법은 조직 배양액에서 뉴런 세포의 성장 및/또는 재생 및/또는 생존을 향상시키기 위해서 DR6을 발현하는 하나 이상의 포유동물 세포에서 세포자멸을 억제하기 위해 시험관 내에서 수행된다. 예로서, 상기 DR6 길항제는 조직 배지, 예를 들어 뉴런 세포 배양물을 증식시키기 위해 설계된 배지에 대한 시험관내 첨가제로서 유용하다. 특히, 당업계에 알려진 바와 같이, 특정 뉴런 세포 배양물의 증식은 상기 세포가 세포자멸을 경험하는 경향 때문에 문제가 될 수 있다. 일부 뉴런 배양물은 예를 들어, 외인성 인자, 예를 들어 신경 성장 인자의 부재 하에 죽는다. 본원에서 개시되는 내용은 DR6 길항제가 세포 성장 및/또는 재생 및/또는 생존을 향상시키기 위해, 예를 들어 상기 뉴런 세포 배양액에서의 신경 성장 인자의 용도와 유사한 방식으로 상기 뉴런 세포 배양액에 사용될 수 있음을 보여준다.
본 발명의 추가의 실시태양에서, 신경학적 병태 또는 질환이 존재하는 포유동물의 생체 내에서 APP에 대한 DR6의 결합을 억제하는 방법을 실시할 수 있다. 임의로, 신경학적 병태 또는 질환은 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴 병 또는 알츠하이머병이다. 별법으로, 신경학적 병태 또는 질환은 뇌졸중에 의한 뉴런 세포 또는 조직 손상, 뇌 또는 척수 조직에 대한 외상, 또는 뉴런 조직 내의 병변을 포함한다.
본 발명의 추가의 실시태양은 포유동물에게 유효량의 하나 이상의 DR6 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 신경학적 병태 또는 질환이 있는 포유동물의 치료 방법을 제공한다. 일반적으로, 상기 방법에서, 하나 이상의 DR6 길항제는 DR6에 결합하는 항체, 서열 1의 아미노산 1-354를 포함하는 가용성 DR6 폴리펩티드, 및 APP에 결합하는 항체로부터 선택된다. 본 발명의 선택적인 실시태양에서, 신경학적 병태 또는 질환은 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴 병 또는 알츠하이머병이다. 별법으로, 신경학적 병태 또는 질환은 뇌졸중에 의한 뉴런 세포 또는 조직 손상, 뇌 또는 척수 조직에 대한 외상, 또는 뉴런 조직 내의 병변을 포함한다. 본 발명의 다양한 실시태양에서, 하나 이상의 추가의 치료제가 상기 포유동물에게 투여된다. 본 발명의 특정 예시적인 실시태양에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 NGF, 세포자멸 억제제, EGFR 억제제, β-세크레타제 억제제, γ-세크레타제 억제제, 콜린에스테라제 억제제, 항-Abeta 항체 및 NMDA 수용체 길항제로부터 선택된다. 임의로, 하나 이상의 DR6 길항제 및/또는 추가의 치료제가 주사, 주입 또는 관류를 통해 포유동물에게 투여된다.
본 발명의 또 다른 실시태양은 APP에 대한 DR6의 결합을 억제하는 관심있는 분자를 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 관심있는 분자의 존재 또는 부재 하에 DR6 및 APP를 합한 후; 상기 관심있는 분자의 존재 하에서 APP에 대한 DR6의 결합의 억제를 검출하는 것을 포함한다. 본 발명의 관련 실시태양은 조성물이 서열 1의 아미노산 1-655 (및 임의로 서열 1의 아미노산 1-354)를 포함하는 DR6 폴리펩티드와 서열 6의 아미노산 66-81을 포함하는 APP 폴리펩티드 (예를 들어, APP695, sAPPα 또는 sAPPβ) 사이의 결합을 조정하는지를 결정하는 방법을 제공하고, 이 방법은 조성물을 DR6 및 APP와 합한 후, 조성물이 DR6과 APP 사이의 결합을 조정하는지를 결정하기 위해 조성물 존재 하에서의 DR6과 APP 사이의 결합을 조성물 부재 하에서의 DR6과 APP 사이의 결합과 비교하는 것을 포함한다. 임의로, 상기 방법에서 결합의 차이는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술 (예를 들어 비아코어 라이프 사이언시즈 (Biacore Life Sciences)로부터 이용가능한)을 통해 측정된다. 본 발명의 실시태양은 또한 이들 방법에 따라 확인된 관심있는 분자를 포함한다.
본 발명의 추가의 실시태양은 환자로부터 샘플을 얻고, 서열 1의 DR6 폴리펩티드 서열과 상이한 폴리펩티드 서열을 갖는 DR6 폴리펩티드 변이체의 존재에 대해 샘플을 시험하는 것을 포함하는, 신경학적 질환이 존재하거나 또는 신경학적 질환에 걸리기 쉬운 환자의 진단 방법을 포함한다. 임의로, 상기 방법은 폴리펩티드 변이체를 서열 1의 DR6 폴리펩티드 서열에 대해 관찰된 친화도와 상이한 APP 폴리펩티드에 대한 친화도를 갖는 것으로서 확인하는 것을 추가로 포함한다. 본 발명의 관련 실시태양은 서열 1의 아미노산 1-655를 포함하는 DR6의 폴리펩티드 변이체가 포유동물에 존재하는지를 결정하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 DR6의 폴리펩티드 변이체가 포유동물에 존재하는지를 결정하기 위해서 포유동물에서 발현된 DR6 폴리펩티드의 서열을 서열 1과 비교하는 것을 포함한다. 상기 방법의 특정 실시태양은 포유동물에 존재하는 것으로 관찰된 폴리펩티드 변이체를 APP 결합 변이체로서 확인하는 추가의 단계를 포함할 수 있고, 여기서 APP 결합 변이체는 서열 6의 아미노산 66-81을 포함하는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 폴리펩티드 (예를 들어 APP695, sAPPα 또는 sAPPβ)에 대한 결합 친화도가 서열 1을 포함하는 DR6 폴리펩티드의 서열 6의 아미노산 66-81을 포함하는 APP 폴리펩티드에 대한 결합 친화도와 상이한 것을 특징으로 한다. 임의로, 상기 방법에서 결합 친화도의 차이는 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술 (예를 들어 비아코어 라이프 사이언시즈로부터 이용가능한)을 통해 측정된다. 상기 방법의 일부 실시태양은 개별 환자를 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴 병 또는 알츠하이머병에서 관찰되는 증상 또는 상태를 갖는 환자로 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 전장 천연 서열 DR6 및 APP 폴리펩티드 이외에, DR6 및/또는 APP 폴리펩티드 변이체를 제조할 수 있음이 고려된다. DR6 및/또는 APP 변이체는 코딩 DNA에 적절한 뉴클레오티드 변경을 도입하고/하거나 목적하는 폴리펩티드의 합성에 의해 제조될 수 있다. 당업자는 아미노산 변경이 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드의 번역후 프로세싱의 변경, 예를 들어 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변경 또는 막 앵커링 (anchoring) 특징의 변경을 야기할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에서 설명되는 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드의 변이는 예를 들어 임의의 기술 및 예를 들어 미국 특허 5,364,934에 제시된 보존적 및 비-보존적 돌연변이에 대한 지침을 사용하여 형성될 수 있다. 변이는 천연 서열 폴리펩티드에 비해 아미노산 서열을 변경시키는, 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 변이는 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인에서 적어도 하나의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 어느 아미노산 잔기가 목적하는 활성에 불리한 영향을 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는지를 결정할 때의 지침은 DR6 폴리펩티드의 서열을 공지의 상동성 단백질 분자와 비교하고 높은 상동성 구역에서 이루어지는 아미노산 서열 변경의 수를 최소화함으로써 제시될 수 있다. 아미노산 치환은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 교체, 예를 들어 류신을 세린으로 교체, 즉, 보존적 아미노산 교체의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산에 걸칠 수 있다. 허용되는 변이는 서열에 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환을 체계적으로 만들고, 생성되는 변이체를 DR6 및/또는 APP 길항 활성에 대해 시험함으로써 결정할 수 있다.
DR6 및/또는 APP 폴리펩티드 단편이 본원에서 제공된다. 상기 단편은 예를 들어 전장 천연 단백질과 비교할 때 N-말단 또는 C-말단에서 말단절단될 수 있거나, 또는 내부 잔기가 결여될 수 있다. 특정 단편에는 DR6 폴리펩티드의 요구되는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기가 결여된다.
DR6 및/또는 APP 폴리펩티드 단편은 임의의 많은 통상적인 기술에 의해 제조할 수 있다. 목적하는 펩티드 단편은 화학적으로 합성할 수 있다. 다른 방법은 효소에 의한 소화에 의해, 예를 들어 특정 아미노산 잔기에 의해 규정되는 부위에서 단백질을 절단하는 것으로 알려진 효소로 단백질을 처리하거나, 또는 DNA를 적합한 제한 효소로 소화시켜 폴리펩티드 단편을 생성시키고 목적하는 단편을 단리하는 것을 수반한다. 또다른 적합한 기술은 목적하는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭하는 것을 수반한다. DNA 단편의 목적하는 말단을 규정하는 올리고뉴클레오티드가 PCR에서 5' 및 3' 프라이머에 사용된다.
특정 실시태양에서, 목적하는 보존적 치환은 바람직한 치환의 표제 하에 하기 표에 나타낸다. 상기 치환이 생물학적 활성을 변경시키면, 하기 표에 예시적인 치환으로 명명된 또는 아미노산 클래스에 대해 아래에서 상세히 설명하는 보다 큰 변화가 도입되고, 생성물을 스크리닝한다.
본래 서열 예시적인 치환 바람직한 치환
Ala (A) val; leu; ile val
Arg (R) lys; gln; asn lys
Asn (N) gln; his; asp, lys; arg gln
Asp (D) glu; glu
Cys (C) ser ser
Gln (Q) asn asn
Glu (E) asp asp
Gly (G) pro; ala ala
His (H) asn; gln; lys; arg arg
Ile (I) leu; val; met; ala; phe; 노르류신 leu
Leu (L) 노르류신; ile; val; met; ala; phe ile
Lys (K) arg; gln; asn arg
Met (M) leu; phe; ile leu
Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu
Pro (P) ala ala
Ser (S) thr thr
Thr (T) ser ser
Trp (W) tyr; phe tyr
Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe
Val (V) ile; leu; met; phe; ala; 노르류신 leu
항체의 생물학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선 입체형태로서의 치환 구역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 대부분의 측쇄를 유지하는 것에 대한 그의 효과가 크게 상이한 치환을 선택함으로써 달성한다. 자연 발생 잔기는 통상적인 측쇄 특성을 기초로 하여 다음 군으로 분류된다.
(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 상기 클래스의 하나의 멤버를 다른 클래스와 교환하는 것을 수반할 것이다. 상기 치환된 잔기는 보존적 치환 부위에 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비-보존된) 부위 내에도 도입될 수 있다.
변이는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 올리고뉴클레오티드-매개 (부위 지정) 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이 유발을 사용하여 달성할 수 있다. 부위 지정 돌연변이 유발 ([Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)]; [Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)]), 카세트 돌연변이 유발 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 대해 수행하여 DR6 폴리펩티드 변이체 DNA를 생산할 수 있다.
스캐닝 아미노산 분석은 또한 인접한 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산에는 비교적 작은, 중성 아미노산이 존재한다. 상기 아미노산은 알라닌, 글라이신, 세린, 및 시스테인을 포함한다. 알라닌이 상기 군 중에서 일반적으로 바람직한 스캐닝 아미노산이고, 그 이유는 알라닌이 베타-탄소를 지나서 존재하는 측쇄를 제거하고, 변이체의 주쇄 입체형태를 변경시킬 가능성이 작기 때문이다 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. 알라닌은 또한 가장 흔한 아미노산이기 때문에 일반적으로 바람직하다. 또한, 알라닌은 종종 매립된 위치 및 노출된 위치 모두에서 발견된다 [Creighton, The Proteins. (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol. 150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당량의 변이체를 생성시키지 않을 경우에, 이소테릭 (isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
DR6 및/또는 APP 폴리펩티드의 적절한 입체형태 유지에 관련되지 않은 임의의 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선시키고 비정상적인 가교결합을 억제할 수 있다. 이와 반대로, 그의 안정성을 개선시키기 위해 시스테인 결합(들)이 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드에 첨가될 수 있다.
본원에 개시된 본 발명의 실시태양은 매우 다양한 APP 폴리펩티드에 적용된다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 예를 들어 APP는 도 1B-1D에 제시된 전장 695, 750 또는 770 APP 이소형이다. 본 발명의 다른 실시태양에서, APP는 APP 엑토도메인을 갖고 번역후 프로세싱으로부터 생성된 APP의 N-말단부 (예를 들어 sAPPα 또는 sAPPβ)를 포함한다. 임의로, 예를 들어, APP는 세크레타제에 의한 절단으로부터 생성되는 695, 750 또는 770 APP 이소형 중의 하나의 가용성 형태, 예를 들어 β-세크레타제에 의한 절단으로부터 생성되는 뉴런 APP695의 가용성 형태를 포함할 수 있다. 예시적인 특정 실시태양에서, APP는 APP695의 아미노산 20-591을 포함한다 (예를 들어, [Jin et al., J. Neurosci., 14(9): 5461-5470 (1994)] 참조). 본 발명의 다른 실시태양에서, APP는 모노클로날 항체 22C11 (예를 들어, 케미콘 인터내셔날 인크. (Chemicon International Inc., 미국 캘리포니아주 테메쿨라)으로부터 입수가능한 것)에 의해 인식되는 에피토프를 갖는 폴리머라제를 포함한다. 임의로, APP는 22C11 에피토프를 함유하는 구역인 APP695의 잔기 66-81을 포함한다 (예를 들어, [Hilbrich, J. B. C. Vol. 268, No. 35: 26571-26577 (1993)] 참조).
하기 설명은 주로 DR6 폴리펩티드 코딩 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양하여 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 생산하는 것에 관한 것이다. 물론, DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 제조하기 위해 당업계에 공지된 다른 방법도 사용할 수 있다. 예를 들어, 적절한 아미노산 서열, 또는 그의 일부는 고체상 기술을 이용한 직접 펩티드 합성 (예를 들어, [Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)]; [Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963) 참조])에 의해 생산될 수 있다. 시험관내 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화 기술에 의해 수행할 수 있다. 자동화 합성은 예를 들어 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) 펩티드 합성기 (미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 달성할 수 있다. DR6 및/또는 APP 폴리펩티드의 다양한 부분은 별개로 화학적으로 합성되고, 목적하는 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 생산하기 위해 화학적 또는 효소에 의한 방법을 사용하여 조합될 수 있다.
설명된 방법 및 기술은 DR6 및/또는 APP 변이체, DR6 및/또는 APP의 변형된 형태 및 DR6 및/또는 APP 항체의 생산에 유사하게 적용될 수 있다.
DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 의 단리
DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드 mRNA를 갖고 이를 검출가능한 수준으로 발현하는 것을 생각되는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 따라서, 인간 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드 DNA는 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 얻을 수 있다. DR6 및/또는 APP 폴리펩티드 코딩 유전자는 또한 게놈 라이브러리로부터 또는 공지의 합성 절차 (예를 들어, 자동화 핵산 합성)으로 얻을 수 있다.
라이브러리는 목적하는 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질을 확인하도록 디자인된 프로브 (예를 들어 적어도 약 20-80개 염기의 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 문헌에 기재된 바와 같은 표준 절차를 사용하여 수행할 수 있다 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]. DR6 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 단리하기 위한 다른 수단은 PCR 방법을 사용하는 것이다 ([Sambrook et al., 상기 문헌]; [Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]).
cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술은 당업계에 공지되어 있다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 충분한 길이이고 가양성이 최소화되도록 충분히 분명하여야 한다. 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 스크리닝되는 라이브러리 내의 DNA에 대한 혼성화시에 검출될 수 있도록 표지된다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고, 32P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중등 엄격성 및 고엄격성을 포함하는 혼성화 조건은 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 제공된다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 공공 데이타베이스, 예를 들어 GenBank 또는 다른 사설 서열 데이타베이스에 기탁되고 이로부터 이용가능한 다른 공지의 서열과 정렬되어 비교될 수 있다. 분자의 규정된 구역 내의 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 당업계에 공지되고 본원에서 설명된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
단백질 코딩 서열을 갖는 핵산은 처음으로 본원에 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하여, 필요한 경우 cDNA로 역전사될 수 없는 mRNA의 전구체 및 처리 중간체를 검출하기 위해 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같은 통상적인 프라이머 연장 절차를 사용하여 선택된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다.
숙주세포의 선택 및 형질전환
숙주세포는 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드 생산을 위해 본원에서 설명된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지 내에서 배양된다. 배양 조건, 예를 들어 배지, 온도, pH 등은 과도한 실험을 수행하지 않으면서 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양액의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실용적인 기술은 문헌 ([Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)] 및 [Sambrook et al., 상기 문헌])에서 볼 수 있다.
진핵세포 형질감염 및 원핵세포 형질전환 방법, 예를 들어 CaCl2, CaPO4, 리포좀-매개 및 전기천공은 당업자에게 공지되어 있다. 사용된 숙주세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적절한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 사용한 칼슘 처리, 또는 전기천공은 일반적으로 원핵생물에 대해 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용하는 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene. 23:315 (1983)] 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859에 기재된 바와 같은 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 상기 세포벽이 없는 포유동물 세포에 대해서는, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전 방법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질감염의 일반적인 측면은 미국 특허 4,399,216에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 ([Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977)] 및 [Hsiao et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)])의 방법에 따라 수행한다. 그러나, DNA를 세포 내로 도입하기 위한 다른 방법, 예를 들어 핵 미세주사, 전기천공, 무손상 세포와 세균 원형질체 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어, 폴리브렌, 폴리오르니틴에 의한 방법도 사용할 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환하기 위한 다양한 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature. 336:348-352 (1988)])을 참조한다.
본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기 위해 적합한 숙주세포는 원핵생물, 효모, 또는 보다 고등한 진핵세포를 포함한다. 적합한 원핵생물은 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아세 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli)를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446); 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537); 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)가 공개적으로 이용가능하다. 다른 적합한 원핵 숙주세포는 엔테로박테리아세, 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실러스 (Bacilli), 예를 들어 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 비. 리케니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이들 예는 제한적인 것이 아니라 예시적인 것이다. 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효를 위한 통상적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모 숙주이다. 바람직하게는, 숙주세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주에 내인성인 단백질을 코딩하는 유전자에 유전자 돌연변이를 발생시키도록 변형될 수 있고, 상기 숙주의 예는 완전한 유전형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2; 완전한 유전형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4; 완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244); 완전한 유전형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6; 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이가 존재하는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4; 및 1990년 8월 7일 등록된 미국 특허 4,946,783에 개시된 돌연변이체 주변 세포질 (periplasmic) 프로테아제를 갖는 이. 콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관 내 클로닝 방법, 예를 들어, PCR 또는 다른 핵산 폴리머라제 반응이 적합하다.
원핵생물 이외에, 진핵 미생물, 예를 들어 필라멘트성 진균 또는 효모가 DR6 폴리펩티드를 코딩하는 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)는 흔히 사용되는 보다 저등한 진핵 숙주 미생물이다. 다른 숙주는 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe ) (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985년 5월 2일 공개된 EP 139,383); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어, 케이. 락티스 (K. lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2):737-742 [1983]), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)), 케이. 테르모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28:265-278 [1988]); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 쉬바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis) (1990년 10월 31일 공개된 EP 394,538); 및 필라멘트성 진균, 예를 들어, 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공개된 WO 91/00357), 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) ([Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]]; [Tilburn et al., Gene. 26:205-221 [1983]]; [Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 1470-1474 [1984]]) 및 에이. 니거 (niger) (Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985])를 포함한다. 메탄올 자화 (methylotropic) 효모가 본원에서 적합하고, 한세눌라 (Hansenula), 칸디다, 클로에케라 (Kloeckera), 피키아, 사카로마이세스, 토룰롭시스 (Torulopsis) 및 로도토룰라 (Rhodotorula)로 구성된 속으로부터 선택된, 메탄올로 성장할 수 있는 효모를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기 효모 클래스의 예시적인 특정 종은 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에 제시되어 있다.
글리코실화된 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주세포는 다세포 유기체로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라 (Drosophila) S2 및 스포돕테라 (Spodoptera) Sf9 및 식물 세포, 예를 들어 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페튜니아, 토마토 및 담배의 세포 배양액을 포함한다. 많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 숙주, 예를 들어 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda; 쐐기벌레), 아에데스 아에깁티 (Aedes aegypti, 모기), 아에데스 알보픽투스 (albopictus, 모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster, 과일파리), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)로부터의 대응하는 허용되는 곤충 숙주세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 이용가능하고, 상기 바이러스는 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따라 본원에서 바이러스로서 이용할 수 있다.
그러나, 척추동물 세포가 가장 관심의 대상이 되어 왔고, 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었다. 유용한 포유동물 숙주세포주의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양으로 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포들 (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1997)); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL 1587); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암세포주 (Hep G2)이다.
숙주세포는 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드 생산을 위한 상기한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 통상적인 영양 배지 내에서 배양된다.
복제가능 벡터의 선택 및 사용
DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입될 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 이용가능하다. 벡터는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자, 또는 파지 형태로 존재할 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 절차에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입된다. 벡터 성분은 일반적으로 하나 이상의 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터, 및 전사 종결 서열을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 하나 이상의 상기 성분을 포함하는 적합한 벡터의 제작은 당업자에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 이용한다.
DR6 및/또는 APP는 직접 또는 신호 서열 또는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩티드일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 재조합 방법으로 제조할 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입되는 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어 알칼린 포스파타제, 페니실리나제, lpp, 또는 열안정성 엔테로톡신 II 리더의 군 중에서 선택된 원핵세포 신호 서열일 수 있다. 효모 분비를 위해, 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, 알파 인자 리더 (사카로마이세스 α-인자 리더 및 미국 특허 5,010,182에 기재된 클루이베로마이세스 α-인자 리더), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공개된 EP 362,179) 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열, 예를 들어 동일한 또는 관련된 종의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더가 단백질의 분비를 지시하기 위해 사용될 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주세포에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 세균, 효모, 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 선택가능 마커로도 언급되는 선택 유전자를 포함할 것이다. 전형적인 선택 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용가능하지 않은 중요한 영양분을 공급하는 단백질, 예를 들어 바실러스의 D-알라닌 라세마제를 코딩한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능 마커의 예는 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 섭취하는 능력을 갖는 세포의 확인을 가능하게 하는 것, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 사용될 때 적절한 숙주세포는 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조되어 증식하는, DHFR 활성이 결여된 CHO 세포주이다. 효모에 사용하기 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 ([Stinchcomb et al., Nature. 282:39 (1979)]; [Kingsman et al., Gene. 7:141 (1979)]; [Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]). trpl 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 결여된 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어 ATCC No. 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)).
발현 및 클로닝 벡터는 mRNA 합성을 지시하기 위해 보통 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 효능있는 숙주세포에 의해 인식되는 프로모터가 공지되어 있다. 원핵세포 숙주에 사용하기 위한 적합한 프로모터는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 ([Chang et al., Nature, 275:615 (1978)]; [Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)]), 알칼린 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]를 포함한다. 세균 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno (S. D.)) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주에 사용하기 위해 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] 또는 다른 당분해 효소 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 무타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제용 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 조절되는 전사의 추가의 잇점을 갖는 유도가능 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사에 관여하는 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 작용하는 효소용 프로모터 구역이다. 효모 발현에 사용하기 위해 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다.
포유동물 숙주세포에서 벡터로부터 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드 전사는 프로모터가 숙주세포 시스템과 상용성일 경우 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 조류폭스 바이러스 (1989년 7월 5일 공개된 UK 2,211,504), 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 파필로마 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터로부터, 열 충격 프로모터로부터 얻은 프로모터에 의해 조절된다.
보다 고등한 진핵세포에 의한 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 인핸서는 그의 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 대해 작용하는, 대체로 약 10 내지 300 bp DNA의 시스 작용 (cis-acting) 성분이다. 많은 인핸서 서열이 현재 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, 알파-페토단백질 및 인슐린)로부터 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예는 복제 기점의 하류 쪽의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점 하류 쪽의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드 코딩 서열의 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 부위 5'에 위치한다.
진핵 숙주세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 (nucleated) 세포)에 사용되는 발현 벡터도 전사 종료 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 상기 서열은 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역 영역으로부터 통상 얻을 수 있다. 이들 구역은 DR6 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 비번역 부분 내의 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 포함한다.
재조합 척추동물 세포 배양액에서 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드의 합성에 사용하기 적합한 다른 방법, 벡터, 및 숙주세포는 문헌 ([Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)]; [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)]; EP 117,060; 및 EP 117,058)에 기재되어 있다.
숙주세포의 배양
본 발명의 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용된 숙주세포는 다양한 배지 내에서 배양할 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들어 햄 (Ham) F10 (시그마 (Sigma)), 최소 영양 배지 (MEM, 시그마), RPMI-1640 (시그마) 및 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium; DMEM, 시그마)가 숙주세포를 배양하기에 적합하다. 또한, 문헌 ([Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979)], [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:225 (1980)], 미국 특허 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; 또는 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 Re. 30,985에 설명된 임의의 배지를 숙주세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 임의의 이들 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 외피 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 버퍼 (예를 들어 HEPES), 뉴클레오티드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어, GENTAMYCIN™ 약물), 미량 원소 (대체로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 동등한 에너지원으로 보충될 수 있다. 임의의 다른 필수 보충물이 또한 당업자에게 알려진 적절한 농도로 포함될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주세포와 함께 이전에 사용된 것이며, 당업자에게 명백할 것이다.
유전자 증폭/발현의 검출
유전자 증폭 및/또는 발현은 예를 들어 본원에서 제공되는 서열을 기초로 하여 mRNA의 전사를 정량화하는 통상적인 서던 (Southern) 블로팅, 노던 (Northern) 블로팅 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201-5205 (1980)], 도트 블로팅 (DNA 분석), 또는 적절하게 표지된 프로브를 사용한 계내 혼성화에 의해 직접 샘플에서 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중체, RNA 이중체, 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함하여 특이적인 이중체를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 항체는 표지될 수 있고, 표면에 이중체의 형성시에 이중체에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있도록 이중체가 표면에 결합되어 분석을 수행할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 면역학적 방법, 예를 들어 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색 및 유전자 산물의 발현을 직접적으로 정량하는 세포 배양액 또는 체액의 분석에 의해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및/또는 샘플 유체의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 항체는 천연 서열 DR6 폴리펩티드 또는 본원에 제시된 DR6 서열을 기초로 한 합성 펩티드에 대항하여 또는 DR6 DNA에 융합되고 특이적 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대항하여 제조할 수 있다.
DR6 폴리펩티드의 정제
DR6 및/또는 APP 폴리펩티드의 형태는 배양 배지 또는 숙주세포 용해물로부터 회수할 수 있다. 막에 결합된 경우에는, 폴리펩티드는 적합한 세제 용액 (예를 들어 Triton-X 100)을 사용하여 또는 효소에 의한 절단으로 막으로부터 방출될 수 있다. DR6 폴리펩티드의 발현에 사용되는 세포는 다양한 물리적 또는 화학적 수단, 예를 들어 동결-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 파괴, 또는 세포용해제에 의해 파괴될 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예이다: 이온 교환 컬럼 상의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온-교환 수지, 예를 들어 DEAE 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱 (chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, Sephadex G-75를 사용한 겔 여과; 오염물, 예를 들어 IgG를 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼; 및 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드의 에피토프-태깅된 형태에 결합하는 금속 킬레이팅 컬럼. 단백질의 다양한 정제 방법을 사용할 수 있고, 상기 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 ([Deutscher, Methods in Enzvmology, 182 (1990)]; [Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)])에 기재되어 있다. 선택된 정제 단계(들)은 예를 들어 사용된 생산 방법의 특성 및 생산되는 특정 DR6 폴리펩티드에 따라 결정될 것이다.
DR6 및/또는 APP의 가용성 형태는 본 발명의 방법에서 DR6 길항제로서 사용될 수 있다. 상기 DR6 및/또는 APP의 가용성 형태는 아래에서 설명되는 바와 같은 변형 (면역글로불린, 에피토프 태그 또는 류신 지퍼에 대한 융합에 의한 것과 같은)을 포함할 수 있다. 면역어드헤신 분자가 본원의 방법에 사용하기 위해 추가로 고려된다. DR6 및/또는 APP 면역어드헤신은 다양한 형태의 DR6 및/또는 APP, 예를 들어 전장 폴리펩티드 및 DR6 및/또는 APP의 가용형, 세포외 도메인 형태 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 특정 실시태양에서, 분자는 DR6 폴리펩티드와 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 구역의 융합체를 포함할 수 있다. 2가 형태의 면역어드헤신의 경우, 상기 융합체는 IgG 분자의 Fc 구역을 포함할 수 있다. Ig 융합체는 바람직하게는 Ig 분자 내의 적어도 하나의 가변 구역 대신에 폴리펩티드의 가용성 (막횡단 도메인 결실된 또는 불활성화된) 형태를 사용하는 것을 포함한다. 특히 바람직한 실시태양에서, 면역글로불린 융합체는 힌지, IgG1 분자의 CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 구역을 포함한다. 면역글로불린 융합체의 생산에 대해서는, 또한 미국 특허 5,428,130 (1995년 6월 27일 등록) 및 문헌 [Chamow et al., TIBTECH, 14:52-60 (1996)]을 참조한다.
선택적인 면역어드헤신 디자인은 어드헤신의 결합 도메인(들) (예를 들어, DR6 및/또는 APP 엑토도메인)을 면역글로불린 중쇄의 Fc 구역과 조합한다. 통상적으로, 본 발명의 면역어드헤신을 제조할 때, 어드헤신의 결합 도메인을 코딩하는 핵산은 면역글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산의 C-말단에 융합될 것이지만, N-말단 융합체도 가능하다.
일반적으로, 상기 융합체에서 코딩되는 키메라 폴리펩티드는 적어도 기능적으로 활성인 힌지, 면역글로불린 중쇄의 불변 구역의 CH2 및 CH3 도메인을 보유할 것이다. 또한, 융합은 불변 도메인의 Fc 부분의 C-말단에, 또는 중쇄의 CH1 또는 경쇄의 대응하는 구역의 바로 N-말단에서 이루어진다. 융합이 이루어지는 정확한 부위는 중요하지 않고; 특정 부위는 공지되어 있고, 면역어드헤신의 생물학적 활성, 분비, 또는 결합 특성을 최적화하기 위해 선택될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 어드헤신 서열은 면역글로불린 G1 (IgG1)의 Fc 구역의 N-말단에 융합된다. 전체 중쇄 불변 구역을 어드헤신 서열에 융합시킬 수 있다. 그러나, 보다 바람직하게는, IgG Fc를 화학적으로 규정하는 파파인 절단 부위의 바로 상류의 힌지 구역에서 시작하는 서열 (즉, 잔기 216, 중쇄 불변 구역의 제1 잔기를 114로 간주함), 또는 다른 면역글로불린의 유사한 부위가 융합체에 사용된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 어드헤신 아미노산 서열은 IgG 중쇄의 (a) 힌지 구역 및 CH2 및 CH3 또는 (b) CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 융합된다.
이중특이적 면역어드헤신의 경우, 면역어드헤신은 다량체, 특히 이종이량체 또는 이종사량체로서 회합된다. 일반적으로, 상기 회합된 면역글로불린은 공지의 단위 구조를 가질 것이다. 기본적인 4개의 사슬 구조 단위는 IgG, IgD, 및 IgE가 존재하는 형태이다. 4개의 사슬 단위는 보다 고분자량의 면역글로불린에서 반복되고; IgM이 일반적으로 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 4개의 기본적인 단위의 오량체로 존재한다. IgA 글로불린, 및 경우에 따라 IgG 글로불린도 혈청에 다량체 형태로 존재할 수 있다. 다량체의 경우에, 각각의 4개의 단위는 동일하거나 상이할 수 있다.
본원의 범위 내에 포함되는 회합된 면역어드헤신의 다양한 예를 아래에 개략적으로 제시한다:
(a) ACL-ACL;
(b) ACH-(ACH, ACL-ACH, ACL-VHCH, 또는 VLCL-ACH);
(C) ACL-ACH-(ACL-ACH, ACL-VHCH, VLCL-ACH, 또는 VLCL-VHCH)
(d) ACL-VHCH-(ACH, 또는 ACL-VHCH, 또는 VLCL-ACH);
(e) VLCL-ACH-(ACL-VHCH, 또는 VLCL-ACH); 및
(f) (A-Y)n-(VLCL-VHCH)2
여기서, 각각의 A는 동일하거나 상이한 어드헤신 아미노산 서열을 나타내고;
VL은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이고;
VH는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이고;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이고;
CH는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인이고;
n은 1보다 큰 정수이고;
Y는 공유 가교결합제의 잔기를 나타낸다.
간결함을 위해, 상기 구조는 단지 주요 특징부만을 제시한 것이고, 면역글로불린의 연결 (J) 또는 다른 도메인을 나타내지 않았고, 디술피드 결합도 제시되지 않았다. 그러나, 상기 도메인이 결합 활성에 필요한 경우에는 면역글로불린 분자 내의 통상적인 위치에 존재하도록 구성될 것이다.
별법으로, 어드헤신 서열은 키메라 중쇄를 포함하는 면역글로불린이 얻어지도록 면역글로불린 중쇄와 경쇄 서열 사이에 삽입될 수 있다. 이 실시태양에서, 어드헤신 서열은 힌지와 CH2 도메인 사이, 또는 CH2와 CH3 도메인 사이에서 면역글로불린의 각각의 아암 (arm) 내의 면역글로불린 중쇄의 3' 말단에 융합된다. 유사한 구조가 문헌 [Hoogenboom et al., Mol. Immunol., 28:1027-1037 (1991)]에 보고된 바 있다.
면역글로불린 경쇄의 존재가 본 발명의 면역어드헤신에 요구되지 않지만, 면역글로불린 경쇄는 어드헤신-면역글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유 회합되거나, 또는 어드헤신에 직접 융합된 상태로 존재할 수 있다. 전자의 경우에, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 일반적으로 어드헤신-면역글로불린 중쇄 융합 단백질을 코딩하는 DNA와 동시 발현된다. 분비시에, 하이브리드 중쇄 및 경쇄는 2개의 디술피드-연결 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍을 포함하는 면역글로불린 유사 구조를 제공하도록 공유 회합될 것이다. 상기 구조의 제조에 적합한 방법은 예를 들어 1989년 3월 28일 등록된 미국 특허 4,816,567에 개시되어 있다. 면역어드헤신은 가장 편리하게는 어드헤신 부분을 코딩하는 cDNA 서열을 면역글로불린 cDNA 서열에 인-프레임 (in-frame)으로 융합시켜 제조된다. 그러나, 게놈 면역글로불린 단편에 대한 융합도 사용될 수 있다 (예를 들어, [Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990)]; 및 [Stamenkovic et al., Cell, 66:1133-1144 (1991)] 참조). 후자의 융합 방식은 발현을 위해 Ig 제어 서열의 존재를 필요로 한다. IgG 중쇄 불변 구역을 코딩하는 cDNA는 혼성화 또는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술에 의해, 비장 또는 말초혈 림프구로부터 유도된 cDNA 라이브러리로부터 공개된 서열을 기초로 하여 단리할 수 있다. 면역어드헤신의 "어드헤신" 및 면역글로불린 부분을 코딩하는 cDNA는 선택된 숙주세포에서 효율적인 발현을 지시하는 플라스미드 벡터 내로 앞뒤로 직렬로 삽입된다.
다른 실시태양에서, DR6 길항제는 미국 특허 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337에 제시된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나 또는 다른 유사한 분자, 예를 들어 폴리글루타메이트에 수용체 폴리펩티드를 연결함으로써 공유 변형될 수 있다. 상기 페길화 형태는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다.
상기 분자의 류신 지퍼 형태도 본 발명에서 고려된다. "류신 지퍼"는 그의 융합 파트너 (예를 들어, 류신 지퍼가 융합되거나 연결되는 서열 또는 분자)의 이량체화 또는 삼량체화를 향상시키거나, 촉진시키거나 또는 유도하는 류신 풍부 서열을 의미하기 위해 당업계에서 사용되는 용어이다. 상이한 류신 지퍼 폴리펩티드가 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, [Landschulz et al., Science, 240:1759 (1988)]; 미국 특허 5,716,805; WO 94/10308; [Hoppe et al., FEBS Letters, 344:1991 (1994)]; [Maniatis et al., Nature, 341:24 (1989] 참조). 당업자는 류신 지퍼 서열이 DR6 분자의 5' 또는 3' 말단에서 융합될 수 있음을 이해할 것이다.
또한, 본 발명의 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드는 폴리펩티드를 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합시켜 키메라 분자를 형성시키는 방식으로 변형될 수 있다. 바람직하게는, 상기 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 키메라 분자를 올리고머화시키는 작용을 하는 것이다. 하나의 실시태양에서, 상기 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 위치한다. 상기 에피토프-태깅된 형태의 폴리펩티드의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 제공함으로써 폴리펩티드가 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화도 매트릭스를 사용하는 친화도 정제에 의해 쉽게 정제될 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 그의 각각의 항체는 당업계에 잘 공지되어 있다. 그 예는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글라이신 (폴리-his-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 그에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]; 및 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]를 포함한다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; 알파-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]를 포함한다.
항- DR6 및 항- APP 항체
본 발명의 다른 실시태양에서, DR6 및/또는 APP 항체를 제공한다. 예시적인 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 이중특이적, 및 이종컨쥬게이트 항체를 포함한다. 이들 항-DR6 및/또는 APP 항체는 바람직하게는 DR6 길항제 항체이다.
폴리클로날 항체
본 발명의 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 면역화제 및 필요한 경우 어쥬번트 (adjuvant)의 1회 이상의 주사에 의해 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및/또는 어쥬번트는 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유동물에게 주사될 것이다. 면역화제는 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드 (예를 들어 DR6 및/또는 APP ECD) 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화되는 포유동물에 면역원성인 것으로 알려진 단백질에 면역화제를 컨쥬게이팅시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 어쥬번트의 예는 프로인트 (Freund) 완전 어쥬번트 및 MPL-TDM 어쥬번트 (모노포스포릴 리피드 A, 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)를 포함한다. 면역화 프로토콜은 과도한 실험을 실시하지 않으면서 당업자에 의해 선택될 수 있다. 이어서, 포유동물로부터 채혈하여 혈청을 DR6 및/또는 APP 항체 역가에 대해 분석할 수 있다. 필요한 경우, 포유동물을 항체 역가가 증가하거나 평탄해질 때까지 부스터링할 수 있다.
모노클로날 항체
본 발명의 항체는 별법으로 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 예를 들어 문헌 [Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물은 일반적으로 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 면역화제로 면역화된다. 별법으로, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다.
면역화제는 일반적으로 DR6 및/또는 APP 폴리펩티드 (예를 들어 DR6 및/또는 APP ECD) 또는 그의 융합 단백질, 예를 들어 DR6 ECD-IgG 및/또는 APP sAPP-IgG 융합 단백질을 포함할 것이다.
일반적으로, 인간 기원의 세포가 요구될 경우 말초혈 림프구 ("PBL")가 사용되거나, 비-인간 포유동물 공급원이 요구될 경우 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 림프구는 적합한 융합제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 무한증식 세포주와 융합되어 하이브리도마 세포를 형성한다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. 무한증식 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인간 기원의 골수종 세포이다. 대체로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 무한증식 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 히포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결핍된 경우, 하이브리도마의 배양 배지는 일반적으로 히포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이고, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제한다.
바람직한 무한증식 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정적인 고수준 생성을 지지하고, 배지, 예를 들어 HAT 배지에 민감한 세포이다. 보다 바람직한 무한증식 세포주는 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 매나싸스)로부터 얻을 수 있는 뮤린 골수종 라인이다. 상기 뮤린 골수종 세포주의 예는 P3X63Ag8U.1 (ATCC CRL 1580)이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 설명된 바 있다 ([Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63]).
이어서, 하이브리도마 세포를 배양할 수 있는 배양 배지를 DR6 및/또는 APP에 대해 작용하는 모노클로날 항체의 존재에 대해 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전 또는 시험관내 결합 분석, 예를 들어 방사성 면역 분석 (RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)에 의해 결정한다. 상기 기술 및 분석은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어 스캐챠드 (Scatchard) 분석 [Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)] 또는 BiaCore 분석에 의해 결정할 수 있다.
요구되는 하이브리도마 세포가 확인된 후에, 클론은 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝하고 표준 방법 (Goding, 상기 문헌)으로 성장시킬 수 있다. 상기 목적에 적합한 배양 배지는 예를 들어 둘베코 개질 이글 배지 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 포유동물에서 복수로서 생체 내에서 성장시킬 수 있다.
서브클론에서 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 면역글로불린 정제 과정, 예를 들어 단백질 A-세파로즈, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피에 의해 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 또는 정제될 수 있다.
또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조할 수 있다. 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 방법을 사용하여 (예를 들어 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열을 결정한다. 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리된 DNA는 발현 벡터에 삽입되고, 이 벡터는 재조합 숙주세포에서 모노클로날 항체를 합성하기 위해 본래 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주세포, 예를 들어 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포를 형질감염시킨다. 또한, DNA는 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 코딩 서열을 치환시키거나 (Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 상기 방식으로, 본원의 항-DR6 모노클로날 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체를 제조한다.
일반적으로, 상기 비-면역글로불린 폴리펩티드가 본 발명의 항체의 불변 도메인을 대신하거나, 본 발명의 항체의 한 항원 결합 부위의 가변 도메인을 대신하여 DR6에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위 및 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킨다.
또한, 키메라 또는 하이브리드 항체는 가교결합제를 수반하는 것을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 사용하여 시험관 내에서 제조할 수도 있다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 사용하여 또는 티오에테르 결합을 형성하여 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트를 포함한다.
또한, 단일쇄 Fv 단편은 예를 들어 문헌 [Iliades et al., FEBS Letters, 409:437-441 (1997)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 다양한 링커를 사용한 상기 단일쇄 단편의 커플링은 문헌 [Kortt et al., Protein Engineering, 10:423-433 (1997)]에 기재되어 있다. 항체의 재조합 생산 및 조작을 위한 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로 당업자에 의해 이용되는 상기 기술의 예를 아래에서 보다 상세히 설명한다.
인간화 항체
일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 그 내부에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 "도입 (import)" 잔기로서 종종 언급되고, 일반적으로 "도입" 가변 도메인으로부터 취한다. 인간화는 필수적으로 인간 항체의 대응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 대체함으로써 윈터 (Winter) 등의 방법 ([Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)]; [Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science. 239:1534-1536 (1988)])을 따라 수행할 수 있다.
따라서, 상기 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 작은 도메인이 비-인간종의 대응하는 서열로 대체된 키메라 항체이다. 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.
항체가 항원에 대한 높은 친화도 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화되는 것이 더욱 중요하다. 이를 달성하기 위해서, 바람직한 방법에 따르면, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모서열 및 상이한 개념적 인간화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상 입수가능하고, 당업계의 숙련인에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 그려 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 상기 디스플레이의 조사를 통해 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 끼치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 컨센서스 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합되어 목적하는 항체 특성, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가를 달성할 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 대한 영향에 직접적으로 가장 실질적으로 관련된다.
인간 항체
인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주는 예를 들어 문헌 ([Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984)], 및 [Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)])에 기재되어 있다.
면역화시에 내인성 면역글로불린 생성의 부재시에 인간 항체의 레퍼토리를 생성시킬 수 있는 트랜스제닉 (transgenic) 동물 (예, 마우스)을 현재 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 돌연변이체 마우스의 항체 중쇄 연결 구역 (JH) 유전자의 동종접합성 결실이 내인성 항체 생성을 완전히 억제한다고 설명되었다. 상기 생식세포 돌연변이체 마우스에서 인간 생식세포 면역글로불린 유전자 어레이의 전이는 항원 시험접종시에 인간 항체의 생성을 야기할 것이다 (예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362. 255-258 (1993)] 참조).
문헌 [Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997)])에서는 기술을 보다 개선시켜, 항원으로 시험접종시에 고친화도의 완전 인간 항체를 생성시키는 "Xenomouse II"로 명명된 트랜스제닉 마우스 라인을 생성시켰다. 이것은 메가베이스의 인간 중쇄 및 경쇄 로커스의 상기한 바와 같은 내인성 JH 세그먼트가 결실된 마우스 내로의 생식세포 통합에 의해 달성되었다. Xenomouse II는 약 66 VH 유전자, 완전한 DH 및 JH 구역 및 3개의 상이한 불변 구역 (μ, δ 및 χ)를 포함하는 1,020 kb의 인간 중쇄 로커스를 보유하고, 또한 32 Vκ 유전자, Jκ 세그먼트 및 Cκ 유전자를 포함하는 800 kb의 인간 κ 로커스를 보유한다. 상기 마우스에서 생산된 항체는 유전자 재배열, 회합 및 레파토리를 포함하여 모든 면에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사하다. 인간 항체는 뮤린 로커스에서 유전자 재배열을 방지하는 내인성 JH 세그먼트의 결실에 의해 내인성 항체보다 우선적으로 발현된다.
별법으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990))을 사용하여 면역화되지 않은 공여자로부터 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관 내에서 생성시킬 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 필라멘트성 박테리오파지, 예를 들어 M13 또는 fd의 주요 또는 마이너 코트 단백질 유전자 내로 인 프레임으로 클로닝되어 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트성 입자는 파지 게놈의 단일가닥 DNA 카피를 포함하기 때문에, 항체의 기능성 특성에 기초한 선택을 통해 또한 상기 특성을 보이는 항체를 코딩하는 유전자의 선택이 가능하다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993)]을 참조한다. V-유전자 세그먼트의 복수의 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 어레이를 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 V 유전자 레퍼토리를 제조할 수 있고, 다양한 항원 어레이 (자가항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)], 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다. 자연 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 속도로 돌연변이를 축적시킨다 (체세포 과다돌연변이). 도입된 변이의 일부는 보다 높은 친화도를 부여하고, 고친화도 표면 면역글로불린을 디스플레이하는 B 세포는 후속 항원 시험접종 동안 우선적으로 복제 및 분화된다. 상기 천연 과정은 "사슬 셔플링"으로 알려진 기술 (Marks et al., Bio/Technol., 1O, 779-783 [1992])을 사용하여 모방할 수 있다. 상기 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 얻은 "1차" 인간 항체의 친화도는 면역화되지 않은 공여자로부터 얻은 V 도메인 유전자의 자연 발생 변이체의 레퍼토리로 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 후속적으로 대체함으로써 개선시킬 수 있다. 상기 기술은 nM 범위의 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편의 생산을 가능하게 한다. 매우 큰 파지 항체 레퍼토리 ("머더-오브-올 라이브러리 (mother-of-all libraries)"로도 알려짐)를 제조하기 위한 한 전략은 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)]에 기재되어 있다. 또한, 유전자 셔플링을 사용하여 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도할 수 있고, 여기서 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅 (imprinting)"으로도 불리는 상기 방법에 따라, 파지 디스플레이 기술에 의해 얻은 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자가 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 설치류-인간 키메라를 생성시킨다. 항원에 대해 선택하여 기능성 항원 결합 부위를 저장할 수 있는 인간 가변 도메인을 단리한다. 즉, 에피토프가 파트너 선택을 좌우 (임프린팅)한다. 나머지 설치류 V 도메인을 대체하기 위해 과정을 반복할 때, 인간 항체를 얻게 된다 (1993년 4월 1일 공개된 PCT 특허 출원 WO 93/06213 참조). CDR 그라프팅 (grafting)에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 상기 기술은 설치류 기원의 프레임워크 또는 CDR 잔기가 없는 완전 인간 항체를 제공한다.
아래에서 상세히 논의되는 바와 같이, 본 발명의 항체는 임의로 단량체 항체, 이량체 항체, 및 다가 형태의 항체를 포함할 수 있다. 당업자는 당업계에 공지된 기술에 의해 본원의 DR6 및/또는 APP 항체를 사용하여 상기 이량체 또는 다가 형태를 제조할 수 있다. 1가 항체의 제조 방법도 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 한 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형 중쇄의 재조합 발현을 수반한다. 중쇄는 중쇄 가교결합을 방지하기 위해서 일반적으로 Fc 구역의 임의의 지점에서 말단 절단된다. 별법으로, 관련 시스테인 잔기는 다른 아미노산 잔기로 대체되거나 결실되어 가교결합을 방지한다.
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날의, 바람직하게는 인간 또는 인간화 항체이다. 이 경우에, 결합 특이성의 하나는 DR6 수용체에 대한 것이고, 다른 결합 특이성은 임의의 다른 항원, 바람직하게는 다른 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다. 이중특이적 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하고, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, 1983, Nature, 305:537-539). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 랜덤 분류 때문에, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마 (quadroma))는 하나만 정확한 이중특이적 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산한다. 보통 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고, 생산 수율이 낮다. 유사한 절차가 PCT 출원 공개 WO 93/08829 (1993년 5월 13일 공개) 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO 10, 3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
상이한, 보다 바람직한 방식에 따르면, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 구역을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 융합체의 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 구역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체 및, 필요한 경우 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이는 제작에 사용된 3개의 폴리펩티드 사슬의 불균등한 비율이 최적 수율을 제공하는 실시태양에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 큰 탄력성을 제공한다. 그러나, 균등한 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 고수율을 나타낼 때 또는 상기 비가 특히 중요하지 않을 때 하나의 발현 벡터 내에 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다. 이 방법의 바람직한 실시태양에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 쪽 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄쌍 (제2 결합 특이성을 제공하는)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 반쪽에만 면역글로불린 경쇄가 존재하는 것이 손쉬운 분리 방법을 제공하므로, 상기 비대칭 구조는 원치 않는 면역글로불린 사슬 조합물로부터 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 1994년 3월 3일 공개된 PCT 공개 WO 94/04690에 개시되어 있다.
이중특이적 항체의 생성에 대한 보다 상세한 내용에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121, 210 (1986)]을 참조한다.
이종컨쥬게이트 항체
또한, 이종컨쥬게이트 항체가 본 발명의 범위에 포함된다. 이종컨쥬게이트 항체는 2개의 공유연결된 항체로 이루어진다. 상기 항체는 예를 들어 면역계 세포를 원치 않는 세포에 대해 표적화시키고 (미국 특허 4,676,980), HIV 감염의 치료를 위해 (PCT 출원 공개 WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089) 제안되었다. 이종컨쥬게이트 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 공지되어 있고, 많은 가교결합 기술과 함께 미국 특허 4,676,980에 개시되어 있다.
항체 단편
특정 실시태양에서, 항-DR6 및/또는 APP 항체 (뮤린, 인간 및 인간화 항체, 및 항체 변이체)는 항체 단편이다. 항체 단편 생산을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 상기 단편은 무손상 항체의 단백질 분해 소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, [Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 상기 단편은 이제 재조합 숙주세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 실시태양에서, F(ab')2는 F(ab')2 분자의 회합을 촉진하기 위해 류신 지퍼 GCN4를 사용하여 형성된다. 다른 방법에 따르면, Fv, Fab 또는 F(ab')2 단편은 재조합 숙주세포 배양액으로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술을 당업자는 쉽게 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 파파인을 사용한 소화를 수행할 수 있다. 파파인 소화의 예는 1994년 12월 22일 공개된 WO 94/29348 및 미국 특허 4,342,566에 기재되어 있다. 항체를 파파인으로 소화하면 일반적으로 단일 항원 결합 부위를 각각 갖는, Fab 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편, 및 잔여 Fc 단편이 생성된다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위를 갖고 여전히 항원을 가교결합시킬 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다.
항체 소화에서 생성된 Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 항체 힌지 구역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본원에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 포함하는 Fab'의 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 한쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 당업계에 공지되어 있다.
항체의 글리코실화 변이체
항체는 그의 불변 구역 내의 보존된 위치에서 글리코실화된다 ([Jefferis and Lund, Chem. Immunol. 65: 111-128 [1997]]; [Wright and Morrison, TibTECH 15:26-32 [1997]]). 면역글로불린의 올리고당 측쇄는 단백질의 기능에 영향을 주고 ([Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318 [1996]]; [Wittwe and Howard, Biochem. 29:4175-4180 [1990]]), 당단백질의 일부 사이의 분자내 상호작용은 당단백질의 입체 형태 및 제시된 3차원 표면에 영향을 줄 수 있다 ([Hefferis and Lund, 상기 문헌]; [Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416 [1996]]). 또한, 올리고당은 특이적 인식 구조를 기초로 하여 제시된 당단백질이 특정 분자를 표적화하도록 기능할 수 있다. 예를 들어, 비갈락토실화된 IgG에서, 올리고당 모이어티는 CH2 공간 내로부터 '튀어오르고 (flipping)', 말단 N-아세틸글루코사민 잔기가 만노스 결합 단백질에 대한 결합에 이용가능하게 된다고 보고되었다 (Malhotra et al., Nature Med. 1:237-243 [1995]). 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 생산된 CAMPATH-1H (인간 림프구의 CDw52 항원을 인식하는 재조합 인간화 뮤린 모노클로날 IgG1 항체)로부터 올리고당의 글리코펩티다제에 의한 제거는 보체 매개 용해 (CMCL)의 완전한 감소를 야기하지만 (Boyd et al., Mol. Immunol. 32:1311-1318 [1996]), 뉴라미니다제를 사용한 시알산 잔기의 선택적인 제거는 DMCL의 손실을 전혀 야기하지 않았다. 또한, 항체의 글리코실화는 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 영향을 주는 것으로 보고되었다. 특히, 이등분 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 테트라사이클린-조절된 발현을 보이는 CHO 세포가 개선된 ADCC 활성을 갖는 것으로 보고되었다 (Umana et al., Mature Biotech. 17:176-180 [1999]).
항체의 글리코실화 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변경된 변이체이다. 변경은 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 결실, 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 항체에 대한 부가, 글리코실화 조성 (글리코실화 패턴)의 변경, 글리코실화 수준의 변경 등을 의미한다. 글리코실화 변이체는 예를 들어 항체를 코딩하는 핵산 서열에 하나 이상의 글리코실화 부위의 제거, 변경 및/또는 부가를 통해 제조할 수 있다.
항체의 글리코실화는 일반적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 의미한다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 모이어티의 효소에 의한 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내의 상기 트리펩티드 서열의 존재는 효능있는 글리코실화 부위를 생성시킨다. O-연결 글리코실화는 당 N-아세일갈락토사민, 갈락토스, 또는 크실로스의 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌 중의 하나의 부착을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신도 사용될 수 있다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 트리펩티드 서열 (N-연결 글리코실화 부위에 대해)을 포함하도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다. 또한, 변형은 본래 항체의 서열에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 수행될 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위에 대해).
또한, 항체의 글리코실화 (글리코실화 패턴)은 근본적인 뉴클레오티드 서열을 변경시키지 않으면서 변경될 수 있다. 글리코실화는 주로 항체 발현에 사용된 숙주세포에 따라 결정된다. 잠재적인 치료제로서 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현에 사용되는 세포 종류는 천연 세포가 드물기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴의 유의한 변경을 예상할 수 있다 (예를 들어 [Hse et at, J. Biol. Chem. 272:9062-9070 [1997]] 참조). 숙주세포의 선택에 추가하여, 항체의 재조합 생산 동안 글리코실화에 영향을 주는 인자는 성장 방식, 배지 제제, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 방식 등을 포함한다. 올리고당 생산에 관여하는 특정 효소의 도입 또는 과다발현을 포함하여 특정 숙주 유기체에서 달성되는 글리코실화 패턴을 변경시키기 위해 다양한 방법이 제안되었다 (미국 특허 5,047,335; 5,510,261 및 5.278,299). 글리코실화, 또는 특정 종류의 글리코실화는 예를 들어 엔도글리코시다제 H (Endo H)를 사용하여 당단백질로부터 효소에 의해 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주세포는 예를 들어 특정 종류의 다당류의 프로세싱에 결함이 있도록 유전공학적으로 처리될 수 있다. 상기 기술 및 유사한 기술은 당업계에 공지되어 있다.
항체의 글리코실화 구조는 렉틴 크로마토그래피, NMR, 질량분광분석, HPLC, GPC, 단당류 조성 분석, 순차적 효소 소화 및 전하를 기초로 하여 올리고당을 분리하기 위해 고 pH 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 HPAEC-PAD를 포함하여 종래의 탄수화물 분석 기술에 의해 쉽게 분석할 수 있다. 또한, 분석 목적을 위해 올리고당을 방출하는 방법이 공지되어 있고, 효소 처리 (통상 펩티드-N-글리코시다제 F/엔도-β-갈락토시다제를 사용하여 수행), 주로 O-연결 구조를 방출하기 위해 가혹한 알칼리 환경을 사용한 제거, 및 N- 및 O-연결된 올리고당을 모두 방출하기 위해 무수 히드라진을 사용하는 화학적 방법을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
예시적인 항체
하기 실시예에 설명된 바와 같이, 항-DR6 모노클로날 항체가 확인되었다. 선택적인 실시태양에서, 본 발명의 DR6 항체는 본원에 구체적으로 개시된 임의의 항-DR6 및/또는 APP 항체와 동일한 생물학적 특성을 가질 것이다.
용어 "생물학적 특성"은 모노클로날 항체의 시험관내 및/또는 생체내 활성 또는 특성, 예를 들어 DR6에 특이적으로 결합하거나 DR6 활성화를 차단, 억제 또는 중화하는 능력을 의미하기 위해 사용된다. DR6 및/또는 APP 항체의 특성 및 활성은 아래 실시예에 추가로 기재되어 있다.
임의로, 본 발명의 모노클로날 항체는 아래 실시예에서 구체적으로 특성화된 임의의 항체와 동일한 생물학적 특성을 갖고(갖거나) 상기 항체와 동일한 에피토프(들)에 결합할 것이다. 이것은 본원에서 및 실시예에서 설명된 바와 같은 다양한 분석을 수행함으로써 결정할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체가 본원에서 구체적으로 언급된 DR6 및/또는 APP 항체와 동일한 특이성을 갖는지를 결정하기 위해, 그의 활성을 경쟁적 결합 분석에서 비교할 수 있다. 또한, 특정 항-DR6 및/또는 APP 항체가 결합하는 에피토프는 DR6 및/또는 APP와 목적하는 항체 사이의 복합체에 대한 결정구조 분석에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 설명되는 DR6 및/또는 APP 항체는 바람직하게는 요구되는 DR6 길항 활성을 보유할 것이다. 상기 DR6 항체는 키메라, 인간화, 인간, 및 친화도 성숙 항체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기한 바와 같이, DR6 및/또는 APP 항체는 상기 요구되는 활성 또는 특성을 달성하기 위해서 다양한 기술을 사용하여 제조되거나 공학처리될 수 있다.
본 발명의 추가의 실시태양은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 비-단백질성 중합체에 연결된, 본원에 개시된 항-DR6 수용체 및/또는 APP 리간드 항체를 포함한다. 임의로, 본원에 개시된 항-DR6 수용체 및/또는 APP 리간드 항체는 글리코실화되거나 또는 비글리코실화된다.
본 발명의 항체는 "가교결합된" DR6 및/또는 APP 항체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "가교결합된"은 적어도 2개의 IgG 분자가 함께 결합하여 하나의 (또는 단일) 분자를 형성함을 의미한다. DR6 및/또는 APP 항체는 다양한 링커 분자를 사용하여 가교결합될 수 있고, 바람직하게는 DR6 및/또는 APP 항체는 항-IgG 분자, 보체, 화학적 변형 또는 분자공학을 사용하여 가교결합된다. 당업자는 세포 표면막에 항체가 결합하면 보체가 항체 분자에 대한 비교적 높은 친화도를 갖는다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 보체를 세포 표면막에 결합된 2 이상의 항-DR6 항체를 연결시키는 가교결합 분자로서 사용할 수 있음이 생각된다.
본 발명은 또한 본원에 개시되는 DR6 및/또는 APP 항체를 코딩하는 단리된 핵산, 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주세포, 및 항체 제조를 위한 재조합 기술을 제공한다.
항체의 재조합 생산을 위해, 항체 코딩 핵산은 단리되어 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능 벡터 내로 삽입된다. 항체 코딩 DNA는 쉽게 단리되고, 통상적인 과정 (예를 들어 항체 코딩 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여)에 의해 서열결정된다. 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열 중의 하나 이상을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 항-DR6 및/또는 APP 항체 경쇄 또는 중쇄 (또는 경쇄와 중쇄 모두)를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 단계, 숙주세포를 상기 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키는 단계 및 숙주세포(들)를 재조합 항-DR6 항체 및/또는 APP 항체 생성물을 생산하기에 충분한 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는, 키메라 또는 재조합 항-DR6 및/또는 APP 항체의 제조 방법을 포함한다.
DR6 길항제의 제제
본원에서 전형적인 제제의 제조시에, 사용되는 성분의 권장 품질 또는 "등급 (grade)"은 제제의 궁극적인 용도에 따라 결정될 것임을 유의해야 한다. 치료 용도를 위해, 성분(들)은 제약 제품에 대한 첨가제로서 허용되는 등급 (예를 들어 "GRAS")이 바람직하다.
특정 실시태양에서, DR6 길항제(들) 및 DR6 길항제의 용해도 및/또는 안정성을 향상시키기 위해 충분한 이온 강도를 제공하는 하나 이상의 부형제를 포함하는 조성물이 제공되고, 상기 조성물의 pH는 6 (또는 약 6) 내지 9 (또는 약 9)이다. DR6 길항제는 단백질, 예를 들어 상기 방법에 따라 단백질의 요구되는 순도를 달성하기 위해서 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시태양에서, DR6 길항제는 숙주세포에서 재조합 방식으로 발현되거나 또는 화학 합성에 의해 제조된다. 제제 내의 DR6 길항제의 농도는 예를 들어 제제의 의도하는 용도에 따라 상이할 수 있다. 당업자는 과도한 실험을 수행하지 않으면서 DR6 길항제의 요구되는 농도를 결정할 수 있다.
DR6 길항제의 용해도 및/또는 안정성을 향상시키기 위해 충분한 이온 강도를 제공하는 제제 내의 하나 이상의 부형제는 임의로 다이온성 유기 또는 무기산, 아스파르테이트, 황산나트륨, 숙신산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, Captisol™, Tris, 아르기닌 염 또는 다른 아미노산, 당 및 폴리올, 예를 들어 트레할로스 및 수크로스이다. 바람직하게는, 충분한 이온 강도를 제공하는 제제 내의 하나 이상의 부형제는 염이다. 사용될 수 있는 염은 나트륨 염 및 아르기닌 염을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 사용되는 염의 종류 및 염의 농도는 제제 내의 DR6 길항제가 안정될 수 있는 비교적 높은 이온 강도를 제제가 갖도록 하는 것이 바람직하다. 임의로, 염은 약 20 mM 내지 약 0.5 M의 농도로 제제 내에 존재한다.
조성물의 pH는 바람직하게는 6 (또는 약 6) 내지 9 (또는 약 9), 보다 바람직하게는 약 6.5 내지 약 8.5, 훨씬 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 본 실시태양의 바람직한 측면에서, 조성물은 조성물의 pH를 적어도 약 6 내지 약 8로 유지하기 위해 버퍼를 추가로 포함할 것이다. 사용될 수 있는 버퍼의 예는 Tris, HEPES, 및 히스티딘을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. Tris를 사용할 때, pH는 약 7 내지 8.5로 임의로 조정될 수 있다. Hepes 또는 히스티딘을 사용할 경우에는, pH는 약 6.5 내지 7로 임의로 조정될 수 있다. 임의로, 버퍼는 제제에 약 5 mM 내지 약 50 mM의 농도로 사용된다.
특히 액체 제제 (또는 재구성되는 동결건조된 제제)의 경우에, 조성물에 하나 이상의 계면활성제를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 계면활성제는 예를 들어 비이온계 계면활성제, 예를 들어 TWEEN™ 또는 PLURONICS™ (예를 들어, 폴리소르베이트 또는 폴록사머)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 계면활성제는 폴리소르베이트 20 ("Tween 20")을 포함한다. 계면활성제는 임의로 약 0.005％ 내지 약 0.2％의 농도로 사용될 것이다.
본 발명의 제형은 DR6 길항제(들) 및 상기 설명된 성분 이외에, 추가의 다양한 다른 부형제 또는 성분을 포함할 수 있다. 임의로, 제제는 비경구 투여를 위해 제약상 또는 비경구적으로 허용되는 담체, 즉 사용되는 용량 및 농도에서 투여자에게 무독성이고 제제 내의 다른 성분과 상용성인 담체를 포함할 수 있다. 임의로, 담체는 비경구 담체, 예를 들어 투여자의 혈액과 등장성인 용액이다. 상기 담체 비히클 (vehicle)의 예는 물, 염수 또는 완충 용액, 예를 들어 포스페이트-완충 염수 (PBS), 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 다양한 선택적인 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed. (1980)]에 추가로 설명되어 있다.
또한, 본원에서 제제는 하나 이상의 보존제를 포함할 수 있다. 그 예는 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드 (알킬기가 장쇄 화합물인 알킬벤질디메틸암모늄 클로라이드의 혼합물) 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 다른 종류의 보존제는 방향족 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤 및 m-크레졸을 포함한다. 항산화제는 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 부틸 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레졸시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
본 발명의 조성물은 액체 제제 (액체 용액 또는 액체 현탁액), 및 동결건조된 제제, 및 현탁액 제제를 포함할 수 있다. 액체인 경우에, 최종 제제는 바람직하게는 ≤ 20℃에서 동결 보관된다. 별법으로, 제제는 동결건조되고, 주사용수를 사용한 재구성을 위해 분말로서 제공될 수 있고, 임의로 2-30℃에서 보관될 수 있다.
치료 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 멸균은 멸균 여과막 (예를 들어, 0.2 마이크로미터 막)을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 치료 조성물은 일반적으로 멸균 접근부를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘이 투과될 수 있는 스토퍼 (stopper)를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 공급된다.
조성물은 통상적으로 수용액 또는 재구성을 위한 동결건조된 제제로서 단일 단위 또는 다중 투여 용기, 예를 들어, 밀봉 앰플 또는 바이알에 보관될 것이다. 용기는 당업계에서 이용가능한 임의의 용기이고, 통상적인 방법을 사용하여 충전된다. 임의로, 제제는 제제의 치료 목적의 전달에 적합한 주사 펜 기기 (또는 펜 기기 내에 설치되는 카트리지), 예를 들어 당업계에서 이용가능한 기기 (예를 들어, US 특허 5,370,629 참조)에 포함될 수 있다. 주사 용액은 예를 들어 주사용수를 사용하여 동결건조된 DR6 길항제를 재구성하여 제조할 수 있다.
DR6 길항제(들)을 사용한 요법
본 발명의 DR6 길항제는 다양한 효용성을 갖는다. DR6 길항제는 신경학적 질환의 진단 및 치료에서 유용하다. 본원에 기재된 다양한 병리학적 상태의 포유동물에서 진단은 숙련된 당업자에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 포유동물에서 다양한 신경학적 질환의 진단 또는 검출을 허용하는 진단 기술이 당업계에서 이용가능하다.
본 발명에 의한 치료에 고려되는 신경학적 질환은 가족성 및 산발성 근위축성 측삭 경화증 (각각 FALS 및 ALS), 가족성 및 산발성 파킨슨병, 헌팅턴 병, 가족성 및 산발성 알츠하이머병, 및 척수 근육 위축증 (SMA)을 포함한다 (Price et al., 상기 문헌). 많은 이들 질병은 중년 동안의 발병을 특징으로 하고, 신경계 내에서 특수한 하위세트의 뉴런의 급속한 변성을 일으켜, 궁극적으로 조기 사망을 일으킨다.
근위축성 측삭 경화증 (ALS)은 가장 일반적으로 진단되는 진행성 운동 뉴런 질병이다. 상기 질병은 피질, 뇌간 및 척수에서 운동 뉴런의 변성을 특징으로 한다 ([Siddique et al., J. Neural Transm. Suppl., 49:219-233 (1997)]; [Siddique et al., Neurology, 47: (4 Suppl 2):S27-34; discussion S34-5 (1996)]; [Rosen et al., Nature, 362:59-62 (1993)]; [Gurney et al., Science, 264:1772-1775 1994)]).
파킨슨병 (진전 마비)은 대체로 중년 내지 만년에 나타나는 일반적인 신경변성 질환이다. 가족성 및 산발성 사례가 일어나지만, 가족성 사례는 관찰된 사례의 단지 1-2％만 차지한다. 환자는 종종 뇌간의 흑색질 및 청반 (locus coeruleus) 내에 루이 소체 및 반응성 신경교증을 갖는 뉴런 세포 손실을 갖는다. 하나의 클래스로서, 흑질 선조체의 도파민성 뉴런이 가장 큰 영향을 받는 것으로 보인다 ([Uhl et al., Neurology, 35:1215-1218 (1985)]; [Levine et al., Trends Neurosci., 27:691-697 (2004)]; [Fleming et al., NeuroRx, 2:495-503 (2005)]).
근위 (proximal) 척수 근육 위축증 (SMA)은 전형적으로 척수 운동 뉴런의 손실 및 사지와 몸통 근육의 위축을 특징으로 하는 인간에서 일반적인 상염색체 열성 신경변성 질병이다 ([Monani et al., Hum. Mol. Genet., 9:2451-2457 (2000)]; [Monani et al., J. Cell Biol., 160:41-52 (2003)]). 이는 10,000명 중 1명의 빈도로 발생하고, 유아 사망률의 가장 일반적인 유전적 원인이다. 발병시 연령 및 질병 표현형의 심도를 기준으로, 근위 SMA는 I형 (중증), II형 (중간) 및 III형 (경증) SMA로 분류되었다. 3가지 모든 형태의 질병은 운동 뉴런 유전자 (SMN1)의 말단 생존의 손실 또는 돌연변이로 인한 것이다 ([Monani et al., 상기 문헌, 2000]; [Monani et al., 상기 문헌, 2003)]).
뉴런 세포 손실은 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 및 척수 근육 위축증 (SMA)을 비롯한 많은 신경변성 질병에서 보고되었다.
임의로, 환자에서 알츠하이머병의 진단은 문헌 [Diagnostic and Statistical Manual of Mental disorders, 4th Edition (DSM-IV-TR)]의 기준을 기초로 할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [American Psychiatric Association. Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 4th Edition-text revised. Washington, DC: 2000] 참조). 간단히 설명하면, DSM-IV-TR 기준은 (A) 기억력 장애, 및 (1) 언어상실증; (2) 행위상실증; (3) 인식불능증; 및 (4) 실행성 기능의 장애 중의 하나 이상에 의해 나타난 다수의 인지 결핍의 발달; (B) 인지 결핍이 과거의 기능으로부터 감퇴를 나타내고, 사회적 또는 직업적 기능에서 심각한 장애를 일으키고; (C) 경과는 점진적인 발병 및 계속적인 감퇴를 특징으로 하고; (D) 인지 결핍은 기억 및 인지의 진행성 결핍을 유발하는 다른 중추 신경계, 전신, 또는 물질-유도성 상태로 인한 것이 아니고; (E) 장애가 다른 정신 질환에 의한 것으로 간주되지 않는 것을 포함한다. 알츠하이머병을 진단할 수 있는 다른 기준은 알츠하이머병에 대한 [National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke-Alzheimer's Disease and Related Disorder Association (NINDS-ADRDA)] 작업군 기준을 기초로 한 것을 포함한다 (예를 들어, [McKhann et al., Neurology 1984; 34: 939-944] 참조). 간단히 설명하면, 가능한 알츠하이머병에 대한 NINCDS-ADRDA 기준은 치매를 일으킬 수 있는 임의의 동반-이환 (co-morbid) 질병이 원인인 것으로 생각되지 않는 공지의 병인론을 갖지 않고 비정형 발병, 제시, 또는 진행을 갖는 치매 증후군을 포함한다. 가능한 알츠하이머병에 대한 NINCDS-ADRDA 기준은 임상 및 신경심리 검사에 의해 확립된 치매를 포함하고, (a) 기억을 비롯한 2개 이상의 인지 영역에서의 진행성 결핍; (b) 40 내지 90세 사이에서의 발병; 및 (c) 섬망을 비롯한 치매 증후군을 일으킬 수 있는 전신 또는 다른 뇌 질병의 부재를 수반한다. 확정 알츠하이머병에 대한 NINCDS-ADRDA 기준은 가능한 알츠하이머병에 대한 기준을 만족하는 것을 포함하고, 부검 또는 생검을 통한 알츠하이머병의 조직병리학적 증거를 갖는다.
개정 NINDS-ADRDA 진단 기준은 문헌 [Dubois et al., The Lancet Neurology, Volume 6, Issue 8, August 2007, Pages 734-746]에서 제안되었다. 아래에 간단히 개략한 바와 같이, 가능한 알츠하이머병에 대한 상기 기준을 만족하기 위해, 병에 걸린 개인은 기준 A (핵심 임상 기준), 및 B, C, D, 및 E에 제시된 적어도 하나 이상의 보완적 생체마커 기준을 충족해야 한다. 이러한 맥락에서, 기준 A는 다음 특징을 포함하는 초기 및 유의한 에피소드 (episodic) 기억 장애의 존재를 특징으로 한다: (1) 6개월 이상에 걸쳐 환자 또는 통지자가 보고한 기억 기능의 점차적이고 진행성 변화; (2) 시험에서 유의하게 손상된 에피소드 기억의 객관적 증거: 이는 일반적으로 정보의 효과적인 부호화가 이전에 제어된 후 암시 또는 인식 시험으로 유의하게 개선되지 않거나 표준화되지 않는 회상력 결핍으로 이루어진다; (3) 에피소드 기억력 장애는 AD의 발병시에 또는 AD가 진행함에 따라 다른 인지 변화와 격리되거나 연관될 수 있다. 기준 B는 예를 들어 시각적 스코어링을 사용하는 정성적 등급화 (연령 기준을 갖는 잘 특성화된 집단을 참조함) 또는 관심있는 구역의 정량적 부피측정 (연령 기준을 갖는 잘 특성화된 집단을 참조함)을 사용하는 MRI 상에서 입증된 해마, 내후각내 피질, 편도의 부피 손실에 의해 나타난 바와 같은, 내측 측두엽 위축의 존재를 특징으로 한다. 기준 C는 비정상적 뇌척수액 생체마커, 예를 들어 낮은 아밀로이드 β1-42 농도, 증가된 총 타우 (tau) 농도, 또는 증가된 포스포-타우 농도 또는 3개의 조합을 특징으로 한다. 기준 C는 PET를 사용한 기능적 신경영상 상의 특수한 패턴, 예를 들어 양측 측두-두정 구역에서 글루코스 대사의 감소를 특징으로 한다. 기준 E는 입증된 직계 가족 내에서 AD 상염색체 우성 돌연변이를 특징으로 한다. AD는 다음의 것이 존재하는 경우에 확정된 것으로 간주된다: (1) AD의 사후 진단을 위한 NIA-Reagan 기준에 의해 요구되는 바와 같은 질병의 임상학적 및 조직병리학적 (뇌 생검 또는 부검) 증거; 기준이 존재해야 한다 (예를 들어 [Neurobiol Aging 1997; 18: S1-S2] 참조); 및 (2) AD의 임상학적 및 유전적 증거 (염색체 1, 14, 또는 21 상의 돌연변이); 기준이 존재해야 한다.
본 발명의 방법에서, DR6 길항제는 바람직하게는 담체; 바람직하게는 제약상 허용되는 담체 중에서 포유동물에 투여된다. 적합한 담체 및 그의 제제는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., edited by Oslo et al.]에 기재되어 있다. 일반적으로, 제제를 등장성으로 만들기 위해 적절한 양의 제약상 허용되는 염이 제제에 사용된다. 담체의 예는 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가의 담체는 지연 방출 제제, 예를 들어 성형품, 예를 들어 필름, 리포좀 또는 마이크로입자의 형태인 항체 함유 고상 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함한다. 당업자는 예를 들어 투여 경로 및 투여되는 DR6 길항제의 농도에 따라 특정 담체가 더 바람직할 수 있음을 분명하게 알 수 있을 것이다.
DR6 길항제는 주사 (예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근내, 문맥내), 경구, 또는 다른 방법, 예를 들어 유효 형태로 혈류 내로 전달되는 것을 보장하는 주입에 의해 포유동물에게 투여될 수 있다. 또한, DR6 길항제는 국소 치료 효과를 발생시키기 위해 분리된 관류 기술, 예를 들어 분리된 조직 관류, 또는 경막내, 안구내, 또는 요추 천자에 의해 투여될 수 있다. 혈액-뇌 장벽을 쉽게 횡단하지 못하는 DR6 길항제는 직접, 예를 들어 뇌내로 또는 척수 공간 내로 또는 상기 길항제를 장벽을 가로질러 수송하는 다른 방법으로 투여될 수 있다. DR6 길항제의 유효 투여량 및 투여 계획은 경험적으로 결정할 수 있고, 이 결정은 당업자의 능력 범위 내에 있는 것이다. 당업자는 투여되어야 하는 DR6 길항제의 투여량이 예를 들어 길항제를 투여하는 포유동물, 투여 경로, 사용되는 길항제의 특정 종류 및 포유동물에게 투여되는 다른 약물에 따라 상이함을 이해할 것이다. 적절한 투여량 선택에 대한 지침은 예를 들어 항체의 치료 용도에 대한 문헌에서 볼 수 있다 (예를 들어 [Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357]; [Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389]). 단독으로 사용되는 DR6 항체의 전형적인 1일 투여량은 상기 요인에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg (체중)/일이거나 이를 초과할 수 있다.
또한, DR6 길항제는 하나 이상의 다른 치료제와 조합되어 포유동물에게 투여될 수 있다. 상기 다른 치료제의 예는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 억제제, 예를 들어, EGFR에 결합하거나 직접 상호작용하여 그의 신호전달 활성을 억제하거나 저하시키는 화합물, 예를 들어 Tarceva, 세툭시맙 및 Erbitux® (임클론 시스템즈 인크. (ImClone Systems Inc.))로도 언급되는 C225와 같은 항체, 완전 인간 ABX-EGF (파니투무맙, 아브게닉스 인크. (Abgenix Inc.)), 및 E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 및 E7.6.3으로 알려지고 US 6,235,883에 기재되어 있는 완전 인간 항체; MDX-447 (메다렉스 인크 (Medarex Inc)), 및 EGFR 소분자 억제제, 예를 들어 US5616582, US5457105, US5475001, US5654307, US5679683, US6084095, US6265410, US6455534, US6521620, US6596726, US6713484, US5770599, US6140332, US5866572, US6399602, US6344459, US6602863, US6391874, WO9814451, WO9850038, WO9909016, WO9924037, US6344455, US5760041, US6002008, US5747498에 기재된 화합물; 특정 소분자 EGFR 억제제, 예를 들어 OSI-774 (CP-358774, 에를로티닙, 오에스아이 파마슈티칼스 (OSI Pharmaceuticals)); PD 183805 (CI 1033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-, 디히드로클로라이드, 화이자 인크. (Pfizer Inc.)); 이레사 (ZD1839, 게피티닙, 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린, 아스트라제네카 (AstraZeneca)); ZM 105180 ((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린, 제네카 (Zeneca)); BIBX-1382 (N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-d]피리미딘-2,8-디아민, 뵈링거 인겔하임 (Boehringer Ingelheim)); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀); (R)-6-(4-히드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘); CL-387785 (N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드); 및 EKB-569 (N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(디메틸아미노)-2-부텐아미드)를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 치료제는 세포자멸 억제제, 특히 세포내 세포자멸 억제제, 예를 들어 카스파제 억제제, 예를 들어 카스파제-3, 카스파제-6, 또는 카스파제-8 억제제, Bid 억제제, Bax 억제제 또는 그의 임의의 조합물을 포함한다. 적합한 억제제의 예는 일반적인 카스파제 억제제, 디펩티드 억제제, 카르바메이트 억제제, 치환된 아스파르트산 아세탈, 헤테로시클릴디카르바미드, 퀴놀린-(디-, 트리-, 테트라펩티드) 유도체, 치환된 2-아미노벤즈아미드 카스파제 억제제, 치환된 a-히드록시산 카스파제 억제제, 니트로실레이션 (nitrosylation)에 의한 억제; CASP-1; CASP-3: 단백질-억제제, 안티센스 분자, 니코티닐-아스파르틸-케톤, y-케토산 디펩티드 유도체, CASP-8: 안티센스 분자, 상호작용 단백질 CASP-9, CASP2: 안티센스 분자; CASP-6: 안티센스 분자; CASP-7: 안티센스 분자; 및 CASP-12 억제제이다. 추가의 예는 미토콘드리아 억제제, 예를 들어 Bcl-2-조정 인자; Bad로부터 유도된 Bcl-2 돌연변이체 펩티드, Bad, BH3-상호작용 도메인 사멸 아고니스트, Bax 억제제 단백질 및 BLK 유전자 및 유전자 산물이다. 세포자멸의 다른 적합한 세포내 조정자는 CASP9/Apaf-1 회합의 조정자, Apaf-1 발현의 안티센스 조정자, 세포자멸의 억제 펩티드, 단순 헤르페스 바이러스의 R1 서브유닛을 포함하는 항-세포자멸성 조성물, MEKK1 및 그의 단편, 서비빈 (Survivin)의 조정자, 세포자멸 억제제의 조정자 및 HIAP2이다. 상기 물질의 추가의 예는 미토콘드리아로부터 시토크롬 c 방출을 억제하고 카스파제-3 mRNA 상향조절을 차단하는 미노사이클린 (뉴로아폽토시스 래보러토리 (Neuroapoptosis Laboratory), p53 억제제인 피피트린 (Pifithrin) 알파 (UIC), JNK 경로 억제제인 CEP-1346 (세팔론 인크 (Cephalon Inc.)), 세포자멸 촉진성 GAPDH 신호 전달을 억제하는 TCH346 (노바티스 (Novartis)), 범-카스파제 억제제인 IDN6556 (이둔 파마슈티칼스 (Idun Pharmaceuticals)); 카스파제-3 억제제인 AZQs (아스트라제네카), 카스파제-1/-4 억제제인 HMR-3480 (아벤티스 파마 (Aventis Pharma)), 및 혈병을 용해시키는 악티바제 (Activase)/TPA (제넨테크) (혈전용해약)를 포함한다.
DR6 길항제에 추가하여 투여될 수 있는 추가의 적합한 물질은 콜린에스테라제 억제제 (예를 들어 도네페질, 갈란타민, 리바스티그민, 타크린), NMDA 수용체 길항제 (예를 들어 메만틴), Aβ 응집 억제제, 항산화제, γ-세크레타제 조정자, NGF 모방제 또는 NGF 유전자 요법제, PPARγ 아고니스트, HMG-CoA 리덕타제 억제제 (스타틴), 암파킨, 칼슘 채널 차단제, GABA 수용체 길항제, 글리코겐 합성효소 키나제 억제제, 정맥내 면역글로불린, 무스카린 수용체 아고니스트, 니코틴 수용체 조정자, 능동 또는 수동 Aβ 면역화, 포스포디에스테라제 억제제, 세로토닌 수용체 길항제 및 항-Aβ 항체를 포함한다 (예를 들어, WO 2007/062852; WO 2007/064972; WO 2003/040183; WO 1999/06066; WO 2006/081171; WO 1993/21526; EP 0276723B1; WO 2005/028511; WO 2005/082939 참조).
DR6 길항제는 하나 이상의 다른 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. DR6 길항제 및 치료제의 양은 예를 들어 사용되는 약물의 종류, 치료되는 병릭학적 상태 및 투여 계획 및 경로에 따라 상이하지만, 일반적으로 각각 개별적으로 사용될 경우보다는 적을 것이다.
DR6 길항제를 포유동물에게 투여한 후, 포유동물의 생리학적 상태는 숙련된 의사에게 잘 알려진 다양한 방식으로 모니터링할 수 있다.
본 발명의 DR6 항체의 치료 효과는 시험관 내 분석 및 생체 내 동물 모델을 사용하여 조사할 수 있다. 다양한 잘 공지된 분석 및 동물 모델을 사용하여 후보 치료제의 효능을 시험할 수 있다. 상기 모델의 생체 내 특성을 통해 특히 인간 환자의 반응을 예측할 수 있다. 다양한 신경변성 병태의 동물 모델 및 상기 신경변성 모델과 연관된 병리학적 과정을 조사하기 위한 관련 기술 (예를 들어, DR6 길항제의 존재 및 부재 하에)은 아래 실시예 14에서 논의된다.
다양한 신경학적 질환의 동물 모델은 비-재조합 및 재조합 (트랜스제닉) 동물을 모두 포함한다. 비-재조합 동물 모델은 예를 들어 설치류, 예를 들어 뮤린 모델을 포함한다. 상기 모델은 표준 기술, 예를 들어 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 및 신피막 하 이식을 사용하여 세포를 동계 마우스 내로 도입함으로써 생성시킬 수 있다. 생체내 모델은 뇌졸중/뇌 허혈의 생체 내 모델, 신경변성 질병의 생체 내 모델, 예를 들어 파킨슨병의 마우스 모델; 알츠하이머병의 마우스 모델; 근위축성 측삭 경화증 ALS의 마우스 모델; 척수 근육 위축증 SMA의 마우스 모델; 국소 및 전뇌 허혈의 마우스/래트 모델, 예를 들어 통상적인 경동맥 폐색증 모델 또는 중대 뇌동맥 폐색증 모델; 또는 생체 외에서의 전체 배아 배양액을 포함한다. 예를 들어 아래에서 설명하거나 또는 당업계에 공지되고 문헌에 기재된 바와 같이 공지의 시험관내 또는 생체내 분석 포맷으로 다양한 분석을 실시할 수 있다 (예를 들어, [McGowan et al., TRENDS in Genetics, 22:281-289 (2006)]; [Fleming et al., NeuroRx, 2:495-503 (2005)]; [Wong et al., Nature Neuroscience, 5:633-639 (2002)] 참조). 다양한 상기 동물 모델은 또한 상업적인 시판자, 예를 들어 잭슨 래보러토리스 (Jackson Laboratory) (http://jaxmice.jax.org 참조)로부터 이용가능하다.
본원에 개시된 DR6 길항제의 신경학적 질환, 예를 들어 AD에 대한 활성을 조사하기 위해 당업계에 공지된 많은 동물 모델을 사용할 수 있다 (예를 들어, [Rakover et al., Neurodegener Dis. 2007; 4(5): 392-402]; [Mouri et al., FASEB J. 2007 Jul;21(9):2135-48]; [Minkeviciene et al., J Pharmacol Exp Ther. 2004 Nov; 311 (2): 677-82] 및 [Yuede et al., Behav Pharmacol. 2007 Sep; 18 (5-6):347-63)] 참조). 예를 들어, 본원에 개시된 DR6 길항제의 마우스의 인지 기능에 대한 효과는 사물 인식 시험을 사용하여 조사할 수 있다 (예를 들어, [Ennaceur et al., Behav. Brain Res. 1988; 31:47-59] 참조). 예를 들어 뇌 감염에 대한 본원에 개시된 DR6 길항제의 활성은 예를 들어 마우스 혈장 분획에서 염증 마커, 예를 들어 IL-1β 및 TNF-α 및 항-염증성 시토킨 IL-1O의 수준을 측정하기 위해 디자인된 조직화학적 분석 및 ELISA 프로토콜에 의해 마우스에서 조사될 수 있다 (예를 들어 [Rakover et al., Neurodegener Dis. 2007;4 (5):392-402] 참조).
본원에 개시된 DR6 길항제의 인간의 신경학적 질환, 예를 들어 알츠하이머병 (AD)에 대한 효과는 예를 들어 전반적인 평가와 함께 인지 결과 측정을 사용하여 조사될 수 있다 (예를 들어 Leber P: Guidelines for Clinical Evaluation of Antidementia Drugs, 1st draft, Rockville, MD, US Food and Drug Administration, 1990] 참조). 신경학적 질환, 예를 들어 AD에 대한 효과는 예를 들어 단일 또는 다수 세트의 기준을 사용하여 조사될 수 있다. 예를 들어, 유럽 의약품 평가청 (European Medicine Evaluation Agency (EMEA))은 인지 개선 및 기능 및 전반적인 활동 모두의 안정화의 기특정된 정도에 대응하는 반응자의 정의를 도입하였다 (예를 들어 [European Medicine Evaluation Agency (EMEA): Note for Guidelines on Medicinal Products in the Treatment of Alzheimer's Disease. London, EMEA, 1997] 참조). 단독으로 사용되거나 또는 물질에 대한 환자의 반응성을 평가하는 것과 함께 사용될 수 있는, 확립된 많은 특정 시험이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 [Van Dyke et al., AM J Geriatr. Psychiatry 14:5 (2006)] 참조). 예를 들어, 물질에 대한 반응성은 보다 중증의 AD 환자에서 인지 변화를 측정하기 위해 사용될 수 있는 시험인 중증 손상 평가 (Severe Impairment Battery (SIB))를 사용하여 평가할 수 있다 (예를 들어 [Schmitt et al., Alzheimer Dis Assoc Disord 1997; 11 (suppl 2):51-56] 참조). 또한, 물질에 대한 반응성은 치매의 후기 단계를 평가하기 위해 설계된 일상 생활의 활동을 수행할 때 독립적인 실행 수준을 측정하는 19개 항목의 목록인 ADCSADL19 (the 19-item Alzheimer's Disease Cooperative Study-Activities of Daily Living inventory)를 사용하여 측정할 수 있다 (예를 들어 [Galasko et al., J Int Neuropsychol Soc 2005; 11:446-453] 참조). 또한, 물질에 대한 반응성은 환자와 보호자 모두와의 체계적인 인터뷰를 기초로 한 7개 특징의 전반적인 변화인 CIBIC-Plus (Clinician's Interview-Based Impression of Change Plus Caregiver Input)를 사용하여 측정할 수 있다 (예를 들어 [Schneider et al., Alzheimer Dis Assoc Disord 1997; 11 (suppl 2):22-32] 참조). 또한, 물질에 대한 반응성은 보호자 인터뷰를 기초로 한 12개의 거동 증상의 빈도 및 심도를 평가하는 NPI (Neuropsychiatric Inventory)를 사용하여 측정할 수 있다 (예를 들어, [Cummings et al., Neurology 1994; 44:2308-2314] 참조).
다양한 콜린에스테라제 억제제 (도네페질, 갈란타민, 리바스티그민 및 타크린뿐만 아니라 N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA) 수용체 길항제인 메만틴)가 알츠하이머병의 치료에 대해 승인을 받았다 (예를 들어, [Roberson et al., Science 314: 781-784 (2006)] 참조). 경도 내지 중등 심도의 AD 환자에서 콜린에스테라제 억제제의 임상 시험에서, 치료 반응의 일반적인 정의는 6개월에 걸쳐 알츠하이머병 평가 척도 (Alzheimer's Disease Assessment Scale-Cognitive Subscale; ADAS-cog)에 대한 적어도 4개 특징의 개선을 포함하였다 (예를 들어, [Winblad et al., Int J Geriatr Psychiatry 2001; 16: 653-666]; [Cummings J., Am J Geriatr Psychiatry 2003; 11: 131-145]; 및 [Lanctot et al., CMAJ 2003; 169: 557-564] 참조). 또한, 상기 결과를 질병 과정을 각각 약 6개월 또는 1년 역전시키는 것과 비교하였다 (예를 들어 [Doraiswamy et al., Alzheimer Dis Assoc Disord (2001) 15: 174-183] 참조). 메만틴의 임상 시험에서, 치료 반응자는 전반적인 능력이 퇴보하지 않고 기능 또는 인지 능력이 퇴보하지 않은 환자로서 기특정되었다 (예를 들어 [Reisberg et al., N. Engl. J. Med. 2003; 348: 1333-1341] 참조). 안정한 용량의 콜린에스테라제 억제제 도네페질을 투여한 환자에서 메만틴의 다른 시험은 메만틴을 중증 손상 평가 (SIB), 및 변형 ADCS-ADL19 (19-item AD Cooperative Study-Activities of Daily Living Inventory), CIBIC-Plus (Clinician's Interview-Based Impression of Change Plus Caregiver Input), NPI (Neuropsychiatric Inventory), 및 노인병 환자에 대한 행동 등급 척도 (BGP Care Dependency Subscale)의 기준선으로부터의 변화를 포함하는 결과 측정에 대해서 위약에 비해 유리한 효과를 나타내는 것으로서 특성화하였다 (예를 들어, [Tariot et al., JAMA 2004; 291:317-324] 참조). 메만틴은 다수의 SIB, ADCS-ADL19, CIBIC-Plus 및 NPI 결과 측정에 걸쳐 증상의 개선 및 안정화를 생성시킴으로써 효과적인 것으로 더욱 특성화되었다 (예를 들어, [van Dyck et al., AM J Geriatr. Psychiatry 14:5 (2006)] 참조).
DR6 길항제 진단 용도
가족성 알츠하이머병 (FAD) 또는 상염색체 우성 조기 발병 알츠하이머병 (ADEOAD)은 대체로 상염색체 우성 방식으로 유전될 수 있는 65세 이전 (대체로 20 내지 65세)으로 정의된 생애 초기에 발생하는 드문 형태의 알츠하이머병을 나타낸다. 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 프레세닐린 1 (PSEN1), 및 프레세닐린 2 (PSEN2) 유전자의 연구에서는 이들 유전자의 돌연변이가 ADEOAD의 대다수의 관찰된 사례의 원인이라는 증거를 제공한다 (예를 들어, [Raux et al., Journal of Medical Genetics 2005; 42: 793-795] 참조). 그러나, 상기 증후군의 많은 관찰된 사례는 설명되지 않은 상태이다. 본원에 제시된 데이타는 사멸 수용체 6의 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 변이체가 일부 사례의 FAD 및/또는 다른 신경학적 질환의 원인일 수 있음을 제안한다. 본 발명의 실시태양은 개인에 존재하는 DR6 폴리펩티드의 서열을 서열 1과 비교하여, DR6의 폴리펩티드 변이체가 개인에서 발생하는지 결정하는 것을 포함하는, 서열 1을 포함하는 사멸 수용체 6 (DR6) 폴리펩티드의 폴리펩티드 변이체가 개인에 존재하는지 결정하는 방법을 포함한다. 임의로, 상기 방법에서, 환자는 FAD 및/또는 다른 신경학적 질환이 존재하거나 존재하는 것으로 의심되는 환자이다.
상기 맥락에서, 환자 샘플 내의 DR6 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드는 임상 샘플 및 세포주의 면역조직화학 분석, 계내 혼성화, RT-PCR 분석, 웨스턴 블롯 분석, 및 조직 어레이 분석을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 잘 공지된 많은 수단에 의해 분석될 수 있다 (예를 들어, DR6의 자연 발생 변이체를 확인하기 위해). DR6 유전자의 서열 (예를 들어 DR6 5' 및 3' 제어 서열, 인트론, 엑손 등) 및 DR6 유전자 산물 (예를 들어 DR6 mRNA, DR6 폴리펩티드 등)을 평가하기 위한 대표적인 프로토콜은 예를 들어 문헌 [Ausubel et al. eds., 2007, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis)]에서 찾을 수 있다.
상기 분석의 예시적인 실시태양에서, 뉴런 세포는 신경학적 질환이 존재하거나 신경학적 질환에 걸리기 쉬운 것으로 의심되는 환자로부터 얻어지고, 여기에서 발현된 DR6 폴리펩티드 및/또는 mRNA 서열은 면역분석, 노던 블롯 분석 또는 폴리뉴클레오티드 서열 분석과 같은 절차에 의해 분석될 수 있다 (예를 들어 [Lane et al., Laryngoscope. 2002; 112(7 Pt 1): 1183-9]; 및 [Silani et al., Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord. 200; 2 Suppl 1:S69-76] 참조). 본 발명의 특정 실시태양에서, 환자 뉴런 세포 (이는 임의로 시험관내 배양으로 계대배양될 수 있다)로부터 얻어진 DR6 폴리펩티드는 면역분석, 예를 들어 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석될 수 있다 (예를 들어 [Pettermann et al., J Neurosci. (10): 3624-3632 (1988)] 참조). 별법으로, DR6 유전자의 일부 또는 전체 코딩 구역은 예를 들어 환자 뉴런 세포로부터 추출된 mRNA의 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR) 분석에 의해 분석될 수 있다. 본 발명의 다른 실시태양에서, DR6 게놈 서열은 뉴런 세포 이외의 세포, 예를 들어 섬유모세포 또는 말초혈 백혈구로부터 얻어지고, 이들 게놈 서열이 폴리펩티드를 코딩하고/하거나 DR6의 폴리뉴클레오티드 변이체 (예를 들어, 세포 내의 DR6 발현 수준에 영향을 주는 5' 및 3' 제어 서열 변이체 포함)를 갖는지 결정하기 위해 분석된다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 상기 분석은 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 프레세닐린 1 (PSEN1), 및 프레세닐린 2 (PSEN2) 유전자의 분석에 대해 패턴화될 수 있다 (예를 들어, [Nagasaka et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2005;102 (41):14854-9]; 및 [Finckh et al., Neurogenetics. 2005;6(2):85-9] 참조).
DR6 길항제를 확인하기 위한 스크리닝 방법
본 발명의 실시태양은 APP에 대한 DR6의 결합을 억제하는 관심있는 분자를 확인하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 관심있는 분자의 존재 또는 부재 하에 DR6 및 APP를 합한 후; 상기 관심있는 분자의 존재 하에서 APP에 대한 DR6의 결합의 억제를 검출하는 것을 포함한다. 특히, 본원에 제시된 개시내용을 사용하여, 예를 들어 DR6 및/또는 APP와 상호작용하고 DR6과 APP 사이의 상호작용을 억제하는 단백질, 소분자 및 다른 분자를 확인할 수 있다. 상기 방법의 예시적인 실시태양에서, DR6은 매트릭스 상에 고정될 수 있다. 이어서, 고정된 DR6에 결합하는 유리 APP (예를 들어, 검출가능 마커, 예를 들어 발색 마커, 형광 태그, 방사성 표지, 자기 태그, 또는 효소 반응 생성물 등으로 표지된 APP)의 능력을 관심있는 분자의 존재 및 부재 하에 관찰할 수 있다. 이후에, DR6에 대한 APP 결합의 감소 (예를 들어 검출가능 마커의 수준 및/또는 위치의 변화를 통해 관찰되는 바와 같이)는 분자를 DR6에 결합하는 APP의 능력을 억제하는 것으로서 확인하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 별도의 실시태양에서, APP는 관심있는 분자의 존재 및 부재 하에 유리 DR6 (예를 들어 검출가능 마커로 표지된 DR6)에 결합하는 APP의 능력을 검출하기 위해 매트릭스 상에 고정될 수 있다. 임의로 상기 실시태양에서, 관심있는 분자는 항체일 수 있다.
본원에서 제시되는 개시내용을 기초로 하여, 당업계에서 사용되는 다양한 프로토콜을 사용하여 폴리펩티드, 예를 들어 DR6과 APP 사이의 결합 상호작용을 억제하는 분자를 확인하기 위해 사용되는 DR6과 APP 사이의 결합을 특성화할 수 있다. 그러한 본 발명의 실시태양은 ELISA 분석 (예를 들어, 미국 특허 6,855,508; 6,113,897 및 7,241,803에 개시된 경쟁 또는 샌드위치 ELISA 분석), 방사성 면역 분석 (예를 들어, [Ausubel et al. eds., Current Protocols In Molecular Biology, 2007]의 unit 10.24에 개시된 바와 같은), 웨스턴 블롯 분석 (예를 들어, [Pettermann et al., J Neurosci. (10): 3624-3632 (1988)] 및 아래 실시예 10에 개시된 바와 같은), 면역조직학적 분석 (예를 들어, 아래 실시예 10에 개시된 바와 같은), IAsys 분석 및 CM-5 (BIAcore) 센서 칩 분석 (예를 들어, 미국 특허 6,720,156 및 7,101,851 참조)을 사용하는 실시태양을 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, APP에 대한 DR6의 결합을 억제하는 관심있는 분자를 확인하는 방법은 단백질 마이크로어레이를 이용한다. 단백질 마이크로어레이는 일반적으로 규정된 위치에서 표면 상에 고정된 관심있는 단백질 분자 (예를 들어 DR6 및/또는 APP)를 이용하고, 소분자 결합 단백질을 확인하기 위해 사용되었다 (예를 들어, [Wilson et al., Curr. Opinion in Chemical Biology 2001, 6, 81-85]; 및 [Zhu, H., et al., Science 2001, 293, 1201-2105] 참조).
키트 및 제품
본 발명의 추가의 실시태양에서, 신경학적 질환의 치료에 유용한 물질을 포함하는 제품 및 키트가 제공된다. 제품은 라벨이 존재하는 용기를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알 및 시험관을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있고, 바람직하게는 멸균된다. 용기는 알츠하이머병을 포함하는 신경학적 질환의 치료에 효과적인 활성제를 갖는 조성물을 보유한다. 조성물 내의 활성제는 DR6 길항제이고, 바람직하게는 항-DR6 모노클로날 항체 또는 항-APP 모노클로날 항체를 포함한다. 용기 상의 라벨은 조성물이 신경학적 질환이 치료에 사용됨을 나타내고, 또한 상기 설명한 바와 같은 생체 내 또는 시험관 내 사용을 위한 지시사항을 나타낼 수 있다. 제품 또는 키트는 임의로 적응증, 용도, 투여량, 투여, 금기 사항, 포장 제품과 함께 사용되는 다른 치료 제품 및/또는 치료 제품의 사용에 관한 경고 사항에 대한 정보를 포함하는, 치료 제품의 상업적 포장에 통상적으로 포함되는 사용 설명서를 의미하는 포장 삽입물을 추가로 포함한다.
본 발명의 키트는 상기 설명된 용기 및 버퍼를 포함하는 제2 용기를 포함한다. 키트는 상업적인 관점 및 사용자 입장에서 바람직한 다른 물질, 예를 들어 다른 버퍼, 희석제, 필터, 바늘, 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 측면은 다음 실시예에 의해 더욱 설명되고 예시되고, 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 배아 및 성체 중추 신경계에서 DR6 발현
TNF 수용체 수퍼패밀리 발현 패턴의 RNA 계내 스크린을 뮤린 배아 조직에서 실시하였다. 보다 구체적으로, mRNA 로케이터 (locator) 키트 (앰비온 (Ambion), Cat. No.1803)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 계내 혼성화 실험을 수행하였다. 이들 실험을 위한 리보프로브 (riboprobe)를 생성하기 위해 DR6 cDNA의 다음 1차 서열을 사용하였다:
Figure 112009044415955-PCT00001
제조사의 프로토콜에 따라 리보프로브의 시험관내 합성을 위해 Maxiscript 키트 (앰비온, Cat. No. 1308)를 사용하였다.
도 2A에 도시된 바와 같이, DR6은 단계 E10 내지 E12 (뉴런 세포 사멸이 일 어나는 것으로 알려진 단계)에서 발달하는 척수 및 후근신경절 세포에서 증식하는 전구세포보다는 분화된 뉴런에 의해 거의 독점적으로 발현된 것으로 밝혀졌다.
도 2B에 도시된 바와 같이, DR6 단백질은 뉴런의 세포체 및 축삭 모두에서 발현된다.
도 2B에서, 상부 2개의 사진은 정상 마우스 시각화 DR6 (좌측) 또는 대조 단백질 (우측)로부터의 뉴런을 보여준다. 하부 2개의 사진은 상응하게 DR6 녹-아웃 마우스 시각화 DR6 (좌측) 또는 대조 단백질 (우측)로부터의 뉴런을 보여준다.
본 도면에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 예를 들어 도 2B에 도시된 바와 같이 감각 축삭 상의 DR6 단백질 발현을 시각화하기 위해, DR6-특이적 마우스 모노클로날 항체는 제넨테크에서 면역원으로서 인간 재조합 DR6을 사용하여 생성되었다 (아래 실시예 3 참조). 이들 항체를 세포 표면 상에 발현된 전장 마우스 및 인간 DR6를 인식하는 그의 능력에 대해 면역형광에 의해 추가로 스크리닝하였다. "RA.3" ("3F4.8.8" mAb로도 알려지고, 아래 실시예 3 및 실시예 7에 추가로 기재되어 있다)으로 불리는 하나의 상기 항체는 인간 및 마우스 DR6 폴리펩티드 모두와 교차반응하고, 도 2B에 도시된 바와 같이 축삭 상에서 DR6 발현을 시각화하기 위해 사용되었다. 면역형광 염색 절차는 당업계에 공지된 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다 (Nikolaev et al., 2003, Cell, 112(1), 29-40). 축삭 상의 DR6 발현을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈 (Carl Zeiss Imaging Solutions))를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 상에서 사진을 찍었다.
도 2C에 도시된 바와 같이, DR6 mRNA는 뉴런을 분화시킴으로써 발현된다. 도 2C에서 좌측에서 우측으로, 3개의 사진은 각각 발생 단계 E10.5, E11.5 및 E12.5에서 정상 마우스로부터 뉴런의 뇌 스캔을 보여준다.
본 도면에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 발달하는 마우스 배아에서 DR6 mRNA 발현을 시각화하기 위해, DR6 3'UTR-특이적 방사성-표지된 RNA 프로브를 사용하는 계내 mRNA 혼성화 (ISH)를 E10.5-E12.5 마우스 배아의 흉추축 수준에서 취한 20 마이크로미터 조직 절편에 대해 수행하였다. mRNA 로케이터 계내 혼성화 키트를 사용하여, mRNA 로케이터 지시 매뉴얼 (앰비온 인크., Cat. No. 1803)에 개략된 제조사의 프로토콜에 따라 ISH 실험을 수행하였다. 마우스 DR6 3'UTR의 안티-센스 서열에 대응하는 방사성 표지된 mRNA 프로브는 MAXIscript Kit를 사용하여 제조사의 지시 매뉴얼 (앰비온 인크., Cat. No. 1308-1326)에 따라 시험관내 번역 반응으로 생성되었다. 배아 조직 절편을 갖는 슬라이드에 적용된 Kodak Autoradiography Emulsion (코닥 (Kodak))을 사용하여, DR6 mRNA 발현 데이타를 시각화하였다. AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 상에서 암시야에서 사진을 찍었다.
이들 실험에서 리보프로브를 생성하기 위해 사용된 DR6 cDNA의 1차 서열은 다음과 같다:
Figure 112009044415955-PCT00002
Allen Brain Atlas (http://www.brainatlas.org/aba/; Allen Brain Atlas는 마우스 뇌 내의 약 20,000 유전자의 발현의 지도를 제공하는 공용 학술 자료이다)를 사용한 추가의 분석으로 DR6이 성체 뇌의 뇌 피질에서 많이 발현되는 것이 밝혀졌다. DR6 mRNA는 예를 들어 피질 뉴런, 해마 CA1-CA4 추체 뉴런 및 치상회 내에서 발현된다. DR6 단백질은 성체 피질 및 해마에서 뉴런 세포체에서 발현된다.
상기 발현 패턴은 발생에 있어서 그의 역할 이외에, DR6이 또한 뉴런 세포 손실과 연관된 신경변성 질병의 진행에서 기능할 수 있다는 증거를 제공한다.
실시예 2: RNA 간섭에 의한 DR6 발현의 억제는 체외이식편 배양액에서 연합 뉴런의 축삭 변성을 방지한다.
연합 뉴런은 발생 단계 E9.5 내지 E11.5 사이에 등쪽 척수에서 생성된 일군의 긴 돌기 척수 중간뉴런이다. 연합 뉴런은 그의 생존을 위해 하나의 그의 중간체 표적인 척수의 마루판으로부터 영양 지지에 의존적인 것으로 생각된다. 이러한 의존성은 그의 축삭이 마루판을 따라 연장할 때 수일의 기간 동안 일어나고, 그 후 이들은 추가의 영양 요건을 발현시킨다. 그의 중간체 축삭 표적으로부터 유래된 영양 지지에 대한 뉴런의 의존성은 잘못 돌출하는 뉴런을 신속하게 제거하기 위한 메카니즘을 제공하고, 이는 신경계의 발생 동안 비정상 뉴런 회로의 형성을 방지하는 것을 도울 수 있다 (Wang et al., Nature, 401:765-769 (1999)).
연합 뉴런의 축삭 변성 및 세포 예정사에서 DR6의 기능적 역할을 검사하기 위해, RNAi-기반 등쪽 척수 생존 분석 ([Kennedy et al., Cell, 78:425-435 (1994)]; [Wang et al., 상기 문헌, 1999])을 실시하였다 (도 3 참조). E13 래트 또는 E11.5 마우스 배아를 L15 배지 (깁코 (Gibco)) 내에 넣고, siRNA (IDT)를 초록 형광 단백질 ("GFP")-코딩 플라스미드와 함께 신경관 내로 주입하였다. 이어서, siRNA 및 플라스미드를 전기천공에 의해 등쪽 전구 세포로 전달하였다. 이어서, 등쪽 척수 체외이식편을 절개하고, 3D-콜라겐 겔 매트릭스 내로 매몰하고, 재조합 네트린-1 (알앤디 파마슈티칼스 (R&D Pharmaceuticals)) 및 5％ 말 혈청 (시그마)을 함유하는 Opti-MEM/F12 배지 (인비트로겐 (Invitrogen)) 내에서 37℃에서 5％ CO2 환경 내에서 배양하였다. 화학주성 네트린-1에 반응하여 16시간 이내에, 연합 축삭이 체외이식편으로부터 콜라겐 매트릭스 겔 내로 성장한다 (Kennedy et al., 상기 문헌, 1994). 연합 축삭은 도립 현미경을 사용하는 관찰에 의해 GFP 형광에 의해 시각화된다.
도 4A에 도시된 바와 같이, 마루판으로부터 유래된 영양 인자 지지의 부재 하에 배양액 내에서 48시간 후, 연합 뉴런은 세포 예정사를 겪고 그의 축삭은 변성한다 (또한 [Wang et al., 상기 문헌, 1999] 참조). 상기 축삭 변성은 연합 뉴런에서 DR6 발현이 DR6-특이적 siRNA 분자에 의해 하향-조절될 때 현저하게 차단되었다 (도 4, 좌측 패널 참조). 상기 축삭 변성의 억제는 비-표적화 siRNA 분자를 사용하는 대조 실험에서는 관찰되지 않았다. 데이타는 DR6이 그의 중간체 표적인 척 수의 마루판으로부터 영양 지지의 공급 중단 시에 연합 뉴런의 축삭 변성을 위해 요구되는 중요한 세포자멸 촉진성 수용체임을 제안한다.
도 4B에 도시된 바와 같이, RNAi-내성 DR6 cDNA는 DR6 siRNA에 의해 차단된 변성 표현형을 구조한다.
도 4B에서 좌측에서 우측으로, 상부 4개의 사진은 (1) 대조 RNAi; (2) DR6 siRNA #3에 노출된 야생형-DR6; (3) DR6 siRNA #2에 노출된 미스매치 (mismatch)-DR6; 및 (4) DR6 siRNA #3에 노출된 미스매치-DR6의 존재 하에 뉴런을 보여준다. 하부 2개의 패널은 (1) 대조 siRNA, siRNA #2, 및 siRNA #3의 존재 하에 야생형 DR6 mRNA; 및 (2) 대조 siRNA, siRNA #2, 및 siRNA #3의 존재 하에 미스매치 DR6 mRNA의 자가방사선 사진을 보여준다.
본 도면에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 연합 뉴런의 축삭 변성 및 세포 예정사에서 DR6 수용체의 생리학적 역할을 조사하기 위해, 당업계에 공지된 프로토콜 ([Kennedy et al., Cell, 78:425-435 (1994)]; [Wang et al., Nature, 401:765-769 (1999)])에 따른 등쪽 척수 생존 분석을 수행하였다 (데이타는 도 4B에 도시한다). E13 래트 배아를 L15 배지 (깁코) 내에 넣고, 그의 신경관에 다음 siRNA 구성체를 주입하였다 (도 4B):
야생형 또는 미스-매치 DR6 cDNA 및 GFP-코딩 플라스미드와 함께 대조 비-표적화, 또는 표적화 DR6 siRNA #2, 또는 표적화 DR6 siRNA #3 (IDT). DR6 cDNA 및 GFP cDNA를 pCAGGS 벡터 백본 (BCCM/LMBP로부터 시판됨) 내로 서브클로닝하였다. 이어서, siRNA 및 플라스미드를 전기천공에 의해 등쪽 전구 세포로 전달하였다. 이어서, 등쪽 척수 체외이식편을 절개하고, 3D 콜라겐 겔 매트릭스 내로 매몰하고, 재조합 네트린-1 및 5％ 말 혈청 (시그마)을 함유하는 Opti-MEM/F12 배지 (인비트로겐) 내에서 37℃에서 5％ CO2 환경 내에서 배양하였다. 화학주성 네트린-1에 반응하여 16시간 이내에, 연합 축삭이 체외이식편으로부터 콜라겐 매트릭스 겔 내로 성장한다 (Kennedy et al., Cell, 78:425-435 (1994). 연합 축삭은 도립 현미경을 사용하는 관찰에 의해 GFP 형광에 의해 시각화된다. 마루판으로부터 유래된 영양 인자 지지의 부재 하에 배양액 내에서 48시간 후에, 연합 뉴런은 세포 예정사를 겪고 그의 축삭은 변성한다 (Wang et al., Nature, 401:765-769 (1999)) (도 4B). 그러나, 축삭 변성 프로그램은 표적화 DR6-특이적 siRNA #3의 도입에 의해 차단될 수 있다 (도 4B). DR6-특이적 siRNA #3의 특이적인 표적 상 효과는 DR6 siRNA #3과 함께 siRNA #3-내성 미스-매치 DR6 cDNA 구성체의 축삭 변성 표현형이 동시-발현에 의해 복구되는 구조 실험에서 추가로 확인된다 (도 4B). 제시된 실험적 증거는 그의 중간체 표적인 척수의 마루판으로부터의 공급 중단 시에 연합 뉴런의 축삭 변성 및 사멸을 위해 DR6 수용체 기능이 요구됨을 확립한다.
상기 설명된 분석에서 사용된 DR6 siRNA #2 및 #3 (센스 가닥), 및 DR6 siRNA #3 서열에 상보적인 DR6 cDNA의 미스매치 단편의 서열은 다음과 같다:
래트 DR6 siRNA #2: 5'-AAU CUG UUG AGU UCA UGC CUU-3' (서열 11)
래트 DR6 siRNA #3: 5'-CAA UAG GUC AGG AAG AUG GCU-3' (서열 12)
DR6 siRNA #3 서열에 상보적인 래트 DR6 cDNA의 미스매치 단편: 5'- GGACTCTGTGTACAGTCACCTCCCAGATCTGTTATAG-3' (서열 13)
실시예 3: 항- DR6 항체에 의한 DR6 수용체 신호 전달의 억제는 체외이식편 배양액 내에서 연합 뉴런의 축삭 변성을 방지한다.
등쪽 척수 생존 분석 (상기 실시예 2에 설명된 바와 같음)을 항-DR6 항체를 사용하여 실시하였다. 현미경 관찰 (GFP를 위한 초록 형광 채널 사용)을 이용하여 연합 축삭을 시각화하였다. 등쪽 척수 생존 분석을 상기 실시예 2에 개략된 바와 같이 변경하여 당업계에 공지된 프로토콜 ([Kennedy et al., Cell, 78:425-435 (1994)]; [Wang et al., Nature, 401:765-769 (1999)])에 따라 수행하였다. E13 래트 배아에게 그의 신경관 내로 GFP-발현 플라스미드 구성체를 주입하였다 (GFP cDNA를 pCAGGS 벡터 백본 (BCCM/LMBP로부터 시판됨) 내로 서브클로닝하였다). 이어서, GFP-발현 플라스미드를 전기천공에 의해 등쪽 전구 세포로 전달하였다. 항-DR6 차단 항체 또는 대조 정상 마우스 IgG를 연합 체외이식편에 40 ㎍/ml에서 플레이팅 24시간 후에 첨가하였다. 연합 체외이식편의 사진을 아래에 개략한 바와 같이 플레이팅 48시간 후에 찍었다. GFP-발현 연합 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axiovert 200 Zeiss 도립 현미경 (GFP를 위한 초록 형광 채널 내에서) 상에서 사진을 찍었다.
본 실험에 사용되는 항-DR6 항체는 다음과 같이 생성하였다.
Fc와 융합된 인간 DR6 세포외 도메인 서열 (hDR6-ECD-Fc)을 면역원으로서 사용하여 항-DR6 마우스 모노클로날 항체를 생성하였다. 사용된 hDR6-ECD-Fc 면역원 의 서열은 다음과 같다:
Figure 112009044415955-PCT00003
융합 폴리펩티드는 이전에 설명된 면역어드헤신 프로토콜을 사용하여 생성하였다 ([Ashkenazi et al., Curr Opin Immunol., 9(2):195-200 (1997)]; [Haak-Frendscho et al., J Immunol., 152(3): 1347-53 (1994)]).
9주령 Balb/c 마우스를 약 8주 기간의 과정에 걸쳐 100 ㎕의 hDR6-ECD-Fc 면역원 (1 mg/동물)을 주사하여 면역화시켰다. 이어서, 모든 면역화된 마우스의 림프절 (11x106 세포/ml, 5 ml)을 PU.1 골수종 세포 (뮤린 골수종 세포, ATCC)와 5x106 세포/ml, 5 ml의 농도에서 융합시켰다. 세포를 4개의 플레이트 내로 2x106 세포/ml로 플레이팅하였다.
상기 설명된 hDR6-ECD-Fc 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 하이브리도마를 스크리닝하기 위해 포획 ELISA를 사용하였다. 플레이트를 50 ㎕의 2 ㎍/ml 염소 항-인간 IgG Fc 특이적 (캐펠 (Cappel) Cat. No. 55071)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS + Brij로 3회 세척하고, 플레이트를 200 ㎕의 2％ BSA로 실온에서 1시간 동안 차단하였다. 이어서, 플레이트를 PBS + Brij로 3회 세척하였 다. 후속적으로, 플레이트를 100 ㎕/웰 면역어드헤신과 함께 0.4 ㎍/ml에서 1시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBS + Brij로 3회 세척하였다. 100 ㎕의 제1 항체를 웰에 첨가하고, 1시간 동안 진탕기 상에서 인큐베이팅하였다. 플레이트를 다시 PBS + Brij로 3회 세척하였다. 100 ㎕의 양 항-마우스 IgG HRP (인간에 교차성이 아님, 캐펠 Cat. No. 55569) 항체를 1:1000에서 1시간 동안 첨가하였다. 플레이트를 PBS + Brij로 3회 세척하였다. 50 ㎕의 기질 (TMB Microwell 퍼옥시다제 KPL #50-76-05)을 첨가하고, 플레이트를 5분 동안 인큐베이팅하였다. 반응을 50 ㎕/웰의 중지 용액 (KPL #50-85-05)으로 중지시켰다. 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 사용된 분석 버퍼는 PBS, 5％ BSA, 및 0.05％ Tween 20을 함유하였다.
이어서, 포획 ELISA 분석에서 hDR6-ECD-Fc 폴리펩티드에 대한 결합에서 양성으로 시험된 하이브리도마를 제한 희석에 의해 클로닝하였다 (10％ HCF, 10％ FCS를 함유하는 SCDME 배지). 10일 후에 플레이트를 꺼내고, 하나의 콜로니를 갖는 웰을 상기 설명된 포획 ELISA에 의해 분석하였다. 이어서, 다양한 선택된 모노클로날 항체를 이소형 시험하였고, IgG1 이소형의 것으로 나타났다.
이어서, "3B11.7.7"; "3F4.4.8"; "4B6.9.7"; 및 "1E5.5.7"로서 확인된 4개의 항-DR6 mAb를 축삭 변성을 차단하는 그의 능력에 대해 등쪽 척수 생존 분석으로 시험하였다.
놀랍게도, 이들 항-DR6 mAb 중 몇몇 (3F4.4.8; 4B6.9.7; 및 1E5.5.7)은 배양액 내에서 48시간 동안 영양 결핍에 의해 유도된 연합 뉴런의 축삭 변성을 부분적 으로 억제할 수 있었다 (도 5 참조). 상기 항체는 예를 들어, 추정 DR6 리간드와 DR6 수용체 사이의 상호작용을 차단함으로써 또는 리간드-비의존 DR6 신호 전달을 억제함으로써 뉴런 생존을 촉진할 수 있는 것으로 생각된다. 3B11.7.7 DR6 항체는 축삭 변성을 유도하는데 있어서 근소한 자극 효과를 가졌다.
실시예 4: JUN N-말단 키나제의 특이적 펩티드 억제제 ( JNKI )에 의한 DR6 수용체 신호 전달의 억제.
DR6 수용체는 JNK의 활성화를 통해 신호전달하는 것으로 보고되었고, JNK 활성은 DR6 결실 마우스 모델에서 손상되는 것으로 관찰되었다 ([Pan et al., FEBS Lett., 431:351-356 (1998)]; [Zhao et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441 (2001)]). 축삭 변성에서 DR6-JNK 신호 전달의 역할을 검사하기 위해, 펩티드 억제제 L-JNK-I ((L)-HIV-TAT48-57-PP-JBD20; 칼비오켐 (Calbiochem))을 1 μM 농도에서 사용하여 연합 뉴런에서 JNK 신호 전달 경로를 차단하는 것을 제외하고 등쪽 척수 생존 분석 (상기 실시예 2에 설명된 바와 같은)을 실시하였다. DMSO (시그마) 및 정상 마우스 IgG를 대조군으로서 시험하였다.
도 6에 도시된 바와 같이, 상기 JNK 신호 전달의 억제는 등쪽 척수 생존 분석에서 축삭 변성을 부분적으로 차단한다. 데이타는 DR6이 적어도 부분적으로 JNK 경로를 통해 축삭 과정의 변성 신호를 전달하는 것을 제안한다.
실시예 5: 항- DR6 항체에 의한 DR6 수용체 신호 전달의 억제는 마우스 배아 척수에서 뉴런 세포 사멸을 방지한다.
DR6 신호 전달이 전체 배아 배양 시스템에서 항-DR6 mAb에 의해 차단되는 분 석을 실시하였다. 아래에 설명된 상기 시스템은 전체 마우스 배아가 발생 단계 E9.5에서 E11.5까지 바이알 내에서 2일 동안 시험관 내에서 배양되도록 한다. E9.5 배아를 배아에 부착된 난황낭과 함께 자궁으로부터 절개하고, 100％ 래트 혈청 (할란 (Harlan)) 내에서 65％ 산소 환경에서 제1일 동안 및 95％ 산소 내에서 제2일 동안 37℃에서 배양하였다. 항-DR6 mAb (상기 실시예에 설명된)를 분석물에 10 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하고, 대조군으로서 정상 마우스 IgG 항체를 10 ㎍/ml의 농도로 사용하였다.
절단된 카스파제-3을 인식하는 항체 (마우스 절단된 카스파제-3에 대한 항체, 알앤디 시스템스 (R&D Systems)로부터 구입함)를 사용하는 면역형광 염색을 이용하여 세포자멸성 세포를 검출하고 현미경으로 관찰하였다. 결과를 도 7에 예시한다. 놀랍게도, 항-DR6 mAb 3F4.4.8; 4B6.9.7; 및 1E5.5.7에 의한 DR6의 억제는 상기 시스템에서 자연 발생하는 발생적 세포 사멸에 대해 척수 뉴런을 보호하였다.
실시예 6: DR6 결실 MICE 에서 감소된 뉴런 세포 사멸
발생 단계 E15.5에서 DR6 녹-아웃 배아 (Zhao et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001)의 표현형을 분석하였다. 절단된 카스파제 3은 세포자멸성 세포의 마커이고, 배아 척수에서 뉴런 세포 사멸의 정도를 검사하기 위해, 절단된 카스파제 3에 대한 면역염색 (마우스 절단된 카스파제-3에 대한 항체, 알앤디 시스템스로부터 구입함)을 사용하였다. 대조군으로서 DR6 이종 한배 새끼를 또한 검사하였다. 파라포름알데히드 (PFA)-고정된 배아 조직 절편을 1시간 동안 차단 용액 (2％ 열-불활성화된 염소 혈청 (시그마)/PBS (깁 코)/0.1％ Triton (시그마)) 내에서 차단하고, 차단 용액 내의 1차 항체 (마우스 절단된 카스파제-3에 대한 항체의 1:500 희석물, 알앤디 시스템스로부터 구입함)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 절편을 1시간 실온에서 차단 용액으로 3회 세척하고, 2차 항체 (염소 항-토끼 Alexa 488의 1:500 희석물, 몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes), 인비트로겐)와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 이어서, 절편을 1시간 동안 실온에서 차단 용액으로 세척하고, 초록 채널 내에서 면역형광에 의해 시각화되었다.
배아 당 척수 절편 당 카스파제 3 양성 핵의 수를 정량하였다 (도 8 및 9A 참조). DR6 이형접합성 한배 새끼 대조군에 비해 뉴런 세포 사멸에서 약 40 내지 50％ 감소가 DR6 결실 마우스 척수 및 후근신경절 ("DRG")에서 검출되었다 (도 8 및 9A). 따라서, DR6 신호 전달은 생체 내에서 발생하는 신경계에서 뉴런 세포 사멸을 촉진할 수 있는 것으로 생각된다.
도 9B에 도시된 바와 같이, DR6은 DR6 결실 마우스를 사용하여 입증된 바와 같이 운동 축삭 변성을 위해 요구된다. 발생 단계 E13.5에서 정상 및 DR6 녹-아웃 배아 (Zhao et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001)로부터의 배쪽 척수 체외이식편 (운동 뉴런)을 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF) 및 뉴로트로핀 3 (NT-3) (BDNF 및 NT-3은 케미콘으로부터 입수함)의 존재 및 부재 하에 분석하였다.
도 9B에서, 상부 좌측 패널은 BDNF 및 NT-3의 존재 하에 정상 마우스로부터 배쪽 척수 체외이식편을 보여주는 반면, 하부 좌측 패널은 BDNF 및 NT-3의 존재 하 에 DR6 녹-아웃 (KO) 마우스로부터 배쪽 척수 체외이식편을 보여준다. 이와 유사하게, 상부 우측 패널은 이들 성장 인자의 부재 하에 정상 마우스로부터 배쪽 척수 체외이식편을 보여주고, 하부 우측 패널은 이들 성장 인자의 부재 하에 DR6 녹-아웃 (KO) 마우스로부터 배쪽 척수 체외이식편을 보여준다.
도 9B에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 운동 뉴런 배쪽 척수 생존 분석을 몇몇을 변형하여 문헌 [Henderson et al., Nature, 363:266-270 (1993)]에 기재된 바와 같이 수행하였다. DR6 이형접합성 또는 DR6 결실 마우스 E13.5 배아를 알콜-처리한 가위를 사용하여 절개하고, 가온 L15 배지 (깁코) 내에 넣었다. 동일한 가위 및 겸자를 사용하여, 배아의 배쪽 구역을 열고, 장기를 제거하고, 늑골을 절단하고, 전체 척수를 절개한 후, 둘러싸는 수막 조직을 겸자로 제거하였다. 천장판을 제거하고, 척수의 펼쳐진 책 (open book) 제제를 얻었다. MMC 및 LMC 운동 기둥을 포함하는 척수의 배쪽 반쪽을 단리하고, 남아있는 마루판 조직을 조심스럽게 절개하여 제거하였다. 배쪽 척수를 텅스텐 바늘을 사용하여 체외이식편 내로 추가로 절편화하기 위해 L15 내에서 새로운 작은 접시 w/L15 + 5％ FBS (시그마) 혈청에 코팅된 옐로우 팁 (yellow tip)을 사용하여 옮겼다.
PDL/라미닌 코팅된 8 웰 슬라이드 (벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니 (Becton, Dickinson and Company))에 웰 당 500 ㎕의 뉴로베이살 (Neurobasal) 배지 (인비트로겐) + 50 ng/ml의 각각의 재조합 BDNF 및 NT-3 (케미콘), + B-27 보충물 X50 (인비트로겐); + Pen Strip 글루타민 X100 (Cat. No. 10378-016; 깁코); + 글루코스 X100을 채웠다. 절편화된 배쪽 척수 체외이식편을 각각의 웰 (웰 당 2-3 체외이식편) 내에 넣고, 성장을 위해 37℃ 인큐베이터 내에 48시간 동안 넣었다. 2일 후, 영양 인자 결핍을 다음과 같이 수행하였다: 사용된 배지를 제거하고, 웰을 뉴로베이살 배지 (영양 인자를 함유하지 않음)로 부드럽게 2회 세척하였다.
예온시킨 뉴로베이살 배지/B-27 (인비트로겐) (상기 설명된 영양 인자를 갖지 않은 것과 같이 제조됨) + 항-BDNF 및 항-NT3 차단 항체 (제넨테크, 인크.)를 20 ㎍/ml로 첨가하였다. 이어서, 체외이식편이 담긴 슬라이드를 37℃에서 추가로 24-48시간 동안 인큐베이팅하였다.
2일 후, 체외이식편을 PBS 내의 4％ PFA 내에 고정시키고, Net Gel 내의 0.2％ Triton (Nikolaev et al., 2003, Cell, 112(1), 29-40)으로 10분 동안 0℃에서 투과화시키고, Net Gel로 2회 세척하였다. 비-특이적 결합 부위를 차단하기 위해, 슬라이드를 PBS 내의 1％ BSA 내에서 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 변성하는 운동 축삭을 시각화하기 위해, 항-p75NTR-특이적 항체 (1:500 희석, 케미콘)을 사용하는 면역염색을 다음날 수행하였다 (1차 Ab 1:500을 1％ BSA/PBS 내에서 밤새 4℃, 2차 Ab 1:500을 1시간 동안 실온에서). 웰을 꺼내고, Fluoromount-G를 사용하여 커버글라스를 갖는 슬라이드에 탑재하였다. p75NTR-발현 운동 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 상에서 사진을 찍었다.
도 9C에 개시된 데이타에서 보이는 바와 같이, 손상 유도된 변성이 DR6 녹- 아웃 마우스에서 지연된다.
도 9C에서 좌측에서 우측으로, 상부 4개의 패널은 신경 성장 인자 (NGF)의 존재 하에; 및 각각 손상 4, 8 또는 16시간 후의 정상 마우스로부터의 뉴런을 보여준다. 도 9C에서 좌측에서 우측으로, 하부 4개의 패널은 좌측에서 우측으로 외인성 신경 성장 인자 (NGF)의 존재 하에; 및 각각 손상 4, 8 또는 16시간 후의 DR6 KO 마우스로부터의 뉴런을 보여준다.
도 9C에 도시된 바와 같은 시험관내 감각 축삭 병변 분석은 다음과 같이 수행하였다. DR6 이형접합성 또는 DR6 결실 마우스 E12.5 배아를 절개하고, 가온 L15 배지 (깁코) 내에 넣었다. 동일한 가위 및 겸자를 사용하여, 배아의 배쪽 구역을 열고, 장기를 제거하고, 늑골을 절단하고, 척수에 부착된 후근신경절 (DRG)을 겸자를 사용하여 절개하였다. 이어서, DRG를 텅스텐 바늘을 사용하여 1/4 DRG 체외이식편 내로 추가로 절편화하기 위해 L15 내에서 새로운 작은 접시 w/L15 + 5％ FBS (시그마) 혈청에 코팅된 옐로우 팁을 사용하여 옮겼다.
PDL/라미닌 예비-코팅된 플라스틱 8 웰 슬라이드 (벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니)에 웰 당 500 ㎕의 뉴로베이살 배지 (인비트로겐) + 50 ng/ml의 NGF (로슈 몰레큘라 바이오케미칼스 (Roche Molecular Biochemicals)), + B-27 보충물 X50 (인비트로겐); + Pen Strip 글루타민 X100; + 글루코스 X100을 채웠다. 절편화된 DRG 체외이식편을 각각의 웰에 넣고 (웰 당 2-3 DRG 체외이식편), 성장을 위해 37℃ 인큐베이터 내에 48시간 동안 넣었다. 2일 후, 축삭 병변 분석은 다음과 같이 수행하였다: 마이크로-나이프 (micro-knife; 파인 사이언스 툴스 (Fine Science Tools))로 DRG 체외이식편 바로 위에 및 바로 아래에 감각 축삭의 2개의 평행 절단을 만듦으로써 손상을 유도하였다. DRG 체외이식편의 좌측 및 우측에 절단되지 않은 축삭은 내인성 무병변 대조군으로서 역할을 하였다. 절단된 DRG 체외이식편을 갖는 슬라이드를 손상 0, 4, 8, 16 및 24시간 후 PBS 내의 4％ PFA 내에 고정시키고, Net Gel 내의 0.2％ Triton (Nikolaev et al., 2003, Cell, 112(1), 29-40)으로 10분 동안 0℃에서 투과화시키고, Net Gel로 2회 세척하였다. 비-특이적 결합 부위를 차단하기 위해, 슬라이드를 PBS 내의 1％ BSA 내에서 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 변성하는 감각 축삭을 시각화하기 위해, Neuronal Class III β-튜불린 (TUJ1)-특이적 항체 (1:500 희석, 코밴스 (Covance))를 사용하는 면역염색을 다음날 수행하였다 (1차 Ab 1:500을 밤새 4℃에서 1％ BSA/PBS 내에서, 2차 Ab 1:500을 1시간 동안 실온에서). 웰을 꺼내고, Fluoromount-G를 사용하여 커버글라스를 갖는 슬라이드에 탑재하였다. 면역형광으로 표지된 감각 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 상에서 사진을 찍었다.
실시예 7: 항- DR6 항체 길항제는 뉴런의 변성을 억제한다.
도 10A에 도시된 바와 같이, 항-DR6 항체는 다양한 영양 인자 결핍 뉴런의 변성을 억제한다 (축삭 변성의 분석에서).
도 10A에서 좌측에서 우측으로, 첫 번째 2개의 상부 및 하부 사진은 연합 뉴런으로부터 데이타를 보여준다. 이들 첫 번째 4개의 사진에서, 상부 2개의 사진은 각각 대조 IgG 및 RA.5 DR6 항체의 존재 하에 연합 뉴런을 보여주는 반면, 하부 2 개의 사진은 각각 RA.1 DR6 항체 및 RA.3 DR6 항체의 존재 하에 연합 뉴런을 보여준다. 도 10A에서 중간의 2개의 상부 및 하부 사진은 감각 뉴런으로부터 데이타를 보여준다. 이들 중간의 4개의 사진에서, 상부 2개의 사진은 각각 NGF의 존재 및 부재 하에 감각 뉴런을 보여주는 반면, 하부 2개의 사진은 NGF의 부재 하에, 그러나 각각 RA.1 DR6 항체 및 RA.3 DR6 항체의 존재 하에 감각 뉴런을 보여준다. 도 10A의 우측면의 2개의 상부 및 하부 사진은 운동 뉴런으로부터 데이타를 보여준다. 이들 우측의 4개의 사진에서, 상부 2개의 사진은 각각 성장 인자의 존재 및 부재 하에 운동 뉴런을 보여주는 반면, 하부 2개의 사진은 성장 인자의 부재 하에, 그러나 각각 RA.1 DR6 항체 및 RA.3 DR6 항체의 존재 하에 운동 뉴런을 보여준다.
본 도면에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 마우스 모노클로날 RA.1-RA.5 DR6 항체는 마우스를 상기 실시예 3에 설명된 바와 같이 DR6 엑토도메인으로 면역화시킴으로써 생성하였다. 본 실시예와 도면에서 "RA.1" 및 "RA.3" 항체로 칭하는 DR6 항체는 각각 실시예 3에 설명된 "1E5.5.7" 및 "3F4.4.8" 항체이다 (예를 들어, 별도의 명명법을 사용하여 간단히 칭해진다). 이와 유사하게, 본 실시예와 도면에서 칭하는 "RA.5" 항체는 실시예 3에 설명된 "3B11.7.7" 항체이다 (예를 들어, 별도의 명명법을 사용하여 칭해진다).
감각, 운동, 및 연합 체외이식편 배양을 다음과 같이 변형하면서 상기 설명된 실시예 2 및 실시예 6에서와 같이 수행하였다. 연합 체외이식편 생존 분석을 위해, DR6 항체 RA.1 또는 RA.3, 또는 대조 IgG를 플레이팅 24시간 후에 연합 체외이식편 배양액에 20 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다 (도 10A). 감각 체외이식편 배양액에 대해, 플레이팅 48시간 후에 NGF 결핍 분석을 수행하였다. NGF를 함유하지 않지만, NGF-차단 항체 (제넨테크, 인크.)를 함유하는 신선한 뉴로베이살 배지를 표시된 DR6 항체 (RA.1 또는 RA.3) 또는 대조 IgG와 함께 플레이팅 48시간 후에 감각 체외이식편 배양액에 20 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다 (도 10A). 운동 체외이식편 배양액에 대해, 플레이팅 48시간 후에 영양 인자 결핍 분석을 수행하였다. NT3/BDNF를 함유하지 않지만, BDNF-차단 및 NT3-차단 항체 (기능 차단 영양 인자 mAb, 제넨테크, 인크.)를 함유하는 신선한 뉴로베이살 배지를 표시된 DR6 항체 (RA.1 또는 RA.3) 또는 대조 IgG와 함께 플레이팅 48시간 후에 감각 체외이식편 배양액에 20 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다 (도 10A). 따라서, 항-TUJ1 (코밴스) 및 항-p75NTR (케미콘/밀리포어 (Millipore)) 항체를 사용하는 면역형광 염색에 의해 표지된 감각 및 운동 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 상에서 사진을 찍었다. GFP-발현 연합 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axiovert 200 Zeiss 도립 현미경 (GFP를 위한 초록 형광 채널 내에서) 상에서 사진을 찍었다.
도 10B에 도시된 바와 같이, 항-DR6 항체는 다양한 영양 인자-결핍 뉴런의 변성을 억제하였다 (TUNEL 염색을 통한 자멸하는 세포체의 분석에서). 도 10B에서 좌측으로부터 시작하여, 2개의 상부 및 하부 사진은 연합 뉴런으로부터 데이타를 보여준다. 이들 첫 번째 4개의 사진에서, 상부 2개의 사진은 각각 대조 IgG 및 RA.5 DR6 항체의 존재 하에 연합 뉴런을 보여주는 반면, 하부 2개의 사진은 각각 RA.1 DR6 항체 및 RA.3 DR6 항체의 존재 하에 연합 뉴런을 보여준다. 도 10B에서 중간 세트의 2개의 상부 및 하부 사진은 감각 뉴런으로부터 데이타를 보여준다. 이들 중간의 4개의 사진에서, 상부 2개의 사진은 각각 NGF의 존재 및 부재 하에 감각 뉴런을 보여주는 반면, 하부 2개의 사진은 NGF의 부재 하에, 그러나 각각 RA.1 DR6 항체 및 RA.3 DR6 항체의 존재 하에 감각 뉴런을 보여준다. 도 10B의 우측면의 2개의 상부 및 하부 사진 세트는 운동 뉴런으로부터 데이타를 보여준다. 이들 우측 4개의 사진에서, 상부 2개의 사진은 각각 성장 인자의 존재 및 부재 하에 운동 뉴런을 보여주는 반면, 하부 2개의 사진은 성장 인자의 부재 하에, 그러나 각각 RA.1 DR6 항체 및 RA.3 DR6 항체의 존재 하에 운동 뉴런을 보여준다.
도 10의 개시내용은 리간드가 축삭 변성에서 DR6 기능에 중요한 역할을 할 수 있음을 제안한다.
본 도면에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 상기한 바와 같이, 마우스 모노클로날 RA.1-RA.5 DR6 항체는 마우스를 상기 실시예 3에 설명된 바와 같이 DR6 엑토도메인으로 면역화시킴으로써 생성하였다. 감각, 운동, 및 연합 체외이식편 배양을 다음과 같이 변형시켜 상기 설명된 실시예 2 및 실시예 6에서와 수행하였다. 연합 체외이식편 생존 분석을 위해, 상기 실시예 3에 설명된 바와 같이, DR6 항체 RA.1 및 RA.3, 항체 RA.5 (별법으로 "1B11.7.7"로 칭함, 제넨테크, 인크.), 또는 대조 IgG (제넨테크, 인크.)를 플레이팅 24시간 후에 연합 체외이식편 배양액에 20 ㎍/ml의 최종 농도로 개별적으로 첨 가하였다 (도 10B, 좌측).
감각 체외이식편 배양액에 대해, 플레이팅 48시간 후에 NGF 결핍 분석을 수행하였다. NGF를 함유하지 않지만, NGF-차단 항체 (제넨테크, 인크.)를 함유하는 신선한 뉴로베이살 배지를 DR6 항체 RA.1 또는 RA.3, 또는 대조 IgG (제넨테크, 인크.)와 함께 플레이팅 48시간 후에 감각 체외이식편 배양액에 20 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다 (도 10B, 중간). 운동 체외이식편 배양액에 대해, 플레이팅 48시간 후에 영양 인자 결핍 분석을 수행하였다. NT3/BDNF를 함유하지 않지만, BDNF-차단 및 NT3-차단 항체 (기능 차단 영양 인자 mAb, 제넨테크, 인크.)를 함유하는 신선한 뉴로베이살 배지를 RA.1 또는 RA.3, 또는 대조 IgG (제넨테크, 인크.)와 함께 플레이팅 48시간 후에 감각 체외이식편 배양액에 20 ㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다 (도 10B, 우측).
체외이식편을 4％PFA/PBS 내에서 고정시키고, 제조사의 지시 매뉴얼 (로슈)에 따라 계내 세포 사멸 검출 키트 (Cat. No. 11 684 795 910, 로슈)를 사용하여 DNA 가닥 절단의 표지 (TUNNEL 기술)에 기초하여 단일 세포 수준에서 세포자멸의 검출을 위해 처리하였다. 연합, 감각 및 운동 체외이식편 배양액의 세포체에서 세포자멸을 형광 현미경에 의해 분석하였다 (도 10B). 형광 표지된 TUNNEL-양성 세포자멸 세포체를 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 (적색 형광 채널 내에서) 상에서 사진을 찍었다.
실시예 8: DR6 면역어드헤신 길항제는 뉴런의 변성을 억제한다.
도 11A에 도시된 바와 같이, 연합 축삭 변성은 hDR6-ECD-Fc에 의해 지연되었다. 본 분석에서 사용된 hDR6-ECD-Fc 면역어드헤신 단백질은 상기 실시예 3에 설명되어 있다.
도 11A에서 좌측에서 우측으로, 첫 번째 사진은 48시간에서 연합 축삭 변성을 보여주는 대조군을 제공한다. 두 번째 사진은 30 ㎍/ml hDR6-ECD-Fc의 존재 하에 48시간에서 연합 축삭 변성을 보여준다. 세 번째 사진은 10 ㎍/ml hDR6-ECD-Fc의 존재 하에 48시간에서 연합 축삭 변성을 보여준다.
본 도면에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 연합 체외이식편 배양 및 생존 분석을 상기 실시예 2-6에 설명된 바와 같이 제조하고 수행하였다. 본 분석에서 사용된 hDR6-ECD-Fc 면역어드헤신 단백질 서열은 상기 실시예 3에 설명되어 있다. GFP-표지된 연합 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axiovert 200 Zeiss 도립 현미경 (GFP를 위한 초록 형광 채널 내에서) 상에서 사진을 찍었다.
도 11B에 도시된 바와 같이, hDR6-ECD-Fc는 신경 성장 인자 (NGF) 공급 중단에 의해 유도된 감각 축삭 변성을 지연시켰다. 도 11B에서 좌측에서 우측으로, 상부 3개의 사진은 각각 0, 6 및 24시간에서 대조 Fc의 존재 하에 NGF가 결핍되는 감각 뉴런을 보여주는 반면, 하부 3개의 사진은 각각 0, 6 및 24시간에서 DR6-Fc 구성체의 존재 하에 NGF가 결핍되는 감각 뉴런을 보여준다.
도 11에 제공된 개시내용은 리간드가 축삭 변성에서 DR6 기능에 대해 중요한 역할을 할 수 있음을 추가로 제안한다.
본 도면에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 감각 축삭 변성에서 DR6 기능을 위해 리간드가 요구되는지 검사하기 위해, 감각 축삭 성장 및 변성의 구획화 (compartmented) 배양 분석을 다음과 같이 수행하였다. 캄페노트 (Campenot) 뉴런 세포 챔버 (chamber) 시스템을 사용하여, 신경계의 한 위치에서 다른 위치 내의 말초 표적으로 그의 축삭을 돌출하는 뉴런 세포체와 유사하게, 상이한 컴파트먼트 (compartment) (분리된 유체 환경) 내의 세포체로부터 뉴런 돌기 (축삭)을 단리하였다. 분석은 다음과 같이 변형하여 문헌 [Campenot et al., J. Neurosci. 11(4): 1126-39 (1991)]에 처음에 설명된 바와 같이 수행하였다. 간단히 설명하면, 예를 들어, 캄페노트 등의 상기 문헌의 도 1 및 4에 예시된 바와 같이 35-mm 조직 배양 접시를 PDL/라미닌으로 코팅하고, 핀 레이크 (pin rake) (타일러 리서치 (Tyler Research))로 긁어 트랙을 생성하였다.
배양 배지 (B27 보충물, 25 ng/ml의 NGF, 및 4 g/L의 메틸셀룰로스가 존재하는 뉴로베이살 배지) 1적을 긁어낸 하층 상에 넣었다. 테플론 디바이더 (divider) (타일러 리서치)를 실리콘 그리스 (grease) 상에 설치하고, 한 줌의 실리콘 그리스를 중앙 슬롯 (slot)의 입구에 놓았다. E12.5 마우스 DRG로부터 유래된 분열된 감각 뉴런을 메틸셀룰로스-농후화 배지 내에 현탁시키고, 22-게이지 바늘이 장착된 일회용 멸균 시린지 내로 로딩하였다. 상기 세포 현탁액을 해부 현미경 하에 각각의 구획화된 접시의 중앙 슬롯 내로 주입하였다. 뉴런을 밤새 정치시켰다. 접시의 외부 주변 (세포체 컴파트먼트) 및 내부 축삭 컴파트먼트를 메틸셀룰로스-함유 배 지로 채웠다. 시험관 내에서 3-5일 내에, 예를 들어, 캄페노트 등의 상기 문헌의 도 1 및 4에 예시된 바와 같이 축삭은 좌측 및 우측 컴파트먼트 내로 나타나기 시작한다.
국소 축삭 변성을 촉발시키기 위해, 축삭 컴파트먼트로부터 NGF-함유 배지를 NGF 차단 항체 (항-NGF, 제넨테크, 인크., 20 ㎍/ml)를 함유하는 뉴로베이살 배지로 치환하였다. NGF 결핍의 0시간, 6시간, 또는 24 내지 48시간 후, 감각 뉴런을 4％ PFA 내에서 30분 동안 실온에서 고정시키고, 형광 현미경에 의해 변성하는 축삭을 시각화하기 위해 축삭 마커 TUJ-1 (코밴스, 1:500 희석)을 사용한 면역형광 염색을 위해 처리하였다 (도 11B) (상기 실시예 7에 설명된 바와 같이). 캄페노트 챔버의 축삭 컴파트먼트에서 면역형광 표지된 감각 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 상에서 사진을 찍었다.
리간드가 NGF 공급 중단에 의해 촉발된 축삭 변성 프로그램에서 DR6 기능을 위해 요구되는지 검사하기 위해, 30 ㎍/ml의 hDR6-ECD-Fc 면역어드헤신 단백질 (상기 실시예 3에 설명됨) 또는 30 ㎍/ml의 대조 Fc (제넨테크, 인크.)를 항-NGF 처리와 함께 캄페노트 챔버의 축삭 컴파트먼트 내에 포함시켰다. NGF 결핍 0 내지 24시간 후에, 캄페노트 챔버 내의 축삭을 4％PFA/PBS로 고정시키고, TUJ-1 (1:500, 코밴스)/형광기 Alexa 488에 컨쥬게이팅된 2차 항체 (몰레큘라 프로브스, BD)를 사용한 면역-형광 염색에 의해 시각화하였다 (도 11B).
NGF 결핍은 도 11B에 도시된 바와 같이 축삭 변성의 두드러진 패턴을 촉발하 였다. 유의하게는, hDR6-ECD-Fc 면역어드헤신 단백질의 첨가는 상기 시스템에서 축삭 변성의 발생을 지연시켰다 (도 11B, 하부 패널). 따라서, 이들 데이타는 성장 인자의 제거에 의해 유발된 국소 축삭 변성에서 DR6 수용체 기능을 위해 가용성 리간드가 요구될 수 있음을 제안한다.
실시예 9: NGF 결핍 후 축삭으로부터 DR6 리간드 -결합 부위의 탈락
도 12A 및 12B에 도시된 바와 같이, DR6-AP 구성체를 사용하여 감각 축삭 상의 DR6 결합 부위를 시각화하였다.
도 12A에서 좌측에서 우측으로, 상부 2개의 사진은 각각 저배율 및 고배율에서 축삭을 시각화하기 위해 DR6-AP 구성체를 사용하여 48시간에서 NGF의 존재 하에 발생 단계 E12.5에서 감각 축삭 상의 DR6 결합 부위의 시각화를 보여주는 반면, 하부 2개의 사진은 각각 저배율 및 고배율에서 AP 대조 구성체를 사용하는 감각 축삭의 시각화를 보여준다.
도 12B에 도시된 바와 같이, DR6 리간드-결합 부위는 NGF 결핍 후 감각 축삭으로부터 상실된다.
도 12B에서 좌측에서 우측으로, 상부 2개의 사진은 감각 축삭 상의 DR6 결합 부위의 시각화를 보여주고, 여기서 첫 번째 사진은 NGF 및 BAX 억제제의 존재 하에 감각 뉴런을 보여주는 반면, 두 번째 사진은 NGF의 존재 하에 BAX 결실 감각 뉴런을 보여준다. 하부 2개의 사진은 각각 NGF의 부재 하에, 그러나 BAX 억제제의 존재 하에 감각 뉴런; 및 NGF의 부재 하에 BAX 결실 감각 뉴런을 보여준다. 뉴로트로핀의 존재 및 부재 하에 운동 축삭에서 동등한 결과가 관찰된다.
도 12A 및 12B에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. DR6-AP 구성체는 마우스 DR6 엑토도메인을 pRK5-AP 클로닝 벡터를 사용하여 인간 태반 알칼린 포스파타제에 융합함으로써 (DR6-AP) 생성하였다 (예를 들어 [Yan et al., Nature Immunology 1, 37-41 (2000)] 참조). PRK5 모 클로닝 벡터는 벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니, 파밍엔 디비젼 (Pharmingen division)으로부터 입수가능하다. DR6-AP 융합 단백질을 생성하기 위해 사용된 뮤린 DR6 엑토도메인 서열은 다음과 같다:
Figure 112009044415955-PCT00004
BAX 결실 마우스 라인 (Bax-R1)은 이전에 설명되었고 (Deckwerth et al., Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996), 잭슨 래보러토리스로부터 입수하였다. BAX 억제 펩티드는 뉴런 세포 사멸을 차단하기 위해 10 μM로 사용되었다 (Bax-V5, 토크리스 인크 (Tocris Inc)).
마우스 DR6 엑토도메인-AP 융합 단백질 (DR bv6-AP)을 생성하기 위해, DMEM/10％FBS (깁코) 배지 내에서 배양된 COS-1 세포를 제조사 프로토콜에 따라 FuGene 형질감염 시약 (로슈)를 사용하여 15 ㎍의 DR6-AP 융합 발현 구성체로 형질감염시켰다. 형질감염의 12시간 후, COS-1 세포 배지를 OPTI-MEM (인비트로겐)으로 교환하였다. 형질감염의 48시간 후, DR6-AP 단백질을 함유하는 COS-1 세포 조 건화 배지를 모으고 여과하였다. 배지 내의 DR6-AP 단백질의 양은 다음과 같이 정량하였다:
100 ㎕의 2XAP 버퍼 (100 mg 파라-니트로페닐 포스페이트 (시그마) 및 15 ㎕의 1M MgCl2를 15 ml 2M 디에탄올아민 (pH 9.8)에 첨가하여 제조함)를 동일 부피의 형질감염된 COS 세포 조건화 배지, 또는 형질감염되지 않은 COS-1 세포로부터의 대조 조건화 배지와 혼합하였다. 반응액의 색상은 12-15분에 걸쳐 발색되었고, O.D.는 직선 범위이다 (0.1-1). 이어서, 800 ㎕의 증류수를 첨가하여 반응액의 부피를 조정하고, O.D.를 405 nm 흡광 파장에서 측정하였다. 농도 (nM)는 다음 식에 따라 계산하였다 (100 ㎕에 대해): C (nM) = O.D. X 100 X (60/발색 시간)/30.
계 내에서 DR6-AP 감각 축삭 결합 분석을 위해, 야생형 또는 BAX 결실 감각 체외이식편을 50 ng/ml NGF (로슈)와 함께 상기 실시예 7-8에 개략된 바와 같이 뉴로베이살 배지/B27 (인비트로겐) 내에서 배양하였다. 플레이팅 2일 후, DRG 체외이식편을 상기 실시예 7-8에 설명된 바와 같이 비처리하여 방치하거나, NGF를 결핍시켰다. Bax 억제 펩티드를 도 12B에 표시된 곳에서 첨가하였다 (10 μM, Bax-V5, 토크리스). NGF 결핍 12시간 후에, DRG 체외이식편을 결합 버퍼 (HBSS, 깁코 Cat. No. 14175-095, 0.2％ BSA, 0.1％ NaN3, 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES 함유 (pH=7.0))로 2회 세척하였다. 이어서, DR6-AP 조건화 배지와 결합 버퍼 (또는 대조 AP 조건화 배지와 결합 버퍼)의 1:1 혼합물을 제조함으로써 AP 결합 분석을 수행하였고, 상기 혼합물을 8-웰 배양 슬라이드 (벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니) 내에서 DRG 체외이식편에 직접 적용하고 90분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다.
인큐베이션 후, DRG 체외이식편을 결합 버퍼로 5회 세정함으로써 결합되지 않은 DR6-AP 단백질을 세척 제거하였다. 이어서, DRG 체외이식편을 PBS 내에 희석시킨 3.7％ 포름알데히드로 12분 동안 실온에서 고정시켰다. 남아있는 포름알데히드는 DRG 체외이식편을 HBS 버퍼 (20 mM HEPES (pH=7.0), 150 mM NaCl)로 3회 세정함으로써 제거하였다. 내인성 AP 활성은 HBS 버퍼 내에서 30분 동안 65℃에서 열 불활성화에 의해 차단하였다. 이어서, DRG 체외이식편을 AP 반응 버퍼 (100 mM TRIS pH=9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2) 내에서 3회 세척하였다. 이어서, 감각 축삭에 결합하는 DR6-AP 융합 단백질은 1/50 (부피)의 NBT/BCIP 스톡 용액 (로슈, Cat. No. 1681451)을 사용하여 실온에서 밤새 AP 반응 버퍼 내에서 DRG 체외이식편 상의 색상 스테인을 발색시킴으로써 시각화하였다 (도 12A 및 B). 평행 대조 실험에서, AP-형질감염된 COS 세포로부터 조건화 배지를 AP 축삭 결합 분석을 위해 사용하였다 (도 12A, 하부 패널).
도 12B에 도시된 바와 같이, DR6-AP 결합 부위는 NGF 결핍 후 감각 축삭 표면으로부터 상실되고, 이는 영양 결핍 후 DR6 리간드가 축삭 조건화 배지 내로 방출됨을 제안한다.
도 12C에 도시된 바와 같이, 발생 단계 E12.5에서 BAX 결실 감각 축삭의 연구에서는 베타 세크레타제 (BACE) 억제제가 NGF 공급 중단 후 감각 축삭으로부터 DR6-AP 결합 부위의 소실을 차단할 수 있음을 보여준다. 도 12C에서 좌측에서 우 측으로, 상부 3개의 사진은 각각 DMSO 대조군; OM99-2 (BACE-I 억제제) 및 TAP1 (알파 세크레타제-I 억제제)의 존재 하에 이들 뉴런을 보여준다. 하부 사진은 NGF의 존재 하에 이들 뉴런을 보여준다.
상기 데이타를 생성하기 위해 사용된 마우스 DR6 엑토도메인-AP 융합 단백질은 위에서 설명된다. BAX 결실 마우스 라인 (Bax-R1)은 이전에 설명되었고 (Deckwerth et al., Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996), 잭슨 래보러토리스로부터 입수하였다. DRG 체외이식편 배양 및 DR6-AP 축삭 결합 분석은 도 12A 및 12B에 대해 상기 설명된 바와 같이 수행하였다. BACE 억제제는 본 분석에서 1 μM 최종 농도로 사용되었다 (InSolution OM99-2, 칼비오켐/머크 (Merck)). 알파-세크레타제 억제제 TAPI는 본 분석에서 10 μM 최종 농도로 사용되었다 (TAPI-1, 칼비오켐). DR6-AP-양성 감각 축삭 (상기 실시예 9에 개략된 비색 염색 반응에 의해 염색함)을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 상에서 명시야 사진을 찍었다.
실시예 10: 아밀로이드 전구체 단백질 ( APP )은 DR6 의 동족체 리간드이다.
도 13에 도시된 바와 같이, N-APP는 DR6 엑토도메인-회합 리간드인 것으로 밝혀졌다.
도 13A에서 좌측에서 우측으로, 첫 번째 2개의 블롯은 성장 인자의 존재 및 부재 하에 (및 Bax 억제제의 존재 하에) 감각 및 운동 뉴런으로부터 얻은 단백질을 프로빙하기 위해 DR6-AP 구성체를 사용하는 연구로부터 데이타를 제공한다. 이들 블롯에서, 약 35 kDA에서 강한 밴드를 포함하는 APP 폴리펩티드가 성장 인자가 결핍되는 감각 및 운동 뉴런 모두에서 (및 Bax 억제제의 존재 하에) 관찰된다. 도 13A의 중앙 블롯은 약 35 kDA에서 강한 밴드를 포함하는 APP 폴리펩티드가 성장 인자가 결핍되는 감각 뉴런으로부터 얻은 폴리펩티드의 항-N-APP 항체 프로브에서도 상응하게 관찰되는 것을 보여준다. 1:100 희석으로 웨스턴 블롯 실험에 사용된 폴리클로날 항-N-APP 항체는 써모 사이언티픽 (Thermo Scientific)으로부터 입수하였다 (Cat. No. RB-9023-P1). Bax 억제제 펩티드 P5는 10 μM로 사용되었다 (토크리스 바이오사이언시즈 (Tocris Biosciences), Cat. No. 1786, 미토콘드리아 내로 Bax 전위의 세포-투과성 합성 펩티드 억제제).
APP가 DR6 엑토도메인-회합 리간드라는 관찰은 도 13A의 우측에 도시된 블롯에 제시된 데이타에 의해 추가로 확인되었다. 일반적인 풀-다운 프로토콜 (예를 들어, [Nikolaev et al., 2004, BBRC, 323, 1216-1222])을 사용하여, NGF 결핍 조건 하에 캄페노트 챔버의 축삭 컴파트먼트로부터 모은 감각 축삭 조건화 배지로부터 DR6-ECD 엑토도메인 회합된 인자를 정제하였다. DR6-ECD-His 엑토도메인 (구성체를 아래에 설명함)-커플링된 NiNTA 비드 (시그마)를 50 ml의 감각 축삭 조건화 배지와 함께 150 mM NaCl, 0.2％ NP-40 (칼비오켐), 1X PBS 버퍼 하에 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 이어서, DR6-ECD-His 엑토도메인-커플링된 NiNTA 비드 (시그마)를 10배 과량의 결합 버퍼 (150 mM NaCl, 0.2％ NP-40 (칼비오켐), 1X PBS 버퍼 내에)로 5회 세척하고, DR6-ECD-회합 단백질 복합물을 1X SDS 샘플 로딩 버퍼 (인비트로겐)로 용출하고, 이어서 이를 겔 전기영동을 통해 분리하고 항-N-APP 항 체로 프로빙하였다. 상기 DR6-ECD 풀 다운 실험으로부터의 데이타는 약 35 kDA에서 강한 밴드를 포함하는 APP 폴리펩티드를 상응하게 확인한다.
축삭 조건화 배지 상에서 DR6-AP 블롯 분석을 이전에 설명된 프로토콜에 따라 수행하였다 (Pettmann et al., 1988, J. Neurosci., 8(10): 3624-3632). 웨스턴 블롯 실험에 사용된 폴리클로날 항-N-APP 항체는 써모 사이언티픽으로부터 입수하였다 (Cat. No. RB-9023-P1). 사용된 마우스 DR6 엑토도메인-AP 융합 단백질은 상기 실시예 9에서 설명되었다. 마우스 재조합 DR6-ECD-His는 CHO 세포 배양액으로부터 발현되고 후속적으로 정제되었다. 뮤린 DR6-ECD-His의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure 112009044415955-PCT00005
도 13B는 DR6-AP 블로팅에 의한 축삭 조건화 배지 내에서 DR6 리간드의 다른 시각화를 보여준다. 상기 블로팅 데이타는 35 kDa에서 N-말단 APP을 포함하는 많은 APP 폴리펩티드와 또한 C99-APP 및 C83/C89 APP 폴리펩티드를 확인한다. 축삭 조건화 배지 상에서 DR6-AP 블롯 분석은 이전에 설명된 프로토콜에 따라 수행하였다 (Pettmann et al., 1988, J. Neurosci., 8(10): 3624-3632). 마우스 DR6 엑토도메인-AP 융합 단백질은 상기 실시예 8에 설명된 바와 같이 생성하였다. 마우스 재조합 DR6-ECD-His는 CHO 세포 배양액으로부터 발현되고 후속적으로 정제되었다. DR6-ECD-His의 아미노산 서열은 위에 제시한다. 웨스턴 블롯 실험에 사용된 폴리클로날 항-N-APP 항체는 써모 사이언티픽으로부터 입수하였다 (Cat. No. RB-9023-P1). 막-결합 APP C-말단 단편 (CTF) C99-APP 및 C83/C89-APP를 시각화하기 위해, Abeta의 중앙부 내의 에피토프를 인식하는 4G8 항체 (모노클로날 4G8, 1:500, 코밴스)를 사용하여 축삭 용해물의 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
도 14A는 APP 엑토도메인의 탈락이 NGF 결핍 후 초기에 발생함을 보여주는 사진을 제공한다. 도 14A에서, 성장 인자 제거 후 다양한 시간에서 뉴런을 축삭 변성을 차단하기 위해 첨가된 Bax 억제제의 존재 하에 N-APP 폴리클로날 항체로 염색하였다. 좌측에서 우측으로, 이들 사진은 0시간 및 NGF의 제거 (및 항-NGF 항체의 첨가)의 3, 6, 12 및 24시간 후에 축삭 변성을 보여준다.
APP 축삭 탈락 실험에서 표면 APP 발현을 시각화하기 위해 사용된 폴리클로날 항-N-APP 항체는 써모 사이언티픽으로부터 입수하였다 (Cat. No. RB-9023-P1). 감각 체외이식편 배양을 상기 실시예 6 및 7에 설명된 바와 같이 수행하였다. NGF 결핍 분석을 다음과 같이 변형하여 상기 실시예 7에 설명된 바와 같이 수행하였다. DRG 체외이식편 배양액을 NGF 결핍 이후 표시된 시간 간격 후 4％ PFA/PBS 내에서 고정시켰다: 0시간, 3시간, 6시간, 12시간, 및 24시간. 표면 APP 발현을 시각화하기 위해, DRG 축삭을 상기 설명된 항-N-APP 1차 항체를 사용하여 Triton 투과화 단계 없이 실시예 6 및 7에서와 같이 면역형광 염색을 위해 처리하였다.
감각 축삭 (항-N-APP 항체 (써모 사이언티픽, Cat. No. RB-9023-P1)로 면역형광 표지된) 상의 표면 APP 발현을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 (적색 형광 채널 내에서) 상에서 사진을 찍었다.
도 14B는 DR6 엑토도메인이 배양된 세포에 의해 발현된 APP에 결합함을 보여주는 사진을 제공한다. 도 14B에서, 좌측에서 우측으로, 상부 2개의 사진은 각각 DR6-APP (DR6 엑토도메인을 갖는)로 프로빙된 대조 Cos 세포 및 APP 발현 세포를 보여준다. 하부 2개의 사진은 DR6-AP로 프로빙된 p75NTR 수용체 및 DR6 수용체 발현 세포를 보여준다. DR6 엑토도메인은 p75NTR 또는 DR6 수용체 발현 세포에 결합하지 않는다.
본 도면에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. APP가 DR6 세포외 도메인과 직접 상호작용하는지 시험하기 위해, 세포-기반 AP 결합 분석을 수행하였다 (도 14B). DR6 엑토도메인-AP 융합 단백질 (DR6-AP)을 생성하기 위해, DMEM/10％FBS (깁코) 배지 내에서 배양된 COS-1 세포를 제조사 프로토콜에 따라 FuGene 형질감염 시약 (로슈)을 사용하여 15 ㎍의 DR6-AP 융합 발현 구성체로 형질감염시켰다. 형질감염의 12시간 후, COS-1 세포 배지를 OPTI-MEM (인비트로겐)으로 교환하였다. 형질감염의 48시간 후, DR6-AP 단백질을 함유하는 COS-1 세포 조건화 배지를 모으고 여과하였다.
배지 내의 DR6-AP 단백질의 양은 다음 절차에 따라 정량하였다. 100 ㎕의 2XAP 버퍼 (100 mg 파라-니트로페닐 포스페이트 (시그마) 및 15 ㎕의 1M MgCl2를 15 ml 2M 디에탄올아민 (pH 9.8)에 첨가하여 제조함)을 동일 부피의 형질감염된 COS 세포 조건화 배지, 또는 형질감염되지 않은 COS-1 세포로부터의 대조 조건화 배지와 혼합하였다. 반응액의 색상은 12-15분에 걸쳐 발색되었고, O.D.는 직선 범위이다 (0.1-1). 이어서, 800 ㎕의 증류수를 첨가하여 반응액의 부피를 조정하고, O.D.를 405 nm 흡광 파장에서 측정하였다. 농도 (nM)는 다음 식에 따라 계산하였다 (100 ㎕에 대해): C (nM) = O.D. X 100 X (60/발색 시간)/30.
APP AP 결합 분석을 위해, 6-웰 배양 접시에서 DMEM/10％FBS (깁코) 배지 내에서 배양된 COS-1 세포를 제조사 프로토콜에 따라 FuGene 형질감염 시약 (로슈)을 사용하여 웰 당 2 ㎍의 APP 발현 벡터로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후에, 세포를 결합 버퍼 (HBSS, 깁코 Cat. No. 14175-095, 0.2％ BSA, 0.1％ NaN3, 5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES 함유 (pH=7.0))로 2회 세척하였다. 이어서, DR6-AP 조건화 배지와 결합 버퍼의 1:1 혼합물을 제조함으로써 AP 결합 분석을 수행하였고, 상기 혼합물을 APP 과다-발현 COS-1 세포에 직접 적용하고 90분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후, COS-1 세포를 결합 버퍼로 5회 세정함으로써 결합되지 않은 DR6-AP 단백질을 세척 제거하였다. 이어서, 세포를 PBS 내에 희석시킨 3.7％ 포름알데히드로 12분 동안 실온에서 고정시켰다. 남아있는 포름알데히드는 세포를 HBS 버퍼 (20 mM HEPES (pH=7.0), 150 mM NaCl)로 3회 세정함으로써 제거하였다. 내인성 AP 활성은 HBS 버퍼 내에서 30분 동안 65℃에서 열 불활성화에 의해 차단하였다. 이어서, COS-1 세포를 AP 반응 버퍼 (100 mM TRIS pH=9.5, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2) 내에서 3회 세정하였다. 이어서, 막횡단 APP에 결합하는 DR6-AP 융합 단백질은 1/50 (부피)의 NBT/BCIP 스톡 용액 (로슈, Cat. No. 1681451)을 사용하여 실온에서 밤새 AP 반응 버퍼 내에서 COS-1 세포 상에서 색상 스테인을 발색시킴으로써 시각화하였다 (도 14B). 평행 대조 실험에서, 형질감염되지 않은 COS 세포로부터 조건화 배지를 AP 결합 분석을 위해 사용하였다. COS-1 세포에서 발현된 막횡단 p75NTR 및 DR6 수용체는 동일한 실험 조건 하에 DR6-AP 융합 단백질에 대해 특이적 결합을 보이지 않았고 (도 14B), 이는DR6 엑토도메인과 APP 사이의 상호작용이 특이적임을 나타낸다.
도 14C는 DR6이 감각 축삭 상의 N-APP에 대한 주요 수용체이고, APP 결합 부위는 DR6 결실 마우스의 뉴런 세포에서 유의하게 결핍됨을 보여주는 사진을 제공한다. 도 14C에서, 좌측에서 우측으로, 상부 3개의 사진은 각각 AP 대조군, N-APP-AP, 및 Sema3A-AP로 프로빙된 DR6 +/- (het) 마우스로부터 얻은 뉴런을 보여준다. 하부 3개의 사진은 각각 AP 대조군, N-APP-AP, 및 Sema3A-AP로 프로빙된 DR6 -/- (KO) 마우스로부터 얻은 뉴런을 상응하게 보여준다.
도 14C에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 마우스 DR6 엑토도메인-AP 융합 단백질은 실시예 9에서 상기 설명된 바와 같이 생성하였다. 마우스 Sema3A 엑토도메인-AP (Sema3A-AP) 융합 단백질은 이전에 설명된 바와 같이 생성하였다 (Feiner et al., 1997, Neuron, Vol. 19, 539-545). DR6 결실 마우스 라인 (DR6.KO)은 이전에 설명되었다 (Zhao et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001). DRG 체외이식편 배양 및 DR6-AP 축삭 결합 분석을 도 12A 및 12B에 대해 실시예 9에서 상기 설명된 바와 같이 수행하였다.
도 14D는 길항제 DR6 항체가 DR6 엑토도메인과 뉴런 APP 사이의 상호작용을 붕괴시킴을 보여주는 사진을 제공한다. 이들 연구에서, DR6을 발현하는 뉴런 세포에 N-APP를 첨가한 후, 항-N-APP 항체를 사용하여 시각화하였다. 좌측에서 우측으로, 첫 번째 4개의 사진은 각각 대조 IgG; RA.4 항-DR6 항체; RA.3 항-DR6 항체 및 RA.1 항-DR6 항체의 존재 하에 뉴런의 표면 상의 DR6에 결합하는 N-APP의 능력을 보여준다. 최우측 사진은 대조 IgG를 사용한 세포 상의 DR6의 염색을 보여준다.
본 도면에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 도 14D에 제시된 데이타를 얻기 위해 사용된 세포-기반 리간드 결합 분석은 다음과 같이 변형하여 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (Okada et al., Nature, 2006, Vol. 444, 369-373). N-말단 성장 인자-유사 도메인 APP-His 융합 단백질 (N-APP-His)을 생성하기 위해, DMEM/10％FBS (깁코) 배지 내에서 배양된 COS-1 세포를 제조사 프로토콜에 따라 FuGene 형질감염 시약 (로슈)을 사용하여 15 ㎍의 N-APP-His 융합 발현 구성체로 형질감염시켰다. 형질감염 12시간 후에, COS-1 세포 배지를 OPTI-MEM (인비트로겐)로 교환하였다. 형질감염 48시간 후에, N-APP-His 단백질을 함유하는 COS-1 세포 조건화 배지를 모으고 여과하였다. N-APP-His의 농도는 상기 설명된 항-N-APP 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다.
본 결합 분석에 사용된 인간 N-APP-His의 아미노산 서열은 다음과 같다:
Figure 112009044415955-PCT00006
이어서, N-APP-His 결합 분석은 N-APP-His 조건화 배지와 결합 버퍼의 1:1 혼합물을 제조함으로써 수행하였고, 상기 혼합물을 DR6 수용체 과다-발현 COS-1 세포에 직접 적용하고 90분 동안 실온에서 인큐베이팅하였다. 표시된 경우에, DR6 mAb RA.1, RA.3 또는 RA.4 (상기 설명됨, 실시예 3 및 7)를 개별적으로 20 ㎍/ml로 N-APP-His 조건화 배지 및 결합 버퍼와 함께 첨가하였다. 대조 실험에서는 정상 마우스 IgG (제넨테크, 인크.)를 20 ㎍/ml로 N-APP-His 조건화 배지 및 결합 버퍼와 함께 첨가하였다.
DR6 수용체 발현 세포에 대한 N-APP 결합은 항-N-APP 항체 (써모 사이언티픽 Cat. No. RB-9023-P1)를 사용하여 실시예 6 및 7의 프로토콜에 설명된 바와 같이 공지의 프로토콜에 따라 면역형광 염색에 의해 시각화하였다 (Okada et al., Nature, 2006, Vol. 444, 369-373). 세포 표면 상의 DR6 수용체에 결합된 N-APP 단백질을 시각화하기 위해 (항-N-APP 항체 (써모 사이언티픽, Cat. No. RB-9023-P1)로 면역형광 표지됨), AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 (적색 형광 채널 내에서) 상에서 사진을 찍었다.
실시예 11: 아밀로이드 전구체 단백질 ( APP )은 축삭 변성을 유도하도록 DR6 을 활성 화시킨다.
도 15A는 N-말단 APP에 대한 폴리클로날 항체가 연합 축삭 분석에서 축삭 변성을 차단함을 보여주는 사진을 제공한다. 좌측에서 우측으로, 도 15A의 사진은 각각 대조 IgG; 30 ㎍/ml의 항-NAPP 항체; 및 1.1 ㎍/ml의 항-NAPP 항체의 존재 하에 연합 축삭 변성을 보여준다.
도 15A에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 연합 체외이식편 생존 분석을 실시예 2의 프로토콜 및 도 4B에 생성된 데이타에 설명된 바와 같이 표시된 양의 폴리클로날 항-N-APP 항체 (써모 사이언티픽 Cat. No. RB-9023-P1, 광범위하게 투석됨) 또는 대조 IgG (토끼 IgG, 알앤디 시스템스)을 사용하여 수행하였다. GFP-표지된 연합 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axiovert 200 Zeiss 도립 현미경 (GFP를 위한 초록 형광 채널 내에서) 상에서 사진을 찍었다.
도 15B는 N-말단 APP 항체가 NGF 제거에 의해 유도된 감각 축삭 변성을 억제하였음을 보여주는 사진을 제공한다. 좌측에서 우측으로, 도 15B의 상부 3개의 사진은 각각 NGF 및 대조 항체; 항-APP 모노클로날 항체 22C11; 및 항-APP 폴리클로날 항체의 존재 하에 감각 축삭을 보여준다. 하부 3개의 사진은 상응하게 각각 NGF (및 항-NGF 항체) 및 대조 항체; 항-APP 모노클로날 항체 22C11; 및 항-APP 폴리클로날 항체의 부재 하에 감각 축삭을 보여준다.
도 15B에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같 다. NGF 결핍 분석을 상기 실시예 8에 설명된 바와 같이 캄페노트 챔버 내에서 수행하였다. 본 분석에서 사용된 N-말단 APP에 대한 항체는 폴리클로날 항-N-APP 항체 (써모 사이언티픽 Cat. No. RB-9023-P1, 광범위하게 투석됨) 또는 22C11 모노클로날 항체 (22C11, 케미콘, 광범위하게 투석됨)였다. 대조 실험으로서 정상 IgG (토끼 IgG, 알앤디 시스템스)를 첨가하였다. TUJ1 항체 (1:500, 코밴스)를 사용하는 감각 축삭의 면역형광 표지는 실시예 1, 7 및 8에 설명된 바와 같이 수행하였다. 캄페노트 챔버의 축삭 컴파트먼트에서 면역형광 표지된 감각 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 상에서 사진을 찍었다.
도 15C는 β-세크레타제 (BACE) 활성의 억제에 의해 차단된 축삭 변성이 N-APP의 첨가에 의해 구조될 수 있음을 보여주는 사진을 제공한다. 좌측에서 우측으로, 도 15C의 상부 3개의 사진은 각각 DMSO 대조군, BACE 억제제 및 N-APP (및 BACE-I)의 존재 하에 관찰된 뉴런 (NGF의 부재 하에 배양된) 및 축삭 변성을 보여준다. 도 15C의 하부 3개의 사진은 상응하게 뉴런 (NGF의 존재 하에 배양된) 및: 각각 DMSO 대조군, BACE 억제제 및 N-APP (및 BACE-I)를 보여준다.
도 15C에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. NGF 결핍 분석을 상기 실시예 8에 설명된 바와 같이 캄페노트 챔버에서 수행하였다. 본 분석에서 사용된 인간 재조합 N-APP 아미노산 19-306은 노부스 (Novus)로부터 구입하였다 (노부스 바이올로지컬스 (Novus Biologicals), Cat. No. H00000351-P01). NGF 결핍 시에 N-APP를 3 ㎍/ml로 BACE 억제제 (1 μM 최종 농도, InSolution OM99-2, 칼비오켐/머크)와 함께 첨가하였다. BACE 억제제는 본 분석에서 1 μM 최종 농도로 사용되었다 (InSolution OM99-2, 칼비오켐/머크). TUJ1 항체 (1:500, 코밴스)를 사용한 감각 축삭의 면역형광 표지는 실시예 1, 7 및 8에 설명된 바와 같이 수행하였다. 캄페노트 챔버의 축삭 컴파트먼트에서 면역형광 표지된 감각 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 상에서 사진을 찍었다.
도 15D는 RNAi에 의한 APP 제거가 BACE 억제제의 존재 하에 성장된 뉴런 세포를 N-APP에 의해 유도된 세포 사멸에 대해 감작시킴을 보여주는 사진을 제공한다. 도 15D에서 좌측에서 우측으로, 상부 3개의 사진은 대조 RNAi의 존재 하에 배양된 뉴런을 보여준다. 이들 상부 사진은 대조군 및 각각 3 ㎍/ml N-APP 또는 0.1 ㎍/ml N-APP와 함께 배양된 뉴런을 보여준다. 하부 3개의 사진은 APP RNAi의 존재 하에 배양된 뉴런을 보여준다. 이들 하부 사진은 대조군 및 각각 3 ㎍/ml N-APP 또는 0.1 ㎍/ml N-APP와 함께 배양된 뉴런을 보여준다.
도 15D에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 연합 체외이식편 배양액에서 APP RNAi는 실시예 2에 설명된 바와 같이 수행하였다. 본 분석에 사용된 인간 재조합 N-APP 아미노산 19-306은 노부스로부터 구입하였다 (노부스 바이올로지컬스, Cat. No. H00000351-P01). 예비-설계된 래트-특이적 APP ON-TARGETplus siRNA 풀 (pool)을 제조사 프로토콜에 따라 본 분석에서 사용하여, E13 래트 연합 체외이식편에서 APP 발현을 하향-조절하였다 (APP ON-TARGETplus siRNA 풀, GeneID: 54226, Cat. No. 088191, 다르마콘 인크. (Dharmacon Inc.)). GFP-표지된 및 RFP-표지된 연합 축삭 (실시예 2 및 7에 설명된 바와 같이)을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axiovert 200 Zeiss 도립 현미경 (GFP를 위한 초록 형광 채널 내에서) 상에서 사진을 찍었다.
실시예 12: DR6 은 APP 유도된 축삭 변성을 위해 요구되지만 ABETA 에 의해 촉발된 변성을 위해서는 요구되지 않는다.
도 16A에 도시된 바와 같이, DR6 활성화가 N-APP 유도된 축삭 변성에 요구된다.
도 16A에서 좌측에서 우측으로, 상부 3개의 사진은 DR6 +/- (het) 마우스로부터 얻은 뉴런을 보여준다. 첫 번째 사진은 Abeta 또는 N-APP에 노출되지 않은 뉴런을 보여주고, 두 번째 사진은 Abeta에 노출된 뉴런을 보여주고, 세 번째 사진은 N-APP에 노출된 뉴런을 보여준다. 하부 3개의 사진은 DR6 -/- (KO) 마우스로부터 얻은 뉴런을 보여준다. 좌측에서 우측으로, 하부 첫 번째 사진은 Abeta 또는 N-APP에 노출되지 않은 대조 뉴런을 보여주고, 두 번째 사진은 Abeta에 노출된 뉴런을 보여주고, 세 번째 사진은 N-APP에 노출된 뉴런을 보여준다.
도 16A에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 연합 체외이식편 배양 및 생존 분석을 실시예 2에 설명된 바와 같이 수행하였다. DR6 결실 마우스 라인 (DR6.KO)은 이전에 설명되었다 (Zhao et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 194, 1441-1441, 2001). 본 분석에 사용된 인간 재조합 N-APP 아미노산 19-306은 노부스로부터 구입하였다 (노부스 바이올로지컬스, Cat. No. H00000351-P01). 본 분석에 사용된 재조합 인간 베타 아밀로이드 아미노산 1-42는 케미콘으로부터 구입하였다 (초순수 인간 Abeta 1-42, Cat. No. AG912, 케미콘). N-APP를 플레이팅 24시간 후에 연합 체외이식편에 3 ㎍/ml로 BACE 억제제와 함께 첨가하였다. 재조합 인간 베타 아밀로이드 아미노산 1-42는 플레이팅 24시간 후에 연합 체외이식편에 3 μM로 BACE 억제제와 함께 첨가하였다. BACE 억제제는 본 분석에서 1 μM 최종 농도로 사용되었다 (InSolution OM99-2, 칼비오켐/머크). 연합 체외이식편을 표시된 양의 N-APP 또는 Abeta와 함께 추가의 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 연합 체외이식편 플레이팅 48시간 후에 데이타를 모았다. 연합 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axiovert 200 Zeiss 도립 현미경 (명시야에서) 상에서 사진을 찍었다.
도 16B에 도시된 바와 같이, 길항제 DR6 항체는Abeta에 의해 촉발된 축삭 변성을 차단하지 못하였다. 도 16B에서 좌측에서 우측으로, 상부 3개의 사진은 대조 뉴런, BACE-I의 존재 하에 뉴런, 및 BACE-I 및 Abeta의 존재 하에 뉴런을 보여준다. 도 16B에서, 하부 2개의 사진은 BACE-I, Abeta 및 항-DR6 항체 RA.1의 존재 하에 뉴런, 및 이어서 BACE-I, Abeta 및 항-DR6 항체 RA.3의 존재 하에 뉴런을 보여준다.
도 16B에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같 다. 연합 체외이식편 배양 및 생존 분석을 실시예 2에 설명된 바와 같이 수행하였다. 본 분석에 사용된 재조합 인간 베타 아밀로이드 아미노산 1-42는 케미콘으로부터 구입하였다 (초순수 인간 Abeta 1-42, Cat. No. AG912, 케미콘). BACE 억제제는 본 분석에서 1 μM 최종 농도로 사용되었다 (InSolution OM99-2, 칼비오켐/머크). 재조합 인간 베타 아밀로이드 아미노산 1-42를 플레이팅 24시간 후에 연합 체외이식편에 3 μM로 BACE 억제제 및 표시된 항-DR6 mAb 40 ㎍/ml과 함께 첨가하였다. BACE 억제제는 본 분석에서 1 μM 최종 농도로 사용되었다 (InSolution OM99-2, 칼비오켐/머크). 연합 체외이식편을 표시된 양의 Abeta와 함께 추가의 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 연합 체외이식편 플레이팅의 48시간 후에 데이타를 모았다.
마우스 모노클로날 RA.1-RA.5 DR6 항체는 상기 실시예 3에 설명된 바와 같이 마우스를 DR6 엑토도메인으로 면역화시킴으로써 생성하였다. 상기한 바와 같이, 본원에서 RA.1 및 RA.3 항체로 지정된 DR6 항체는 각각 실시예 3에 설명된 "1E5.5.7" 및 "3F4.4.8" DR6 항체이다. GFP-표지된 연합 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axiovert 200 Zeiss 도립 현미경 (GFP를 위한 초록 형광 채널 내에서) 상에서 사진을 찍었다.
실시예 13: 세포내 DR6 신호 전달
카스파제는 세포 예정사 경로에서 중요한 인자이고 (예를 들어 문헌 ([Grutter et al., Curr Opin Struct Biol. 10(6):649-55 (2000)]; [Kuida et al., Nature 384 (6607): 368-72 (1996)]: 및 [Finn et al., J Neurosci. 20 (4): 1333-41 (2000)]) 참조), 일부 카스파제는 헌팅턴 병 및 AD를 포함한 신경변성 질병에서 세포내 신호 전달과 연관된다 (예를 들어 문헌 ([Wellington et al., J Neurosci. 22(18): 7862-72 (2002)]; [Graham et al., Cell 125(6): 1179-91 (2006)]; [Guo et al., Am J Pathol. (2):523-31 (2004)]; 및 [Horowitz et al., J Neurosci. 24(36): 7895-902 (2004)]) 참조).
도 17A는 5일 동안 배양한 후, 24시간 동안 다양한 상이한 배양 조건에 노출시킨 감각 뉴런의 사진을 보여준다. 도 17A에 도시된 바와 같이, 축삭 변성은 JNK 및 상류 카스파제-8에 의해 지연되지만, 하류 카스파제-3에 의해 지연되지 않는다.
도 17A에서, 좌측의 2개의 사진은 내림 순으로 각각 NGF 및 항-NGF 항체에 노출된 감각 뉴런을 보여준다. 도 17A에서, 우측의 4개의 사진은 내림 순으로 각각 항-NGF 항체 및 JNK 억제제; 항-NGF 항체 및 카스파제-8 억제제; 항-NGF 항체 및 BAX 억제제; 및 항-NGF 항체 및 카스파제-3 억제제에 노출된 감각 뉴런을 보여준다.
도 17A에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 캄페노트 챔버 내에서 NGF 결핍 분석을 상기 실시예 8에 설명된 바와 같이 수행하였다. 소분자 JNK 억제제인 SP 600125는 본 분석에서 1 μM 최종 농도로 사용되었다 (SP 600125, Cat. No. 1496, 토크리스 바이오사이언시즈). 카스파제-3 억제제인 Z-DEVD-FMK는 본 분석에서 10 μM로 사용되었다 (Z-DEVD-FMK, Cat. No. 264155, 칼비오켐). 카스파제-8 억제제인 Z-IETD-FMK는 본 분석에서 10 μM로 사 용되었다 (Z-IETD-FMK, Cat. No. FMK007, 알앤디 시스템스). BAX 억제 펩티드는 뉴런 세포 사멸을 차단하기 위해 10 μM로 사용되었다 (Bax-V5, 토크리스 인크). BAX 결실 마우스 라인 (Bax-R1)은 이전에 설명되었고 (Deckwerth et al., Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996), 잭슨 래보러토리스로부터 입수하였다. TUJ1 항체 (1:500, 코밴스)를 사용한 감각 축삭의 면역형광 표지는 실시예 1, 7 및 8에 설명된 바와 같이 수행하였다. 캄페노트 챔버의 축삭 컴파트먼트 내에서 면역형광 표지된 감각 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 상에서 사진을 찍었다.
도 17B는 E12.5 운동 뉴런 체외이식편 배양액으로부터 운동 뉴런의 사진을 제공하고, 카스파제-3은 세포체에서 기능하는 반면, 카스파제-6은 축삭에서 기능함을 보여준다.
도 17B에서 좌측에서 우측으로, 4개의 사진은 각각 (1) 성장 인자와 함께; (2) 성장 인자 없이 카스파제 억제제의 부재 하에 (대조군); (3) 성장 인자 없이 카스파제-3 억제제의 존재 하에; 및 (4) 성장 인자 없이 카스파제-6 억제제의 존재 하에 배양된 뉴런을 보여준다.
도 17B에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 카스파제-3 억제제인 Z-DEVD-FMK는 본 분석에서 10 μM로 사용되었다 (Z-DEVD-FMK, Cat. No. 264155, 칼비오켐). 카스파제-6 억제제인 Z-VEID-FMK는 본 분석에서 10 μM로 사용되었다 (Z-VEID-FMK, Cat. No. 550379, 벡톤, 디킨슨 앤드 컴 퍼니 파밍엔 디비젼). 운동 뉴런 배쪽 척수 생존 분석을 상기 실시예 6에 설명된 바와 같이 수행하였다. TUJ1 항체 (1:500, 코밴스)를 사용한 운동 축삭의 면역형광 표지는 실시예 1, 7 및 8에 설명된 바와 같이 수행하였다. 면역형광 표지된 운동 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 상에서 사진을 찍었다.
도 17C는 5일 동안 배양된 후, 24시간 동안 다양한 상이한 배양 조건에 노출시킨 감각 뉴런의 사진을 제공한다. 도 17C의 데이타는 카스파제-3은 축삭 변성을 위해 요구되는 것으로 보이지 않지만, BAX는 요구되는 것으로 보임을 보여준다.
도 17C에서 좌측에서 우측으로, 상단 4개의 사진은 NGF와 함께; 이어서 각각 16, 24 및 48시간 동안 항-NGF 항체의 존재 하에 (즉, NGF 결핍) 배양된 BAX +/+ 뉴런을 보여준다. 하단 4개의 사진은 상응하게 NGF와 함께; 이어서 각각 16, 24 및 48시간 동안 항-NGF 항체와 함께 배양된 BAX -/- 뉴런을 보여준다.
도 17C에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 캄페노트 챔버 내에서 NGF 결핍 분석을 상기 실시예 8에 설명된 바와 같이 수행하였다. BAX 결실 마우스 라인 (Bax-Rl)은 이전에 설명되었고 (Deckwerth et al., Neuron, Vol. 17, 401-411, 1996), 잭슨 래보러토리스로부터 입수하였다. NGF 항체는 캄페노트 챔버의 축삭 컴파트먼트 내에서 NGF 결핍 분석에서 사용되었다 (모노클로날 기능-차단 항-NGF #911, 제넨테크, 20 ㎍/ml). TUJ1 항체 (1:500, 코밴스)를 사용한 감각 축삭의 면역형광 표지는 실시예 1, 7 및 8에 설명된 바와 같이 수행하였다. 캄페노트 챔버의 축삭 컴파트먼트 내에서 면역형광 표지된 감각 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 (초록 형광 채널 내에서) 상에서 사진을 찍었다.
도 17D는 24시간 동안 상이한 배양 조건 하에 배양된 E13 래트 체외이식편 연합 뉴런의 배양액의 사진을 제공한다. 도 17D의 데이타는 카스파제-3은 세포체에서 기능하는 반면, 카스파제-6은 축삭에서 기능함을 보여준다.
도 17D에서 좌측에서 우측으로, 상단 3개의 사진은 각각 카스파제-3 또는 카스파제-6 억제제와 함께 배양된 뉴런에 비교한 대조 뉴런의 GFP 분석을 보여준다. 하단 3개의 사진은 상응하게 각각 카스파제-3 또는 카스파제-6 억제제와 함께 배양된 뉴런에 비교한 대조 뉴런의 TUNEL (세포 사멸) 분석을 보여준다.
도 17D에 제시된 데이타를 생성하기 위해 사용된 물질 및 방법은 다음과 같다. 연합 체외이식편 배양 및 생존 분석은 실시예 2에 설명된 바와 같이 수행하였다. 연합 세포체에서 세포 예정사는 연합 체외이식편 배양액 내에서 상기 실시예 7에 설명된 바와 같이 TUNNEL 분석에 의해 시각화하였다. 연합 체외이식편을 4％PFA/PBS 내에서 고정시키고, 제조사의 지시 매뉴얼 (로슈)에 따라 계내 세포 사멸 검출 키트 (Cat. No. 11 684 795 910, 로슈)를 사용하여 DNA 가닥 절단 (TUNNEL 기술)의 표지에 기초한 단일 세포 수준에서 세포 예정사 (세포자멸)의 검출을 위해 처리하였다. 연합, 감각 및 운동 체외이식편 배양액의 세포체에서 세포자멸을 형광 현미경에 의해 분석하였다 (도 17D). 카스파제-3 억제제인 Z-DEVD-FMK는 본 분 석에서 10 μM로 사용되었다 (Z-DEVD-FMK, Cat. No. 264155, 칼비오켐). 카스파제-6 억제제인 Z-VEID-FMK는 본 분석에서 10 μM로 사용되었다 (Z-VEID-FMK, Cat. No. 550379, 벡톤, 디킨슨 앤드 컴퍼니, 파밍엔 디비젼). GFP-표지된 연합 축삭을 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axiovert 200 Zeiss 도립 현미경 (GFP를 위한 초록 형광 채널 내에서) 상에서 사진을 찍었다. 형광 표지된 TUNNEL-양성 세포자멸성 세포체를 시각화하기 위해, AxioVision40 Release 4.5.0.0 SP1 (03/2006) 컴퓨터 소프트웨어 (칼 자이스 이미징 솔루션즈)를 사용하여 Axioplan-2 Imaging Zeiss 현미경 (TUNNEL을 위한 적색 형광 채널 내에서) 상에서 사진을 찍었다.
실시예 14: 동물 모델에서 DR6 길항제 활성
당업자는 생체 내에서 DR6 길항제의 효과를 검사하기 위해 상이한 신경변성 질병과 연관된 많은 동물 모델을 사용할 수 있다. 예를 들어, APP/RK 트랜스제닉 마우스는 돌연변이체 아밀로이드 전구체 단백질 폴리펩티드를 발현하고, 중증 신경변성 및 세포자멸을 나타낸다. 따라서, APP/RK 트랜스제닉 마우스는 상기 동물 모델에서 관찰되는 알츠하이머 증후군과 연관된 병리학적 과정에 대한 DR6 길항제의 효과를 검사하기 위해 사용될 수 있는 알츠하이머병의 모델을 제공한다 (예를 들어 [Moechars et al., Neuroscience 91(3): 819-830 (1999)] 참조). 다양한 다른 트랜스제닉 뮤린 라인, 예를 들어 APP23 및 JNPL3 트랜스제닉 라인은 돌연변이체 알츠하이머 연관 폴리펩티드를 발현하고, 추가로 뉴런 세포 손실을 나타낸다. 따라서, APP23 및 JNPL3 트랜스제닉 마우스는 DR6 길항제가 투여될 수 있는 알츠하이머 병의 대안적인 모델을 제공한다 (예를 들어 [McGowan et al., TRENDS in Genetics Vol. 22 No. 5 (2006)] 참조).
G93A SOD1 트랜스제닉 마우스는 인간 수퍼옥시드 디스뮤타제 돌연변이체 폴리펩티드를 발현하고, 상승된 수준의 카스파제-3 발현 및 운동 뉴런 세포자멸을 나타낸다. G93A SOD1 트랜스제닉 마우스는 DR6 길항제의 효과를 검사하기 위해 사용될 수 있는 근위축성 측삭 경화증의 모델을 제공한다 (예를 들어 [Tokuda et al., Brain Res. 1148: 234-242 (2007)]; 및 [Wang et al., Eur. J. Neurosci. 26(3): 633-641 (2007)] 참조). R6/2 트랜스제닉 마우스는 그의 천연 프로모터의 제어 하에 팽창된 N-말단 폴리글루타메이트 반복체를 갖는 헌팅턴의 엑손-1을 발현하고, 인간에서 헌팅턴 병을 암시하는 진행성 신경병리학적 변화를 나타낸다 (예를 들어 [Mangarini et al., Cell, 87, 493-506 (1996)]; [Chen et al., Nat. Med. 6, 797-801 (2000)] 참조). R6/2 트랜스제닉 마우스는 상기 동물 모델에서 관찰되는 헌팅턴 병 증후군과 연관된 병리학적 과정에 대한 DR6 길항제의 효과를 검사하기 위해 사용될 수 있는 헌팅턴 병의 모델을 제공한다 (예를 들어 [Wang et al., European Journal of Neuroscience, 26: 633-641 (2007)] 참조). PK-KO 트랜스제닉 마우스는 Park-2 유전자의 단백질 산물을 발현하지 않고, 파킨슨병을 모방하는 이상증을 나타내고, 야생형 마우스로부터의 것보다 더 세포자멸에 감수성인 뉴런을 갖는다 (예를 들어 [Casarejos et al., J Neurochem. 97(4): 934-46 (2006)] 참조). PK-KO 트랜스제닉 마우스는 상기 동물 모델에서 관찰되는 파킨슨병 증후군과 연관된 병리학적 과정에 대한 DR6 길항제의 효과를 검사하기 위해 사용될 수 있는 파킨슨 병의 모델을 제공한다. 또한, 많은 트랜스제닉 마우스 라인, 예를 들어 Smn-/-SMN2 마우스, 인간 AR 프로모터 하에 순수 239 트리뉴클레오티드 CAG 반복체를 보유하는 트랜스제닉 마우스, 및 뮤린 배경에서 기능하는 인간 SMNC 유전자의 적어도 하나의 카피를 갖는 천연 마우스 Smn 유전자의 트랜스제닉 이중 녹-아웃은 모두 생존 운동 뉴런 유전자의 단백질 산물을 발현하지 않거나 그의 변경된 버전을 발현하고, 결과적으로 척수 근육 위축 질병을 모방하는 이상증을 나타낸다 (예를 들어 ([Hsiu et al., Nature Genetics 24, 66-70 (2000)]; [Ferri et al., Neuroreport 15(2): 275-280 (2004)]; [Ferri et al., Curr Biol. 2003 Apr 15; 13(8): 669-73]; 및 [Rossol et al., Journal of Cell Biology, Volume 163, Number 4, 801-812 (2003)]) 참조). 상기 트랜스제닉 뮤린 라인은 결과적으로 상기 동물 모델에서 관찰되는 척수 근육 위축증 증후군과 연관된 병리학적 과정에 대한 DR6 길항제의 효과를 검사하기 위해 사용될 수 있는 척수 근육 위축증의 모델을 제공한다.
상기한 것을 포함한 신경학적 병태 또는 질환의 동물 모델은 본원에 개시된 DR6 길항제, 예를 들어 DR6에 결합하는 하나 이상의 항체 (예를 들어 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7 모노클로날 항체), 및/또는 APP에 결합하는 DR6의 하나 이상의 가용성 형태 (예를 들어, 서열 1의 아미노산 1-354을 포함하는 것), 및/또는 APP에 결합하는 하나 이상의 항체 (예를 들어 22C11 모노클로날 항체) 및 이들 물질의 서로와의 및/또는 당업계에 공지된 다른 치료제와 조합물의 효과를 검사하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 개시된 하나 이상의 DR6 길항제의 실험적 시험을 위한 예시적인 프로토콜에서, 동물 모델로부터 많은 연령 및 성별 매칭된 (matched) 동물 (예를 들어 6월령 암컷 APP/RK 트랜스제닉 마우스)을 다수의 시험군 및/또는 대조군 중 하나에 배정할 수 있다. 이어서, 이들 동물의 제1 시험군에 선택된 DR6 길항제를 특정한 투여 프로토콜에 따라 투여할 수 있다 (예를 들어, 각각의 주사를 6개월 동안 2주마다 하여 20 mg/kg 체중으로 DR6 길항제 항체의 복강내 주사). 다른 시험군에 대한 조건은 예를 들어 상이한 용량의 DR6 길항제 (예를 들어 1, 5, 10, 15 mg/kg 체중)를 투여함으로써; 상이한 스케줄의 DR6 길항제 (예를 들어 12개월 동안 매주 주사)를 투여함으로써; 상이한 DR6 길항제 (예를 들어 DR6 면역어드헤신)을 투여함으로써; 물질의 조합물 (예를 들어 콜린에스테라제 억제제와 조합한 DR6 길항제)을 사용함으로써; 상이한 투여 경로 (예를 들어 정맥내 투여)를 이용함으로써 등에 의해 표준 실무에 따라 변화될 수 있다. 하나 이상의 군의 동물, 예를 들어 DR6 길항제를 투여받는 시험군과 동일한 투여 과정에 따라 멸균 포스페이트 완충 염수를 투여받는 군이 대조군으로서 역할을 할 수 있다.
이어서, DR6 길항제를 투여받은 후 일정한 시간에, 예를 들어 생체내 DR6 길항제의 효과를 검사하고/하거나 특성화하기 위해 이들 동물의 시험군 및 매칭된 대조군을 비교할 수 있다. 예를 들어, 이들 동물의 시험군 및 대조군으로부터 특정한 조직 또는 장기 (예를 들어 뇌)로부터의 뉴런 세포를 포함하는 샘플을 이들 군에서 뉴런 세포의 상태를 비교하기 위해 자기 공명 현미경 및/또는 면역조직화학적 분석과 같은 기술에 의해 평가할 수 있다 (예를 들어 [Petrik et al., Neuromolecular Med. 9(3):216-29 (2007)] 참조). 별법으로, 이들 군으로부터 얻은 샘플을 변경된 신경돌기 궤적, 수상돌기 가시 손실 또는 수상돌기의 얇아짐과 같은 현상을 입증하기 위해 다-광자 (multi-photon) 현미경과 같은 기술에 의해 평가할 수 있다 (예를 들어 [Tsai et al., Nat. Neurosci. 7, 1181-1183 (2004)]: 및 [Spires et al., J. Neurosci. 25, 7278-7287 (2005)] 참조). 별법으로, 이들 군으로부터 얻은 혈액 또는 다른 조직 샘플을 염증 및/또는 세포자멸의 마커, 예를 들어 IL-1β, TNF-α, IL-10, p53 단백질, 인터페론-γ 또는 NF-kappaB의 수준을 측정하기 위해 고안된 ELISA 프로토콜로 처리할 수 있다 (예를 들어 [Rakover et al., Neurodegener. Dis. 4(5):392-402 (2007)]; 및 [Mogi et al., Neurosci Lett. 414 (1): 94-7 (2007)] 참조). 별법으로, 시험군 및 매칭된 대조군으로부터의 동물을 당업계에 공지된 거동 시험 패러다임, 예를 들어 모리스 (Morris) 수중 미로 또는 사물 인식 시험으로 비교할 수 있다 (예를 들어, [Hsiao et al., Science 274, 99-102 (1996)]; [Janus et al., Nature 408, 979-982 (2000)]; [Morgan et al., Nature 408, 982-985 (2000)]; 및 [Ennaceur et al., Behav. Brain Res. 1988; 31:47-59] 참조). 시험군과 매칭된 대조군의 동물들 사이의 비교의 결과로 인해 당업자는 동물 모델에서 생체내 DR6 길항제의 효과를 검사할 수 있을 것이다.
실시예 1-13, 그에 포함된 데이타 및 상기 데이타의 연관된 특성화는 DR6 길항제가 예를 들어, 생체 내에서 뉴런 세포의 세포자멸을 억제할 것임을 증명한다. 특히, 상기 실시예 1-13은 예를 들어 (1) DR6은 매우 다양한 뉴런 세포에서 세포자 멸을 유도하고; (2) APP는 DR6에 결합하고 DR6 매개된 세포자멸을 촉발하는 DR6에 대한 동족체 리간드이고; (3) 시험관 내에서 DR6/APP 결합 상호작용을 억제하는 DR6 길항제는 결과적으로 시험관 내에서 DR6 매개된 세포자멸을 억제함을 보여준다. 본 발명자들의 발견과 개시내용에 비추어, 당업자는 DR6 길항제가 생체 내에서 DR6 매개된 세포자멸을 억제함을 합리적으로 예상할 것이다. 이러한 이유로, 당업자는 합리적으로 본원에 설명된 바와 같이 DR6 길항제의 생물학적 활성을 확인하기 위해 상기한 것과 같은 동물 모델 및 이들 동물 모델에서 관찰된 다양한 병리학적 과정을 검사하기 위한 연관된 기술을 예상할 것이다.
실시예 15: 척수 근육 위축증의 동물 모델에서 RA .1 ("1 E5 .5.7"), RA .2, RA .3 ("3F4.4.8") 및 RA .4 항체 처리
척수 근육 위축증 (SMA)은 척수의 전각 (anterior horn)에서 운동 뉴런에 침범하는 열성 운동 뉴런 질병이고, SMN (생존 운동 뉴런) 단백질의 감소로 인한 것으로 생각된다. SMA의 동물 모델은 균주 명칭: FVB.Cg-Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb Tg(SMN2)89Ahmb Smn1tm1Msd/J (JAX 5025)인 트랜스제닉 마우스 라인이다 (예를 들어 [Le et al., Human Molecular Genetics 14(6): 845-857 (2005)] 참조). 상기 삼중 돌연변이체 마우스는 2개의 트랜스제닉 대립유전자 및 단일 표적화 돌연변이체를 보유한다. Tg(SMN2*delta7)4299Ahmb 대립유전자는 엑손 7이 결핍된 SMA cDNA로 이루어지는 반면, Tg(SMN2)89Ahmb 대립유전자는 전체 인간 SMN2 유전자로 이루어진다. 아래 설명에서, 상기 균주는 Delta 7 SMA KO 모델로도 언급된다.
표적화 돌연변이체 Smn 대립유전자에 대해 동종접합성이고 2개의 트랜스제닉 대립유전자에 대해 동종접합성인 마우스는 근위 척수 근육 위축증 (SMA)에 걸린 환자와 유사한 증상 및 신경병리 상태를 나타낸다. 출생시에, 삼중 돌연변이체는 정상 한배 새끼보다 현저하게 더 작다. 제5일에, 근 약화의 징후가 명백하고, 마우스가 비정상적인 걸음, 뒷다리 떨림 및 넘어지는 경향을 보이기 때문에 다음 주에 걸쳐 진행적으로 보다 두드러진다. 평균 생존은 약 13일이다. 삼중 돌연변이체 마우스는 또한 표면 복원 (righting), 음성 주지성 (geotaxis) 및 절벽 혐오에 대해 손상된 반응을 나타내지만 촉각 자극에 대해서는 그렇지 않다. 자발적 운동 활동 및 악력 (grip strength)도 또한 이들 마우스에서 유의하게 손상된다 (예를 들어 [Butchbach et al., Neurobiol Dis. 27(2):207-19 (2007)] 참조). Delta 7 SMA 모델 마우스 (KO)의 생존, 체중 및 근긴장 (muscle tone)에 대한 특정 항체, 예를 들어 DR6 길항제 항체, 및 용량의 효과를 결정하기 위해 다음 프로토콜이 고안된다.
상기한 바와 같이, 본 연구에 사용된 마우스는 Delta-7 SMA (JAX 5025) KO 모델 (smn -/-; SMN2+/+; d7+/+)일 수 있다. 출생시에, 한배 새끼를 예를 들어, 동일한 수의 수컷 및 암컷을 제거하여 무작위로 10마리 동물 (또는 일부 다른 수)로 모을 수 있다. 상기 프로토콜에 따라, 제1 투여 시에 (P3) 한배 새끼를 8마리 마우스로 모을 수 있다. 6마리 미만의 새끼를 갖는 임의의 한배 새끼는 연구에서 제외할 수 있다. 마우스는 월요일과 수요일 사이에 태어난 한배 새끼로부터 출생시에 (P0) 꼬리 절단할 수 있다. 유전자형결정은 당업계에 공지된 다양한 방법론에 의해, 예를 들어 분자 진단학 회사, 예를 들어 트랜스네틱스 인크 (Transnetyx Inc)에서 시판되는 생검 내의 트랜스제닉, 녹-아웃, 및 녹-인 (knock-in) 돌연변이에 대한 자동화 유전자형결정 서비스 스크린을 사용하여 수행할 수 있다. 그러한 유전자형 데이타는 대개 출생 후 48시간 이내에 이용가능하다.
예를 들어, 월요일-수요일에 태어난 마우스를 예시적인 실험에서 사용할 수 있다. 마우스에게 P3에서 시작하여 IP 용량 투여할 수 있다. 연구에서 전형적인 수는 (1) 예를 들어, 비히클, 예를 들어 멸균 PBS를 사용하는 평균 10마리의 KO (5마리 수컷 및 5마리 암컷) 대조군; (2) 예를 들어, 20 mg/kg를 포함하는 각각의 항체의 제1 용량을 사용하는 평균 10마리의 KO (5마리 수컷 및 5마리 암컷); 및 (3) 예를 들어, 5 mg/kg를 포함하는 각각의 DR6 항체의 제2 용량을 사용하는 평균 10마리의 KO (5마리 수컷 및 5마리 암컷)일 수 있다. 각각의 동물에게 각각의 RA.1, RA.2, RA.3, 및 RA.4 항체의 IP 용량을 매주 2회 투여할 수 있다. "RA.1 항체"는 "1E5.5.7"에 해당하고, "RA.3 항체"는 "3F4.4.8"에 해당한다. "RA.2 항체"는 "4B6.9.7"에 해당하는 반면, "RA.4 항체"는 "2C7.3.7"에 해당한다 (제넨테크, 인크., DR6에 결합하지만, 기능-차단성이 아닌 항체). "RA.5 항체"는 "3B11.7.7"에 해당한다 (제넨테크, 인크., DR6에 결합하지만, DR6 활성을 향상 또는 자극할 수 있는 항체).
RA.1, RA.2, RA.3 및 RA.4 항체를 4℃에서 저장할 수 있다. 이들 항체는 필요한 경우에 투여하기 전에 실온으로 가온될 수 있다. 전형적인 비히클, 예를 들어 PBS가 사용될 수 있다. 본 실시예에서 RA.1, RA.2, RA.3, 및 RA.4 모노클로날 항체는 면역원으로서 인간 DR6 폴리펩티드 서열을 사용하여 생성되지만, 이들 모든 항체는 실시예 7에 설명된 축삭 변성 및 세포자멸 분석과 같은 프로토콜에 의해 보이는 바와 같이 인간뿐만 아니라 래트 및 마우스 DR6과 반응한다.
하나의 예시적인 실시태양에서, 평가된 DR6 길항제는 길항제 항체, 즉 RA.1, RA.2, RA.3 및 RA.4일 수 있고; 항체당 처리군의 수는 2일 수 있고 (군 당 10마리의 동물); 투여 경로는 IP일 수 있고; 및 용량 범위는 5 내지 20 mg/kg일 수 있다. 임의로, 군은 다음과 같을 수 있다: (1) RA.1: 5 mg/kg IP; (2) RA.1: 20 mg/kg IP; (3) RA.2: 5 mg/kg IP; (4) RA.2: 20 mg/kg IP; (5) RA.3: 5 mg/kg IP; (6) RA.3: 20 mg/kg IP; (7) RA.4: 5 mg/kg IP; (8) RA.4: 20 mg/kg IP; 및 (9) 비히클 (PBS) IP. 본 프로토콜에서, 마우스의 체중을 매일 잴 수 있다. 출생 다음 (PND) 10, 12 및 14일에, 한배 새끼 내의 각각의 새끼의 체중을 잴 수 있다. PND 6, 8, 10, 12, 14 및 16일에, 연구에서 각각의 동물에 대해 근긴장 평가를 수행할 수 있다 (예를 들어, 아래 제공된 예시적인 표현형결정 프로토콜 참조).
출생일에 (P0), 새끼에게 피부 아래에 무독성 잉크를 적용하여 문신을 할 수 있고, 유전자형 결정을 위해 절단된 꼬리 샘플을 취한다 (결과는 보통 48 hr 이내에 이용가능하다). 실험일 (P3)에, 신생동물과 함께 어미를 매일 동시에 실험실에 보내고, 시험을 시작하기 전에 적어도 10 min 동안 방해하지 않고 두었다. 새끼를 먼저 주지성 시험으로, 이어서 관 (tube) 시험으로 시험할 수 있다 (관 시험에 대해 2회 연속 시험). 새끼는 한배 새끼의 모든 새끼를 시험할 때까지 열 패드 상에 놓을 수 있고, 그 후, 모든 새끼를 어미에게 되돌려보낼 수 있다 (취급 후 어미에 의한 거부를 최소화하기 위해 새끼에게 깔짚을 섞을 수 있다). 생존 및 체중을 출 생부터 이유기까지 매일 검토할 수 있다. 신생동물 축 (axial) 체온에 대한 약물의 효과는 보통 이전에 수행된 만성 MTD 연구 동안 평가된다. 체온: 축 체온의 하나의 판독치는 명시된 연령에서 취할 수 있다.
시험군 및 대조군 내의 마우스를 주지성을 비롯한 검사 프로토콜에 의해 차이에 대해 검사할 수 있다. 주지성은 경사진 플랫폼 상에서 얼굴을 아래로 하여 놓았을 때 방향을 맞추는 동물의 능력을 시험한다. 상기 시험은 운동 협응 및 전정계 (vestibular system)을 측정한다.
생존 평가는 사후 검정 (post-hoc)으로서 Mantel-Cox를 사용한 Kaplan-Meier 분석을 이용하여 수행할 수 있다.
시간에 따른 반복 측정치를 갖는 데이타를 분석하기 위해, 혼합 효과 (Mixed Effects) 모델 (혼합 ANOVA 모델로도 알려짐)을 사용할 수 있다. 상기 방법은 전형적인 반복된-측정 ANOVA 분석에서와 같이 적률 (moment) 추정보다는 우도 (likelihood) 추정에 기초하지만, 이는 시간에 따른 마우스 사망률로 인한 분실값에 대해 보다 더 안정하다. 모든 모델은 SAS 9.1.3. (에스에이에스 인스티튜트 (SAS Institute, 미국 뉴욕주 캐리)) 내의 PROC MIXED 절차를 사용하여 피팅(fitting)될 수 있다. 처리는 모델에서 가장 중요한 인자이다. 성별 및 일수뿐만 아니라 처리와 그의 상호작용도 고려할 수 있다.
연구 종점은 사망일 수 있다.
동물을 실시예 14에 설명된 것과 같은 방법, 예를 들어 조직학적 분석에 의해 추가로 평가할 수 있다. 또한, RA.1, RA.2, RA.3 및 RA.4 혈청 농도를 결정하 기 위해 혈청/혈액을 평가할 수 있다.
물질의 기탁
다음 물질을 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 20110-2209 버지니아주 매나싸스 10801 유니버시티 불리바드; ATCC)에 기탁하였다:
물질 ATCC 기탁 번호 기탁일
3F4.4.8 PTA-8095 2006년 12월 21일
4B6.9.7 PTA-8094 2006년 12월 21일
1E5.5.7 PTA-8096 2006년 12월 21일
상기 기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 (Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder; 부다페스트 조약)의 규정 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존가능한 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 규정 하에 ATCC로부터 이용가능할 것이고, 제넨테크, 인크.와 ATCC 사이의 협정에 따르고, 이는 관련 미국 특허의 발행 시에 또는 임의의 미국 또는 외국 특허 출원의 공개 시에 (어느 것이든 선행일에) 공공에 대한 기탁물의 배양물의 자손체의 영구적이고 비제한적인 이용가능성을 보장하고, 미국 특허청장 (U.S. Commissioner of Patents and Trademarks)이 35 USC '122 및 그에 따른 청장 규칙 (886 OG 638을 특히 참조한 37 CFR '1.14 포함)에 따라 자격이 주어진 것으로 결정한 사람에게 자손체의 이용가능성을 보장한다.
본원의 양수인은 기탁 중인 물질의 배양물이 적합한 조건 하에 배양될 때 사멸 또는 상실 또는 파괴될 경우에, 물질을 통지시에 동일한 다른 배양물로 신속하게 교체할 것임을 동의하였다. 기탁된 물질의 이용가능성은 해당 특허법에 따라 임의의 정부의 권한 하에 승인된 권리에 위반하여 본 발명을 실시할 권한으로서 해석되어서는 안 된다.
상기 기술된 설명은 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 간주된다. 본 발명은 본원에 제시된 실시예에 의한 범위 내에 제한되지 않아야 한다. 실제로, 본원에 나타내고 설명된 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형이 상기 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백해질 것이고, 첨부된 청구의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Anatoly J. Nikolaev Marc Tessier-Lavigne <120> DR6 ANTIBODIES INHIBITING THE BINDING OF DR6 TO APP, AND USES THEREOF IN TREATING NEUROLOGICAL DISORDERS <130> P2417R1 <140> 60/871528 <141> 2006-12-22 <140> 60/900848 <141> 2007-02-12 <160> 15 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 655 <212> PRT <213> human "Death Receptor 6" <400> 1 Met Gly Thr Ser Pro Ser Ser Ser Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ile Ala Arg Arg Ala Thr Ala Thr Met Ile Ala Gly Ser Leu Leu Leu 20 25 30 Leu Gly Phe Leu Ser Thr Thr Thr Ala Gln Pro Glu Gln Lys Ala Ser 35 40 45 Asn Leu Ile Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Ala Thr Gly Gln Val 50 55 60 Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys 65 70 75 80 Thr Asn Thr Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Val Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Arg His Glu Asn Gly Ile Glu Lys Cys His Asp Cys Ser Gln Pro 100 105 110 Cys Pro Trp Pro Met Ile Glu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Leu Thr Asp 115 120 125 Arg Glu Cys Thr Cys Pro Pro Gly Met Phe Gln Ser Asn Ala Thr Cys 130 135 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Thr Val Pro Asp Asn Thr Ser Ser Thr Ser Gly Lys Glu Gly Thr 275 280 285 Asn Arg Thr Leu Pro Asn Pro Pro Gln Val Thr His Gln Gln Ala Pro 290 295 300 His His Arg His Ile Leu Lys Leu Leu Pro Ser Ser Met Glu Ala Thr 305 310 315 320 Gly Glu Lys Ser Ser Thr Ala Ile Lys Ala Pro Lys Arg Gly His Pro 325 330 335 Arg Gln Asn Ala His Lys His Phe Asp Ile Asn Glu His 340 345 <210> 15 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mus musculis <400> 15 Met Gly Thr Arg Ala Ser Ser Ile Thr Ala Leu Ala Ser Cys Ser Arg 1 5 10 15 Thr Ala Gly Gln Val Gly Ala Thr Met Val Ala Gly Ser Leu Leu Leu 20 25 30 Leu Gly Phe Leu Ser Thr Ile Thr Ala Gln Pro Glu Gln Lys Thr Leu 35 40 45 Ser Leu Pro Gly Thr Tyr Arg His Val Asp Arg Thr Thr Gly Gln Val 50 55 60 Leu Thr Cys Asp Lys Cys Pro Ala Gly Thr Tyr Val Ser Glu His Cys 65 70 75 80 Thr Asn Met Ser Leu Arg Val Cys Ser Ser Cys Pro Ala Gly Thr Phe 85 90 95 Thr Arg His Glu Asn Gly Ile Glu Arg Cys His Asp Cys Ser Gln Pro 100 105 110 Cys Pro Trp Pro Met Ile Glu 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Ile Lys Ala Pro Lys Arg Gly His Pro 325 330 335 Arg Gln Asn Ala His Lys His Phe Asp Ile Asn Glu His His His His 340 345 350 His His

Claims (65)

  1. 사멸 수용체 6 (DR6) 폴리펩티드 및/또는 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 폴리펩티드를 APP에 대한 DR6의 결합이 억제되는 조건 하에 하나 이상의 DR6 길항제에 노출시키는 것을 포함하는, APP에 대한 DR6의 결합을 억제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 DR6 길항제가 DR6에 결합하는 항체, 서열 1의 아미노산 1-354를 포함하는 가용성 DR6 폴리펩티드, 및 APP에 결합하는 항체 중에서 선택되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 가용성 DR6 폴리펩티드가 DR6 면역어드헤신을 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 가용성 DR6 폴리펩티드가 면역글로불린의 Fc 구역에 융합된 DR6 세포외 도메인 서열을 포함하는 것인 방법.
  5. 제2항에 있어서, DR6에 결합하는 상기 항체가 도 1의 아미노산 1-349 또는 42-349 (서열 1)을 포함하는 DR6 폴리펩티드에 결합하는 것인 방법.
  6. 제2항에 있어서, DR6에 결합하는 상기 항체가 키메라, 인간화 또는 인간 항 체인 방법.
  7. 제2항에 있어서, DR6에 결합하는 상기 항체가 각각 ATCC 기탁 번호 PTA-8095, PTA-8094 또는 PTA-8096으로서 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7 모노클로날 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것인 방법.
  8. 제2항에 있어서, DR6에 결합하는 상기 항체 또는 가용성 DR6 폴리펩티드가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 비-단백질성 중합체에 연결되는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, APP에 결합하는 상기 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  10. 제9항에 있어서, APP에 결합하는 상기 모노클로날 항체가 키메라, 인간화 또는 인간 항체인 방법.
  11. 제9항에 있어서, APP에 결합하는 상기 모노클로날 항체가 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, APP에 결합하는 상기 항체가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로 필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 비-단백질성 중합체에 연결되는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 DR6 폴리펩티드가 하나 이상의 포유동물 세포의 세포 표면 상에 발현되고, 상기 하나 이상의 DR6 길항제의 결합이 DR6 활성화 또는 신호 전달을 억제하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, DR6을 발현하는 하나 이상의 포유동물 세포에서 세포자멸을 억제하도록 시험관 내에서 수행되는 방법.
  15. 제13항에 있어서, DR6을 발현하는 하나 이상의 포유동물 세포에서 세포자멸을 억제하도록 생체 내에서 수행되는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 세포 표면 상에서 발현되는 DR6 폴리펩티드를 갖는 하나 이상의 포유동물 세포 중 적어도 하나가 연합 뉴런 세포, 감각 뉴런 세포 또는 운동 뉴런 세포인 방법.
  17. 제13항에 있어서, 신경학적 병태 또는 질환을 갖는 포유동물에서 생체 내에서 수행되는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 신경학적 병태 또는 질환이 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨 (Parkinson) 병, 헌팅턴 (Huntington) 병 또는 알츠하이머 (Alzheimer) 병인 방법.
  19. 제17항에 있어서, 신경학적 병태 또는 질환이 뇌졸중에 의한 뉴런 세포 또는 조직 손상, 뇌 또는 척수 조직에 대한 외상, 또는 뉴런 조직 내의 병변을 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 DR6 길항제 중 적어도 하나가 서열 6의 아미노산 66-81을 포함하는 APP 폴리펩티드에 대한 DR6의 결합을 억제하는 것인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 DR6 길항제 중 적어도 하나가 서열 1의 아미노산 1-655를 포함하는 DR6 폴리펩티드에 대한 APP의 결합을 억제하는 것인 방법.
  22. 신경학적 병태 또는 질환에 걸린 포유동물에게 유효량의 하나 이상의 DR6 길항제를 투여하는 것을 포함하는, 상기 신경학적 병태 또는 질환에 걸린 포유동물을 치료하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 DR6 길항제가 DR6에 결합하는 항체, 서 열 1의 아미노산 1-354를 포함하는 가용성 DR6 폴리펩티드, 및 APP에 결합하는 항체 중에서 선택되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 가용성 DR6 폴리펩티드가 DR6 면역어드헤신을 포함하는 것인 방법.
  25. 제23항에 있어서, 가용성 DR6 폴리펩티드가 면역글로불린의 Fc 구역에 융합된 DR6 세포외 도메인 서열을 포함하는 것인 방법.
  26. 제23항에 있어서, DR6에 결합하는 상기 항체가 도 1의 아미노산 1-349 또는 42-349 (서열 1)를 포함하는 DR6 폴리펩티드에 결합하는 것인 방법.
  27. 제23항에 있어서, DR6에 결합하는 상기 항체가 키메라, 인간화 또는 인간 항체인 방법.
  28. 제23항에 있어서, DR6에 결합하는 상기 항체가 각각 ATCC 기탁 번호 PTA-8095, PTA-8094 또는 PTA-8096으로서 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7 모노클로날 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것인 방법.
  29. 제23항에 있어서, DR6에 결합하는 항체 또는 가용성 DR6 폴리펩티드가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 비-단백질성 중합체에 연결되는 것인 방법.
  30. 제22항에 있어서, APP에 결합하는 상기 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  31. 제30항에 있어서, APP에 결합하는 상기 모노클로날 항체가 키메라, 인간화 또는 인간 항체인 방법.
  32. 제30항에 있어서, APP에 결합하는 상기 모노클로날 항체가 모노클로날 항체 22C11의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것인 방법.
  33. 제30항에 있어서, APP에 결합하는 상기 모노클로날 항체가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 비-단백질성 중합체에 연결되는 것인 방법.
  34. 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 DR6 길항제 중 적어도 하나가 서열 6의 아미노산 66-81을 포함하는 APP 폴리펩티드에 대한 DR6의 결합을 억제하는 것인 방법.
  35. 제22항에 있어서, 상기 하나 이상의 DR6 길항제 중 적어도 하나가 서열 1의 아미노산 1-655를 포함하는 DR6 폴리펩티드에 대한 APP의 결합을 억제하는 것인 방법.
  36. 제22항에 있어서, 신경학적 병태 또는 질환이 근위축성 측삭 경화증, 파킨슨병, 헌팅턴 병 또는 알츠하이머병인 방법.
  37. 제22항에 있어서, 신경학적 병태 또는 질환이 뇌졸중에 의한 뉴런 세포 또는 조직 손상, 뇌 또는 척수 조직에 대한 외상, 또는 뉴런 조직 내의 병변을 포함하는 것인 방법.
  38. 제22항에 있어서, 하나 이상의 추가의 치료제가 상기 포유동물에게 투여되는 것인 방법.
  39. 제22항에 있어서, 하나 이상의 DR6 길항제가 주사, 주입 또는 관류를 통해 포유동물에게 투여되는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 치료제가 NGF, 세포자멸 억제제, EGFR 억제제, β-세크레타제 억제제, γ-세크레타제 억제제, 콜린에스테라제 억제제, 항-Abeta 항체 및 NMDA 수용체 길항제 중에서 선택되는 것인 방법.
  41. 관심있는 분자의 존재 또는 부재 하에 DR6 및 APP를 합하고;
    상기 관심있는 분자의 존재 하에 APP에 대한 DR6의 결합의 억제를 검출하는 것
    을 포함하는, APP에 대한 DR6의 결합을 억제하는 관심있는 분자를 확인하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 관심있는 분자가 APP에 결합하는 항체, DR6에 결합하는 항체 또는 서열 1의 아미노산 1-354를 포함하는 가용성 DR6 폴리펩티드인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 관심있는 분자의 존재 하에 APP에 대한 DR6의 결합의 억제를 검출하는 것을 무세포 분석으로 수행하는 것인 방법.
  44. 제41항에 있어서, 세포 표면 상에서 DR6을 발현하는 포유동물 세포를 사용하여 방법을 수행하고; DR6 활성화 또는 신호 전달의 억제를 검출하는 것을 더 포함하는 방법.
  45. 제40항의 방법에 따라 확인된 관심있는 분자를 함유하는 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 담체를 포함하는 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 담체가 제약상 허용되는 담체인 조성물.
  48. (a) 서열 1을 포함하는 DR6 폴리펩티드에 결합하는 모노클로날 항체 또는 (b) 가용성 DR6 폴리펩티드 또는 (c) 서열 6을 포함하는 APP에 결합하는 모노클로날 항체를 포함하는, DR6에 대한 APP의 결합을 억제하는 단리된 DR6 길항제.
  49. 제48항에 있어서, 가용성 DR6 폴리펩티드가 DR6 면역어드헤신을 포함하는 것인 단리된 DR6 길항제.
  50. 제49항에 있어서, 가용성 DR6 폴리펩티드가 면역글로불린의 Fc 구역에 융합된 DR6 세포외 도메인 서열을 포함하는 것인 단리된 DR6 길항제.
  51. 제48항에 있어서, DR6에 결합하는 상기 항체가 도 1의 아미노산 1-349 또는 42-349 (서열 1)를 포함하는 DR6 폴리펩티드에 결합하는 것인 단리된 DR6 길항제.
  52. 제48항에 있어서, DR6에 결합하는 상기 항체가 키메라, 인간화 또는 인간 항체인 단리된 DR6 길항제.
  53. 제48항에 있어서, DR6에 결합하는 상기 항체가 각각 ATCC 기탁 번호 PTA-8095, PTA-8094 또는 PTA-8096으로서 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 3F4.4.8, 4B6.9.7 또는 1E5.5.7 모노클로날 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것인 단리된 DR6 길항제.
  54. 제48항에 있어서, DR6에 결합하는 상기 항체 또는 가용성 DR6 폴리펩티드가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어지는 군 중에서 선택된 하나 이상의 비-단백질성 중합체에 연결되는 것인 단리된 DR6 길항제.
  55. 제48항에 있어서, 서열 6의 아미노산 66-81을 포함하는 APP 폴리펩티드에 대한 DR6의 결합을 억제하는 단리된 DR6 길항제.
  56. 제48항에 있어서, APP에 대한 DR6의 결합을 입체 억제에 의해 억제하는 에피토프에 결합하는 단리된 DR6 길항제.
  57. 제48항에 있어서, APP에 결합하는 상기 모노클로날 항체가 키메라, 인간화 또는 인간 항체인 단리된 DR6 길항제.
  58. 제48항에 있어서, APP에 결합하는 상기 항체가 22C11 모노클로날 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것인 단리된 DR6 길항제.
  59. 제48항에 있어서, APP에 결합하는 상기 항체가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로 필렌 글리콜 및 폴리옥시알킬렌으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 비-단백질성 중합체에 연결되는 것인 단리된 DR6 길항제.
  60. 제48항에 있어서, 상기 길항제가 서열 6의 아미노산 66-81을 포함하는 APP 폴리펩티드에 대한 DR6의 결합을 억제하는 것인 단리된 DR6 길항제.
  61. 제47항 내지 60항 중 어느 한 항의 DR6 길항제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  62. 신경학적 질환이 존재하거나 또는 신경학적 질환에 걸리기 쉬운 환자로부터 샘플을 얻고, 서열 1의 DR6 폴리펩티드 서열과 상이한 폴리펩티드 서열을 갖는 DR6 폴리펩티드 변이체의 존재에 대해 샘플을 시험하는 것을 포함하는, 상기 신경학적 질환이 존재하거나 또는 신경학적 질환에 걸리기 쉬운 환자를 진단하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 폴리펩티드 변이체를, 서열 1의 DR6 폴리펩티드 서열에 대해 관찰된 친화도와 상이한 APP 폴리펩티드에 대한 친화도를 갖는 것으로서 확인하는 것을 더 포함하는 방법.
  64. (a) 유효량의 제47항 내지 60항 중 어느 한 항의 DR6 길항제를 포함하는 조성물;
    (b) 상기 조성물을 함유하는 용기; 및
    (c) 신경학적 병태 또는 질환의 치료에서 상기 DR6 길항제의 사용을 위한 사용설명서를 제공하는, 상기 용기 상에 고정된 라벨, 또는 상기 용기 내에 포함된 포장 삽입물
    을 포함하는 제품.
  65. 제1 용기, 상기 용기 상의 라벨, 및 상기 용기 내에 함유된 조성물; 제약상 허용되는 버퍼를 포함하는 제2 용기; 및 적어도 하나의 종류의 포유동물 뉴런 세포에서 세포자멸을 억제하기 위해 DR6 길항제를 사용하기 위한 사용설명서를 포함하고,
    상기 조성물이 적어도 하나의 종류의 포유동물 뉴런 세포에서 세포자멸을 억제하는데 효과적인 활성제를 포함하고, 상기 용기 상의 라벨, 또는 상기 용기 내에 포함된 포장 삽입물은 조성물이 적어도 하나의 종류의 포유동물 뉴런 세포에서 세포자멸을 억제하기 위해 사용될 수 있음을 나타내고, 상기 조성물 내의 활성제는 제47항 내지 60항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 DR6 길항제를 포함하는 것인 키트.
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