JP2761809B2 - クイラヤ サポニンアジュバントおよびこれを含むワクチン製剤 - Google Patents
クイラヤ サポニンアジュバントおよびこれを含むワクチン製剤Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、新規なサポニン成分およびこれを免疫アジ
ュバントとして含むワクチン製剤に関する。さらに詳細
には、本発明は、分子量が約956ダルトンである新規サ
ポニン成分、クイラヤ サポナリヤ モリナ（Quillaja
saponaria Morina）の樹皮からサポニン成分を分離す
る方法、このサポニン成分を免疫アジュバントとして含
むワクチン製剤、前記サポニン成分および第２アジュバ
ントを含有するアジュバント組成物を用いることによっ
て抗原に対する免疫応答を増加させる方法に関する。
ュバントとして含むワクチン製剤に関する。さらに詳細
には、本発明は、分子量が約956ダルトンである新規サ
ポニン成分、クイラヤ サポナリヤ モリナ（Quillaja
saponaria Morina）の樹皮からサポニン成分を分離す
る方法、このサポニン成分を免疫アジュバントとして含
むワクチン製剤、前記サポニン成分および第２アジュバ
ントを含有するアジュバント組成物を用いることによっ
て抗原に対する免疫応答を増加させる方法に関する。
発明の背景 生命工学技術は、種々のウイルス外被蛋白質から由来
した組換え抗原を含むワクチンの開発に重大な寄与をし
た。しかし、HIV（Human Immunodeficiency Virus）お
よびHCV（Hepatitis C Virus）によって惹起される疾病
のような脅威的な疾病を予防できる効果的なワクチン
は、組換え抗原の比較的弱い抗原性を増強させ得る効果
的なアジュバントがないなどの理由のため、まだ開発さ
れていない。したがって、かかるワクチンに用いられる
適切なアジュバントを開発するための研究が集中的に行
われてきた。
した組換え抗原を含むワクチンの開発に重大な寄与をし
た。しかし、HIV（Human Immunodeficiency Virus）お
よびHCV（Hepatitis C Virus）によって惹起される疾病
のような脅威的な疾病を予防できる効果的なワクチン
は、組換え抗原の比較的弱い抗原性を増強させ得る効果
的なアジュバントがないなどの理由のため、まだ開発さ
れていない。したがって、かかるワクチンに用いられる
適切なアジュバントを開発するための研究が集中的に行
われてきた。
現在、水酸化アルミニウム（ミョウバン（alum））
は、その毒性が低いためヒト用として認可された唯一の
アジュバントである。しかし、ミョウバンは、HIV、HC
V、HSV（Herpes Simplex Virus）によって惹起される疾
病、および住血吸虫症（Schistosomiasis）、百日咳（w
ooping cough）および腸チフス（typhoid）に対する抗
原と共に用いる時には効果がないと知られている（Sanc
hez−Pescador et al.,J.Immunol.，141,1720−1727（1
988）;James,S.L.,et al.,ibid.，140,2753−2759（198
8）;Edelman R.,Rev.Infect.Dis.,２,370−383（198
0））。したがって、新しいアジュバントを開発する必
要性が認識され、かかる必要性に応えて、多くのアジュ
バント、たとえば、サポニン、油乳剤（oil emulsio
n）、モノホスホリルリピドＡ（monophosphoryl lipid
A）およびフロイントアジュバント（Freund′s adjuvan
t）などが提案されてきた。しかし、これらのアジュバ
ントはそれぞれ、満足できないアジュバント活性、高い
毒性および／または好ましくない副作用を起こすなどの
問題点を有すると明らかになった。たとえば、フロイン
トアジュバントは肉芽腫性炎（granulomatous inflamma
tion）を起こし得、先行技術に記載されたサポニンは下
記の毒性問題が生じ得る。
は、その毒性が低いためヒト用として認可された唯一の
アジュバントである。しかし、ミョウバンは、HIV、HC
V、HSV（Herpes Simplex Virus）によって惹起される疾
病、および住血吸虫症（Schistosomiasis）、百日咳（w
ooping cough）および腸チフス（typhoid）に対する抗
原と共に用いる時には効果がないと知られている（Sanc
hez−Pescador et al.,J.Immunol.，141,1720−1727（1
988）;James,S.L.,et al.,ibid.，140,2753−2759（198
8）;Edelman R.,Rev.Infect.Dis.,２,370−383（198
0））。したがって、新しいアジュバントを開発する必
要性が認識され、かかる必要性に応えて、多くのアジュ
バント、たとえば、サポニン、油乳剤（oil emulsio
n）、モノホスホリルリピドＡ（monophosphoryl lipid
A）およびフロイントアジュバント（Freund′s adjuvan
t）などが提案されてきた。しかし、これらのアジュバ
ントはそれぞれ、満足できないアジュバント活性、高い
毒性および／または好ましくない副作用を起こすなどの
問題点を有すると明らかになった。たとえば、フロイン
トアジュバントは肉芽腫性炎（granulomatous inflamma
tion）を起こし得、先行技術に記載されたサポニンは下
記の毒性問題が生じ得る。
サポニンは、飲料の発泡剤、繊維工業における洗剤お
よびその他多くの商業的な用途を有する植物配糖体（gl
ycosides）である。最近、南アメリカ産木であるクイラ
ヤ サポナリヤ モリナ（Quillaja Saponaria Molin
a）の樹皮から抽出して得られるクイラヤ サポニンの
混合物が体液性および細胞性免疫応答を示すことが明ら
かになった（Espinet R.G.,Gac.Vet.，13,268−273（19
51）;Dalsgaard K.,Arch.Gesamte Virus Forsch.，44,2
43−254（1974）;Morein B.,Nature，322,287−288（19
88））。精製したクイラヤ サポニンの形態は“Quil−
A"という名で市販されている（Iscotec AB,Sweden;およ
びSuperfos Biosector a/s,Frydenlundsvej 30,DK−Ved
baek,Denmark）。
よびその他多くの商業的な用途を有する植物配糖体（gl
ycosides）である。最近、南アメリカ産木であるクイラ
ヤ サポナリヤ モリナ（Quillaja Saponaria Molin
a）の樹皮から抽出して得られるクイラヤ サポニンの
混合物が体液性および細胞性免疫応答を示すことが明ら
かになった（Espinet R.G.,Gac.Vet.，13,268−273（19
51）;Dalsgaard K.,Arch.Gesamte Virus Forsch.，44,2
43−254（1974）;Morein B.,Nature，322,287−288（19
88））。精製したクイラヤ サポニンの形態は“Quil−
A"という名で市販されている（Iscotec AB,Sweden;およ
びSuperfos Biosector a/s,Frydenlundsvej 30,DK−Ved
baek,Denmark）。
しかし、Quil−Ａは、トリテルペノイド クイライン
酸、すなわちアグリコンが、グリコシド結合を通じて色
々な種類や長さの糖残基に結合している一般的化学構造
で表される多数の同類配糖体の混合物である。また、こ
のグリコシドの各成分はそれぞれ、非常に多様なアジュ
バント活性および毒性を示し、したがって、Quil−Ａは
ヒト用の医薬製剤としては安全でないと知られている
（Kersten et al.,Infect.Immun.，56,432−438（198
8））。したがって、安全で効果的なクイラヤ サポニ
ン成分を同定し、その製造方法を開発するための研究が
行われた。
酸、すなわちアグリコンが、グリコシド結合を通じて色
々な種類や長さの糖残基に結合している一般的化学構造
で表される多数の同類配糖体の混合物である。また、こ
のグリコシドの各成分はそれぞれ、非常に多様なアジュ
バント活性および毒性を示し、したがって、Quil−Ａは
ヒト用の医薬製剤としては安全でないと知られている
（Kersten et al.,Infect.Immun.，56,432−438（198
8））。したがって、安全で効果的なクイラヤ サポニ
ン成分を同定し、その製造方法を開発するための研究が
行われた。
ケンシルら（Kensil）は、クイラヤ樹皮粗抽出物のメ
タノール可溶性分画をメタノール／水（58:42（v/v））
中で40mM酢酸を用いる逆相高圧液体クロマトグラフィー
（“RP−HPLC"）で分離して数種の精製されたサポニン
成分を得た。このうち、QS−18と命名された成分は、高
い溶血活性、すなわち、非常に高い毒性を示すことが明
らかになった。一方、QS−21と命名された成分は、低い
毒性を示した反面、高いアジュバント活性を示した。ま
た、QS−７およびQS−17と命名された成分もアジュバン
ト効果を有すると報告された（Kensil et al.,J.Immuno
l.,146,431−437（1991）;Kensil et al.,米国特許第
５、057、540号（1991））。さらに、上述のQS−21成分
はHIVおよびその他のウイルス抗原の免疫活性を増強さ
せると報告された（Kensil et al.,JAMA，199,1423−14
27（1991）;Wu,J.W.,et al.,J.Immunol.,148,1519−152
5（1992））。
タノール可溶性分画をメタノール／水（58:42（v/v））
中で40mM酢酸を用いる逆相高圧液体クロマトグラフィー
（“RP−HPLC"）で分離して数種の精製されたサポニン
成分を得た。このうち、QS−18と命名された成分は、高
い溶血活性、すなわち、非常に高い毒性を示すことが明
らかになった。一方、QS−21と命名された成分は、低い
毒性を示した反面、高いアジュバント活性を示した。ま
た、QS−７およびQS−17と命名された成分もアジュバン
ト効果を有すると報告された（Kensil et al.,J.Immuno
l.,146,431−437（1991）;Kensil et al.,米国特許第
５、057、540号（1991））。さらに、上述のQS−21成分
はHIVおよびその他のウイルス抗原の免疫活性を増強さ
せると報告された（Kensil et al.,JAMA，199,1423−14
27（1991）;Wu,J.W.,et al.,J.Immunol.,148,1519−152
5（1992））。
しかし、ケンシルらによって開示された製造方法は、
シリカゲルクロマトグラフィーおよびRP−HPLCを共に使
用しなければならないので過度に複雑である。そのう
え、分離したQS−７、QS−17、QS−18およびQS−21成分
は、1,800ないし2,600ダルトン範囲の分子量を有し、こ
れは樹皮抽出物に存在するクイラヤ サポニンのごく一
部のみに属する。
シリカゲルクロマトグラフィーおよびRP−HPLCを共に使
用しなければならないので過度に複雑である。そのう
え、分離したQS−７、QS−17、QS−18およびQS−21成分
は、1,800ないし2,600ダルトン範囲の分子量を有し、こ
れは樹皮抽出物に存在するクイラヤ サポニンのごく一
部のみに属する。
一方、ケルステンら（Kersten）は、疎水性RP−HPLC
を用いて23個以上のQuil−Ａ成分を分離した。QA−３と
命名された特定成分は、２次元または３次元免疫原性複
合体の形態であり、ステロール、リン脂質および抗原と
共に用いられる場合、毒性およびアジュバント活性の面
においてQS−21より優れていると明らかになった（Kers
ten et al.,WO92/06710）。
を用いて23個以上のQuil−Ａ成分を分離した。QA−３と
命名された特定成分は、２次元または３次元免疫原性複
合体の形態であり、ステロール、リン脂質および抗原と
共に用いられる場合、毒性およびアジュバント活性の面
においてQS−21より優れていると明らかになった（Kers
ten et al.,WO92/06710）。
しかし、ケルステンらによって開示された免疫原性複
合体に含まれているステロールを注射製剤として使用す
ることは認められなかった。また、ケルステンらによっ
て分離及び開示されたQA−３を含むすべての成分は、1,
300ないし2,400ダルトン範囲の分子量を有するサポニン
に限られる。このように、先行研究はクイラヤ樹皮抽出
物の他の部分、特に、低分子量クイラヤ サポニン成分
において、効果的で安全なアジュバントを発見する可能
性については全く言及していない。
合体に含まれているステロールを注射製剤として使用す
ることは認められなかった。また、ケルステンらによっ
て分離及び開示されたQA−３を含むすべての成分は、1,
300ないし2,400ダルトン範囲の分子量を有するサポニン
に限られる。このように、先行研究はクイラヤ樹皮抽出
物の他の部分、特に、低分子量クイラヤ サポニン成分
において、効果的で安全なアジュバントを発見する可能
性については全く言及していない。
発明の概要 したがって、本発明の目的は、ワクチンに用いられる
場合、毒性がないかほとんどなく、高いアジュバント活
性を示す新規なサポニン成分を提供することである。
場合、毒性がないかほとんどなく、高いアジュバント活
性を示す新規なサポニン成分を提供することである。
本発明の他の目的は、クイラヤ サポナリヤ モリナ
の樹皮から前記サポニン成分を分離する方法を提供する
ことである。
の樹皮から前記サポニン成分を分離する方法を提供する
ことである。
本発明のまた他の目的は、任意の他のアジュバントと
共に前記サポニン成分をアジュバントとして含むワクチ
ン製剤を提供することである。
共に前記サポニン成分をアジュバントとして含むワクチ
ン製剤を提供することである。
本発明のまた他の目的は、任意の第２アジュバントと
共に前記サポニン成分をアジュバントとして用いること
によって、ワクチン製剤中の抗原に対する免疫応答を増
加させる方法を提供することである。
共に前記サポニン成分をアジュバントとして用いること
によって、ワクチン製剤中の抗原に対する免疫応答を増
加させる方法を提供することである。
本発明の一つの態様によって、クイラヤ サポナリヤ
モリナの樹皮から分離し、毒性がないかほとんどない
反面、第２アジュバントと配合すると高い相乗的アジュ
バント活性を示し、約950ダルトンの分子量を有するQS
−L1と命名されたサポニン成分が提供される。
モリナの樹皮から分離し、毒性がないかほとんどない
反面、第２アジュバントと配合すると高い相乗的アジュ
バント活性を示し、約950ダルトンの分子量を有するQS
−L1と命名されたサポニン成分が提供される。
図面の簡単な説明 本発明の前記および他の目的と特徴は、本願に添付さ
れた図面を参照とした下記の説明から明らかになる。
れた図面を参照とした下記の説明から明らかになる。
図１は、クイラヤ サポナリヤ モリナの樹皮抽出物
のRP−HPLC分析結果を示し； 図２は、Quil−ＡのRP−HPLC分析結果を示し； 図３は、Quil−Ａおよび精製したサポニン成分QS−L
1、QS−L2、QS−L3、QS−L4およびQS−L5のシリカゲル
薄層クロマトグラフィー（TLC）結果を示し； 図４は、QS−L1を電子噴霧イオン化−質量分析装置
（EMI−MS）で分析した結果を示し； 図５は、リン酸塩緩衝食塩水（PBS）、QS−L1、QS−L
2、QS−L3、QS−L4、QS−L5およびQuil−Ａのヒツジ赤
血球に対する溶血活性を示し、 図6Aおよび6Bは、HBsAg抗原を用いた免疫化において
観察されたQS−L1およびQS−L1/ミョウバンのアジュバ
ント活性をミョウバンおよびフロイント完全アジュバン
ト（FCA）のアジュバント活性と比べた結果を示す。
のRP−HPLC分析結果を示し； 図２は、Quil−ＡのRP−HPLC分析結果を示し； 図３は、Quil−Ａおよび精製したサポニン成分QS−L
1、QS−L2、QS−L3、QS−L4およびQS−L5のシリカゲル
薄層クロマトグラフィー（TLC）結果を示し； 図４は、QS−L1を電子噴霧イオン化−質量分析装置
（EMI−MS）で分析した結果を示し； 図５は、リン酸塩緩衝食塩水（PBS）、QS−L1、QS−L
2、QS−L3、QS−L4、QS−L5およびQuil−Ａのヒツジ赤
血球に対する溶血活性を示し、 図6Aおよび6Bは、HBsAg抗原を用いた免疫化において
観察されたQS−L1およびQS−L1/ミョウバンのアジュバ
ント活性をミョウバンおよびフロイント完全アジュバン
ト（FCA）のアジュバント活性と比べた結果を示す。
発明の詳細な説明 本発明のサポニン成分、すなわち、QS−L1は、クイラ
ヤ サポナリヤ モリナの樹皮から分離され、毒性がな
いかほとんどない反面、ミョウバンのような他のアジュ
バントと配合すると驚くほど高い免疫アジュバント活性
を示す。
ヤ サポナリヤ モリナの樹皮から分離され、毒性がな
いかほとんどない反面、ミョウバンのような他のアジュ
バントと配合すると驚くほど高い免疫アジュバント活性
を示す。
本願に用いられた用語“免疫アジュバント”は、抗原
と共にヒトに投与するか、試験管内で試験する場合、抗
原に対する試験対象の免疫応答を増強させる化合物をい
う。
と共にヒトに投与するか、試験管内で試験する場合、抗
原に対する試験対象の免疫応答を増強させる化合物をい
う。
QS−L1は、電子含むイオン化法を用いた質量分析法
（ESI−MS）に従って分析した結果、m/z979.4の分子イ
オンを有し、また、水／アセトニトリル（7:3（v/v））
中で0.1重量％トリフルオロ酢酸水溶液を1ml/分の流速
で用いる4.6x250mmバイダック（Vydac）C4カラム上の逆
相高圧液体クロマトグラフィーで分析した場合約13.98
分の保持時間を有することによっても特定化される。
（ESI−MS）に従って分析した結果、m/z979.4の分子イ
オンを有し、また、水／アセトニトリル（7:3（v/v））
中で0.1重量％トリフルオロ酢酸水溶液を1ml/分の流速
で用いる4.6x250mmバイダック（Vydac）C4カラム上の逆
相高圧液体クロマトグラフィーで分析した場合約13.98
分の保持時間を有することによっても特定化される。
本発明は、またねキュウ．サポナリヤ モリナの樹皮
からQS−L1を分離する方法を提供し、これは下記のよう
に要約できる。まず、キュウ．サポナリヤ モリナの形
成層を水で処理し、この粗抽出物を凍結乾燥することに
よってキュウ．サポナリヤ モリナの樹皮抽出物を製造
する。
からQS−L1を分離する方法を提供し、これは下記のよう
に要約できる。まず、キュウ．サポナリヤ モリナの形
成層を水で処理し、この粗抽出物を凍結乾燥することに
よってキュウ．サポナリヤ モリナの樹皮抽出物を製造
する。
次いで、 （ａ）酢酸水溶液中の樹皮抽出物溶液を遠心分離して上
澄液を得； （ｂ）この上澄液を限外透析膜を用いて酢酸水溶液で透
析し； （ｃ）生成した透析物を遠心分離して上澄液を得； （ｄ）上澄液を凍結乾燥してサポニン抽出物粉末を得； （ｅ）このサポニン抽出粉末を適切な溶媒に溶かし、溶
液をRP−HPLCで分離して実質的に純粋なQS−L1を含む分
画を得る段階を含む方法によって、キュウ．サポナリヤ
モリナの樹皮抽出物からQS−L1を精製できる。
澄液を得； （ｂ）この上澄液を限外透析膜を用いて酢酸水溶液で透
析し； （ｃ）生成した透析物を遠心分離して上澄液を得； （ｄ）上澄液を凍結乾燥してサポニン抽出物粉末を得； （ｅ）このサポニン抽出粉末を適切な溶媒に溶かし、溶
液をRP−HPLCで分離して実質的に純粋なQS−L1を含む分
画を得る段階を含む方法によって、キュウ．サポナリヤ
モリナの樹皮抽出物からQS−L1を精製できる。
段階（ａ）での酢酸水溶液の濃度は、10ないし100m
M、好ましくは40mMである。段階（ｂ）で用いられた透
析膜の分子量カット−オフ値は、12ないし14kDであり、
これは低分子量の水溶性汚染物質の除去に適当である。
段階（ｅ）でRP−HPLCを用いた分離は、C4RP−HPLCカラ
ムおよび、0.1％トリフルオロ酢酸水溶液を用いて行う
ことが好ましい。
M、好ましくは40mMである。段階（ｂ）で用いられた透
析膜の分子量カット−オフ値は、12ないし14kDであり、
これは低分子量の水溶性汚染物質の除去に適当である。
段階（ｅ）でRP−HPLCを用いた分離は、C4RP−HPLCカラ
ムおよび、0.1％トリフルオロ酢酸水溶液を用いて行う
ことが好ましい。
樹皮抽出物のRP−HPLC分析結果は32以上のピークを示
す。これらのピークの多数は予備分画によってきれいに
分離され得、QS−L1と命名された新規低分子量サポニン
成分を含む高純度の種々のサポニン成分を提供する。QS
−L1は4.6x250mmバイダック（Vydac）C4カラムを用いた
時、保持時間13.98分で溶出される。QS−L1のESI−MS分
析はm/z979.4の分子イオンを示し、Na寄与分を差し引く
とQS−L1の分子量は約956ダルトンであると推論され
る。
す。これらのピークの多数は予備分画によってきれいに
分離され得、QS−L1と命名された新規低分子量サポニン
成分を含む高純度の種々のサポニン成分を提供する。QS
−L1は4.6x250mmバイダック（Vydac）C4カラムを用いた
時、保持時間13.98分で溶出される。QS−L1のESI−MS分
析はm/z979.4の分子イオンを示し、Na寄与分を差し引く
とQS−L1の分子量は約956ダルトンであると推論され
る。
また、QS−L1は、前記のRP−HPLC方法を用いてQuil−
Ａ（Superfos Biosector a/s,Frydenlundsvej 30,DK−V
edbaek,Denmark）のような他のクイラヤ抽出物から分離
し得る。
Ａ（Superfos Biosector a/s,Frydenlundsvej 30,DK−V
edbaek,Denmark）のような他のクイラヤ抽出物から分離
し得る。
QS−L1の毒性は72時間内にマウスに死をもたらす腹腔
内注射投与量から測定できる。このような実験によれ
ば、QS−L1は500μｇ以下の投与量でマウスに致命的で
ないことが明らかになった。
内注射投与量から測定できる。このような実験によれ
ば、QS−L1は500μｇ以下の投与量でマウスに致命的で
ないことが明らかになった。
QS−L1を抗原と単独で用いた場合、QS−L1は当分野で
公知のいくつかのサポニン成分、たとえば、QS−21に比
べて低い免疫アジュバント活性を示す。しかし、他のア
ジュバント、たとえば、ミョウバンと配合して用いた場
合、QS−L1は著しく高い免疫アジュバント活性を示す。
このような二つまたはその以上のアジュバントの間の強
い相乗的相互作用はこれまで報告されていない。
公知のいくつかのサポニン成分、たとえば、QS−21に比
べて低い免疫アジュバント活性を示す。しかし、他のア
ジュバント、たとえば、ミョウバンと配合して用いた場
合、QS−L1は著しく高い免疫アジュバント活性を示す。
このような二つまたはその以上のアジュバントの間の強
い相乗的相互作用はこれまで報告されていない。
したがって、本発明は、抗原および、QS−L1と他のア
ジュバント、好ましくはミョウバンを含むアジュバント
組成物からなるワクチン製剤をさらに提供する。ミョウ
バンはそれに抗原が吸着された形態であるものが好まし
い。本発明に用いるに適切は抗原は特定の抗原に限られ
るのではなく、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、HIVおよびH
CVなどの抗原を含む。本発明の製剤中の抗原の濃度は種
々の因子、たとえば、抗原の種類、求められる抗原性の
水準、接種する対象の特性および好ましい免疫程度によ
って調整できる。
ジュバント、好ましくはミョウバンを含むアジュバント
組成物からなるワクチン製剤をさらに提供する。ミョウ
バンはそれに抗原が吸着された形態であるものが好まし
い。本発明に用いるに適切は抗原は特定の抗原に限られ
るのではなく、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原、HIVおよびH
CVなどの抗原を含む。本発明の製剤中の抗原の濃度は種
々の因子、たとえば、抗原の種類、求められる抗原性の
水準、接種する対象の特性および好ましい免疫程度によ
って調整できる。
本発明のワクチン製剤は、注射可能な溶液または懸濁
液の形態であり得、これは通常の方法によって製造でき
る。
液の形態であり得、これは通常の方法によって製造でき
る。
この製剤はまた、薬剤学的に許容可能な賦形剤、担体
または希釈剤をさらに含むことができる。適切な賦形剤
は、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタ
ノールおよびこれらの混合物を含む。また、この組成物
は湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤などを追加的に含み得る。
または希釈剤をさらに含むことができる。適切な賦形剤
は、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタ
ノールおよびこれらの混合物を含む。また、この組成物
は湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤などを追加的に含み得る。
このワクチン製剤の通常的な１回投与量は、製剤の形
態によって変わり、前述した種々の関連因子に照らして
決定しなければならない。本発明のワクチン製剤中のQS
−L1の一日投与量は１〜500μｇ、好ましくは10〜50μ
ｇであり、ミョウバンの一回投与量は、好ましくは50μ
ｇ〜500μｇである。
態によって変わり、前述した種々の関連因子に照らして
決定しなければならない。本発明のワクチン製剤中のQS
−L1の一日投与量は１〜500μｇ、好ましくは10〜50μ
ｇであり、ミョウバンの一回投与量は、好ましくは50μ
ｇ〜500μｇである。
また、本発明は、サポニン成分QS−L1を、好ましくは
ミョウバンを第２アジュバントとして配合して、免疫ア
ジュバントとして用いることによって前記ワクチン製剤
中の抗原の抗原性を増加させる方法を提供する。
ミョウバンを第２アジュバントとして配合して、免疫ア
ジュバントとして用いることによって前記ワクチン製剤
中の抗原の抗原性を増加させる方法を提供する。
下記参照例および実施例は本発明をさらに詳細に説明
するために例示するのみで、本発明の範囲を限定しな
い。
するために例示するのみで、本発明の範囲を限定しな
い。
また、以下固体混合物中の固体、液体中の液体および
液体中の固体に対する百分率は、特に言及しない限り、
それぞれ重量／重量、体積／体積および重量／体積に基
づいたものである。
液体中の固体に対する百分率は、特に言及しない限り、
それぞれ重量／重量、体積／体積および重量／体積に基
づいたものである。
参照例：サポニン成分の免疫アジュバント活性測定 商品化されたEuVax（LG Chemical Ltd.,大韓民国特許
第38837号）の製造方法に従って、ミョウバンに吸着さ
れたＢ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）を製造した。H
BsAgとミョウバン（３％水酸化アルミニウム）とを10mM
リン酸ナトリウム緩衝液（1.2mM、Na2HPO4・7H2O 8.8mM
K3PO4、0.8％NaCl、pH6.3−6.5）中で、2500μｇミョウ
バンに対してHBsAg100μｇの比で混合し、混合物をオー
ビタール撹拌機（Orbital shaker、“Red Rotor"、Hoef
er、U.S.A.）で６時間撹拌してミョウバンに吸着された
HBsAgを得た。
第38837号）の製造方法に従って、ミョウバンに吸着さ
れたＢ型肝炎ウイルス表面抗原（HBsAg）を製造した。H
BsAgとミョウバン（３％水酸化アルミニウム）とを10mM
リン酸ナトリウム緩衝液（1.2mM、Na2HPO4・7H2O 8.8mM
K3PO4、0.8％NaCl、pH6.3−6.5）中で、2500μｇミョウ
バンに対してHBsAg100μｇの比で混合し、混合物をオー
ビタール撹拌機（Orbital shaker、“Red Rotor"、Hoef
er、U.S.A.）で６時間撹拌してミョウバンに吸着された
HBsAgを得た。
その後、ミョウバンに吸着されたHBsAgを用いて次の
ようにサポニン成分の免疫アジュバント活性を測定し
た。サポニン成分を2mg/mlの濃度で蒸留水に溶かした。
サポニン溶液50μｌをミョウバンに吸着されたHBsAg（1
00μgHBsAg/2500μｇミョウバン）1mlに加えてHBsAgワ
クチン注射液を製造した。50μｌのワクチン注射液を７
ないし８週齢の雌Balb/cマウス（Charle′s River Inst
itute,Japan）の背中の２点に各々皮下注射し、３週間
隔に同一量のワクチン注射液を用いて２回連続的に追加
接種をした。最終の追加接種してから17日後、マウスの
尻尾から血液試料を採取し、次のようにHBsAgに対して
形成された抗体の力価を測定した。
ようにサポニン成分の免疫アジュバント活性を測定し
た。サポニン成分を2mg/mlの濃度で蒸留水に溶かした。
サポニン溶液50μｌをミョウバンに吸着されたHBsAg（1
00μgHBsAg/2500μｇミョウバン）1mlに加えてHBsAgワ
クチン注射液を製造した。50μｌのワクチン注射液を７
ないし８週齢の雌Balb/cマウス（Charle′s River Inst
itute,Japan）の背中の２点に各々皮下注射し、３週間
隔に同一量のワクチン注射液を用いて２回連続的に追加
接種をした。最終の追加接種してから17日後、マウスの
尻尾から血液試料を採取し、次のようにHBsAgに対して
形成された抗体の力価を測定した。
精製したHBsAgを50mMホウ酸ナトリウム緩衝液（pH9.
0）に0.5μg/mlの濃度で溶かした。この溶液をマイクロ
タイタープレート（Immulon typel,microtiter plate,D
ynatech,U.S.A.）のウェルに200μl/ウェルの量で加え
た後、37℃で２時間培養した。その後、0.2％（w/v）ゼ
ラチンを含有するリン酸塩緩衝食塩水（PBS）を250μl/
ウェルの量でウェルに加えた。プレートを37℃で１時間
培養して残っている蛋白質吸着部位を遮断することによ
って、以降に起こり得る非−特異的反応を防止した。こ
のウェルを0.05％（v/v）ツイーン20を含有するPBS
（“洗浄液”）で２回洗浄した。マウスから得た血液試
料を0.25％（w/v）ゼラチン、1.0mM EDTA、１％（v/v）
トリトンＸ−100および0.02％（v/v）チメロサールを含
むPBS（“希釈液”）で400倍に希釈し、さらに前記希釈
液で２倍階段希釈法にしたがって最終的に819,200倍に
なるまでさらに希釈してウェルに加えた。37℃で２時間
培養したプレートのウェルを洗浄液で５回洗浄し、前記
希釈液を用いて4,000倍希釈した、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ（HRP）で標識された抗−マウス抗体（America
n Qualex,Cat.No.A106PS,U.S.A.）を含む溶液を200μl/
ウェルの量でウェルを加えた。
0）に0.5μg/mlの濃度で溶かした。この溶液をマイクロ
タイタープレート（Immulon typel,microtiter plate,D
ynatech,U.S.A.）のウェルに200μl/ウェルの量で加え
た後、37℃で２時間培養した。その後、0.2％（w/v）ゼ
ラチンを含有するリン酸塩緩衝食塩水（PBS）を250μl/
ウェルの量でウェルに加えた。プレートを37℃で１時間
培養して残っている蛋白質吸着部位を遮断することによ
って、以降に起こり得る非−特異的反応を防止した。こ
のウェルを0.05％（v/v）ツイーン20を含有するPBS
（“洗浄液”）で２回洗浄した。マウスから得た血液試
料を0.25％（w/v）ゼラチン、1.0mM EDTA、１％（v/v）
トリトンＸ−100および0.02％（v/v）チメロサールを含
むPBS（“希釈液”）で400倍に希釈し、さらに前記希釈
液で２倍階段希釈法にしたがって最終的に819,200倍に
なるまでさらに希釈してウェルに加えた。37℃で２時間
培養したプレートのウェルを洗浄液で５回洗浄し、前記
希釈液を用いて4,000倍希釈した、西洋ワサビペルオキ
シダーゼ（HRP）で標識された抗−マウス抗体（America
n Qualex,Cat.No.A106PS,U.S.A.）を含む溶液を200μl/
ウェルの量でウェルを加えた。
この結果物を37℃で２時間培養し、前記洗浄液で５回
洗浄した。その後、Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸（OP
D）錠剤（Sigma,U.S.A.）を50mMクエン酸／リン酸緩衝
液（pH5.5）を用いて2mg/mlの濃度で溶かして製造した
基質溶液200μｌを各ウェルに加え、プレートを室温の
暗所で30分間培養した。この結果物に4N硫酸をウェル当
り50μｌずつ加えて発色を中止させ、タイターテック
マルチスキャン プラス（Titertek Multiscan Plus（F
lowlab））を用いて492nmで各ウェルのO.D.を測定し
た。
洗浄した。その後、Ｏ−フェニレンジアミン二塩酸（OP
D）錠剤（Sigma,U.S.A.）を50mMクエン酸／リン酸緩衝
液（pH5.5）を用いて2mg/mlの濃度で溶かして製造した
基質溶液200μｌを各ウェルに加え、プレートを室温の
暗所で30分間培養した。この結果物に4N硫酸をウェル当
り50μｌずつ加えて発色を中止させ、タイターテック
マルチスキャン プラス（Titertek Multiscan Plus（F
lowlab））を用いて492nmで各ウェルのO.D.を測定し
た。
抗体力価はO.D.値が0.5に至るに必要な希釈倍数の逆
数で決定した。
数で決定した。
実施例1:クイラヤ サポナリヤ モリナからサポニン成
分の分離 （段階１）精製したサポニン抽出物の製造 キュウ．サポナリヤ モリナの樹皮を水で抽出して得
られたサポニンを50％以上含有する抽出物をベルグハン
セン社（Berghansen Corp.,Cincinnati,Ohio,U.S.A.）
から購入した。このサポニン粉末を40mM酢酸水溶液に25
0mg/mlの濃度で溶かした。生成した溶液を遠心分離機
（Beckman J2−21,JA 14）で12,000rpmで30分間遠心分
離して不溶性物質を除いた。上澄液を12ないし14kDaの
分子量カット−オフ値を有する限外透析膜（Spectrum M
edical Industries Inc.,Cat.No.132676）を用いて、50
倍容量の40mM酢酸溶液で２回透析することによって低分
子量の水溶性物質を除いた。透析物を再び遠心分離して
不溶性不純物を完全に除き、上澄液を凍結乾燥すること
によって精製されたサポニン粉末を得た。
分の分離 （段階１）精製したサポニン抽出物の製造 キュウ．サポナリヤ モリナの樹皮を水で抽出して得
られたサポニンを50％以上含有する抽出物をベルグハン
セン社（Berghansen Corp.,Cincinnati,Ohio,U.S.A.）
から購入した。このサポニン粉末を40mM酢酸水溶液に25
0mg/mlの濃度で溶かした。生成した溶液を遠心分離機
（Beckman J2−21,JA 14）で12,000rpmで30分間遠心分
離して不溶性物質を除いた。上澄液を12ないし14kDaの
分子量カット−オフ値を有する限外透析膜（Spectrum M
edical Industries Inc.,Cat.No.132676）を用いて、50
倍容量の40mM酢酸溶液で２回透析することによって低分
子量の水溶性物質を除いた。透析物を再び遠心分離して
不溶性不純物を完全に除き、上澄液を凍結乾燥すること
によって精製されたサポニン粉末を得た。
このように得られたサポニン抽出物のシリカゲル薄層
クロマトグラフィー結果は、この抽出物の組成および純
度がQuil−Ａと非常に類似するということを示す。
クロマトグラフィー結果は、この抽出物の組成および純
度がQuil−Ａと非常に類似するということを示す。
（段階２）C4 RP−HPLCによるサポニン成分の分離 段階１で得られたサポニン抽出物を0.1％トリフルオ
ロ酢酸（TFA）水溶液に20mg/mlの濃度を溶かした。生成
した溶液0.1mlを0.1％TFA溶液であらかじめ平衡化され
たC4 RP−HPLCカラム（Vydac,4.6x250mm）に1ml/分の流
速で通した。表１に示されているアセトニトリル濃度勾
配を用いて結合しているサポニンを溶出させ、溶出物を
214nmで検出した。
ロ酢酸（TFA）水溶液に20mg/mlの濃度を溶かした。生成
した溶液0.1mlを0.1％TFA溶液であらかじめ平衡化され
たC4 RP−HPLCカラム（Vydac,4.6x250mm）に1ml/分の流
速で通した。表１に示されているアセトニトリル濃度勾
配を用いて結合しているサポニンを溶出させ、溶出物を
214nmで検出した。
32個以上のサポニン成分が異なる保持時間で溶出され
ることが観察された。保持時間によって分画を集めて多
数の純粋なサポニン成分を得た。サポニン抽出物中の各
サポニン成分は相対比0.13〜32％の範囲で多様に分布し
ていた。
ることが観察された。保持時間によって分画を集めて多
数の純粋なサポニン成分を得た。サポニン抽出物中の各
サポニン成分は相対比0.13〜32％の範囲で多様に分布し
ていた。
参照例の方法に従って、精製したサポニン成分の免疫
アジュバント活性を測定し、比較的に高い免疫原性増強
効果を示す５個の成分をそれぞれQS−L1、QS−L2、QS−
L3、QS−L4およびQS−L5と命名した。この５個の成分に
該当するピークの面積（％）およびこれらの保持時間は
表２に示す。この５個の成分に該当するピークの位置は
図１に示す。
アジュバント活性を測定し、比較的に高い免疫原性増強
効果を示す５個の成分をそれぞれQS−L1、QS−L2、QS−
L3、QS−L4およびQS−L5と命名した。この５個の成分に
該当するピークの面積（％）およびこれらの保持時間は
表２に示す。この５個の成分に該当するピークの位置は
図１に示す。
QS−L1、QS−L2、QS−L3、QS−L4またはQS−L5を含む
各分画を凍結乾燥し、前記と同様なRP−HPLC手順を繰り
返して90〜97％の範囲の純度の各成分を得た。同様なRP
−HPLC手順をQuil−Ａ（Superfos Biosector a/s,Fryde
nlundsvej 30,DK−Vedbaek,Denmark）に適用したとこ
ろ、成分の相対比が樹皮抽出物からのものと多少異なる
ことを除いては、前記と同一なセットのサポニン成分が
観察された。
各分画を凍結乾燥し、前記と同様なRP−HPLC手順を繰り
返して90〜97％の範囲の純度の各成分を得た。同様なRP
−HPLC手順をQuil−Ａ（Superfos Biosector a/s,Fryde
nlundsvej 30,DK−Vedbaek,Denmark）に適用したとこ
ろ、成分の相対比が樹皮抽出物からのものと多少異なる
ことを除いては、前記と同一なセットのサポニン成分が
観察された。
（段階３）精製したサポニン成分のシリカゲル薄層クロ
マトグラフィー 段階２で得られたサポニン成分QS−L1、QS−L2、QS−
L3、QS−L4およびQS−L5各１μｇおよびQuil−Ａ（Supe
rfos Biosector a/s,Frydenlundsvej 30,DK−Vedbaek,D
enmark）40μｇをシリカゲル薄層クロマトグラフィープ
レート（Si60 HPTLC E.M.Science）に加え、展開液とし
てクロロホルム／メタノール／蒸留水（62:32:6（v/v/
v））の混合物を用いて３〜４時間溶出させた。
マトグラフィー 段階２で得られたサポニン成分QS−L1、QS−L2、QS−
L3、QS−L4およびQS−L5各１μｇおよびQuil−Ａ（Supe
rfos Biosector a/s,Frydenlundsvej 30,DK−Vedbaek,D
enmark）40μｇをシリカゲル薄層クロマトグラフィープ
レート（Si60 HPTLC E.M.Science）に加え、展開液とし
てクロロホルム／メタノール／蒸留水（62:32:6（v/v/
v））の混合物を用いて３〜４時間溶出させた。
プレートを80℃で約１時間乾燥した後、バイアル試薬
（Bial′s reagent;Orcinol Ferric Chloride,Sigma,Ca
t.No.0−7875）をその上に噴霧して発色させた。その
後、プレートを80℃で30分間乾燥し、サポニン成分の糖
残基を選択的に染色した。その結果は図３に示し、ここ
で第１列はQuil−Ａであり、第２列はQS−L1、第３列は
QS−L2、第４列はQS−L3、第５列はQS−L4であり、各サ
ポニン成分は単一バンドで表されている。
（Bial′s reagent;Orcinol Ferric Chloride,Sigma,Ca
t.No.0−7875）をその上に噴霧して発色させた。その
後、プレートを80℃で30分間乾燥し、サポニン成分の糖
残基を選択的に染色した。その結果は図３に示し、ここ
で第１列はQuil−Ａであり、第２列はQS−L1、第３列は
QS−L2、第４列はQS−L3、第５列はQS−L4であり、各サ
ポニン成分は単一バンドで表されている。
実施例2:質量分析法 サポニン成分QS−L1の分子量は、電子噴霧イオン化
（ESI−MS）方法を用いるVG Quattro LC/MS（Vaccum Ge
nerator,UK）で測定し、ここで溶離液としてアセトニト
リル／蒸留水／酢酸（60:40:0.5（v/v/v））を用いた。
その結果、図４に示したように、979.4（m/z）で［Ｍ＋
Na］+イオン性分子ピークが検出された。しかし、ナト
リウムイオンがそれに含まれているので、前記（m/z）
値から23を減じなければならない。したがって、純粋な
QS−L1の分子量は、約956ダルトンと測定され、これは
ケルステンら（WO92/06710）によって開示されたQA−３
の分子量、すなわち、1862ダルトンに比べて非常に小さ
い。また、これは、ケンシルら（Vaccine，92,35−40,C
old Spring Harbor Laboratory Press）によって開示さ
れたQS−17、QS−18およびQS−21の分子量、すなわち、
それぞれ2371、2174および2012とも相当異なる。したが
って、QS−L1は新規なナイラヤ サポニン成分であると
いうことが確認された。
（ESI−MS）方法を用いるVG Quattro LC/MS（Vaccum Ge
nerator,UK）で測定し、ここで溶離液としてアセトニト
リル／蒸留水／酢酸（60:40:0.5（v/v/v））を用いた。
その結果、図４に示したように、979.4（m/z）で［Ｍ＋
Na］+イオン性分子ピークが検出された。しかし、ナト
リウムイオンがそれに含まれているので、前記（m/z）
値から23を減じなければならない。したがって、純粋な
QS−L1の分子量は、約956ダルトンと測定され、これは
ケルステンら（WO92/06710）によって開示されたQA−３
の分子量、すなわち、1862ダルトンに比べて非常に小さ
い。また、これは、ケンシルら（Vaccine，92,35−40,C
old Spring Harbor Laboratory Press）によって開示さ
れたQS−17、QS−18およびQS−21の分子量、すなわち、
それぞれ2371、2174および2012とも相当異なる。したが
って、QS−L1は新規なナイラヤ サポニン成分であると
いうことが確認された。
実施例3:サポニン成分およびQuil−Ａの毒性 粗クイラヤ サポニン成分を投与した時、マウスでの
毒性の主な徴候は肝の壊死として現れる。QS−L1、QS−
L2、QS−L3、QS−L4、QS−L5およびQuil−Ａの毒性を調
べるため、８週齢のCD−１雄マウス（Charle′s River
Institute,Japan）に表３に示されているようにそれぞ
れ125、250または500μｇのサポニン成分およびQuil−
Ａを皮内注射した。対照群には生理食塩水のみを注射し
た。
毒性の主な徴候は肝の壊死として現れる。QS−L1、QS−
L2、QS−L3、QS−L4、QS−L5およびQuil−Ａの毒性を調
べるため、８週齢のCD−１雄マウス（Charle′s River
Institute,Japan）に表３に示されているようにそれぞ
れ125、250または500μｇのサポニン成分およびQuil−
Ａを皮内注射した。対照群には生理食塩水のみを注射し
た。
その結果、サポニン成分およびQuil−Ａの投与後72時
間内に死んだマウスの数をケンシルら（Kensil,C.R. et
al.,J.Immunol.，146,431−437（1991））によって開
示された結果と比べて表４に示した。
間内に死んだマウスの数をケンシルら（Kensil,C.R. et
al.,J.Immunol.，146,431−437（1991））によって開
示された結果と比べて表４に示した。
前記結果は、Quil−Ａがずいぶん高い毒性を示し、こ
の毒性の主要な原因はQS−18に該当すると推定されるQS
−L4であるということを示す。QS−L1およびQS−L2は50
0μｇの投与量水準で毒性をほとんど示さなかった。QS
−21と同一であると推定されるQS−L5は、500μｇ投与
量で５匹のマウス中３匹が死んだため、高い毒性を有す
ると思われる。
の毒性の主要な原因はQS−18に該当すると推定されるQS
−L4であるということを示す。QS−L1およびQS−L2は50
0μｇの投与量水準で毒性をほとんど示さなかった。QS
−21と同一であると推定されるQS−L5は、500μｇ投与
量で５匹のマウス中３匹が死んだため、高い毒性を有す
ると思われる。
実施例4:サポニン成分の溶血活性 ケルステンら（WO92/06710）またはケンシルら（USP
5、057、540号（1991））の方法に従って、ヒツジ赤血
球（SRBC）を用いてQS−L1、QS−L2、QS−L3、QS−L4、
QS−L5およびQuil−Ａの溶血活性を測定した。
5、057、540号（1991））の方法に従って、ヒツジ赤血
球（SRBC）を用いてQS−L1、QS−L2、QS−L3、QS−L4、
QS−L5およびQuil−Ａの溶血活性を測定した。
まず、QS−L1、QS−L2、QS−L3、QS−L4、QS−L5およ
びQuil−Ａ各500μg/mlを２倍階段希釈法によって４μg
/mlの最終濃度までそれぞれ希釈した。アルセルベル溶
液（Alserber′s Solution）に分散したSRBC（Korea me
dical Co.）5mlを15mlコニカル管に入れた後、2,000rpm
で10分間遠心分離した。沈殿したSRBCに生理食塩水10ml
を加え、この混合物を前記と同様な条件下で遠心分離し
た。この洗浄過程を１回さらに繰り返した。沈殿したSR
BCを回収し、４％（v/v）の最終濃度で生理食塩水に分
散させた。SRBC溶液150μｌずつを96−ウェル丸底マイ
クロタイタープレートの各ウェルに加え、前記で製造し
たサポニン成分希釈液を50μl/ウェルの量でウェルに加
えた。37℃で30分間培養した後、マイクロプレート遠心
分離機を使って30分間培養した後、マイクロプレート遠
心分離機（Hanil,Korea）を用いてプレートを2,000rpm
で10分間遠心分離して溶血しなかった細胞を沈殿させ
た。各ウェルの上澄液100μｌを平底マイクロタイター
プレートのウェルに移し、ダイナテック（Dynatech）マ
イクロタイタープレートリーダーを使って吸光度を測定
した。その結果は図５に示し、ここでQS−L3、QS−L4お
よびQS−L5は20μg/mlでずいぶん高い溶血活性を示した
反面、QS−L1は500μg/mlまで溶血活性を示さなかっ
た。この結果は、QS−L1が500μg/mlまでの濃度で選択
的にミョウバンに吸着された抗原に対する免疫アジュバ
ントとして安全で効果的に使用され得ることを示す。
びQuil−Ａ各500μg/mlを２倍階段希釈法によって４μg
/mlの最終濃度までそれぞれ希釈した。アルセルベル溶
液（Alserber′s Solution）に分散したSRBC（Korea me
dical Co.）5mlを15mlコニカル管に入れた後、2,000rpm
で10分間遠心分離した。沈殿したSRBCに生理食塩水10ml
を加え、この混合物を前記と同様な条件下で遠心分離し
た。この洗浄過程を１回さらに繰り返した。沈殿したSR
BCを回収し、４％（v/v）の最終濃度で生理食塩水に分
散させた。SRBC溶液150μｌずつを96−ウェル丸底マイ
クロタイタープレートの各ウェルに加え、前記で製造し
たサポニン成分希釈液を50μl/ウェルの量でウェルに加
えた。37℃で30分間培養した後、マイクロプレート遠心
分離機を使って30分間培養した後、マイクロプレート遠
心分離機（Hanil,Korea）を用いてプレートを2,000rpm
で10分間遠心分離して溶血しなかった細胞を沈殿させ
た。各ウェルの上澄液100μｌを平底マイクロタイター
プレートのウェルに移し、ダイナテック（Dynatech）マ
イクロタイタープレートリーダーを使って吸光度を測定
した。その結果は図５に示し、ここでQS−L3、QS−L4お
よびQS−L5は20μg/mlでずいぶん高い溶血活性を示した
反面、QS−L1は500μg/mlまで溶血活性を示さなかっ
た。この結果は、QS−L1が500μg/mlまでの濃度で選択
的にミョウバンに吸着された抗原に対する免疫アジュバ
ントとして安全で効果的に使用され得ることを示す。
実施例5:サポニン成分の免疫アジュバント活性 サポニン成分QS−L1、QS−L2、QS−L3、QS−L4および
QS−L5の免疫アジュバント活性は参照例と同様な手順に
従って測定し、その結果から得られた抗体力価を表５に
示す。
QS−L5の免疫アジュバント活性は参照例と同様な手順に
従って測定し、その結果から得られた抗体力価を表５に
示す。
サポニン成分QS−L1、QS−L2、QS−L3、QS−L4および
QS−L5は、ミョウバンと配合して用いた時、ミョウバン
単独で用いた場合より優れた免疫アジュバント活性を示
した。特に、ミョウバン＋QS−L1は最も高い免疫アジュ
バント活性を示した。したがって、実施例３および本実
施例の結果から分かるように、ミョウバン＋QS−L1は毒
性がほとんどなくかつ既存の他のアジュバントより優れ
た免疫アジュバント活性を示す。
QS−L5は、ミョウバンと配合して用いた時、ミョウバン
単独で用いた場合より優れた免疫アジュバント活性を示
した。特に、ミョウバン＋QS−L1は最も高い免疫アジュ
バント活性を示した。したがって、実施例３および本実
施例の結果から分かるように、ミョウバン＋QS−L1は毒
性がほとんどなくかつ既存の他のアジュバントより優れ
た免疫アジュバント活性を示す。
実施例6:サポニン成分QS−L1を免疫アジュバントとして
含むワクチン製剤 他の免疫アジュバントと共に用いる場合、ワクチン製
剤中のQS−L1の免疫アジュバント活性は次のように測定
した。
含むワクチン製剤 他の免疫アジュバントと共に用いる場合、ワクチン製
剤中のQS−L1の免疫アジュバント活性は次のように測定
した。
まず、20μgHBsAg/500μｇミョウバン/mlを含む組換
えＢ型肝炎ワクチンであるEuVax（LG Chemical Ltd.Kor
ea）1mlを、サポニン成分QS−L1を2mg/ml濃度で蒸留水
に溶かしたQS−L1溶液50μｌと混合してミョウバンとQS
−L1を免疫アジュバントとして含むＢ型肝炎ワクチン製
剤（製剤１）を製造した。一方、ミョウバンに吸着して
いない20μg/ml遊離HBsAg1mlを2mg/mlQS−L150μｌと混
合してQS−L1のみをアジュバントとして含みＢ型肝炎ワ
クチン製剤（製剤２）を製造した。陽性対照群として
は、20μg/mlの濃度でFCAを同量のHBsAgと混合すること
によって製造した、油中水型エマルジョン形態のフロイ
ント完全アジュバント（FCA）をアジュバントとして含
有するＢ型肝炎ワクチン製剤（製剤３）を用いた。
えＢ型肝炎ワクチンであるEuVax（LG Chemical Ltd.Kor
ea）1mlを、サポニン成分QS−L1を2mg/ml濃度で蒸留水
に溶かしたQS−L1溶液50μｌと混合してミョウバンとQS
−L1を免疫アジュバントとして含むＢ型肝炎ワクチン製
剤（製剤１）を製造した。一方、ミョウバンに吸着して
いない20μg/ml遊離HBsAg1mlを2mg/mlQS−L150μｌと混
合してQS−L1のみをアジュバントとして含みＢ型肝炎ワ
クチン製剤（製剤２）を製造した。陽性対照群として
は、20μg/mlの濃度でFCAを同量のHBsAgと混合すること
によって製造した、油中水型エマルジョン形態のフロイ
ント完全アジュバント（FCA）をアジュバントとして含
有するＢ型肝炎ワクチン製剤（製剤３）を用いた。
製剤１、２、３およびEuVax各50μｌずつを７ないし
８週齢の雌Balb/cマウスの背中の２点に皮下注射した。
製剤３、すなわち、FCA製剤0.1mlはマウスに腹腔内注射
した。
８週齢の雌Balb/cマウスの背中の２点に皮下注射した。
製剤３、すなわち、FCA製剤0.1mlはマウスに腹腔内注射
した。
マウスの追加免疫化および抗体力価の測定は参照例と
同様な方法で行われ、ただし、製剤３でのFCAは追加接
種時にフロイント不完全アジュバントに交替された。
同様な方法で行われ、ただし、製剤３でのFCAは追加接
種時にフロイント不完全アジュバントに交替された。
その結果を下記表６に示す。
表６から分かるように、QS−L1は単独で用いた場合、
ミョウバンを単独で用いた場合より低い免疫アジュバン
ト活性を示した。しかし、QS−L1をミョウバンと配合し
て用いた時、QS−L1はミョウバンを単独で用いた時の活
性の３〜４倍に当たる高い免疫アジュバント活性を示し
た。
ミョウバンを単独で用いた場合より低い免疫アジュバン
ト活性を示した。しかし、QS−L1をミョウバンと配合し
て用いた時、QS−L1はミョウバンを単独で用いた時の活
性の３〜４倍に当たる高い免疫アジュバント活性を示し
た。
したがって、ミョウバン＋QS−L1は、ミョウバン単独
より優れた免疫アジュバントとして使用され得る。この
結果はミョウバンとサポニン成分QS−L1が相乗作用を起
こして免疫アジュバント活性を増加させ得ることを示
す。
より優れた免疫アジュバントとして使用され得る。この
結果はミョウバンとサポニン成分QS−L1が相乗作用を起
こして免疫アジュバント活性を増加させ得ることを示
す。
実施例7:細胞性免疫応答に対するQS−L1の影響 細胞性免疫応答に対するQS−L1の影響を、実施例６で
製造したＢ型肝炎ワクチン製剤で注射した後、HBsAgで
処理されたマウスから得られた脾臓細胞の増殖反応を測
定することによって調べた。
製造したＢ型肝炎ワクチン製剤で注射した後、HBsAgで
処理されたマウスから得られた脾臓細胞の増殖反応を測
定することによって調べた。
脾臓細胞の増殖はビアースら（Byars）の方法（Vacci
ne，９,309−317（1991））に従って測定した。
ne，９,309−317（1991））に従って測定した。
まず、参照例の方法に従って、実施例６で製造したワ
クチン製剤でマウスを免疫した。最終の追加接種をして
から２週後に、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、これ
から脾臓細胞を得た。
クチン製剤でマウスを免疫した。最終の追加接種をして
から２週後に、マウスから脾臓を無菌的に摘出し、これ
から脾臓細胞を得た。
脾臓細胞を2x105個、10％牛胎児血清および2mMグルタ
ミンを含有するRPMI−1640培地が入っているＵ−型96−
ウェル培養プレートのウェルに入れた。
ミンを含有するRPMI−1640培地が入っているＵ−型96−
ウェル培養プレートのウェルに入れた。
対照群として用いられた４個のウェルを除いた各ウェ
ルにHBsAGを１μg/mlの濃度で加えた。プレートを37℃
で７％CO2大気下で４日間培養した。
ルにHBsAGを１μg/mlの濃度で加えた。プレートを37℃
で７％CO2大気下で４日間培養した。
培養が終わると、3H−チミジン（Amersham Cat.No.TR
K686）0.5μCiを各ウェルに加えてプレートを前記と同
様な条件下で24時間さらに培養した。細胞収穫機（Skat
ron）を用いて細胞を集め、細胞内に結合された3H−チ
ミジンの量を液体シンチレーション計測管で測定した。
各アジュバントの免疫アジュバント活性は下記式によっ
て計算された刺激指数（Stimulation index,SI）で示し
た： この結果を図6Aおよび6Bで示すが、ここで２匹（図6
A）または４匹（図6B）のマウスに各ワクチン製剤を与
える二つの独立的な実験を実施した。“正常”はHBsAg
で処理しなかったマウスからの脾臓細胞をいう。ミョウ
バンと共に結合しているQS−L1を含むワクチンはミョウ
バンのみを含むワクチン製剤より細胞性免疫応答が顕著
に高いことを示す。
K686）0.5μCiを各ウェルに加えてプレートを前記と同
様な条件下で24時間さらに培養した。細胞収穫機（Skat
ron）を用いて細胞を集め、細胞内に結合された3H−チ
ミジンの量を液体シンチレーション計測管で測定した。
各アジュバントの免疫アジュバント活性は下記式によっ
て計算された刺激指数（Stimulation index,SI）で示し
た： この結果を図6Aおよび6Bで示すが、ここで２匹（図6
A）または４匹（図6B）のマウスに各ワクチン製剤を与
える二つの独立的な実験を実施した。“正常”はHBsAg
で処理しなかったマウスからの脾臓細胞をいう。ミョウ
バンと共に結合しているQS−L1を含むワクチンはミョウ
バンのみを含むワクチン製剤より細胞性免疫応答が顕著
に高いことを示す。
本発明を前記特定実施形態と関連させて記述したが、
添付した特許請求範囲によって定義される本発明の範囲
内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変
化させ得ることは勿論である。
添付した特許請求範囲によって定義される本発明の範囲
内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変
化させ得ることは勿論である。
フロントページの続き (72)発明者 クウォン ヨング ソン 大韓民国 デジョン 302−173 ソ−グ デュンサン−ドング ＃970 ヒャン グチョン アパートメント 107−504 (72)発明者 ジョ ジュング ミョング 大韓民国 デジョン 305−390 ユソン グ−グ ジョンミン−ドング ＃464− １ エキシポ アパートメント 509− 401 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07G 3/00 A61K 39/39 A61K 39/29 C07J 71/00
Claims (10)
- 【請求項１】水／アセトニトリル（7/3;v/v）中の0.1wt
％トリフルオロ酢酸溶液を用い、4.6x250mmバイダック
（Vydac）C4カラム上、1ml/分の流速で逆相高圧液体ク
ロマトグラフィー（RP−HPLC）により分析したとき約14
分の保持時間；及びESI−MSで分析したとき、m/zが979.
4の分子イオンにより特徴付けられるQS−L1と命名され
たクイラヤ樹皮抽出物から分離した実質的に純粋なサポ
ニン成分。 - 【請求項２】（ａ）酢酸水溶液中の樹皮抽出物溶液を遠
心分離して上澄液を得ること、 （ｂ）12〜14kD範囲の分子のカット−オフ値を有する限
外透析膜を用いて酢酸水溶液で該上澄液を透析するこ
と、 （ｃ）生成した透析物を遠心分離して第２上澄液を得る
こと、 （ｄ）前記第２上澄液を凍結乾燥してサポニン抽出物粉
末を得ること、及び （ｅ）前記サポニン抽出物粉末を適切な溶媒に溶かし、
この溶液を0.1％トリフルオロ酢酸を含む30〜40％アセ
トニトリルの線形濃度勾配下にC4 RP−HPLCカラムを用
いるRP−HPLCにかけることによって実質的に純粋なQS−
L1を含む分画を得ることを含むクイラヤ サポナリヤ
モリナの樹皮抽出物から請求項１に記載のサポニン成分
QS−L1を分離する方法。 - 【請求項３】抗原、免疫アジュバントとして請求項１に
記載のサポニン成分QS−L1および第２アジュバントを含
むワクチン製剤。 - 【請求項４】前記第２アジュバントがミョウバンである
請求項３に記載のワクチン製剤。 - 【請求項５】前記抗原がミョウバンに吸着している請求
項４に記載のワクチン製剤。 - 【請求項６】前記抗原がＢ型肝炎ウイルス表面抗原（HB
sAg）である請求項３に記載のワクチン製剤。 - 【請求項７】QS−L1を１〜500μg/単一投与量の範囲の
量で含有する請求項３に記載のワクチン製剤。 - 【請求項８】請求項１に記載のサポニン成分QS−L1を免
疫アジュバントとして第２アジュバントと共に用いるこ
とを含むワクチン製剤中の抗原の抗原性を増加させる方
法。 - 【請求項９】前記第２アジュバントがミョウバンである
請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】前記ワクチン製剤中のQS−L1の量が１〜
500μg/単一投与量の範囲である請求項８に記載の方
法。
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| WO2000023105A2 (en) * | 1998-10-16 | 2000-04-27 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Adjuvant systems and vaccines |
| US6905712B2 (en) * | 1999-12-08 | 2005-06-14 | Statens Veterinarmedicinska Anstalt | Vaccine adjuvants comprising ginseng plant extract and added aluminum salt |
| WO2001041802A1 (en) * | 1999-12-08 | 2001-06-14 | Statens Veterinärmedicinska Anstalt | Vaccine adjuvants comprising ginseng plant extract and added aluminium salt |
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| IL229836A0 (en) | 2013-12-08 | 2014-03-31 | Y & B Mother S Choice Ltd | Formulations to reduce or suppress irritation to eye tissue |
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