CN101148473B - 一种重组人胰岛素及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有重组人胰岛素编码基因的工程菌在制备治疗糖尿病口服疫苗中的应用。本发明重组人胰岛素的氨基酸残基序列如序列表中序列1所示；重组人胰岛素编码基因是序列表中SEQ ID NO：2的自5′端第1-177位核苷酸序列；所述工程菌是将所述重组人胰岛素编码基因通过原核表达载体转入到乳酸菌中，筛选得到可表达所述重组人胰岛素的工程菌；所述乳酸菌为干酪乳杆菌ATCC 27092或乳酸乳球菌MG1363。本发明的含有重组人胰岛素基因的乳酸菌工程菌能在肠道内存活48小时以上，刺激NOD小鼠免疫系统产生重组人胰岛素特异性抗体，使与免疫耐受相关的细胞因子IL-4水平明显升高，诱导免疫耐受产生。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组人胰岛素及其编码基因与应用，特别涉及一种重组人胰岛素及其编码基因与其在制备治疗I型糖尿病的乳酸菌口服疫苗中的应用。
背景技术
胰岛素(Insulin，INS)是一种重要的内分泌激素，是引起自身免疫疾病I型糖尿病(T1DM)的主要自身抗原。现阶段T1DM并无有效的预防手段，且发病者只能通过一日三次注射胰岛素来保持血糖稳定。
有研究表明通过给T1DM的模型非肥胖糖尿病(Non-obese diabetic，NOD)小鼠口服胰岛素能减轻或延缓其发病过程，其机制是抗原通过黏膜的Peyer’s区吸收，从而激活免疫系统，之后与耐受性相关的效应T细胞被激活，引发口服耐受性，从而保护胰岛素不被损伤(Weiner HL.Oral tolerance：immune mechanisms and thegeneration of Th3-type TGF-beta-secreting regulatory cells.Microbes andInfection，2001，3：947-954)。但是如果直接口服抗原，因为蛋白质在胃肠道里的降解，会明显影响抗原的生物利用率。而乳酸菌是一类被普遍认为安全的生物体，在食品行业中已得到广泛的应用，可以作为一种合适的表达胰岛素的基因工程载体。而现在胰岛素的生产是通过基因工程大量表达，纯化，溴化氰裂解，变性，复性等多个步骤，工艺繁琐。因此有必要采用新方法进行给药。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组人胰岛素及其编码基因与应用。
本发明所提供的重组人胰岛素，名称为R-INS，是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；
(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有人胰岛素功能的由(a)衍生的蛋白质。
其中，序列表中的序列1由59个氨基酸残基组成。
为了使(a)中的R-INS分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列，为了(a)中的R-INS便于纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端或C端连接上如表1所示的标签。
表1.标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 11 | EQKLISEEDL |
上述(b)中的R-INS可人工合成，也可先合成其编码基因，再按照下述方法进行生物表达得到。上述(b)中的R-INS的编码基因可通过将序列表中SEQ ID №：2的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端连上信号肽的编码序列，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
上述重组人胰岛素的编码基因(R-INS)也属于本发明的保护范围。
鉴于密码子的兼并性和乳酸菌对氨基酸密码子的偏向性，本发明设计合成了含乳酸菌偏爱密码子的重组人胰岛素的编码基因，可使重组人胰岛素基因的在乳酸菌中表达。
所述重组人胰岛素的编码基因，是优化的重组人胰岛素基因，具体可为如下1)、2)或3)的基因：
1)序列表中SEQ ID №：2的自5′端第1-177位核苷酸序列；
2)编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸；
3)在严格条件下与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。
序列表中序列2是由180个脱氧核苷酸组成，自5′端第1-177位核苷酸序列为编码序列，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列，自5′端第178-180位核苷酸序列为终止密码子。
含有上述重组人胰岛素基因的重组表达载体和转基因细胞系也属于本发明的保护范围。
含有上述重组人胰岛素基因的工程菌也属于本发明的保护范围。
所述工程菌是将上述的重组人胰岛素的编码基因通过原核表达载体转入到乳酸菌中，筛选得到的可表达上述重组人胰岛素工程菌。
所述重组人胰岛素的编码基因的5′端还连接有方便编码的蛋白在所述工程菌的细胞壁中表达的信号肽基因。
所述乳酸菌为干酪乳杆菌(lactobacillus casei)ATCC 27092或乳酸乳球菌(lactococcus lactis)MG1363，优选为干酪乳杆菌(lactobacillus casei)ATCC 27092。
所述信号肽基因为SPUsp45信号肽基因；所述表达的权利要求1所述重组人胰岛素以权利要求1所述重组人胰岛素和SPUsp45信号肽的融合蛋白的形式在所述工程菌的细胞壁中表达；所述SPUsp45信号肽基因的核苷酸序列是GENBANK号为M60178的自5′端第101-214位核苷酸序列；所述信号肽基因的5′端还连接有组成型表达启动子。
所述原核表达载体优选为pSW501。
含有上述工程菌的药物也属于本发明的保护范围。
所述药物可为预防和\或治疗糖尿病，特别是预防和\或治疗I型糖尿病的菌剂。
所述药物可作为治疗I型糖尿病的口服疫苗，服用剂量可为1010-1013cfu/次/60kg，每周一次。
本发明的重组人胰岛素基因，通过密码子优化，可在乳酸菌中表达重组人胰岛素。本发明的重组人胰岛素在天然人胰岛素的A，B链序列之间引入连接肽(RRSPNGKR)利于形成β转角结构，重组蛋白模拟的空间结构与天然胰岛素结构非常相似，实验证明该蛋白具有胰岛素活性，可以与胰岛素多克隆抗体特异性结合。
实验证明，本发明的含有重组人胰岛素基因的工程菌能在肠道内存活48小时以上，刺激NOD小鼠免疫系统产生重组人胰岛素特异性抗体，使与免疫耐受相关的细胞因子IL-4水平明显升高，诱导免疫耐受产生。表明，本发明的含有重组人胰岛素基因的工程菌，对于非肥胖糖尿病的治疗具有很好的效果。
本发明的工程菌制成菌剂作为治疗非肥胖糖尿病的口服疫苗，没有繁琐的后加工过程，只需经过简单的离心或其它常规加工即可得到，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为人胰岛素基因和改造的重组人胰岛素基因序列分析
图2为重组人胰岛素基因乳酸菌表达载体pSW501和对照载体pSW509的构建示意图
图3为工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501表达胰岛素的Western-blot图
图4为工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501表达胰岛素浓度筛选的Western-blot图
图5为NOD小鼠血清中SPUsp45-R-INS特异性抗体的分析结果
图6为NOD小鼠血清中IL-4水平检测结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、重组人胰岛素基因及表达其的工程菌的获得
1、重组人胰岛素基因的合成
根据乳酸菌偏爱密码子在人胰岛素基因序列中替换37个碱基对，并在其A，B链序列之间加入连接肽(RRSPNGKR)的编码序列5’-CGTAGATCTCCTAATGGAAAACGT-3’，RR和KR为胰岛素原C肽两端的氨基酸，SPNG利于形成β转角结构，重组蛋白模拟的空间结构与天然胰岛素结构非常相似。
根据其正负链序列设计八条拼接引物(表2所示，表2中1-4为正链的拼接引物，5-8为负链的拼接引物)，用T4磷酸激酶加上5’-Pi，再加热至95℃，缓慢退火至室温，连接过夜，以退火产物为模板，用引物P1和P2(P1：CAG TCG ACT TTG TCAACC AAC ATT TAT GTG；P2：GCG ATA TCT TAG TTA CAG TAG TTC TCA AGT TG)进行扩增。
反应体系为：100μl；反应程序为：先94℃ 5min；在94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 45s，30次循环；最后72℃ 5min。
扩增得到180bp目的片段，将PCR产物用100％乙醇沉淀，70％洗涤后，室温晾干使乙醇挥发干净，溶于重蒸水中，经过DNA纯化试剂盒纯化后，取4μl在16℃及连接酶作用下连接16hr至pMD18-T(Takara公司)上，进行测序，经测序表明，上述扩增的片段具有序列表中序列2的核苷酸片段，自序列表中序列2的5′的第1-177位脱氧核苷酸序列为编码序列，第178-180位为终止密码子序列，该片段即为重组人胰岛素基因，将其命名为R-INS，其编码的蛋白为R-INS。将连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109，用含有氨苄青霉素的LB平板进行重组子的筛选，挑取具有氨苄青霉素抗性的转化子，通过碱裂解法制备质粒，质粒经过酶切和PCR鉴定，将鉴定结果表明含有上述重组人胰岛素基因的重组载体命名为pSW101，重组人胰岛素与胰岛素基因中有37个碱基不同(图1，图1中1为人胰岛素基因序列，2为替换乳酸菌偏爱密码子的重组人胰岛素基因)，与预先设计的序列完全相符。
表2.拼接引物
| 编号 | 序列 |
| 1 | 5’-AATTCTTTGTCAACCAACATTTATG-3’ |
| 2 | 5’-TGGATCACATTTAGTAGAAGCTTTGTATCTTGTTTGTGGTGAACGTGGATTTTTC-3’ |
| 3 | 5’-TATACACCTAAGACACGTAGATCTCCTAATGGAAAACGTGGTATTGTTGAAC-3’ |
| 4 | 5’-AATGCTGTACATCAATCTGTTCATTGTATCAACTTGAGAACTACTGTAACTAAG-3’ |
| 5 | 5’-TCGACTTAGTTACAGTAGTTCTC-3’ |
| 6 | 5’-AAGTTGATACAATGAACAGATTGATGTACAGCATTGTTCAACAATACCACGTTTTC-3’ |
| 7 | 5’-CATTAGGAGATCTACGTGTCTTAGGTGTATAGAAAAATCCACGTTCACCACAAAC-3’ |
| 8 | 5’-AAGATACAAAGCTTCTACTAAATGTGATCCACATAAATGTTGGTTGACAAAG-3’ |
2、乳酸菌表达载体的构建(载体构建示意图如图2所示)：
1)胰岛素基因的中间载体pSW201的构建：
以pSW101为模板，以合成的胰岛素基因序列设计引物(P1和P2)为引物，进行PCR扩增：
引物序列：P1：CAGTCGACTTTGTCAACCAACATTTATGTG(Sal I)；P2：GCGATATCTTAGTTACAGTAGTTCTCAAGTTG(EcoR V)
反应体系为：100μl；反应程序为：先94℃ 5min；在94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 45s，30次循环；最后72℃ 5min。
反应结束后取2μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外检测在180bp处有一条明显的条带，其分子量大小与预测重组人胰岛素基因的大小一致，经测序表明该片段具有序列表中序列2所示的核苷酸序列。
将PCR产物用100％乙醇沉淀，70％洗涤后，室温晾干使乙醇挥发干净，溶于重蒸水中，将PCR片段用Sal I和EcoR V双酶切后得到的片段，与Sal I和EcoR V双酶切后并经过纯化的含有组成型P59启动子(具有类似自GENBANK号为M24806的5′端第1-180位的核苷酸序列，实际序列为序列表中序列3所示的核苷酸序列)、spUsp45信号肽基因(具有自GENBANK号为M60178的5′端第101-214位的核苷酸序列)的大肠杆菌乳酸菌穿梭载体pVE5523(按照文献Dieye Y，Usai S，Clier F et al.Design of a protein-targeting system for lactic acid bacteria.J Bacteriol，2001，183(14)：4157-4166所述的方法构建)连接，在16℃在连接酶作用下连接16hr。连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌TG1，用氨苄青霉素筛选得到转化子，转化子经过酶切、PCR以及DNA测序验证，将经验证表明含有P59启动子、spUsp45信号肽和上述重组人胰岛素基因的重组载体命名为pSW201。核苷酸序列分析也表明pSW201含有包括组成型P59启动子、spUsp45信号肽基因和胰岛素基因的正确基因序列及阅读框架。
2)胰岛素基因乳酸菌表达载体pSW501的构建：
以pSW201为模板，设计使用P3，P4引物进行PCR扩增，扩增包含组成型P59启动子、spUsp45信号肽基因和重组人胰岛素基因：
P3：CAGAATTCCGGTATCGATAGCCCGCCTAAT(EcoR I)
P4：GCTCTAGATTAGTTACAGTAGTTCTCAAGTTG(Xba I)
反应体系为：100μl；反应程序为：先94℃ 8min；在94℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 45s，30次循环；最后72℃ 5min。
将PCR产物，用Xba I酶切，纯化后与先用EcoR I酶切，平端化后再用Xba I酶切并纯化的pMG36e(按照文献van de Guchte M，van der Vossen JM，Kok J etal. Construction of a lactococcal expression vector：expression of hen eggwhite lysozyme in Lactococcus lactis subsp.lactis.Appl Environ Microbiol.1989，55(1)：224-228所述的方法构建)在16℃连接16hr，连接物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109(购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心)，用红霉素筛选得到转化子，转化子经过酶切、PCR以及DNA测序验证，将验证表明正确的含有组成型P59启动子、sPUsp45信号肽基因和重组人胰岛素基因的pMG36e重组表达载体pSW501。
用Sal I和Xba I酶切pSW501，平端化后在16℃连接16hr，连接产物用氯化钙法转化大肠杆菌JM109，用红霉素筛选得到转化子，转化子经过酶切和PCR验证，得到不含有人胰岛素基因的对照载体pSW509。
3、可表达胰岛素的工程菌的获得及其表达培养：
1)可表达胰岛素的工程菌的获得
将2μL pSW501加到50μL冰预冷的乳酸乳球菌(lactococcus lactis)MG1363(购自NIZO food research BV，Netherland)感受态细胞中混匀，将混合物加入到2mm的无菌电击杯中进行电击。电击条件为：2500V 1800V(Lb.casei ATCC27092)，400Ω，25μF。之后迅速加入1mL SGM17复苏液混匀，30℃复苏2-3h，用含有红霉素的GM17平板进行筛选，转化子经过PCR验证，证明pSW501已转化至乳酸乳球菌MG1363中，将鉴定表明含有pSW501的乳酸乳球菌MG1363工程菌命名为MG1363-pSW501。将pSW501转化干酪乳杆菌(lactobacillus casei)ATCC27092(美国菌种保藏中心，保藏编号ATCC27092)，转化方法与乳酸乳球菌MG1363转化方法除下述条件，其它步骤均相同：电击条件为：1800V，400Ω，25μF。复苏液使用1mLMRS+0.5M Sucrose，用含有红霉素的MRS平板进行筛选鉴定，将鉴定表明含有pSW501的干酪乳杆菌ATCC27092工程菌命名为ATCC27092-pSW501。对照质粒pSW509的转化方法和转化子鉴定同上，将鉴定表明含有pSW509的乳酸乳球菌MG1363工程菌命名为MG1363-pSW509，将鉴定表明含有pSW509的干酪乳杆菌ATCC27092工程菌命名为ATCC27092-pSW509。
2)可表达胰岛素的工程菌的表达产物检测
将工程菌MG1363-pSW501或MG1363-pSW509分别接种至装有3ml GM17液体培养基(每升中含有蛋白胨5g，大豆蛋白胨5g，牛肉膏5g，酵母提取物2.5g，葡萄糖5g，β-磷酸甘油二钠，19g，维生素C 0.5g，1M MgSO4 1ml，加适量水溶解，定容至1000ml，固体培养基加1.2％琼脂。MRS培养基：酶水酪素10g，酵母粉10g，牛肉浸膏10g，葡萄糖20g，柠檬酸氢二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，K2HPO4 2g，MnSO4·4H2O 0.25g，NaAc 5g，Tween-80 1ml)试管中30℃静置过夜后，按体积百分含量为1％接种量(107cfu/ml)接种于装有20ml GM17液体培养基试管中，30℃静置培养至OD600至0.4-0.7之间。将ATCC27092-pSW501或ATCC27092-pSW509分别用MRS培养基(每升中含有酶水酪素10g，酵母粉10g，牛肉浸膏10g，葡萄糖20g，柠檬酸氢二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，K2HPO4 2g，MnSO4·4H2O 0.25g，NaAc 5g，Tween-80 1ml)，按照上述工程菌MG1363-pSW501或MG1363-pSW509的培养方法进行培养至OD600至0.4-0.7之间。
分别离心收集菌体和培养基上清。分别取培养基上清1.6ml，加入0.4ml浓度为0.8g/ml的三氯乙酸溶液，冰上静置20min，离心后沉淀用40μL 50mM NaOH溶液溶解，制得上清浓缩物。
分别将收集的菌体超声破碎后，在4℃下21000g离心45min，沉淀用TES溶液(含有10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA和0.005g/ml SDS的溶液)溶解，得到细胞壁组分，上清为细胞质组分。分别将得到的工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501、MG1363-pSW509或ATCC27092-pSW509的三个组分(培养液上清液、细胞壁组分、细胞质组分)进行抗原鉴定。具体方法如下所示：
表达产物的Western-blot鉴定：
SDS-PAGE采用Tricine电泳系统，16.5％浓度的分离胶。分别取上述工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501、MG1363-pSW509(工程菌MG1363-pSW501的阴性对照)或ATCC27092-pSW509(工程菌ATCC27092-pSW501的阴性对照)的三个组分(培养液上清液、细胞壁组分、细胞质组分)样品各10μl，加入样品缓冲液10μl(100mmol/L Tris-HCl，pH6.8，200mmol/l DTT，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)，水浴煮沸3min，20μl全部点到上样孔中。以人胰岛素(购自中国药品生物制品检定所，货号：140633)为阳性对照，人胰岛素与小分子量标准用同样的方法处理点样。用7mA稳流电泳约2hr后，调电流至15mA，约6hr后停止电泳。SDS-PAGE电泳结束后，凝胶不进行染色，用于Western-blot。将胶用蒸馏水冲洗凝胶，再将凝胶在电转移液(10mM CAPS，pH11，20％甲醇)中浸润，用电转移的方法将蛋白转移至PVDF膜上，转移在冰浴中进行，电流100mA过夜。转有蛋白的PVDF膜在封闭液(质量百分含量为5％的脱脂奶粉溶液，用PBS(NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L，pH7.4)配制)中室温封闭1hr，用PBS洗膜三次，每次8min；然后在室温下与一抗(胰岛素多克隆抗体，购自中国原子能科学研究院)溶液保温1hr，用PBS洗膜三次，每次8min；与二抗溶液(抗豚鼠抗抗体，购自北京市科海军舟生物科技发展中心，货号E18))37℃保温1hr；用PBST(PBS+0.0001g/ml的Tween20)洗膜三次，每次8min；将膜与化学发光增强剂室温孵育3min后封入保鲜膜，压入胶片曝光显影。
Western-blot结果如图3所示，结果表明，只有工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501的细胞壁样品，在10800Da大小处出现一特异的杂交条带，为胰岛素与信号肽SPUsp45的融合蛋白，而且其抗原特异性较好，表明重组工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501的胰岛素表达产物存在于细胞壁上。而工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501的培养液上清液和细胞质组分，以及对照工程菌MG1363-pSW509和ATCC27092-pSW509的三种组分均没有特异的杂交条带。图3中A为乳酸乳球菌工程菌MG1363-pSW501；B.干酪乳杆菌ATCC27092-pSW501；A和B中，R-INS为胰岛素对照，P为细胞质组分，SN为培养液上清浓缩物，CW为细胞壁组分，P’，SN’，CW’：分别为P，SN，CW的阴性对照的细胞质组分、培养液上清浓缩物，和细胞壁组分。
3)可表达胰岛素的工程菌的表达浓度的筛选：
工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501的培养方法同步骤2)，其中用MRS液体培养基替代GM17液体培养基，具体方法如下：
将工程菌MG1363-pSW501、ATCC27092-pSW501分别接种至装有3ml MRS液体培养基(每升中含有酶水酪素10g，酵母粉10g，牛肉浸膏10g，葡萄糖20g，柠檬酸氢二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，K2HPO4 2g，MnSO4·4H2O 0.25g，NaAc 5g，Tween-801ml)或GM17液体培养基(工程菌MG1363-pSW501用GM17液体培养基，ATCC27092-pSW501用MRS液体培养基)试管中30℃静置过夜后，按体积百分含量为1％接种量(107cfu/ml)接种于装有20ml MRS液体培养基或GM17液体培养基(工程菌MG1363-pSW501用GM17液体培养基，ATCC27092-pSW501用MRS液体培养基)试管中，30℃静置培养。
按照上述培养方法分别培养工程菌MG1363-pSW501，得到OD600为0.126，0.225，0.452，0.887，1.115和1.326的工程菌MG1363-pSW501培养液，培养工程菌ATCC27092-pSW501得到OD600为0.316，0.413，0.433，0.613，0.833和1.158工程菌ATCC27092-pSW501培养液；
在上述不同浓度工程菌MG1363-pSW501培养液中分别取5×109个工程菌MG1363-pSW501细胞，在上述不同浓度工程菌ATCC27092-pSW501培养液中分别取109个工程菌ATCC27092-pSW501细胞；按照步骤2的方法，分别提取细胞壁组分，分别进行Western-blot检测；
结果如图4所示，结果表明工程菌MG1363-pSW501和ATCC27092-pSW501都是在OD600为0.4左右时表达量最高，之后逐渐下降，说明它们均在生长旺盛的对数期表达量较高。而且表达产物在干酪乳杆菌工程菌ATCC27092-pSW501中不仅表达时间要长于乳酸乳球菌工程菌MG1363-pSW501，而且表达量也明显高于乳酸乳球菌工程菌MG1363-pSW501。图4中A为工程菌MG1363-pSW501，5×109个细胞的细胞壁组分；其中泳道1-6分别为OD600为0.126，0.225，0.452，0.887，1.115和1.326的工程菌MG1363-pSW501培养液中取的细胞壁组分的结果；图4中B为工程菌ATCC27092-pSW501，109个细胞的细胞壁组分；其中泳道1-6分别为OD600为0.316，0.413，0.433，0.613，0.833和1.158工程菌ATCC27092-pSW501培养液中取的细胞壁组分的结果。
实施例2、工程菌ATCC27092-pSW501作为口服疫苗的动物效果实验
1、工程菌ATCC27092-pSW501活菌的培养收集
将工程菌ATCC27092-pSW501接种至按体积百分比1％(107cfu/ml)接种量接种于MRS培养基，30℃静置培养至OD600 0.3-0.4。收集菌体作为非肥胖糖尿病(NOD)小鼠口服治疗疫苗，以干酪乳杆菌ATCC27092按照同样的方法培养至OD600 0.3-0.4，收集菌体做为对照。
2、工程菌ATCC27092-pSW501对非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的口服效果实验
4周龄非肥胖糖尿病(NOD)小鼠(购自中国医学科学院实验动物研究所)18只，将其随机分为PBS组，对照组和实验组，每组各6只。PBS组用0.4mL PBS灌胃，对照组用步骤1收集的干酪乳杆菌ATCC27092菌体按1010个细胞/只小鼠的量(用0.4ml PBS悬浮)灌胃，实验组用步骤1收集的含有胰岛素基因的干酪乳杆菌工程菌ATCC27092-pSW501菌体按照1010细胞/只小鼠的量(用0.4ml PBS悬浮)灌胃，第一周每天灌胃一次，此后每周一次。
1)在NOD小鼠肠道内的存活时间检测
从灌胃后第二天连续6天取实验组和对照组小鼠粪便1颗，加1mL无菌水充分混匀，稀释10倍后涂布于MRS平板培养基上，PCR鉴定是否有工程菌ATCC27092-pSW501或工程菌ATCC27092-pSW509存在。结果表明，实验组和对照组给小鼠口服工程菌后第一天，所有鼠的肠道内均能检测到工程菌的存在。口服后第二天，仍有大部分鼠肠道能检测到工程菌，但第三天所有小鼠均检测不到其的存在。该结果表明工程菌ATCC27092-pSW501和对照工程菌ATCC27092-pSW509均可在NOD小鼠肠道内存活48h以上，和直接口服胰岛素相比，工程菌能延长胰岛素在小鼠体内的作用时间。具体结果如表2所示：
表2.工程菌ATCC27092-pSW501在NOD小鼠肠道内的存活时间
| 时间 | |||
| 组别 | 第1天 | 第2天 | 第3天 |
| 实验组 | 6/6 | 5/6 | 0/6 |
| 对照组 | 6/6 | 4/6 | 0/6 |
2)NOD小鼠血清中重组人胰岛素(R-INS)特异性抗体的分析：
将步骤1收集的工程菌ATCC27092-pSW501菌体按照实施例1中步骤3中的方法提取细胞壁组分，将提取的细胞壁组分用Tricine SDS-PAGE进行分离，转移至PVDF膜上。
将12周龄的对照组、PBS组、实验组小鼠各取3只小鼠的血清，以1∶20稀释(用封闭液稀释，封闭液为质量百分含量为5％的脱脂奶粉溶液，用PBS配制)作为一抗，1∶500稀释的抗小鼠IgG-HRP(购自北京市科海军舟生物科技发展中心，货号E18)作为二抗，分别与一张按上述方法制备的PVDF膜进行Western blotting检测，具体方法按照实施例1步骤3中的步骤2)的方法进行。
结果如图5所示，结果表明实验组小鼠体内产生了带有信号肽SPUsp45的R-INS特异性的抗体，而其他两组并未发现特异性抗体的存在。这表明，工程菌ATCC27092-pSW501可成功刺激NOD小鼠免疫系统产生抗体。
3)NOD小鼠血清中IL-4水平分析：
取喂养至12周龄的对照组、PBS组、实验组小鼠，每组取4只，每只取血0.3mL，37℃放置1h，4℃过夜，5000g离心5min制备血清。用小鼠IL-4 ELISA Kit(晶美生物工程有限公司，货号：FMK0005-96)检测血清中IL-4的含量。用均数t检验统计结果。结果表明，对照组血清中IL-4水平为31.917±0.417pg/mL，与PBS组29.167±1.448pg/mL相比有显著差异(P＜0.05)，而实验组血清中IL-4水平为38.583±2.083pg/mL，与PBS组、对照组相比则有明显升高(P＜0.05)(图6)。作为免疫耐受相关的典型细胞因子IL-4的升高，表明工程菌ATCC27092-pSW501可促进NOD小鼠免疫耐受的产生。
序列表
<160>3
<210>1
<211>59
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Ser Pro Asn Gly Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile
35 40 45
Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
50 55
<210>2
<211>180
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
tttgtcaacc aacatttatg tggatcacat ttagtagaag ctttgtatct tgtttgtggt 60
gaacgtggat ttttctatac acctaagaca cgtagatctc ctaatggaaa acgtggtatt 120
gttgaacaat gctgtacatc aatctgttca ttgtatcaac ttgagaacta ctgtaactaa 180
<210>3
<211>184
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
cttttttttg atcccctaac caaagaagcg cgtaatatca gggtttaaga gacaataaga 60
aaaaaagatt gaaaaagtga cattaaattc ttgacaggga gagataggtt tgatagaata 120
taataggggt accgagctcg aattcctgca gcccaaatcg cgaaaccgaa cttaatggga 180
ggaa 184
Claims (1)
1.含有重组人胰岛素编码基因的工程菌在制备治疗糖尿病口服疫苗中的应用；
所述重组人胰岛素的氨基酸残基序列如序列表中序列1所示；
所述重组人胰岛素编码基因是序列表中SEQ ID NO：2的自5′端第1-177位核苷酸序列；所述重组人胰岛素编码基因的5′端还连接有方便编码的蛋白在所述工程菌的细胞壁中表达的信号肽基因；所述信号肽基因为SPUsp45信号肽基因；所述SPUsp45信号肽基因的核苷酸序列是GENBANK号为M60178的自5′端第101-214位核苷酸序列；所述信号肽基因的5′端还连接有组成型表达启动子；
所述工程菌是将所述重组人胰岛素编码基因通过原核表达载体转入到乳酸菌中，筛选得到可表达所述重组人胰岛素的工程菌；所述乳酸菌为干酪乳杆菌(lactobacillus casei)ATCC 27092或乳酸乳球菌(lactococcus lactis)MG1363；
所述糖尿病为I型糖尿病。
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| Y. DIEYE等.Design of a Protein-Targeting System for Lactic Acid Bacteria.JOURNAL OF BACTERIOLOGY183 14.2001,183(14),第4157-4166页. |
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| 侯慧丽等.乳酸菌用作口服疫苗传递载体的研究.生物技术通报 3.2007,(3),第72-74页. |
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