CN101921726B - 一种口服免疫阻断鸡抑制素作用的转化子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转化子，包括受体菌和转化到受体菌内部的重组载体，所述的受体菌为乳酸乳球菌NZ9800，重组载体的原始载体为pNZ8112，重组载体的外源目的基因包括鸡抑制素α亚基基因、霍乱毒素B亚基基因以及细胞壁锚定子M6基因。本发明转化子可以通过口服方式进入鸡肠道，与注射免疫相比，降低直接与循环系统接触引起的毒性，增加疫苗的安全性。选用抗原基因/免疫增强因子联合免疫，增强了机体免疫应答，提高了免疫效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种口服免疫阻断鸡抑制素作用的转化子及其应用。
背景技术
禽产品是人类主要动物性食品之一。随着人们生活水平的不断提高，市场对禽产品的需求日益增加。我国是个多禽种国家，地方鸡种资源十分丰富，我国的这些品种与国外培育出的一些“专用家禽品种”相比，具有对周围环境的高度适应性、耐粗放管理、抗病性强、肉及蛋的品质好等特点。然而由于地方鸡种产蛋量少、生长慢、饲料利用率低，再加上外来高生产性能品种的引进，使许多地方鸡种由于市场竞争而逐步减少甚至濒危或灭绝。外来品种虽然生长快、饲料利用率高，但肉及蛋的品质差。随着生活水平的提高，人们已越来越注重禽产品的品质，目前市场对高品质土鸡蛋及肉产品的需求量迅猛增长，这种转变给我们提出了培育产蛋率高、肉蛋品质好的新品种、品系的要求和挑战。
提高动物繁殖性能一直是动物生产研究人员所努力的目标。但目前通过传统的遗传改良和营养调控手段来提高动物繁殖力已很难再有大的进展。因而研究一种安全、高效、对人类无毒副作用的提高动物繁殖性能的制剂或产品是目前养殖业所面临的迫切问题。
动物的生产性状总是由促进和抑制两类激素或因子联合控制的。如果把免疫学的方法应用于动物繁殖性能的调控，选择对动物繁殖力有抑制作用的激素或因子作为抗原来免疫动物，可诱发机体产生对抗该种激素或因子的抗体，从而抑制或减弱该激素或因子的生理功能，进而提高动物的繁殖性能。该技术对那些繁殖性能差的地方品种意义尤其重大，且十分安全无任何副作用。
由于大肠杆菌、酵母菌等不能在动物肠道中定植，所以不能进行口服免疫，必须将所表达的目的产物纯化进行注射免疫。蛋白纯化步骤大大增加了生产的成本和难度，使大规模生产目的蛋白制剂难以实现。同时注射免疫程序也较繁琐，不仅要耗费较大人力，对动物的应激和伤害也较大。因此迫切需要研制出一种对动物繁殖力起促进作用的安全、方便并能进行大规模生产的口服制剂。
乳酸菌是一类在食品中应用最广泛的重要工业菌株，它包括乳酸乳球菌、乳酸杆菌等十几个属，被公认为是安全的食品级微生物。乳酸菌本身就是一种益生菌，能调节肠道微环境，帮助消化，抑制肠道有害微生物，防治腹泻，促动物生长增重。
发明内容
本发明提供了一种口服免疫阻断鸡抑制素作用的转化子，该转化子可以通过口服方式摄入并定植在鸡肠道内，其分泌的融合蛋白能有效诱发鸡体内产生抗鸡抑制素α亚基的抗体，从而抑制或减弱内源抑制素对鸡繁殖力的抑制作用。
一种转化子，包括受体菌和转化到受体菌内部的重组载体，所述的受体菌为乳酸乳球菌NZ9800，重组载体的原始载体为pNZ8112，重组载体的外源目的基因包括鸡抑制素α亚基基因、霍乱毒素B亚基基因以及细胞壁锚定子M6基因。鸡抑制素(Inhibin，INH)主要是由性腺产生的一种二聚体糖蛋白，由一个α亚基和一个β亚基组成，其中α亚基是抑制素特有的亚基，β亚基在其它性腺糖蛋白激素如活化素中也存在。Inhibin抑制动物繁殖力的作用机理在于其对垂体卵泡刺激素(FSH)的负反馈调节，血浆FSH含量的降低导致卵泡的生长发育及精子的产生受阻，因而Inhibin是调节动物繁殖力的一个重要因子。理论上，阻断Inhibin对FSH的这种负反馈作用可引起FSH释放量增加，从而使排卵率和精子产量增加。在本发明中抑制素α亚基(GenBank号：NM_001031257)作为免疫原。
为了增强机体免疫应答，提高免疫效果，在抗原基因上连接霍乱毒素B亚基基因，霍乱毒素B亚基(Cholera toxin B subunit，简称CTB，GenBank号：U25679)为免疫增强子，研究表明它是一种无毒性的非常有效的黏膜免疫佐剂，特别适合作为口服疫苗的免疫增强佐剂蛋白。
细胞壁锚定子M6(GenBank号：M11338)可与乳酸乳球菌细胞膜上的蛋白相结合，免疫原和免疫增强子被表达后分泌到胞外，通过细胞壁锚定子M6能够固定在细胞壁上。
原始载体pNZ8112含有强启动子即乳链菌肽A(Nisin A)的启动子NisA(GenBank号：AY303241)以及高效分泌型信号肽Usp45(GenBank号：M60178)，信号肽Usp45位于启动子NisA的下游，外源目的基因连接在信号肽的C端。
所述的抑制素α亚基基因、霍乱毒素B亚基基因、细胞壁锚定子M6基因、启动子NisA和信号肽Usp45的碱基序列如SEQ ID NO.5～9所示。
乳酸菌本身就是一种益生菌，能调节肠道微环境，帮助消化，抑制肠道有害微生物，防治腹泻，促动物生长增重。乳酸菌能在体内定植或短暂定植是它发挥生理功能的必要条件。通过载体把目的基因如免疫原基因导入乳酸菌中，然后制成活菌制剂饲喂，引入动物体内，产生外源目的基因的产物从而引起黏膜和体液免疫。经研究发现，在肠道中能较长时间定植的乳酸杆菌容易使动物对目的外源基因产物产生免疫耐受，而在肠道中短暂定植的乳酸乳球菌不产生这种免疫耐受现象。
本发明还提供上述转化子在免疫阻断鸡抑制素作用中的应用，通过将分泌表达了外源目的基因产物的转化子喂食给鸡，乳酸乳球菌就会短暂定植在鸡肠道内，从而引起鸡对外源目的基因产物产生免疫，即对乳酸菌表达的抑制素α亚基产生免疫，产生抗抑制素α亚基的抗体，该抗体可减弱或抑制鸡内源抑制素对鸡繁殖性能的抑制作用，达到提高动物繁殖力的目的。
根据上述应用，本发明又提供了一种利用上述转化子制备的鸡口服免疫制剂，它包括培养基和分泌了外源目的基因产物的转化子。该制剂制备和使用均十分方便。
所述的培养基可以为能促进乳酸乳球菌生长的培养基，优选为GM17培养基。在使用时，上述口服免疫制剂中转化子浓度最好为1×108cfu/mL～1×1010cfu/mL，使得肠道内的乳酸乳球菌达到一定浓度，每次喂食量为2ml。
本发明还提供了一种上述鸡口服免疫制剂的制备方法，包括以下步骤：将转化子置于培养基中，培养至OD600为0.3～0.5，加入乳链菌肽继续培养2～3h。
所述的乳链菌肽为表达诱导物，加入后浓度优选为10～20ng/mL。
本发明转化子可以通过口服方式进入鸡肠道，与注射免疫相比，降低直接与循环系统接触引起的毒性，增加疫苗的安全性。选用抗原基因/免疫增强因子(无毒性的霍乱毒素B亚基)联合免疫，增强了机体免疫应答，提高了免疫效果。
具体实施方式
GM17液体培养基：胰蛋白胨2％；酵母膏0.5％；Vc 0.05％；牛肉膏0.5％；乙酸钠0.15％；氯化钠0.4％；MgSO4.7H2O 0.25％；葡萄糖0.5％，调至pH 6.8。GM17固体培养基在上述培养基基础上添加1.6％的琼脂。
乳酸乳球菌NZ9800和载体pNZ8112均为商业化产品，来自荷兰的NIZO food research。
1、目的基因的构建及克隆表达
(1)CTB基因成熟区的获得：
上游引物CTB P1(SEQ ID NO.1)：
5’-GG
ACACCTCAAAATATTACTG-3’
引物结构为：保护碱基(GG)-Xba I位点(框中序列)-CTB 5’端部分序列(下划线序列)
下游引物CTB P2(SEQ ID NO.2)：
5’-TG
ATTTGCCATACTAATTG-3’
引物结构：保护碱基(TG)-EcoR I位点(框中序列)-CTB 3’端部分序列(下划线)。
用上述引物以霍乱弧菌基因组DNA(含CTB基因)为模板，进行PCR得到CTB基因成熟区序列。PCR条件为：总反应体系为50μl，其中含50ng的DNA模板，1×PCR buffer，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.2μM上下游引物，2.5U Taq DNA聚合酶。PCR反应参数设置为：94℃预变性1分钟；94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环；然后72℃后延伸5分钟。
(2)Inhibin α亚基(INHA)基因成熟区的获得：
上游引物INHA P1(SEQ ID NO.3)：
AA
TCCGCCGTGCCCTGGTCGCC
引物结构：保护碱基(AA)-EcoR I位点(框中序列)-INHA 5’端部分序列(下划线)。
下游引物INHA P2(SEQ ID NO.4)：
TT
GACACAGGTGCAGTCC
引物结构：保护碱基(TT)-BamH I位点(框中序列)-INHA 3’端部分序列(下划线)。
用上述引物以鸡基因组DNA(含INHA基因)为模板，进行PCR得到INHA基因成熟区序列。PCR条件同上。
(3)CTB-INHA嵌合基因的构建
将上述PCR所得到的CTB和INHA成熟区序列分别与pGEM-T载体(Promega公司)相连，克隆入大肠杆菌E.coli DH5α(Takara公司)中。抽提重组目的质粒，用内切酶将CTB(Xba I和EcoR I)和INHA(EcoR I和BamH I)成熟区分别从重组T载体上酶切下来，T4DNA连接酶16℃连接过夜得到CTB-INHA的连接产物。以连接产物为模板，以CTB P1(含Xba I位点)和INHA P2(含BamH I位点)为引物，进行PCR，得到CTB-INHA嵌合基因的PCR产物。将该PCR产物用Xba I和BamH I酶切后克隆到pET28载体(Invitrogen公司)中。然后将含CTB-INHA的pET28质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，涂LB平板，37℃培养18-20h，挑取阳性斑扩大培养，然后抽提质粒，PCR和酶切鉴定抽提的质粒中含有目的基因。
(4)CTB-INHA-M6重组表达载体的构建
M6基因的获得：
上游引物M6P1(SEQ ID NO.10)：
5’-AA
AGAGTGTTTCCTAGGGG-3’
引物结构为：保护碱基(aa)-BamH I位点(框中序列)-M65’端部分序列(下划线序列)
下游引物M6P2(SEQ ID NO.11)：
5’-CG 
GTTTTCTTCTTTGCGTT-3’
引物结构为：保护碱基(cg)-Hind III位点(框中序列)-终止子(粗斜体序列)-M63’端部分序列(下划线序列)
用化脓性链球菌基因组DNA(含M6基因)为模板，以上述引物进行PCR(PCR条件同上)，可得到两端带BamH I和Hind III酶切位点的PCR产物，用该两种酶酶切PCR产物，重组入已含CTB-INHA的pET28载体中的CTB-INHA基因下游(通过设计的BamH I位点将CTB-INHA与M6重组相连：(Xba I)CTB-(EcoR I)-INHA(BamH I)和(BamH I)M6-终止子(Hind III))。
然后将含CTB-INHA-M6嵌合基因的pET28质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，涂LB平板，37℃培养18-20h，挑取阳性斑扩大培养，然后抽提质粒，PCR和酶切鉴定抽提的质粒中含有目的基因。
酶切条件为：37℃酶切过夜；连接酶及条件：T4DNA连接酶，16℃连接过夜。其他过程均按常规方法进行。
2、CTB-INHA-M6嵌合基因在中间宿主菌中的克隆和在乳酸乳球菌中的表达
(1)CTB-INHA-M6嵌合基因在中间宿主菌中的克隆
由于表达载体pNZ8112(NIZO food research(荷兰))在乳酸乳球菌中的克隆拷贝数很低，要想得到足够的重组pNZ8112质粒(含CTB-INHA-M6)，必须通过一个中间宿主菌E.coli MC1061(Invitrogen公司)来使pNZ8112质粒达到足够的拷贝数。
用氯霉素抗性筛选重组菌(10ug/ml氯霉素)：pNZ8112上含氯霉素抗性基因，E.coli MC1061菌株本身不具氯霉素抗性，只有被转化入pNZ8112质粒的E.coli MC1061才能在含氯霉素的平板上生长。
首先将目的基因(CTB-INHA-M6)从pET28质粒中酶切(Xba I和Hind III)下来，割胶回收，重组入用相同酶切过的pNZ8112中，T4DNA连接酶16℃连接过夜，然后转化E.coli MC1061感受态细胞，涂LB平板，37℃培养18-24h，挑取氯霉素平板上生长出的菌斑扩大培养，然后抽提质粒，PCR和酶切鉴定抽提的质粒中含有目的基因。
(2)CTB-INHA-M6嵌合基因在乳酸乳球菌中的表达
得到含目的基因(CTB-INHA-M6)的重组E.coli MC1061后，将其扩大培养，使其中的重组pNZ8112质粒得到足够的拷贝数(每个宿主细胞约10～60份拷贝)，然后抽提重组pNZ8112质粒，转化入乳酸乳球菌NZ9800(NIZO food research(荷兰))感受态细胞中，涂布含有10ug/ml氯霉素的GM17平板(同样用氯霉素抗性筛选重组菌)，于30℃培养48-60h，挑取长出的菌斑扩大培养，抽提质粒，PCR和酶切鉴定抽提的质粒中含有目的基因。
将含有阳性重组质粒的乳酸乳球菌转接到5ml含氯霉素(终浓度为10ug/ml)的GM17液体培养基中，在30℃、180r/min培养过夜后；按1∶25的比例稀释至10ml新鲜培养基中，30℃培养至OD600约为0.4，然后加入终浓度为10ng/ml乳链菌肽nisin(Sigma公司)诱导目的基因表达2-3h。
(3)检验目的蛋白
首先将菌体用溶菌酶处理，再用超声波破碎，然后将经超声波破碎处理后的细胞溶液用70％饱和硫酸铵沉淀后，10000g离心30min，将沉淀溶解于50mMol/L pH6.0磷酸缓冲液中，活性炭脱色后用50mMol/L的磷酸缓冲液透析至透析液中检测不到铵根离子，直接上DEAE-Cellulose 52柱(2cm×60cm，Pharmacia，预先用含30mMol/L NaCl的pH6.0、20mMol/L的磷酸缓冲液平衡)，用缓冲体系(含30mMol/L NaCl的20mMol/L pH6.0磷酸缓冲液和含300mMol/L NaCl的20mMol/L pH6.0磷酸缓冲液)进行线性梯度洗脱，先用起始缓冲液(含30mMol/L NaCl的20mMol/L pH6.0磷酸缓冲液)洗柱后，再进行NaCl浓度为30-300mMol/L的线形梯度洗脱，洗脱流速为12mL/h，用核酸/蛋白检测仪监测收集目的蛋白，用去离子水透析过夜，再冷冻浓缩后于4℃保存，用常规Western印迹法(Westernblotting)检测验证，检测方法如下：
首先用商品化的INHA抗原(Sigma产品)免疫兔子，制备用于Westernblotting检测的一抗，用商品化的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(Sigma产品)为二抗。为了检测目的蛋白CTB-INHA-M6(基因大小为1971bp)是否被乳酸乳球菌表达，我们用纯化的表达产物和另一种已知INHA融合蛋白(沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因(H-1d)-抑制素α亚基，简称H-1d-INHA，基因大小为1839bp)做比较，如果用商品INHA抗原免疫兔子所制备的一抗既能与纯化产物结合，又能与H-1d-INHA蛋白结合，且蛋白分子量大小相符，则证明纯化的表达产物中含目的蛋白CTB-INHA-M6。Western blotting结果显示：H-1d-INHA和纯化产物均能与商品INHA抗原免疫兔子所制备的一抗结合，显示出所对应的蛋白条带(H-1d-INHA分子量约为65KD，CTB-INHA-M6约为75KD)，说明CTB-INHA-M6融合蛋白被乳酸乳球菌成功表达。
3、CTB-INHA乳酸乳球菌口服免疫海兰白蛋鸡后的抗体产生情况
随机选取40只海兰白蛋鸡进行了重组乳酸菌口服免疫，将浓度为1×109cfu/mL的菌液喂食20周龄即将进入产蛋期的鸡，每次喂食2ml，每周2次，喂食3周。当然可以根据实际情况改变菌液浓度，一般选择1×108～1×1010cfu/mL。
在首次免疫后3月、6月和9月抽取鸡血，分离得到鸡血清，用于检测鸡INHA抗体产生情况。采用ELISA间接法测定鸡血清中的抗体水平，具体步骤如下：
用0.5mg/ml的INHA抗原(Sigma产品)包被96孔免疫板，每孔加抗原溶液100ml，48℃包被过夜，然后用含1.5％BSA(牛血清白蛋白，Sigma产品)的PBST溶液(含0.05％Tween-20的PBS溶液)封闭免疫板，37℃封闭2h。加入稀释度为1∶50的待测鸡血清，洗涤三次，再加稀释度为1∶1000的辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgG抗体(Sigma产品)，然后将10mg 3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(Sigma产品，酶的底物，可在辣根过氧化物酶作用下显蓝色)溶解在0.025M磷酸盐柠檬酸缓冲液中并加至免疫板各孔中，每孔50ml。底物显色后加0.2M H2SO4终止反应，然后用酶联测定仪以波长450nm测定底物显色后的光吸收值(OD值)，将测得标本(即免疫鸡血清标本)OD值(P)与阴性对照(未免疫鸡血清标本)OD值(N)相比，若P/N值大于或等于2.0，则所测样本抗体为阳性，鸡INHA抗体产生情况检测结果如下表所示：
4、CTB-INHA乳酸菌活菌制剂主动免疫对鸡繁殖性能的影响
从上述被免疫的40只蛋鸡中选取抗体阳性的20只作为免疫组，另选20只未免疫鸡作为对照组。蛋鸡经上述菌液主动免疫后，测定1～3月、4～6月、7～10月的产蛋量和耗料量，统计分析产蛋率和料蛋比。结果如下表所示：
本发明免疫制剂主动免疫对蛋鸡繁殖性能的影响
同行中不同上标字母表示差异显著，a，b表示p＜0.05，a，c表示p＜0.01.
以上数据表明，本发明所研制的鸡CTB-INHA乳酸菌活菌制剂能刺激鸡产生抗抑制素α亚基(INHA)的抗体，减弱体内抑制素对鸡繁殖性能的抑制作用，提高了鸡的产蛋率和料蛋比。
Claims (7)
1.一种转化子，包括受体菌和转化到受体菌内部的重组载体，其特征在于：所述的受体菌为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)NZ9800，重组载体由原始载体和外源目的基因构成，原始载体为包含启动子NisA和信号肽Usp45的pNZ8112，外源目的基因由依次通过EcoR I位点、BamHI位点连接的霍乱毒素B亚基基因、鸡抑制素α亚基基因以及细胞壁锚定子M6基因构成，所述的抑制素α亚基基因、霍乱毒素B亚基基因、细胞壁锚定子M6基因的碱基序列如SEQ ID NO.5～7所示，外源目的基因连接在信号肽Usp45的C端。
2.权利要求1所述转化子在免疫阻断鸡内源抑制素作用中的应用。
3.一种利用权利要求1所述转化子制备的鸡口服免疫制剂，其特征在于：包括培养基和分泌了由所述外源目的基因编码的蛋白质的转化子。
4.根据权利要求3所述的鸡口服免疫制剂，其特征在于：所述的培养基为GM17培养基。
5.根据权利要求3所述的鸡口服免疫制剂，其特征在于：所述的转化子浓度为1×108cfu/mL～1×1010cfu/mL。
6.根据权利要求3所述的鸡口服免疫制剂的制备方法，包括以下步骤：将权利要求1所述的转化子置于培养基中，培养至OD600为0.3～0.5，加入乳链菌肽继续培养2～3h。
7.根据权利要求6的制备方法，其特征在于：所述的乳链菌肽加入后浓度为10～20ng/mL。
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