CN110950968A - gp96-猪瘟E2融合蛋白及其制备方法和疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种gp96‑猪瘟E2融合蛋白及其制备方法和疫苗，涉及生物技术领域。该gp96‑猪瘟E2融合蛋白含有gp96片段和猪瘟E2片段。使用该gp96‑猪瘟E2融合蛋白免疫机体能够显著提高机体的细胞免疫水平和体液免疫水平。

Description

gp96-猪瘟E2融合蛋白及其制备方法和疫苗

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种gp96-猪瘟E2融合蛋白及其制备方法和疫苗。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性，致死性传染病，严重威胁养猪业的发展。在我国，对该病主要的防控策略仍然以疫苗免疫为主，目前，市场上猪瘟疫苗主要依靠引起抗体水平来达到对机体的保护，但对有包膜的RNA病毒来说，机体的主要防御方式以细胞免疫为主，因此，细胞免疫对猪瘟防控非常重要。

传统猪瘟疫苗为C株弱毒疫苗，安全性虽然较高，但是临床应用，无法区分野毒感染和疫苗免疫毒，对于有净化要求的养殖场来说，新型猪瘟E2亚单位疫苗是个不错的选择，既能产生较好的免疫保护，而且还能提供鉴别诊断，有利于养殖场进一步做猪瘟精华。但是目前E2亚单位疫苗不能有力的提高机体的细胞免疫水平。因此，一种能够有效的提高机体细胞免疫水平的猪瘟E2亚单位疫苗是目前需要的。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种gp96-猪瘟E2融合蛋白，该gp96-猪瘟E2融合蛋白免疫后能够显著提高机体的细胞免疫水平。

本发明的第二目的在于提供编码上述gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因。

本发明的第三目的在于提供和gp96-猪瘟E2融合蛋白相关的生物材料。

本发明的第四目的在于提供上述gp96-猪瘟E2融合蛋白的制备方法。

本发明的第五目的在于提供一种疫苗，该疫苗包含上述gp96-猪瘟E2融合蛋白、上述基因和上述生物材料中的至少一种。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种gp96-猪瘟E2融合蛋白，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白含有gp96片段和猪瘟E2片段。

优选地，所述gp96片段包括gp96的ATP结合区；

优选地，所述gp96片段的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示序列，或为以SEQ IDNO.1所示序列为基础经密码子优化的序列。

优选地，所述猪瘟E2片段的核苷酸序列为如SEQ ID NO.2所示序列，或为以SEQ IDNO.2所示序列为基础经密码子优化的序列。

优选地，gp96-猪瘟E2融合蛋白由氨基端至羧基端依次含有gp96片段和猪瘟E2片段；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的羧基端含有KDEL序列；

优选地，所述KDEL序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白含有信号肽；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白含有蜂素信号肽；

优选地，所述蜂素信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白中还含有标签；

优选地，所述标签包括His标签、Flag标签、NusA标签、SUMO标签、GST标签和MBP标签中的一种或多种。

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白由昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达；

优选地，昆虫细胞包括High FiveTM细胞。

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白由氨基端至羧基端依次为蜂素信号肽、标签、gp96片段、猪瘟E2片段和KDEL序列；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID NO.5所示序列；或为和SEQ ID NO.5所示序列90％以上同源性的序列。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了编码上述gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因。

优选地，所述基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO.5所示序列，或为和SEQ ID NO.5所示序列90％以上同源性的序列。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，该生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；该生物材料表达上述gp96-猪瘟E2融合蛋白和/或含有编码上述gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的制备方法，该制备方法包括在宿主中表达编码所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因；

优选地，使用昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达所述gp96-猪瘟E2融合蛋白；

优选地，使用杆状病毒表达系统Bac-to-Bac构建表达所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的杆状病毒表达载体，然后在昆虫细胞中表达所述gp96-猪瘟E2融合蛋白；

优选地，所述昆虫细胞包括High FiveTM细胞。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗包含上述gp96-猪瘟E2融合蛋白、上述基因和上述生物材料中的至少一种；

优选地，所述疫苗包括所述gp96-猪瘟E2融合蛋白；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白由氨基端至羧基端依次为蜂素信号肽、标签、gp96片段、猪瘟E2片段和KDEL序列；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID NO.5所示序列。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的gp96-猪瘟E2融合蛋白含有gp96片段和猪瘟E2片段，通过将热休克蛋白gp96片段和猪瘟E2片段融合，能够有效促进机体产生细胞免疫反应，提高机体中IFN-γ的表达水平，同时还能在一定程度上提高机体的体液免疫水平。上述gp96-猪瘟E2融合蛋白制备方法简单，只需在宿主中表达即可。本发明提供的疫苗具有良好的免疫原性，免疫机体后能够使机体产生较高的细胞免疫水平和体液免疫水平，能够有效的清除猪瘟病毒，达到预防和治疗的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的重组杆粒PCR鉴定结果；

图2为本发明实施例提供的S.1344-E2K蛋白和E2K蛋白纯化前Western Blot鉴定结果；

图3为本发明实施例提供的S.1344-E2K蛋白和E2K蛋白纯化后Western Blot鉴定结果；

图4为本发明实施例提供的S.1344-E2K蛋白Elisa检测gp96特异性的实验结果；

图5为本发明实施例提供的S.1344-E2K蛋白Elisa检测猪瘟E2特异性的实验结果；

图6为本发明实施例提供的E2K载体分别在sf9细胞和High FiveTM细胞中增殖后Elisa检测猪瘟E2特异性的实验结果；

图7为本发明效果例中小鼠首免后第5天血清中IFN-γ含量；

图8为本发明效果例中小鼠二免后第14天猪瘟抗体阻断率；

图9为本发明效果例中小鼠二免后第21天猪瘟抗体阻断率。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种gp96-猪瘟E2融合蛋白，该gp96-猪瘟E2融合蛋白含有gp96片段和猪瘟E2片段。

热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。根据同源程度和分子量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP和泛素等多个亚家族。gp96属于HSP90亚家族的重要成员，在正常组织和肿瘤组织中均有广泛表达，是细胞内质网中含量最丰富的热休克蛋白。

gp96在免疫调节中具有重要的作用。低剂量的外源gp96注射小鼠能显著激活小鼠的免疫系统，高剂量的外源gp96注射小鼠后显著抑制小鼠的免疫系统。热休克蛋白gp96首要功能是作为分子伴侣，在一些肿瘤细胞表面可检测到gp96，在肿瘤免疫中发挥重要作用，是一种潜在的抗肿瘤疫苗。gp96具有特异性结合抗原肽，增强抗原呈递作用，成为一种天然佐剂。结合抗原肽gp96可与抗原呈递细胞表面受体CD91等分子相互作用，内吞进入细胞，从而呈递给MHC I类分子，介导特异性T细胞免疫应答，极大地提高了细胞免疫水平。gp96可作为调节因子，可诱导抗原特异性T细胞对癌症和传染病的反应，增强先天和适应性免疫反应。

将gp96片段与猪瘟E2蛋白融合后得到的gp96-猪瘟E2融合蛋白，免疫小鼠后可显著提高小鼠血清中IFN-γ蛋白水平，IFN-γ主要由活化的T细胞产生，说明gp96-猪瘟E2融合蛋白能够有效促进机体产生细胞免疫。gp96-猪瘟E2融合蛋白优选由氨基端至羧基端依次含有gp96片段和猪瘟E2片段，gp96片段位于靠氨基端一侧，免疫效果更佳。本发明所述的“含有”指的是gp96-猪瘟E2融合蛋白中除去含有gp96片段和猪瘟E2片段，还可以含有本领域常规的功能片段，例如信号肽、连接肽和标签等，本发明对此不作限制。本发明提供的gp96-猪瘟E2融合蛋白中各功能片段可以直接连接，也可以间隔几个氨基酸残基，或通过连接肽连接，本发明对此不做限制。

gp96在进化过程中高度保守，成熟的gp96蛋白由3个结构域组成：N端结构域，含有ATP结合区及抗原肽结合区；中间结构域；以及含有二聚化区的C端结构域；还有内质网定位信号KDEL模体。gp96具有ATP酶活性，gp96 N端片段N355内有多肽的结合位点。N端结构域和C端结构域具有免疫佐剂功能。在一些优选的实施方式中，所述gp96片段包括gp96的ATP结合区。gp96运用其ATP酶活性，通过结合并水解ATP提供的能量，将与其结合的抗原肽加工修剪后直接从自身转移到MHC I类分子上，形成MHC I-肽复合物，该复合物经高尔基体表达到细胞表面，供CD8⁺T细胞的TCR识别，同时gp96再被释放出来。再呈递的过程则是异源性抗原的呈递过程。

在一些优选的实施方式中，gp96片段的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示序列，或为以SEQ ID NO.1所示序列为基础经密码子优化的序列。

在一些优选的实施方式中，猪瘟E2片段的核苷酸序列为如SEQ ID NO.2所示序列，或为以SEQ ID NO.2所示序列为基础经密码子优化的序列。

在一些优选的实施方式中，gp96-猪瘟E2融合蛋白的羧基端含有KDEL序列。KDEL序列是内质网滞留信号：赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸。内质网是MHCⅠ类分子提成抗原肽的最主要场所，添加内质网滞留信号能够使gp96-猪瘟E2融合蛋白靶向转运至内质网腔，增强gp96-猪瘟E2融合蛋白被MHCⅠ类分子提呈的效率。细胞毒性T淋巴细胞通过TCR识别MHCⅠ类分子-肽复合物，然后自身活化，杀死靶细胞。因此添加了KDEL序列的gp96-猪瘟E2融合蛋白能够通过提高MHCⅠ类分子对自身的提呈效率，进一步提高机体的细胞免疫水平。KDEL序列的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.3所示。

在一些优选的实施方式中，为了促进gp96-猪瘟E2融合蛋白在宿主中的分泌表达，优选gp96-猪瘟E2融合蛋白中还含有信号肽。gp96-猪瘟E2融合蛋白优选含有蜂素信号肽，蜂素信号肽能够引导外源蛋白进入内质网进行糖基化修饰，并增强糖蛋白的表达量，并促进外源蛋白分泌表达。蜂素信号肽的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.4所示。

在一些优选的实施方式中，为了便于gp96-猪瘟E2融合蛋白的分离和纯化，gp96-猪瘟E2融合蛋白中还含有标签，标签可选择本领域常规的蛋白标签，本发明不做限制，包括但不限于His标签、Flag标签、NusA标签、SUMO标签、GST标签和MBP标签中的一种或多种。可选地，在氨基端或羧基端设置一个标签，例如在氨基端设置His标签或在羧基端设置GST标签。可选地，在氨基端和羧基端同时设置标签，例如在氨基端设置His标签，同时在羧基端设置Flag标签等方式。

在一些优选的实施方式中，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白由昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达。昆虫细胞杆状病毒表达载体系统具有真核表达系统所具有的传统优势，同时兼具原核表达系统重组蛋白表达量高的特点；还具有构建周期短和蛋白表达水平高的有益效果。昆虫细胞杆状病毒表达载体系统中，昆虫细胞优选采用High FiveTM细胞。本发明经实验发现，使用High FiveTM细胞表达gp96-猪瘟E2融合蛋白表达量更高，且表达更稳定。

在一些优选的实施方式中，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白由氨基端至羧基端依次为蜂素信号肽、标签、gp96片段、猪瘟E2片段和KDEL序列，结构如下：蜂素信号肽-标签-gp96片段-猪瘟E2片段-KDEL序列。上述结构的gp96-猪瘟E2融合蛋白的核苷酸序列为如SEQ IDNO.5所示序列；或为和SEQ ID NO.5所示序列90％以上同源性的序列。

其中“同源性”指的是核苷酸序列与SEQ ID NO.5所示序列的相似性。和SEQ IDNO.5所示序列90％以上同源性的序列和SEQ ID NO.5所示序列的差异包括但不限于由一个或者几个核苷酸的缺失、突变、减少或增加导致，这些改变使核苷酸序列与SEQ ID NO.5所示序列的核苷酸序虽然有差异，但是具有90％以上，例如可以为但不限于为90％、92％、95％、98％或99％的相似度。核苷酸序列和SEQ ID NO.5所示序列的同源性可以通过本领域常规软件实现，本发明对此不做限制。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了编码上述gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因。编码gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因优选为如SEQ ID NO.5所示序列，或为和SEQ ID NO.5所示序列90％以上同源性的序列。其中同源性例如可以为但不限于为90％、92％、95％、98％或99％。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种生物材料，该生物材料能够表达所述gp96-猪瘟E2融合蛋白和/或含有编码所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因。所述生物材料可以含有编码所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因并表达gp96-猪瘟E2融合蛋白，也可以只含有编码gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因，而不表达gp96-猪瘟E2融合蛋白，例如只对所述基因进行克隆而不表达。所述生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种。

可选地，所述生物材料是含有编码gp96-猪瘟E2融合蛋白的表达盒，表达盒中还含有启动子和终止子等功能元件；可选地，所述生物材料是重组微生物，例如大肠杆菌，该大肠杆菌转化有包含上述编码gp96-猪瘟E2融合蛋白基因的质粒，这些质粒能够在大肠杆菌中克隆，以增加质粒以及所述基因的拷贝量；可选地，所述生物材料是表达gp96-猪瘟E2融合蛋白的昆虫细胞系，昆虫细胞系中的gp96-猪瘟E2融合蛋白通过含有编码gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因的杆状病毒表达载体表达。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的制备方法，该制备方法包括在宿主中表达编码所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因，该方法制备gp96-猪瘟E2融合蛋白操作简单。

在一些优选的实施方式中，使用昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达所述gp96-猪瘟E2融合蛋白，昆虫细胞杆状病毒表达载体系统构建周期短，能容纳大分子的插入片段，并且表达量高。优选使用杆状病毒表达系统Bac-to-Bac构建表达所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的杆状病毒表达载体，Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统可以快速、高效的制备重组杆状病毒，该系统依赖一个位点特异性的转座将一个完整的表达元件重组到杆状病毒的穿梭质粒上，该表达系统构建周期短，构建效率高。优选使用High FiveTM细胞表达gp96-猪瘟E2融合蛋白，表达量较高，且表达产物稳定。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种疫苗，该疫苗包含上述gp96-猪瘟E2融合蛋白、上述编码gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因和上述生物材料中的至少一种。可选地，所述疫苗为亚单位疫苗，所述疫苗以gp96-猪瘟E2融合蛋白为主要活性物质；可选地，所述疫苗为DNA疫苗，所述疫苗以上述编码gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因为主要活性物质，所述编码gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因可以包含在载体中，例如所述疫苗含有编码gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因的质粒；可选地，所述疫苗包括多联疫苗，除含有上述gp96-猪瘟E2融合蛋白外，还含有其他致病性微生物的抗原等。本发明提供的疫苗还可以包括本领域的常规辅料，例如免疫佐剂、稳定剂和保护剂等，本发明对此不作限制。

在一些优选的实施方式中，以gp96-猪瘟E2融合蛋白作为疫苗的主要活性成分免疫效果更佳，其中gp96-猪瘟E2融合蛋白优选由氨基端至羧基端依次为蜂素信号肽、标签、gp96片段、猪瘟E2片段和KDEL序列的融合蛋白，更优选SEQ ID NO.5所示序列编码的融合蛋白。通过实验发现SEQ ID NO.5所示序列编码的融合蛋白能够显著提高小鼠的IFN-γ的表达量，是不含有gp96片段的融合蛋白免疫小鼠后IFN-γ的表达量的将近两倍。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例

1.S.1344-E2K、E2K重组杆粒的构建：

首先对序列进行密码子优化，通过杆状病毒表达系统Bac-to-Bac，利用pFastBac-Dual载体和DH10BacTM E.coli，构建重组供体质粒S.1344-E2K和E2K。在S.1344-E2K和E2K的N端添加蜂素信号肽，蜂素信号肽后面添加His标签，以便于蛋白纯化。S.1344的序列为S.S.gp96N端第22-448位氨基酸，S.1344-E2K蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，E2K蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。具体的实验步骤如下：

pFastBac-dual供体质粒进行双酶切，酶切体系为：10×Cutsmart 2μL，BamH I、Hind III各1μL，pFastBac-dual供体质粒1μg，ddH₂O补至20μL，37℃孵育1h。将酶切产物1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收纯化。

利用无缝克隆技术设计无缝克隆引物，PCR扩增S.1344和E2K目的序列，胶回收纯化序列。pFast-dual-HBM-His-S.1344-E2K-optimized无缝克隆引物如表1所示：

表1

pFast-Dual-HBM-His-S.1344-E2K无缝克隆引物如表2所示：

表2

引物	序列(5'-3')	编号
			HBM(BamHI)-F	CCCACCATCGGGCGCGGATCCATGAAATTCTTAGTCAACGTTGCCC	SEQ ID NO.11
TEV(S.1344)R	ATCCACTTCATCCTCCATATGGCCTTGAAAGTACAAGT	SEQ ID NO.12
			S.1344(TEV)F	CTTTCAAGGCCATATGGAGGATGAAGTGGATGTGGATG	SEQ ID NO.13
E2(SpeI)R	TCGAAAGCGGCCGCGACTAGTCTACAGTTCATCTTTAGCGAAATAG	SEQ ID NO.14
			TEV(E2)R	CCTCAGCACTTTCATCATATGGCCTTGAAAGTACAAGT	SEQ ID NO.15
E2(TEV)F	CTTTCAAGGCCATATGATGAAAGTGCTGAGGGGC	SEQ ID NO.16

将回收纯化的双酶切pFastBac-dual供体质粒和回收纯化的S.1344和E2K基因做无缝连接克隆。利用Takara公司的In-fusion Cloning Kit无缝连接后，转化DH5α感受态细胞构建阳性供体质粒，阳性供体质粒转化DH10Bac菌株中，冰上融解100μl DH10Bac感受态细胞，加入供体质粒，冰浴30min，42℃热激45s，立即再置回冰中2min后加入500μL LB液体培养基(不含抗生素)，置于37℃220rpm摇床中培养1h。摇好的菌液150μL均匀涂布到LA-Bac平板(含50ng/μL卡那霉素、7ng/μL庆大霉素、10ng/μL四环素、100μg/mL X-gal、40μg/mLIPTG)，倒置于37℃培养箱，培养过夜，4℃放置24h。挑若干个白色单菌落划线到新的LB-Bac平板上，选蓝色克隆作为对照，37℃培养过夜，4℃放置24h，重复蓝白斑表型验证，并PCR鉴定。将阳性菌液接种于三抗LB液体培养基中(含50ng/μL卡那霉素、7ng/μL庆大霉素、10ng/μL四环素)，37℃220rpm摇床中培养到稳定状态。

重组杆粒Bac-S.1344-E2K和Bac-E2K的提取：取上述培养的菌液1.5mL离心14,000×g，1min；弃尽上清，加入0.3mL Solution I(15mM Tris-HCl pH8.0，10mM EDTA，100μg/mLRNaseA)，轻轻吹打重悬菌体；再加入0.3mL Solution II(0.2M NaOH，1％SDS)轻轻混匀后室温下孵育5min；慢慢地边加入0.3mL 3M PH为5.5的乙酸钾边混匀，出现白色沉淀后，置于冰上5～10min后14,000×g，4℃离心10min；吸取上清缓慢地加入到含有0.8mL异丙醇的EP管中，反复翻转5～6次充分混匀，冰上5～10min，室温下14,000×g离心15min；将上清弃掉，加入0.5mL 70％乙醇，反复翻转5～6次充分洗涤沉淀，14,000×g室温离心15min；弃尽上清，室温下自然干燥5～10min，沉淀DNA溶于40μL的ddH₂O中，于-20℃保存。

设立两组引物(亲本上下游引物、M13上游引物和亲本下游引物)对提取的重组杆粒作PCR鉴定，结果如图1所示，其中opt指的是密码子优化组。泳道M：Trans 5k DNAMarker；

泳道1-2，15-16：Bac-S.1344-E2K-opt杆粒；泳道3、23：pDul-S.1344-E2K-opt质粒对照；

泳道5-6，19-20：Bac-S.1344-E2K杆粒；泳道7：pDul-S.1344-E2K质粒对照；

泳道8-9，21-22：Bac-E2K杆粒；泳道10：pDul-E2K质粒对照；

泳道12-13，17-18：Bac-E2K-opt杆粒；泳道14，24：pDul-E2K-opt质粒对照。

泳道1-14为使用亲本引物扩增结果，泳道15-24为使用亲本上游引物和载体下游引物的扩增结果。

2.重组杆状病毒获取及S.1344-E2K、E2K融合蛋白表达

按照Bac-to-Bac说明书在脂质体Cellfectin^TM II Reagent(说明书)作用下将重组供体质粒转染Sf9昆虫细胞，获得携带目的基因的重组杆状病毒P1代，同时设立未转染的正常Sf9细胞作对照。用sf9细胞，当细胞密度达到1.5×10⁶个/mL时，以MOI＝0.1加入重组杆状病毒P1代感染，27℃培养细胞出现病变，收集P2代病毒液，扩增病毒。

使用High FiveTM细胞扩增病毒，当细胞密度达到1.5×10⁶个/mL，以MOI＝1加入重组杆状病毒感染High FiveTM细胞，72h后细胞活率约为50％收获细胞培养物，收获蛋白。结果证明S.1344-E2K和E2K表达产物稳定，且密码子优化的比未优化的表达量高。表达蛋白优选High FiveTM细胞。

3.S.1344-E2K、E2K的鉴定

Western Blot鉴定：一抗为CSFV的阳性血清、阴性血清，二抗为HRP标记的兔抗猪二抗；一抗为His-TagMouse McAb，二抗为HRP标记的Goat Anti-Mouse二抗；一抗为GRP94Rabbit polyAb，二抗为HRP标记的Goat anti-rabbit。结果如图2和3所示。

图2中泳道M：Thermo 26616 Marker；泳道1：细胞对照上清；泳道2：pDual空杆粒对照上清；泳道3：E2K上清；泳道4：E2K(opt)上清；泳道5：S.1344-E2K上清；泳道6：S.1344-E2K(opt)上清；泳道7：pDual空杆粒对照沉淀；泳道8：E2K沉淀；泳道9：E2K(opt)沉淀；泳道10：S.1344-E2K沉淀；泳道11：S.1344-E2K(opt)沉淀。

图3中(A)～(D)中泳道M：Thermo 26619 Marker；泳道1：S.1344-E2K；泳道2：S.1344-E2K(opt)。图3中(E)中泳道M：Thermo 26619 Marker；泳道1：E2K(opt)；泳道2：E2K。

gp96的双抗夹心ELISA方法定量定性建立：Rat mAb GRP94(1：2000)包被板，4℃过夜；加检测样品，37℃孵育1h；加一抗为GRP94 Rabbit polyAb(1：2000)，37℃孵育1h；二抗为Goat anti-rabbit(1：1000)，37℃孵育30min；TMB底物显色；终止液终止后读取OD450nm数值。S.1344-E2K(优化前和优化后)的Elisa检测结果如图4～图6所示，可以明显看出，密码子优化组(opt组)蛋白表达量高。

E2的双抗夹心ELISA方法检测：WH303酶标板，加检测样品，37℃孵育1h；加酶标二抗为1B6-HRP(1：400)，37℃孵育30min；TMB底物显色；终止液终止后读取OD450nm数值。S.1344-E2K(优化前和优化后)的Elisa检测结果如图5所示。E2K(优化前和优化后)的Elisa检测结果如图6所示。

效果例

S.1344-E2K和E2K蛋白通过Ni柱纯化，与佐剂201乳化，制备乳化抗原，按照5μg和25μg抗原量皮下免疫小鼠，免疫方案如下。

5-6周龄Balb/c雌鼠，分成7组，免疫方案如表1所示：

首免后第5天，应用ELISA方法检测小鼠血清中IFN-γ蛋白水平，见图7。融合蛋白E2K和S.1344-E2K组免疫小鼠血清中IFN-γ蛋白含量较E2对照组均有升高(无论是5μg免疫组还是25μg免疫组)，说明实施例提供的S.1344-E2K融合蛋白对于融合蛋白激活机体的细胞免疫应答有促进作用。

猪瘟E2阻断ELISA方法应用于检测实验动物血清样本内抗体水平的高低，高于40％，可以有效保护动物，具体结果见图8和图9。二免后14天，5μg免疫组可能由于免疫剂量低，均未能达到理想的免疫效果，25μg免疫组中融合蛋白E2K和S.1344-E2K组与E2对照相比，免疫效果差异显著，并且E2抗体阻断率能有效预防猪瘟病毒感染。

二免后21天，25μg各免疫组免疫效果均较好(E2抗体阻断率>40％)，各组间统计学无差异。结合二免后14天猪瘟E2抗体阻断率结果，融合蛋白免疫小鼠，小鼠血清中猪瘟保护性抗体较E2对照组更快的达到免疫要求。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天康生物(上海)有限公司

天康生物股份有限公司

<120> gp96-猪瘟E2融合蛋白及其制备方法和疫苗

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2415

<212> DNA

<213> 猪（sus scrofa）

<400> 1

atgagggccc tgtgggtgct gggcctgtgc tgcgtcctgc tgaccttcgg gtctgtccgc 60

gctgaggatg aagtggatgt ggatgggaca gtggaagaag atctgggtaa aagtagagaa 120

ggttccagga cagatgatga aatagtacag agagaggaag aagctattca attggatgga 180

ttaaatgcat cccaaataag agaacttaga gagaaatcag aaaaatttgc cttccaagct 240

gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattat ataaaaataa agagattttc 300

ctaagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttggata agataaggct aatatcactg 360

actgatgaaa atgctcttgc tggaaatgag gagttaacgg tcaaaattaa gtgtgacaag 420

gagaagaacc tgctccatgt cacagacact ggtgtgggaa tgacccggga agagttggtt 480

aaaaaccttg gtaccatagc caaatctggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgacggag 540

gcacaagaag atggccagtc aacttcggaa ctgattggcc agttcggtgt tggcttctat 600

tctgccttcc ttgtagcaga taaagttatt gtcacgtcaa aacacaacaa tgacacccag 660

cacatctggg agtccgactc caatgaattt tctgtaattg ctgaccccag aggaaacacc 720

ttaggacggg gaacgacaat tacccttgtt ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 780

ttggatacaa ttaaaaatct cgtgaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat 840

gtatggagca gcaagactga aactgtcgag gaacctatgg aagaagaaga agcagcaaaa 900

gaagaaaaag aggaatctga tgatgaagct gcagtagaag aagaagaaga agaaaagaaa 960

ccaaaaacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa tgatatcaaa 1020

ccaatatggc agagaccatc aaaggaagta gaagatgatg aatacaaagc tttctacaaa 1080

tcattttcaa aggaaagcga cgaccccatg gcttatatcc acttcactgc tgaaggggaa 1140

gttaccttca agtcaatttt atttgtaccc acatctgccc cacgtgggct atttgatgaa 1200

tatggatcta agaagagtga ttacattaag ctgtatgtgc gccgcgtgtt catcacagac 1260

gacttccatg atatgatgcc caagtacctg aacttcgtca agggcgttgt ggactcagat 1320

gatctcccct tgaatgtttc ccgtgagact ctgcagcaac ataaactcct taaggtgatt 1380

agaaaaaagc ttgtccgtaa aactctggac atgatcaaga agattgctga tgagaagtat 1440

aatgatactt tttggaaaga atttggtacc aacatcaagc ttggtgtgat agaagaccac 1500

tcaaatagaa cacgtcttgc taaacttctt agattccagt cttctcatca tccaagtgac 1560

attactagtc tagaccagta tgtggaaaga atgaaggaga agcaagacaa aatctacttc 1620

atggctgggt ccagcaggaa agaggctgaa tcttctccat ttgttgagcg acttctgaaa 1680

aagggctatg aagtgattta tctcacagaa cctgtggacg aatactgcat tcaggctctt 1740

cctgagtttg atgggaagag gtttcagaat gttgccaagg aaggagtgaa gtttgatgaa 1800

agtgagaaaa gtaaggagaa tcgtgaagca gttgagaaag aatttgagcc tctgctcaat 1860

tggatgaaag ataaagccct caaggacaag attgaaaagg ctgtggtatc tcagcgcctg 1920

acagagtctc catgtgccct cgtagccagc cagtacggat ggtcaggcaa catggagaga 1980

atcatgaaag cccaagccta ccagacgggc aaggacatct ctacaaatta ctatgccagt 2040

cagaagaaaa catttgaaat taaccccaga catccactga tcagggacat gcttcgacga 2100

gttaaggaag atgaagatga caaaacagtt tcagatcttg ctgtggtttt gtttgaaaca 2160

gcaacactgc ggtcagggta tctcttacca gacactaaag cctatggaga tcgaatagaa 2220

agaatgcttc gcctcagctt aaacattgac cccgatgcaa aggtggaaga ggaacccgaa 2280

gaagaacctg aagaaacaac agaggacacc acagaagaca cagagcaaga cgacgacgaa 2340

gaaatggatg cgggggcaga tgaggaagaa caagaaacat cagagacatc tacagctgaa 2400

aaagatgaac tgtaa 2415

<210> 2

<211> 1092

<212> DNA

<213> 猪（sus scrofa）

<400> 2

atgaaagtgc tgaggggcca gatcgtgcag ggagtggtgt ggctgctgct ggtgacaggc 60

gctcagggaa ggctggcttg caaggaagac tacaggtacg ccatctcctc cacagatgag 120

attggactgc tgggcgctgg aggactgacc accacctgga aggagtacaa ccatgacctg 180

cagctgaacg acggcaccgt gaaggcctcc tgtgtggctg gctcctttaa ggtgaccgcc 240

ctgaatgtgg tgagccggag gtacctggcc tccctgcaca agaaggccct gcctacctcc 300

gtgaccttcg aactgctgtt cgacggcacc aacccctcca ccgaggagat gggcgatgat 360

ttccggagcg gcctgtgtcc cttcgacacc tcccccgtcg tgaagggcaa gtacaacaca 420

accctgctga acggcagcgc cttttacctg gtgtgcccta tcggctggac cggcgtcatc 480

gagtgcacag ccgtctcccc taccaccctg cggacagaag tggtgaagac cttccggagg 540

gacaagcctt tcccccaccg gatggactgt gtcaccacca ccgtggagaa cgaggatctg 600

ttctactgca agctgggcgg caactggacc tgcgtgaagg gcgagcctgt ggtgtacacc 660

ggaggcgtgg tgaagcagtg caggtggtgc ggcttcgact tcgatggacc tgacggcctg 720

cctcactatc ccatcggcaa gtgcattctg gccaacgaga ccggctaccg gatcgtggat 780

tccaccgact gcaaccggga cggcgtggtc atctccaccg aaggcagcca cgagtgcctg 840

atcggcaaca ccacagtgaa ggtgcatgct agcgatgaaa ggctgggacc catgccctgc 900

aggcctaagg agattgtctc ctccgccggc cccgtgatga agaccagctg caccttcaat 960

tacaccaaga ccctgaagaa ccggtactac gagcctcggg actcctactt ccagcagtac 1020

atgctgaagg gcgagtacca gtactggttc gacctggatg ccaccgacag gcacagcgac 1080

tatttcgctt ag 1092

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aaagatgaac tg 12

<210> 4

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tatacatttc ttacatctat 60

gcg 63

<210> 5

<211> 2511

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tatacatttc ttacatctat 60

gcggatcgat cccttaaggg ccatcaccat caccatcacg aaaacttgta ctttcaaggc 120

catatggagg acgaggtgga cgtggacggt accgtggagg aggacctggg taagtcccgc 180

gagggttccc gcaccgacga cgagatcgtg cagcgcgagg aggaggctat ccagctggac 240

ggtctgaacg cttcccagat ccgcgagctg cgcgagaagt ccgagaagtt cgctttccag 300

gctgaggtga accgcatgat gaagctgatc atcaactccc tgtacaagaa caaggagatc 360

ttcctgcgcg agctgatctc caacgcttcc gacgctctgg acaagatccg cctgatctcc 420

ctgaccgacg agaacgctct ggctggtaac gaggagctga ccgtgaagat caagtgcgac 480

aaggagaaga acctgctgca cgtgaccgac accggtgtgg gtatgacccg cgaggagctg 540

gtgaagaacc tgggtaccat cgctaagtcc ggtacctccg agttcctgaa caagatgacc 600

gaggctcagg aggacggtca gtccacctcc gagctgatcg gtcagttcgg tgtgggtttc 660

tactccgctt tcctggtggc tgacaaggtg atcgtgacct ccaagcacaa caacgacacc 720

cagcacatct gggagtccga ctccaacgag ttctccgtga tcgctgaccc tcgcggtaac 780

accctgggtc gcggtaccac catcaccctg gtgctgaagg aggaggcttc cgactacctg 840

gagctggaca ccatcaagaa cctggtgaag aagtactccc agttcatcaa cttccctatc 900

tacgtgtggt cctccaagac cgagaccgtg gaggagccta tggaggagga ggaggctgct 960

aaggaggaga aggaggagtc cgacgacgag gctgctgtgg aggaggagga ggaggagaag 1020

aagcctaaga ccaagaaggt ggagaagacc gtgtgggact gggagctgat gaacgacatc 1080

aagcctatct ggcagcgccc ttccaaggag gtggaggacg acgagtacaa ggctttctac 1140

aagtccttct ccaaggagtc cgacgaccct atggcttaca tccacttcac cgctgagggt 1200

gaggtgacct tcaagtccat cctgttcgtg cctacctccg ctcctcgcgg tctgttcgac 1260

gagtacggtt ccaagaagtc cgactacatc aagctgtacg tgcgccgcgt gttcatcacc 1320

gacgacttcc acgacatgat gcctaagtac ctgaacttcg tgaagggtgt ggtggactcc 1380

gacgacctgc ctctgaacgt gtcccgcatg aaggtgctgc gcggtcagat cgtgcagggt 1440

gtggtgtggc tgctgctggt gaccggtgct cagggtcgcc tggcttgcaa ggaggactac 1500

cgctacgcta tctcctccac cgacgagatc ggtctgctgg gtgctggtgg tctgaccacc 1560

acctggaagg agtacaacca cgacctgcag ctgaacgacg gtaccgtgaa ggcttcctgc 1620

gtggctggtt ccttcaaggt gaccgctctg aacgtggtgt cccgccgcta cctggcttcc 1680

ctgcacaaga aggctctgcc tacctccgtg accttcgagc tgctgttcga cggtaccaac 1740

ccttccaccg aggagatggg tgacgacttc cgctccggtc tgtgcccttt cgacacctcc 1800

cctgtggtga agggtaagta caacaccacc ctgctgaacg gttccgcttt ctacctggtg 1860

tgccctatcg gttggaccgg tgtgatcgag tgcaccgctg tgtcccctac caccctgcgc 1920

accgaggtgg tgaagacctt ccgccgcgac aagcctttcc ctcaccgcat ggactgcgtg 1980

accaccaccg tggagaacga ggacctgttc tactgcaagc tgggtggtaa ctggacctgc 2040

gtgaagggtg agcctgtggt gtacaccggt ggtgtggtga agcagtgccg ctggtgcggt 2100

ttcgacttcg acggtcctga cggtctgcct cactacccta tcggtaagtg catcctggct 2160

aacgagaccg gttaccgcat cgtggactcc accgactgca accgcgacgg tgtggtgatc 2220

tccaccgagg gttcccacga gtgcctgatc ggtaacacca ccgtgaaggt gcacgcttcc 2280

gacgagcgcc tgggtcctat gccttgccgc cctaaggaga tcgtgtcctc cgctggtcct 2340

gtgatgaaga ccaactgcac cttcaactac accaagaccc tgaagaaccg ctactacgag 2400

cctcgcgact cctacttcca gcagtacatg ctgaagggtg agtaccagta ctggttcgac 2460

ctggacgcta ccgaccgcca ctccgactac ttcgctaagg acgagctgta a 2511

<210> 6

<211> 1209

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaaattct tagtcaacgt tgcccttgtt tttatggtcg tatacatttc ttacatctat 60

gcggatcgat ggggacatca ccatcaccat caccatcacc atatgatgaa ggtgctgcgc 120

ggtcagatcg tgcagggtgt ggtgtggctg ctgctggtga ccggtgctca gggtcgcctg 180

gcttgcaagg aggactaccg ctacgctatc tcctccaccg acgagatcgg tctgctgggt 240

gctggtggtc tgaccaccac ctggaaggag tacaaccacg acctgcagct gaacgacggt 300

accgtgaagg cttcctgcgt ggctggttcc ttcaaggtga ccgctctgaa cgtggtgtcc 360

cgccgctacc tggcttccct gcacaagaag gctctgccta cctccgtgac cttcgagctg 420

ctgttcgacg gtaccaaccc ttccaccgag gagatgggtg acgacttccg ctccggtctg 480

tgccctttcg acacctcccc tgtggtgaag ggtaagtaca acaccaccct gctgaacggt 540

tccgctttct acctggtgtg ccctatcggt tggaccggtg tgatcgagtg caccgctgtg 600

tcccctacca ccctgcgcac cgaggtggtg aagaccttcc gccgcgacaa gcctttccct 660

caccgcatgg actgcgtgac caccaccgtg gagaacgagg acctgttcta ctgcaagctg 720

ggtggtaact ggacctgcgt gaagggtgag cctgtggtgt acaccggtgg tgtggtgaag 780

cagtgccgct ggtgcggttt cgacttcgac ggtcctgacg gtctgcctca ctaccctatc 840

ggtaagtgca tcctggctaa cgagaccggt taccgcatcg tggactccac cgactgcaac 900

cgcgacggtg tggtgatctc caccgagggt tcccacgagt gcctgatcgg taacaccacc 960

gtgaaggtgc acgcttccga cgagcgcctg ggtcctatgc cttgccgccc taaggagatc 1020

gtgtcctccg ctggtcctgt gatgaagacc aactgcacct tcaactacac caagaccctg 1080

aagaaccgct actacgagcc tcgcgactcc tacttccagc agtacatgct gaagggtgag 1140

taccagtact ggttcgacct ggacgctacc gaccgccact ccgactactt cgctaaggac 1200

gagctgtaa 1209

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccaccatcg ggcgcggatc catgaaattc ttagtcaac 39

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gcgcagcacc ttcatgcggg acacgttcag 30

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctgaacgtgt cccgcatgaa ggtgctgcgc ggt 33

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctagtacttc tcgacaagct tttacagctc gt 32

<210> 11

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cccaccatcg ggcgcggatc catgaaattc ttagtcaacg ttgccc 46

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

atccacttca tcctccatat ggccttgaaa gtacaagt 38

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctttcaaggc catatggagg atgaagtgga tgtggatg 38

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tcgaaagcgg ccgcgactag tctacagttc atctttagcg aaatag 46

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cctcagcact ttcatcatat ggccttgaaa gtacaagt 38

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctttcaaggc catatgatga aagtgctgag gggc 34

Claims (10)

1.一种gp96-猪瘟E2融合蛋白，其特征在于，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白含有gp96片段和猪瘟E2片段。

2.根据权利要求1所述的gp96-猪瘟E2融合蛋白，其特征在于，所述gp96片段包括gp96的ATP结合区；

优选地，所述gp96片段的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示序列，或为以SEQ ID NO.1所示序列为基础经密码子优化的序列。

3.根据权利要求1所述的gp96-猪瘟E2融合蛋白，其特征在于，所述猪瘟E2片段的核苷酸序列为如SEQ ID NO.2所示序列，或为以SEQ ID NO.2所示序列为基础经密码子优化的序列。

4.根据权利要求1所述的gp96-猪瘟E2融合蛋白，其特征在于，gp96-猪瘟E2融合蛋白由氨基端至羧基端依次含有gp96片段和猪瘟E2片段；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的羧基端含有KDEL序列；

优选地，所述KDEL序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白含有信号肽；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白含有蜂素信号肽；

优选地，所述蜂素信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白中还含有标签；

优选地，所述标签包括His标签、Flag标签、NusA标签、SUMO标签、GST标签和MBP标签中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的gp96-猪瘟E2融合蛋白，其特征在于，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白由昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达；

优选地，昆虫细胞包括High FiveTM细胞。

6.根据权利要求1-5任一项所述的gp96-猪瘟E2融合蛋白，其特征在于，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白由氨基端至羧基端依次为蜂素信号肽、标签、gp96片段、猪瘟E2片段和KDEL序列；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID NO.5所示序列；或为和SEQ ID NO.5所示序列90％以上同源性的序列。

7.编码权利要求1-6任一项所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因；

优选地，所述基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO.5所示序列，或为和SEQ ID NO.5所示序列90％以上同源性的序列。

8.生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、重组微生物或细胞系中的至少一种；所述生物材料表达权利要求1-6任一项所述gp96-猪瘟E2融合蛋白和/或含有权利要求7所述的基因。

9.权利要求1-6任一项所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的制备方法，包括在宿主中表达编码所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的基因；

优选地，使用昆虫细胞杆状病毒表达载体系统表达所述gp96-猪瘟E2融合蛋白；

优选地，使用杆状病毒表达系统Bac-to-Bac构建表达所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的杆状病毒表达载体，然后在昆虫细胞中表达所述gp96-猪瘟E2融合蛋白；

优选地，所述昆虫细胞包括High FiveTM细胞。

10.疫苗，其特征在于，包含权利要求1-6任一项所述gp96-猪瘟E2融合蛋白、权利要求7所述的基因和权利要求8所述的生物材料中的至少一种；

优选地，所述疫苗包括所述gp96-猪瘟E2融合蛋白；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白由氨基端至羧基端依次为蜂素信号肽、标签、gp96片段、猪瘟E2片段和KDEL序列；

优选地，所述gp96-猪瘟E2融合蛋白的核苷酸序列为如SEQ ID NO.5所示序列。

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