KR102351126B1

KR102351126B1 - App 및 mdga1 단백질 상호작용 억제제를 포함하는 약학적 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR102351126B1
Application number: KR1020190159350A
Authority: KR
Inventors: 고재원; 배성원; 엄지원; 김승준; 은종민
Original assignee: 재단법인대구경북과학기술원
Priority date: 2019-12-03
Filing date: 2019-12-03
Publication date: 2022-01-13
Also published as: KR20210069472A

Abstract

APP 및 MDGA1 단백질 상호작용 억제제를 포함하는 약학적 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것으로, APP 및 MDGA1의 단백질 상호작용에 대한 억제제는 뇌신경계 질환 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, 이러한 상호작용을 스크리닝하는 방법을 통해 뇌신경계 질환 치료제를 효율적으로 발굴할 수 있다.

Description

APP 및 MDGA1 단백질 상호작용 억제제를 포함하는 약학적 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법{Pharmaceutical composition comprising APP and MDGA1 interaction inhibitor and screening method using the same}

APP 및 MDGA1 단백질 상호작용 억제제를 포함하는 약학적 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법에 관한 것이다.

단백질-단백질 상호작용(Protein-protein interaction, 이하 PPI)은 최근 들어 매우 주목 받고 있다. 생체 내의 거의 모든 생리작용이 단백질의 상호작용으로 일어나기 때문이다. 특히 저분자량 물질로 이러한 상호작용을 조절한다면 새로운 약물 분자의 개발로도 이어질 수 있다. 이러한 가능성에도 불구하고 단백질의 상호작용을 밝히는 어려움 때문에 제약산업에서 도외시 되었으나, 최근에 이르러 High-throughput screening (HTS) 기술 등의 발전으로 인해 단백질 간의 상호작용 분석이 각광 받고 있다.

고령화 사회의 진행과 함께 뇌신경계 질환이 점차 증가하고 있는 추세이다. 예를 들어, 우리나라의 치매 환자 수는 2012년 54만 명에서 2030년 127만 명, 2050년에는 약 271만 명으로 매 20년마다 약 2배씩 증가할 것으로 추정되고 있다. 또한, 통계청의 2013년 사망원인과 사망률의 분석에 따르면, 뇌혈관질환이 암에 이어 국내 중년층 및 노년층의 사망원인 2위를 차지한다. 이처럼 빠르게 고령화가 진행되고 있는 상황에서 뇌신경계 질환은 국민의 불안감을 초래하는 사회문제로 부각되었으며, 이로 인한 사회경제적 비용도 매년 가중되고 있다.

이러한 기술적 배경 하에서, 뇌신경계 질환을 예방하거나 치료하기 위한 다각적인 연구가 진행되고 있으나(한국 등록특허 제10-0644773호), 아직은 미비한 실정이다.

일 양상은 APP(amyloid precursor protein) 및 MDGA1(MAM Domain Containing Glycosylphosphatidylinositol Anchor 1) 단백질 상호작용 억제제를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 APP 및 MDGA1 단백질의 상호작용을 이용한 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 APP(amyloid precursor protein) 및 MDGA1(MAM Domain Containing Glycosylphosphatidylinositol Anchor 1) 단백질 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 "MDGA1"은 "MDGA1 단백질" 및 "MDGA1 폴리펩타이드"와 상호 교환하여 사용할 수 있으며, 신경계에서 주로 발현되는 글리코실포스파티딜이노시톨-장착된 (glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored) 세포 표면 당단백질일 수 있다. 상기 MDGA1은 세포의 부착, 이동 등에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 MDGA1은 여러 세포 부착 분자-유사 도메인(cell adhesion molecule-like domain)을 가질 수 있으며, 성숙 단백질은 6 개의 Ig 도메인, fnIII 도메인, 및 MAM 도메인을 포함할 수 있다. 상기 단백질 상호작용은 MDGA1의 MAM 도메인에서 일어나는 것일 수 있다.

상기 "APP"는 "APP 단백질" 및 "APP 폴리펩타이드"와 상호 교환하여 사용될 수 있으며, 많은 조직에서 발현되고 뉴런의 시냅스에 농축되어 있는 인 내재성 막 단백질(integral membrane protein)이다. 상기 APP는 시냅스 형성, 신경 가소성, 항미생물 활성, 또는 철 배출의 조절에 관여하는 것일 수 있다. 상기 APP는 베타 아밀로이드(Aβ)를 생성하는 전구체 단백질이므로, 특히 알츠하이머 질환과 연관되어 있다는 것이 알려져 있다. 상기 APP 단백질은 GFLD 및 CuBD를 포함한 E1 도메인, Ex 및 ACID를 포함한 플렉서블 도메인(Flexible domain) 및 E2 도메인을 포함할 수 있다. 상기 단백질 상호작용은 APP의 익스텐션(extension) 도메인에서 일어나는 것일 수 있다.

특히, 상기 MDGA1은 기존 전장 유전체 시퀀싱 (genome-wide sequencing)을 통해 조현병 및 양극성 장애와 연관성이 높다는 것이 알려졌으며 (Kahler et al., 2008; Li et al., 2011), 상기 APP는 알츠하이머성 치매뿐만 아니라 자폐증과의 연관성이 최근 보고되었으므로 (Sokol et al., 2019), 상기 상호작용 억제제는 이러한 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

상기 "상호작용 억제제"는 APP 또는 MDGA1에 특이적으로 결합하는 펩타이드, 펩타이드 미메틱스, 융합 단백질, 앱타머, 항원-결합 단편, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 "펩타이드"는 임의의 정수인 9 내지 30 개의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 정수는 9, 17, 또는 24일 수 있다. 상기 펩타이드는 APP(amyloid precursor protein)에서 유래된 것일 수 있다.

상기 펩타이드의 합성은 펩타이드 화학(peptide chemistry)에서 일반적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있다. 일반적인 합성 방법은 "Peptide Synthesis", Interscience, New York, 1966; "The Proteins", Vol. 2, Academic Press Inc., New York, 1976; "Peptide Synthesis(Peptide Gosei)", Maruzen, 1975; "Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis(Peptide Gosei no Kiso to Jikken)", Maruzen, 1985; 및 "The sequel of Development of Pharmaceuticals(Zoku Iyakuhin no Kaihatsu)", Vol. 14, Peptide Synthesis(Peptide Gosei), Hirokawa Shoten, 1991과 같은 문헌, 및 국제공개 번호 WO 99/67288와 같은 국제공개특허에 기재되었다. 또한, 상기 펩타이드는 알려진 유전 공학 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 상기 펩타이드를 암호화하고 있는 DNA가 삽입된 벡터는 형질전환된 세포(transformed cells)를 생산하기 위해 적합한 숙주 세포에 도입(introduced into)될 수 있고, 이렇게 형질전환된 세포들에서 생산되는 펩타이드들을 수집함으로써 상기 펩타이드를 얻을 수 있다. 또한, 일 구체예에 따른 펩타이드는 적절한 프로테아제(protease)를 이용해 잘리는 융합 단백질(fusion protein)의 형태로서 만들어질 수 있다. 이들은 그 자체로서 조성물에 사용될 수도 있다.

상기 융합 단백질을 제조하기 위한 방법으로, 상기 펩타이드를 암호화하고 있는 폴리뉴클레오티드는 다른 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 프레임(frame)에 연결(ligate)될 수 있으며, 이것은 숙주(host)에서의 발현(expression)을 위해 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 당업계에 알려진 기술들은 이런 목적을 위해 이용될 수 있다. 상기 펩타이드와 융합된 펩타이드를 위해, FLAG(Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210), 6개의 히스티딘(His)으로 이루어진 6x His 잔기들(residues), 10x His, influenza hemagglutinin(HA), 인간 c-myc 단편, VSV-GP 단편, p18HIV 단편(fragments), T7-태그(tag), HSV-태그, E-태그, SV40T 항원 단편, lck 태크, 알파-튜불린(alpha-tubulin) 단편, B-태그, 및 Protein C 단편과 같이 알려진 펩타이드를 사용할 수 있다. 또한, 융합 단백질을 만들기 위해 상기 펩타이드를 글루타치온-S-트랜스퍼라아제(glutathione-S-transferase, GST), influenza hemagglutinin(HA), immunoglobulin constant regions, 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 또는 말토즈-결합 단백질(maltose-binding protein, MBP) 등을 연결하는 것이 가능하다.

따라서, 다른 구체예에 있어서, 상기 펩타이드를 암호화 하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터, 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포가 제공될 수 있다.

상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 또는 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 재조합 벡터에서 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우, 상기 재조합 벡터는 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우, 상기 재조합 벡터는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점으로 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 또는 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 또는 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 가질 수 있다.

상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서, 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포라도 이용될 수 있다. 예를 들어, 원핵 세포는 E. coliJM109, E. coliBL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 또는 다양한 슈도모나스와 같은 장내균과 균주 등이 있다. 예를 들어, 진핵 세포로 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 또는 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.

상기 펩타이드는 화학적 안정성 개선, 약동학적 또는 약리학적 프로파일 (반감기, 흡수성, 역가, 효능 등) 개선, 변경된 특이성 (예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성, 타겟 부위로의 수송 등을 획득하기 위한 특정한 변형을 포함할 수 있다. 상기 펩타이드는 특정한 위치에서 페길화, 시알릴화, 글리코실화, 데글리코실화, 아미노산 삽입, 결실, 또는 치환과 같은 변형, 덱스트란 접합, 카르복시메틸-덱스트란 (carboxymethyl-dextran: CM-dex) 접합, 디에틸아미노에틸-덱스트란 (diethylaminoethyl-dextran: DEAE-dex) 접합 및 고리화로부터 선택된 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형될 수 있으며, 수용체-매개 엔토시토시스에 대한 친화성의 개선을 위해 갈락토오스 또는 만노오스가 접합될 수 있다. 상기 펩타이드는 선택적으로, 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 용어 "항체"는 단일클론 항체, 키메라 항체, 다클론 항체, 인간화 항체, 인간 항체를 포함하며, 신규 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지되거나 시판되는 항체들도 포함한다. 상기 항체는 2 개의 중쇄와 2 개의 경쇄를 포함하는 전체 길이의 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편은 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 여기에는 Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등이 포함될 수 있다.

상기 용어 "앱타머(Aptamer)"는 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)을 의미한다.

상기 뇌신경계 질환은 퇴행성 뇌질환 또는 정신 질환을 포함하는 것일 수 있다.

상기 용어 "퇴행성 뇌질환"은 신경 퇴행성 질환은 노화가 진행됨에 따라 뇌조직 또는 뇌세포의 구조 또는 기능이 퇴화되어 발생하는 질병을 의미할 수 있다. 상기 퇴행성 뇌질환은 뇌졸중, 인지기능 장애, 알츠하이머 치매 (Alzheimer`s disease), 루이체 치매 (Dementia with Lewy bodies), 전측두엽 치매 (frontotemporal dementia), 파킨슨병 (Parkinson`s disease), 크로이츠펠트-야곱병 (Creutzfeldt-Jakob disase; CJD), 헌팅톤병 (Huntington`s disase), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 길리안-바레 증후군 (Gillain-Barre Syndrome; GBS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 정신 질환은 MDGA1 또는 APP와 연관된 모든 정신 질환을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 정신 질환의 예는 양극성 장애, 자폐증, 우울증, 과잉 행동, 주의력 결핍, 자폐증, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 불안 장애, 수면 장애, 공황 장애, 지능 장애, 기억력 저하, 약물 중독, 조현병, 강박증, 과대망상, 성격장애, 알코올중독, 및 조울증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "예방하는" 또는 "예방"은 질환을 예방하는 것, 예를 들어 질환, 병태 또는 장애의 성향이 있을 수 있지만 질환의 병리 또는 징후를 아직 경험하지 않았거나 나타내지 않는 개체에서 질환, 병태 또는 장애를 예방하는 것을 말한다.

용어 "치료하는" 또는 "치료"는 질환을 저해하는 것, 예를 들어, 질환, 병태 또는 장애의 병리 또는 징후를 경험하거나 또는 나타내는 개체에서 질환, 병태 또는 장애를 저해하는 것 즉, 병리 및/또는 징후의 추가적인 발생을 막는 것, 또는 질환을 개선시키는 것, 예를 들어, 질환, 병태 또는 장애의 병리 또는 징후를 경험하거나 또는 나타내는 개체에서 질환, 병태 또는 장애를 개선시키는 것 즉, 병리 및/또는 징후를 반전시키는 것, 예컨대 질환 중증도를 감소시키는 것을 말한다.

상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 화합물의 무기 또는 유기산 부가염을 말한다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 염일 수 있다. 상기 무기산염은 염산염, 브롬산염, 인산염, 황산염, 또는 이황산염일 수 있다. 상기 유기산염은 포름산염, 초산염, 아세트산염, 프로피온산염, 젖산염, 옥살산염, 주석산염, 말산염, 말레인산염, 구연산염, 푸마르산염, 베실산염, 캠실산염, 에디실염, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산염, 벤조산염, 글루콘산염, 메탄술폰산염, 글리콜산염, 숙신산염, 4-톨루엔술폰산염, 갈룩투론산염, 엠본산염, 글루탐산염, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 또는 아스파르트산염일 수 있다. 상기 금속염은 칼슘염, 나트륨염, 마그네슘염, 스트론튬염, 또는 칼륨염일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미일 수 있다. 상기 담체는 아미노산 서열의 물리적 및 화학적 불안정성을 상쇄하기 위한 안정화제일 수 있다. 상기 담체는 단백질, 탄수화물, 시클로덱스트린, 계면활성제, 폴리히드록실화 알코올, 항산화제, 킬레이트화제 또는 무기염일 수 있다. 상기 단백질은 알부민 또는 젤라틴일 수 있다. 상기 탄수화물은 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 락툴로오스, 소르비톨, 말토오스, 덱스트란, 글리세롤, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 트레할로오스, 또는 전분을 포함할 수 있다. 상기 시클로덱스트린은 6, 7 및 8개의 당으로 구성되어 있을 수 있으며, 디메틸, 히드록시프로필 또는 술포부틸에테르로 치환된 것일 수 있다. 상기 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 폴록사머 407 및 폴록사머 188 중 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 폴리히드록실화 알코올은 폴리에틸렌 글리콜 PEG 400, 600, 1000, 1500, 4000, 6000, 8000을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 항산화제는 부틸화된 히드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene: BHT), 부틸화된 히드록시아니솔(butylated hydroxyanisole: BHA), 프로필 갈레이트, 비타민 E, 아스코르브산, 백금, 카탈라제, 소듐 티오술페이트 또는 소듐 술피트를 포함할 수 있다. 상기 킬레이트화제는 철, 구리, 칼슘, 망간, 아연 성분을 포함하는 것일 수 있으며, 디소듐 에틸렌디아민테트라아세트산(disodium ethylenediaminetetraacetic acid: DSEDTA), 시트르산, 티오글리콜릭산일 수 있다. 상기 담체는 당업자에 의하여 제제화에 따라 적절히 단독으로 또는 조합하여 선택되는 것일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구 투여를 위한 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제일 수 있다. 상기 고형 제제는 부형제를 더 포함할 수 있다. 부형제는 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 또는 젤라틴일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 마그네슘 스테아레이트, 또는 탈크와 같은 윤활제를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 또는 시럽제일 수 있다. 상기 액상 제제는 물, 또는 리퀴드 파라핀을 포함할 수 있다. 상기 액상 제제는 부형제, 습윤제, 감미제, 방향제, 또는 보존제를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 또는 좌제일 수 있다. 비수성용제 또는 현탁제는 식물성 기름 또는 에스테르를 포함할 수 있다. 식물성 기름은 예를 들면, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 또는 올리브 오일일 수 있다. 에스테르는 예를 들면 에틸올레이트일 수 있다. 좌제의 기제는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 또는 글리세로젤라틴일 수 있다.

상기 조성물은 경구로 투여되는 것이 편리할 수 있으나, 펩타이드의 낮은 흡수성, 효소에의 민감성, 빠른 클리어런스 또는 화학적 불안정성 등을 이유로 비경구로 투여될 수 있다. 따라서, 일 실시예에 따른 조성물은 정맥주사 (intravenous injection), 피하주사 (subcutaneous injection), 근육주사 (intramuscular injection), 동맥주사 (Intraarterial Injection), 복강내주사 (intraperitoneal injection), 피내주사 (Intradermal Injection), 또는 골내주사 (Intraosseous infusion)로 투여될 수 있으며, 투여되기 직전에 재구성 (reconstitute)되기 위한 동결건조 형태의 분말일 수 있다. 또한, 상기 투여는 비강, 폐, 협강 (buccal), 흉골, 직장, 질 (vaginal), 안구 (ocular) 또는 경피 (transdermal) 경로로도 일어날 수 있다. 상기 주사 부위 및 깊이는 적절한 생체이용률을 얻기 위하여 허벅지, 복부 또는 팔 등에서 당업자에 의해 적절히 정해질 수 있다. 상기 약학적 조성물은 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있고, 단독으로 또는 다른 약학적 활성 화합물과 함께 투여될 수 있다.

상기 조성물은 바람직한 비경구 전달을 위해 폴리머를 포함할 수 있다. 상기 폴리머는 생체적합성이 있고 합리적인 기계적 강도를 가지는 것으로 당업자에게 적절히 선택되는 것일 수 있다. 상기 폴리머는 생분해성 폴리머 또는 비-생분해성 폴리머일 수 있으며, 상기 생분해성 폴리머는 합성 폴리머 또는 천연 폴리머일 수 있다. 상기 합성 폴리머는 폴리아마이드, 폴리언하이드리드, 폴리에스터, 인(phosphorous)-기반 폴리머, 폴리아세탈, 폴리(시아노 아크릴레이트), 폴리디히드로피란, 폴리오르토에스터, 또는 폴리우레탄일 수 있다. 상기 천연 폴리머는 폴라사카라이드 또는 단백질일 수 있다. 상기 비-생분해성 폴리머는 셀룰로오스 유도체, 실리콘, 에틸 비닐 아세테이트, 폴리비닐 피롤리딘, 폴록사머 또는 폴록사민을 포함할 수 있다. 상기 폴리머는 목적에 따라 단독으로 또는 조합하여 이용될 수 있다.

상기 조성물은 바람직한 비경구 전달을 위해 비경구 전달 시스템을 이용할 수 있다. 상기 비경구 전달 시스템은 마이크로스피어, 이식제, 리포좀, 나노입자, 하이드로겔, 마이크로에멀젼, 나노에멀젼, 및 펌프로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 마이크로스피어 시스템은 스프레이 건조, 더블 에멀전, 상분리-코아세르베이션, 에멀전-탈용매법, 에멀전-열변성, 스프레이 동결건조 중 어느 하나의 방법을 이용하는 것일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 0.005 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 0.01 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 0.05 ㎎/kg 내지 약 50 ㎎/kg, 0.1 ㎎/kg 내지 약 50 ㎎/kg, 0.1 ㎎/kg 내지 약 30 ㎎/kg, 약 0.5 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.5 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내일 수 있다. 또한, 상기 투여는 1 일 1 회, 1 일 2 회, 1 일 3 회, 1 일 4 회, 1 일 6 회, 또는 1 주일에 1 회, 2 주일에 1 회, 3 주일에 1 회, 또는 4 주일에 1 회 또는 1 년에 1 회 투여될 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 그 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

다른 양상은 MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 시료에 피검물질을 접촉시키는 단계; 상기 MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편 간의 결합 수준을 측정하는 단계; 및 상기 결합 수준이 대조군 시료와 비교하여 감소한 시료를 선별하는 단계를 포함하는, MDGA1 단백질 및 APP 단백질 간의 결합을 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 약학적 조성물에 대한 설명에서 언급된 용어 또는 요소 중 이미 언급된 것과 동일한 것은 상술한 바와 같다.

상기 MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편은 인공적으로 합성된 폴리펩타이드일 수 있고, 재조합 미생물 또는 세포로부터 정제된 폴리펩타이드일 수 있다. 상기 MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편은 단리된 단일한 폴리펩티드 형태일 수 있고, 세포로부터 유래된 다른 단백질과 혼합된 형태일 수 있다.

상기 용어 "접촉"은 피검물질이 MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편에 직접적 또는 간접적으로 영향을 줄 수 있는 방식으로 결합하는 것을 의미할 수 있다. 즉, 상기 피검물질을 접촉시키는 단계는 세포 외로 정제된 MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 시료에 피검물질을 첨가함으로써 접촉시키는 것일 수 있고, MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편을 발현하는 세포를 포함하는 시료에 피검물질을 첨가함으로써 접촉시키는 것일 수 있다.

상기 대조군 시료는 피검물질을 접촉시키지 않은 시료, 또는 피검물질을 용해시키기 위해 사용된 용매와 접촉된 시료를 의미하는 것일 수 있다.

상기 스크리닝 방법은 상기 피검물질이 첨가된 시료에서 APP 단백질 또는 이의 단편 및 MDGA1 단백질 또는 이의 단편이 형성한 복합체를 선별하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 복합체의 검출은 당업계 통상의 지식을 가진 자가 공지된 기술을 이용하여 적절히 수행할 수 있다.

상기 시료는 세포 배양물일 수 있고, 상기 MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편은 세포 내에 존재하는 것일 수 있다. 상기 세포는 개체의 조직을 이루는 세포를 의미하는 것일 수 있고, 상기 개체로부터 분리된 세포를 의미하는 것일 수 있다. 상기 MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편이 세포 내에 존재하는 경우, 이는 내재적(endogenous), 외래적(exogenous) 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편이 세포 내에 존재하는 형태인 경우, 이들 각각을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내에서 발현되도록 주입될 수 있다. 상기 단백질 또는 이의 단편이 세포 내에 발현되기 위해, 종래에 당업계에 알려진 방법을 이용할 수 있고, 안정적 또는 일시적으로 세포 내에서 발현되도록 할 수 있다.

상기 MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편은 세포 외에 존재하는 것일 수 있다. 세포 외에 존재하는 MDGA1 및 APP 단백질 또는 이들의 단편은 세포 또는 E. coli 내에 과발현시킨 후 그 용해물로부터 단리된 것, 고체상 또는 액체상의 화학적 합성, 또는 고분자 펩타이드 자동합성기를 이용하여 합성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 MDGA1 및 APP 단백질의 상호작용은 Ca²⁺에 의존하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 시료는 Ca²⁺을 포함하는 것일 수 있다.

상기 MDGA1 단백질 및 APP 단백질 간의 결합을 억제하는 물질은 뇌신경계 질환 치료제일 수 있다. 뇌신경계 질환은 상술한 바와 같다.

상기 결합 수준은 면역침전법(immunoprecipitation), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blotting), tag-단백질 pull down 분석, 단백질 칩(Protein Chip), 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET), 이분자 형광 상보(Bimolecular fluorescence complementation: BiFC) 및 효모 이중혼성(Yeast two-hybrid: Y2H)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 측정되는 것일 수 있으며, 당업자에 의해 용이하게 사용될 수 있는 한 제한되지 않는다.

APP 및 MDGA1 단백질과 이들의 결합은 다양한 뇌신경계 질환과 연관되어 있다. 따라서, 이들의 결합을 억제하는 물질은 뇌신경계 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 결합을 스크리닝하는 방법을 이용하여 APP 및 MDGA1 단백질의 결합을 억제하는 물질을 효율적으로 발굴할 수 있고, 결과적으로 유망한 뇌신경계 질환 치료제를 개발하는데 기여할 수 있다.

도 1은 MDGA1 항체인 JK030과 다양한 시냅스 마커 단백질에 대한 항체를 이용하여 해마 신경배양세포에서의 MDGA1 발현 패턴을 분석한 결과이다.
도 2는 질량 분석을 이용하여 APP 단백질의 서열 일부를 확인한 결과이다.
도 3은 쿠마시 염색을 이용하여 APP 단백질의 크기를 확인한 결과이다.
도 4는 특정 APP 서열에 대한 총 이온 크로마토그램(Total ion chromatogram) 및 추출된 이온크로마토그램(extracted ion chromatogram)의 결과이다.
도 5는 MDGA1 및 MDGA2(MAM Domain Containing Glycosylphosphatidylinositol Anchor 2)가 APP, APLP1, APLP2 및 Nlgn2와 결합하는지 여부를 확인한 표면 라벨링 분석 결과이다.
도 6은 MDGA1 및 MDGA2가 APP, APLP1, APLP2 및 Nlgn2와 결합하는지 여부를 확인한 표면 라벨링 분석 결과를 정량화한 그래프이다.
도 7은 MDGA1 및 MDGA2에 대한 각종 결실 컨스트럭트(deletion construct) 및 이들의 APP 단백질에 대한 결합 여부를 나타낸 것이다.
도 8은 MDGA1의 MAM 도메인과 APP 단백질 간의 결합 친화도를 측정한 결과이다.
도 9는 APP의 익스텐션(extension) 도메인이 MDGA1, MDGA1 Ig1-3 도메인, MDGA1 Ig1-6 도메인, MDGA1 FNIII 도메인, MDGA1 MAM 도메인, MDGA2 또는 GABAb1a에 결합하는지 여부를 확인한 표면 라벨링 분석 결과이다.
도 10은 APP의 익스텐션 도메인이 MDGA1, MDGA1 Ig1-3 도메인, MDGA1 Ig1-6 도메인, MDGA1 FNIII 도메인, MDGA1 MAM 도메인, MDGA2 또는 GABAb1a에 결합하는지 여부를 확인한 표면 라벨링 분석 결과를 정량화한 그래프이다.
도 11은 APP 단백질의 각종 결실 컨스트럭트를 나타낸 것이다.
도 12는 APP 익스텐션 도메인의 서열 일부를 나타낸 것이다. 붉은색 박스는 APP에만 존재하는 서열을 표시한 것이다.
도 13은 MDGA1이 APP의 여러 가지 도메인에 결합하는지 여부를 확인한 표면 라벨링 분석 결과이다.
도 14는 MDGA1이 APP의 여러 가지 도메인에 결합하는지 여부를 확인한 표면 라벨링 분석 결과를 정량화한 그래프이다.
도 15는 MDGA1 및 APP의 결합이 칼슘 의존적인지 확인하기 위한 표면 라벨링 분석 결과이다.
도 16은 MDGA1 및 APP의 결합이 칼슘 의존적인지 확인하기 위한 표면 라벨링 분석 결과를 정량화한 그래프이다.
도 17은 HEK293T 세포, P 14 뇌 시냅토좀, 및 P70 뇌 시냅토좀에서 각각의 단백질이 결합하는지 여부를 확인한 면역 블롯팅 결과이다.
도 18은 APP 익스텐션 도메인 아미노산 서열 중 MDGA1과 결합하는 최소 단위 시퀀스를 결정하기 위한 합성 펩타이드 디자인 개요도이다.
도 19는 APP로부터 디자인된 17mer, 9mer, 8mer, 7mer의 펩타이드가 MDGA1 및 APP의 결합을 저해하는지 여부를 확인한 표면 라벨링 분석 결과이다.
도 20은 APP로부터 디자인된 17mer, 9mer, 8mer, 7mer의 펩타이드가 MDGA1 및 APP의 결합을 저해하는지 여부를 확인한 표면 라벨링 분석 결과를 정량화한 그래프이다.
도 21은 신경 배양세포에서 여러 렌티바이러스를 감염시킨 후 마커 단백질을 이용하여 억제성 시냅스의 구조 변화를 분석한 공초점 현미경 이미지이다.
도 22는 신경 배양세포에서 여러 렌티바이러스를 감염시킨 후 마커 단백질을 이용하여 억제성 시냅스의 구조 변화를 분석한 공초점 현미경 이미지를 활용하여, APP 단백질의 넉다운이 억제성 시냅스에 미치는 영향을 정량적으로 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 억제성 시냅스에서의 MDGA1 단백질 위치 확인

MDGA1 단백질 및 다양한 시냅스 마커 단백질들에 대한 항체를 이용하여 신경세포 내 MDGA1 단백질의 발현분포 및 위치를 분석하였다.

구체적으로, 신경배양세포를 제작한 후 12일 뒤 (DIV 12)에 면역염색실험을 진행하였다. 4 % (w/v) 파라포름알데히드(paraformaldehyde)/4 % (w/v) 수크로오스로 상온에서 상기 신경배양세포 표본을 고정시켰다. 이 후 상기 표본을 인산완충생리식염수 (phosphate-buffered saline: PBS) 중 0.2 % 트리톤 X-100 (Triton X-100) 용액으로 투과 (permeabilization)시켰다. PBS로 2 회 세척한 후 블로킹 용액 (blocking solution)(DMEM, 20 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 4 % 소 혈청 알부민(bovin serum albumin: BSA) 및 1% 말 혈청(Horse serum))에 30분간 담가두었다. 이 후 VGLUT1 (Synaptic Systems, RRID:AB_887880), GAD67 (clone 1G10.2; Millipore, RRID: AB_2278725), 마우스 모노클로날 항-MAP2 (clone HM-2; Sigma)를 MDGA1 항체와 함께 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 뒤 해당 항체들에 대응하는 2차 항체를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 각 이미지를 공초점 현미경 (confocal microscope) LSM700으로 촬영하여 획득하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, MDGA1 항체의 위치는 억제성 시냅스 마커 단백질 (GAD67) 항체의 위치와 일치하는 것으로 보이나, 흥분성 시냅스 마커 단백질 (VGLUT1) 항체의 위치와 일치하지 않는 것으로 나타났다. 또한, MDGA1 단백질은 주로 신경세포 몸체와 수상돌기에서 발현함을 확인할 수 있었다.

실시예 2. MDGA1 단백질과 APP 단백질의 상호작용 확인

2-1. 질량 분석

MDGA1에 추가적으로 결합하는 단백질을 확인하고자 질량 분석에 사용할 MDGA1 재조합 단백질을 분석하였다.

구체적으로, HEK293T 세포에서 MDGA1 재조합 단백질 및 음성 대조군 (negative control)으로써 IgC Empty 벡터를 합성하였다. 각 반응마다 10 μg의 재조합 단백질을 사용하였으며, P14 마우스 P2 용해물 (lysate) 2 mg을 각각 4 ℃로 밤새 반응시켰다. PBS로 3 회 세척한 후 소듐 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulfate: SDS)을 포함한 8 % 폴리아크릴아마이드겔에 전기영동하였다. 이어서 쿠마시 염색 (Coomassie staining)을 하고 밴드 (band)를 확인하였다. 그 후 단백질 크기별로 절단(cut)하고 샘플을 prep하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, APP 단백질의 서열로 TTSTATTTTTTESVEEVVR 및 VESLEQEAANER를 확인하였으며, 도 3에 나타낸 바와 같이, APP 단백질은 100 kDa 크기의 밴드에서 주로 검출된다는 것을 알 수 있었다.

2-2. 총 이온 크로마토그램(total ion chromatogram) 및 추출된 이온 크로마토그램(extracted ion chromatogram) 분석

이온 크로마토 그래피는 액상으로 된 샘플을 이동시키며, 이동 중에 녹는 혼합물을 이온교환수지로 만들어진 분리관 내로 통과시켜 샘플 성분의 용출 상태를 전도도 검출기 또는 공학 검출기로 검출하는 방법이다. 이 실험을 통해 각 단백질의 크기에 따라 잘려진 각각의 샘플을 각각 분석하였다. 만약 MDGA1 재조합 단백질과 상호작용하는 단백질이 있다면, 샘플에 함께 포함되어 있을 것이다. 따라서, 대조군과 비교하여 상대적으로 MDGA1 재조합 단백질 샘플에서 많은 양의 단백질이 검출된다면, 그 단백질은 MDGA1 재조합 단백질과 직간접적으로 상호작용한다는 것을 의미할 수 있다. 이러한 목적으로 총 이온 크로마토그램 및 추출된 이온 크로마토그램 분석을 수행하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 분석 결과로 도출된 APP 단백질의 서열인 TTSTATTTTTTESVEEVVR 및 VESLEQEAANER에 대한 결과를 도시하였으며, 크로마토그램으로 APP 단백질 성분 농도를 측정한 결과를 함께 나타내었다.

2-3. 표면 라벨링 분석

HEK293T 세포를 이용한 표면 라벨링 분석을 통해 MDGA1 단백질이 선택적으로 결합하는 단백질을 확인하고자 하였다.

구체적으로, HA 에피토프(epitope)가 부착된 APP, APLP1, APLP2 발현벡터를 HEK293T 세포주에 트랜스펙션 (Transfection)시켰다. 48 시간 뒤에 재조합 MDGA1 단백질을 10 μg/mL 농도로 상기 트랜스펙션된 HEK293T 세포주에 접촉시켰다. 37 ℃에서 2 시간 동안 반응시킨 후 상온에서 4 % 파라포름알데히드 용액으로 고정시켰다. 그 후 블로킹 용액 (DMEM, 20 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 4 % BSA 및 1 % 말 혈청)으로 상온에서 30 분간 반응시켰다. 이어서 인간 IgG Cy3 항체로 상온에서 1 시간 동안 추가적으로 염색하고, PBS 중 0.2 % 트리톤 X-100으로 상온에서 10 분간 투과시켰다. HA-ms (SC7392) 항체로 1 시간 동안 반응시켜 HEK293T 세포주에서 APP, APLP1, APLP2 단백질 발현을 확인하였다. PBS로 2 회 세척한 후 ms-FITC 항체로 1 시간 반응시킨 다음 샘플을 마운팅(mounting)을 하였다. 각 이미지는 공초점 현미경 LSM700으로 촬영하여 획득하였다.

그 결과, 도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, MDGA1은 APP, APLP2 및 Nlgn2에 선택적으로 결합하고, MDGA2는 Nlgn2에 선택적으로 결합한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. APP 단백질과 결합하는 MDGA1 단백질의 도메인 확인

3-1. MDGA1의 MAM 도메인과 APP 단백질간의 결합 친화성 확인

도 7은 MDGA의 결실 컨스트럭트(deletion construct)를 나타낸 것이다. MDGA1의 어느 도메인이 APP와 결합하는지 확인고자 Scatchard 분석을 수행하였다.

구체적으로, 48 웰 HEK293T 세포에 HA가 부착된 APP를 트랜스펙션시키고 이틀 후 800 nM, 400 nM, 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM 또는 0 nM으로 Ig 태그된 재조합 MDGA1을 접촉시켰다. 이어서, 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션시켰다. 실온에서 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 블로킹 용액 (DMEM, 20 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 4 % BSA 및 1 % 말 혈청)으로 실온에서 30분간 블로킹하였다. HRP-IgG 항체를 1:50,000 기준으로 접촉시킨 후 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. PBS로 3 회 세척한 후 비색(colorimetric)을 위한 효소 면역 분석 (enzyme immunoassay)(Bio-Rad)으로 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) 및 퍼옥시다제 (peroxidase)를 9:1로 섞어서 150 μL를 넣고, 15 분간 인큐베이션하였다. 동일한 양의 0.5 M 황산으로 반응을 중지시킨 후 450 nm 파장대로 측정하였다.

그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, APP 및 MDGA1 간의 Kd 값은 41.3 ± 3.6 nM이라는 것을 확인할 수 있었다.

3-2. 표면 라벨링 분석

APP 재조합 단백질에 결합하는 MDGA1 단백질의 도메인을 결정하고자 표면 라벨링 분석을 수행하였다.

구체적으로, MDGA1 단백질은 6 개의 Ig 도메인 ,fnIII 도메인, MAM 도메인으로 이루어져 있다. 임의적으로 Ig1-3 도메인, Ig4-6 도메인, fnIII 도메인, MAM 도메인으로 나누어 결실 컨스트럭트를 pDisplay 벡터에 클로닝하였다. 제조된 MDGA1 결실 컨스트럭트를 각각 HEK293T 세포에 트랜스펙션시킨 후, 20 mM HEPES pH 7.4, 2 mM CaCl₂, 및 2 mM MgCl₂를 함유하는 DMEM 배지에서, 재조합 IgC 태그된 APP 확장된 (Extended) 단백질을 10 μg/mL 농도로 각 상기 HEK293T 세포에 접촉시켰다. 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하고 실온에서 4 % 파라포름알데히드로 고정시켰다. 블로킹 용액 (DMEM, 20 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 4% BSA 및 1% 말 혈청)으로 실온에서 30 분 동안 블로킹하였다. 1:500 비율로 인간 IgG Cys 항체로 실온에서 1 시간 동안 염색을 수행하였다. 이 후 PBS 중 0.2 % 트리톤 X-100 로 실온에서 10 분간 투과시켰다. HEK293T 세포에 부착되어 있는 APP, APLP1, APLP2를 염색하기 위해, 1:400 HA-ms (SC7392)로 1 시간 동안 염색을 수행하였다. 이 후 PBS로 2 회 세척한 후 ms-FITC를 1:150으로 1 시간 염색하고 마운팅 (Mountaining)하였다. 각 이미지는 공초점 현미경 LSM700으로 촬영하였다.

그 결과, 도 9 및 10에 나타낸 바와 같이, APP 단백질은 MDGA1 단백질에 결합하였으며, 특히 MDGA1 MAM 도메인에만 선택적으로 결합함을 확인할 수 있었다. 이는 MDGA1 단백질이 APP 단백질과 결합하기 위해 MAM 도메인만이 필요함을 나타낸다.

실시예 4. MDGA1 단백질에 결합하는 APP 단백질의 도메인 확인

도 11은 APP의 결실 컨스트럭트를 나타낸다. 또한, 도 12는 APP의 익스텐션(extension) 도메인 서열을 세부적으로 나타낸 것으로, APP에만 존재하는 서열을 붉은 박스로 표시하였다. APP의 다양한 도메인 중 어떠한 도메인이 MDGA1 단백질에 결합하는지 확인하고자 하였다.

구체적으로, APP는 GFLD 및 CuBD를 포함한 E1 도메인, Ex 및 ACID를 포함한 플렉서블 도메인(Flexible domain) 및 E2 도메인을 포함한다. 각 도메인에 따른 결실 컨스트럭트를 제작한 후 pDisplay 벡터에 클로닝하였다. 제조된 APP 결실 컨스트럭트를 각각 HEK293T 세포에 트랜스펙션하였다. 48 시간 후 20 mM HEPES pH 7.4, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂를 함유하는 DMEM 배지에서, 재조합 IgC 태그된 MDGA1 단백질을 10 μg/mL 농도로 각 상기 HEK293T 세포에 접촉시켰다. 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하고 실온에서 4 % 파라포름알데히드로 고정시켰다. 블로킹 용액 (DMEM, 20 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 4 % BSA 및 1 % 말 혈청)으로 실온에서 30 분간 블로킹하였다. 1:500으로 인간 IgG Cys 항체로 실온에서 1 시간 염색을 수행하였다. 이 후 PBS 중 0.2 % 트리톤 X-100으로 실온에서 10 분간 투과시켰다. HEK293T 세포에 부착되어 있는 APP, APLP1, APLP2를 염색하기 위해, 1:400 HA-ms (SC7392)로 1 시간 동안 염색하였다. 이 후 PBS로 2 회 세척하고 ms-FITC를 1:150 비율로 1 시간 염색한 뒤 마운팅하였다. 각 이미지는 공초점 현미경 LSM700으로 촬영하였다.

그 결과, 도 13 및 14에 나타낸 바와 같이, MDGA1 단백질은 APP의 익스텐션 도메인에만 선택적으로 결합함을 확인할 수 있었다. 이는 APP 단백질이 MDGA1 단백질과 결합하기 위해 익스텐션 도메인만이 필요함을 나타낸다.

실시예 5. APP 및 MDGA1 단백질 결합 시 Ca ²⁺ 의존성 확인

칼슘을 킬레이팅하여 제거하는 EGTA를 이용하여 APP 단백질과 MDGA1 단백질 결합 시 칼슘이 필요한지 확인하고자 하였다.

구체적으로, APP 컨스트럭트를 각각 HEK293T 세포에 트랜스펙션시킨다. 48 시간 후 20 mM HEPES pH 7.4, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂을 함유하는 DMEM 배지에서, 재조합 IgC 태그된 MDGA1 단백질을 10 μg/mL 농도로 상기 HEK293T 세포에 접촉시켰다. 이 과정에서 Ca²⁺ 킬레이터인 EGTA를 10 mM 로 함께 처리하였다. 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 실온에서 4 % 파라포름알데히드로 고정시켰다. 블로킹 용액(DMEM, 20 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 4 % BSA 및 1 % 말 혈청)으로 실온에서 30 분간 블로킹하였다. 1:500으로 인간 IgG Cys 항체로 실온에서 1 시간 동안 염색을 수행하였다. 이 후 PBS 중 0.2 % 트리톤 X-100으로 실온에서 10 분간 투과시켰다. HEK293T 세포에 부착되어 있는 APP, APLP1, APLP2를 염색하기 위해, 1:400 HA-ms (SC7392)로 1 시간 동안 염색하였다. 이 후 PBS로 2 회 세척하고 ms-FITC을 1:150으로 1 시간 동안 염색한 후 마운팅하였다. 각 이미지는 공초점 현미경 LSM700으로 촬영하였다.

그 결과, 도 15 및 16에 나타낸 바와 같이, Ca²⁺을 킬레이팅하는 EGTA 첨가에 의해 APP 및 MDGA1의 결합이 선택적으로 저해됨을 확인하였다. 이러한 결과로부터 APP 단백질과 MDGA1 단백질이 Ca²⁺에 의존하여 결합함을 알 수 있었다.

실시예 6. 뇌에서 APP 및 MDGA1 복합체 형성 여부 확인

다양한 뇌신경계 질환이 APP 또는 MDGA1의 문제로 발생한다. 따라서, APP 및 MDGA1 단백질이 뇌 조직에서도 실제로 결합하는지 확인하고자 하였다.

구체적으로, MDGA1 단백질은 실제 마우스 뇌의 해마 (hippocampus)에서 주로 발현되기 때문에, P70 및 P14 마우스에서 시냅토좀 절편 (synaptosomal fractions) prep을 진행하였다. 먼저, 세파로스 A 비드 (sepharose A bead)에 재조합 Ig 태그된 MDGA1 단백질 및 음성 대조군인 IgC empty 벡터를 10 μg으로 2 시간 동안 반응시켰다. 각 단백질이 결합한 세파로스 A 비드를 미리 준비한 1 mg 시냅토좀 절편에 밤새 반응시켰다. PBS로 2 회 세척한 후, 8 % 겔에 로딩하였다. 이 후 APP(22C11), APLP1(Cat 12305-2-AP), APLP2(Cat15041-1-AP), NL2(SYSY129202) 항체로 블롯팅 (blotting)하였다.

그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, APP 및 MDGA1 단백질의 결합은 뇌 조직에서도 일어남을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 도 17의 A 및 B는 HEK293T 세포에서 MDGA1이 APP 및 Nlgn2와 선택적으로 결합하며, MDGA2는 APP와 결합하지 않고, Nlgn2만 선택적으로 결합함을 나타낸다. 도 17의 C 및 D는 P14 뇌 시냅토좀 표본에서 MDGA1 단백질이 APP 단백질과 약하게 결합하며, MDGA1 및 MDGA2 모두 Nlgn2 단백질과 강하게 결합함을 나타낸다. 도 17의 E 및 F는 P70 뇌 시냅토좀 표본에서 MDGA1 단백질이 APP, APLP2, Nlgn2 단백질과 복합체를 형성함을 나타낸다.

실시예 7. APP 및 MDGA1 단백질 결합을 선택적으로 저해하는 펩타이드 확인

도 18은 APP 익스텐션 도메인의 서열을 나타낸다. 한편, APP 및 MDGA1 단백질의 결합을 선택적으로 저해하는 경우 뇌신경계 질환에 유효한 효과를 나타낼 수 있을 것이다. 따라서, 상기 서열 중 APP 및 MDGA1 단백질의 결합을 저해할 수 있는 펩타이드를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 도 18에 나타낸 것과 같이, APP 익스텐션 도메인을 세부적으로 17mer (DDSDVWWGGADTDYADG), 9mer (DDSDVWWGG), 8mer (ADTDYADG), 7mer (SEDKVVE)로 나누어 순도 70 %로 정제하였다. APP 컨스트럭트를 각각 HEK293T 세포에 트랜스펙션시켰다. 48 시간 후 20 mM HEPES pH 7.4, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂을 함유하는 DMEM 배지에서, 재조합 IgC 태그된 MDGA1 단백질을 10 μg/mL 농도로 혼합하고 동시에 상기 정제한 펩타이드를 농도 의존적으로 함께 혼합하여 4 ℃로 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 이 후 혼합된 시약 (reagent)을 상기 HEK293T 세포에 접촉시켰다. 37 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하고, 실온에서 4 % 파라포름알데히드로 고정시켰다. 블로킹 용액 (DMEM, 20 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 4 % BSA 및 1 % 말 혈청)으로 실온에서 30 분간 블로킹하였다. 1:500으로 인간 IgG Cys 항체로 실온에서 1 시간 동안 염색을 수행하였다. 이 후 PBS 중 0.2 % 트리톤 X-100으로 실온에서 10 분간 투과시켰다. HEK293T 세포에 부착되어 있는 APP, APLP1, APLP2를 염색하기 위해, 1:400 HA-ms (SC7392)로 1 시간 동안 염색하였다. 이 후 PBS로 2 회 세척하고 ms-FITC를 1:150로 1 시간 염색한 후 마운팅하였다. 각 이미지는 공초점 현미경 LSM700 으로 촬영하였다.

그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 도 18에서 표시한 17 mer 또는 9 mer를 처리한 경우, APP 및 MDGA1 단백질의 결합이 효과적으로 저해됨을 확인하였다. 또한, 도 20에 나타낸 바와 같이, 정량적으로 결합 저해 여부를 확인한 결과, 상기 17 mer는 APP 및 MDGA1 단백질의 결합을 저해하는 효과가 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다.

실시예 8. 억제성 시냅스 구조에 대한 APP 단백질의 효과 확인

신경배양세포를 통하여 APP 단백질이 억제성 시냅스에 어떠한 효과를 미치는지 확인하고자 하였다.

구체적으로, L315 단독 (대조군), shAPP, shAPLP2 렌티바이러스를 4 일간 배양된 해마 뉴런 (hippocampal neuron)(DIV4)에 접촉시켰다. 배양한지 12 일(DIV 12)이 되었을 때 염색을 수행하고 4 % (w/v) 파라포름알데히드 및 4 % (w/v) 수크로오스로 실온에서 고정시켰다. 이 후 PBS 중 0.2 % 트리톤 X-100으로 투과시켰다. PBS로 2 회 세척한 후 블로킹 용액 (DMEM, 20 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 4 % BSA 및 1 % 말 혈청)으로 30 분간 블로킹하였다. 이 후 1: 100으로 GAD67 (clone 1G10.2; Millipore, RRID: AB_2278725)를 실온에서 1 시간 동안 염색하였다. 그 뒤 1:500의 비율로 Cys-ms로 염색하였다. 각 이미지는 공초점 현미경 LSM700으로 촬영하였다.

그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이, 억제성 시냅스의 구조적인 변화를 관찰할 수 있었으며, 이를 정량적으로 분석한 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, APP가 넉다운(Knockdown)된 경우 억제성 시냅스를 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

APP(amyloid precursor protein) 및 MDGA1(MAM Domain Containing Glycosylphosphatidylinositol Anchor 1) 단백질 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌신경계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
상기 상호작용 억제제는 APP 또는 MDGA1에 특이적으로 결합하는 항체의 항원-결합 단편 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 APP는 APP 단백질의 익스텐션(extension) 도메인인 것인 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 MDGA1은 MDGA1 단백질의 MAM 도메인인 것인 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 뇌신경계 질환은 퇴행성 뇌질환 또는 정신질환인 것인 약학적 조성물.
청구항 5에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 뇌졸중, 인지기능 장애, 알츠하이머 치매 (Alzheimer`s disease), 루이체 치매 (Dementia with Lewy bodies), 전측두엽 치매 (frontotemporal dementia), 파킨슨병 (Parkinson`s disease), 크로이츠펠트-야곱병 (Creutzfeldt-Jakob disase; CJD), 헌팅톤병 (Huntington`s disase), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), 길리안-바레 증후군 (Gillain-Barre Syndrome; GBS)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
청구항 5에 있어서, 상기 정신 질환은 양극성 장애, 자폐증, 우울증, 과잉 행동, 주의력 결핍, 자폐증, 외상 후 스트레스 장애(PTSD), 불안 장애, 수면 장애, 공황 장애, 지능 장애, 기억력 저하, 약물 중독, 조현병, 강박증, 과대망상, 성격장애, 알코올중독, 및 조울증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 시료에 피검물질을 접촉시키는 단계;
상기 MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편 간의 결합 수준을 측정하는 단계; 및
상기 결합 수준이 대조군 시료와 비교하여 감소한 시료를 선별하는 단계를 포함하는, MDGA1 단백질 및 APP 단백질 간의 결합을 억제하는 물질을 스크리닝하는 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 MDGA1 단백질 및 APP 단백질 간의 결합을 억제하는 물질은 뇌신경계 질환 치료제인 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 시료는 세포 배양물로서, 상기 MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편은 세포 내에 존재하는 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 MDGA1 단백질 또는 이의 단편, 및 APP 단백질 또는 이의 단편은 세포 외에 존재하는 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 결합 수준은 면역침전법(immunoprecipitation), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블롯(Western Blotting), tag-단백질 pull down 분석, 단백질 칩(Protein Chip), 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET), 이분자 형광 상보(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC) 및 효모 이중혼성(Yeast two-hybrid, Y2H)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상으로 측정하는 것인 방법.