KR100362946B1 - 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 사포닌 변이체 qs-l1을 분리 정제하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 보다 간편하고 단시간내에 다량의 QS-L1 사포닌 분획물을 분리 정제하는 방법에 관한 것으로, 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물을 증류수에 용해시킨 후 원심분리하여 불용성 물질을 제거하는 단계, 상층액을 C4 역상 고압 액체 크로마토그래피로 분리하는 단계, 분획물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 QS-L1 사포닌 변이체를 분리하는 단계를 포함한다.

Description

퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 사포닌 변이체 QS-L1을 분리 정제하는 방법

본 발명은 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 표피 추출물로부터 면역 보조제로 사용할 수 있는 사포닌 변이체 QS-L1을 분리 정제하는 개선된 정제 방법에 관한 것이다.

유전공학 기술의 발전은 바이러스 표면항원 단백질 등을 항원으로 하는 재조합 백신의 개발에 큰 기여를 했지만, 현재 인류의 건강에 큰 위협이 되고 있는 HIV(Human Immuodeficiency Virus), HCV(Hepatitis C Virus) 등의 백신은 아직 개발되지 못하였다. 그 이유중의 하나는 면역성이 약한 이들 재조합 단백질의 면역성을 향상시키는 데 필수적인 백신 보조제가 아직 개발되지 못한 때문이며, 따라서 재조합 항원 단백질의 백신 효율성을 증대시키기 위한 신규 면역 보조제의 개발이 매우 시급한 실정이다.

현재 면역 보조제로는 수산화알루미늄(Aluminum Hydroxide, 이하 "알럼" (Alum)) 외에 아직 개발중에 있는 사포닌계, 오일 에멀젼계, 모노포스포릴 리피드 A(monophosphoryl lipid A)계, 사이토카인계 등이 있다(Fransois M et al., TiPS 141, 174-178(1993)).

이와 같은 면역 보조제들은 각각 면역 보조제로서의 활성, 안전성 및 유용성 등의 면에서 일부 바람직하지 않은 단점을 가지고 있다. 예컨대 생쥐 등의 동물에서의 면역시 주로 사용되는 프로인드 면역 보조제(Freund's adjuvant)는 인체에 사용시 면역 부위에 육아종(Granulomas) 등의 심한 부작용을 나타내는 문제점이 있다. 또한 알럼은 인체에 사용이 허가된 유일한 면역 보조제로서 다른 면역 보조제에 비하여 부작용이 적은 반면 면역 보조활성이 약해서 HIV, HCV 등의 표면항원, HSV(Herpes Simplex Virus), 주형 흡충증(Schistosomiasis), 백일해(Wooping Cough) 및 티루스열(Typhoid) 등의 면역 보조제로 사용될 경우 면역원성 향상효과를 거의 나타내지 않는 등 그 효용성이 상당히 제한적이다(Sanchez-Pescador et al., J. Immunol. 141, 1720-1727(1988); James S. L. et al., J. Immunol., 140, 2753-2759(1988) : Edelman R., Rev. Infect. Dis. 2, 370-383(1980)). 더욱이 체액성 면역 반응만을 유도하는 단점을 가지므로 세포성 면역 반응이 중요한 방어기작이 되는 질병에 있어서는 한계를 나타낸다.

한편, 사포닌은 트리테르펜(triterpene)과 배당체(glycoside)로 구성되어 있으며, 계면활성제 특성을 나타내고 세포 고정제 및 식품 첨가제로서 사용되고 있다. 특히 남미산 식물인 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 추출한 사포닌은 체액성 및 세포성 면역 반응을 증가시키는 것으로 밝혀졌으며(Espinet R. G., Gac Vet. 13, 268-273(1951); Dalsgaard K., Arch. Gesamte Virus Forsoh 44, 243-254(1974); Morein B., Nature 322, 287-288(1988)), 현재 겔 투과 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피 등의 방법을 거쳐 정제된 사포닌이 상업적으로 시판되고 있다(Quil A; Isocotec AB, Sweden).

그러나 상기 Quil A는 여전히 다량의 비활성 독성물질을 함유하고 있으며, 역상 고압 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)로 분리하였을 때 최소한 20 개 이상의 사포닌 성분들로 분리되는 것으로 밝혀졌다(Kersten et al., Infect. Immun. 56, 432-438(1988)). 따라서 사포닌 구성성분이 다양하고 독성이 높은 Quil A를 인체에 직접 사용하는 것은 문제가 있다. 최근에는 이들 사포닌 추출물로부터 개개의 사포닌 성분들을 정제하여, 독성이 낮으면서도 활성이 높은 사포닌 성분만을 면역 보조제로 사용하는 가능성에 대한 연구가 계속되어 오고 있다. 예컨대, 켄실(Kensil) 등은 RP-HPLC로 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 추출한 사포닌을 분리하였을 때 최소한 28 개 이상의 변이체들로 분리되고, 이중에서 QS(또는 QA)로 명명된 성분이 주된 독성을 나타내고, QS-21로 명명된 성분은 독성이 비교적 낮고 높은 면역 보조 활성을 나타내며, 그외 QS-7 및 QS-17 등의 성분들도 면역 보조 활성을 가지고 있는 것으로 보고한 바 있으며, 이들 성분들은 메탄올을 이용한 용출, 실리카겔 흡착 및 메탄올을 사용한 RP-HPLC를 통하여 정제할 수 있음을 밝히고 있다(Kensil et al., J. Immunol. 146, 431-437(1991); Kensil et al., 미국 특허 제 5,057,040 호, 1991). 또한 상기 QS-21을 면역 보조제로 사용할 경우 HIV를 비롯한 다양한 바이러스 항원의 면역원성을 향상시킬 수 있다는 보고도 있다(Kensil et al., JAMA 199, 1423-1427(1991); Wu et al., J. Immunol. 148, 1519-1525(1992)).

또한 상기 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 기존에 발견된 성분 이외에 보다 높은 면역 보조 활성을 나타내는 성분들을 추출하기 위한 시도들이 계속되어 왔으며, 커스텐(Kersten) 등은 Quil A로부터 소수성 크로마토그래피를 통하여 최소한 23 개 이상의 사포닌 성분들을 분리할 수 있으며, 상기 QS-21보다 더 낮은 독성 및 더 높은 면역 보조 활성을 나타내는 성분을 정제하여 스테롤, 포스포리피드 및 항원과의 혼합에 의해 면역 촉진 복합체라는 형태의 면역 증강 제형을 만들 수 있음을 보고하였다(국제 특허출원 공개 제 WO 92/06710 호). 이는 분리방법에 따라 효율적인 면역 보조제를 찾을 수 있는 가능성을 제시한 것이며, 또한 사포닌 자체보다는 사포닌 이외의 다른 성분과의 혼합 사용에 의해 더욱 큰 면역 증강효과를 보이는 제형을 만들 수 있음을 시사해 준다.

그러나 상기 켄실 등에 의한 정제방법은 메탄올을 비롯한 유기용매를 사용하여 QS-21 등을 정제하였으나 이 역시 시험관내 결과에서도 독성을 나타내고 있으며, 이외에 커스텐 등의 방법도 사용되는 스테롤 등의 성분들이 경구용으로는 안전하다고 하나 주사제형으로는 인체에의 사용이 허가되지 않아 면역 증강제로서 인체에 사용하기에는 아직도 부적합하다는 단점이 제기되고 있다.

이에 본 발명자는 이러한 종래의 단점을 해결하여 보다 독성이 낮고 면역 증강 효과가 높은 신규 사포닌 성분인 QS-L1을 퀼라야 사포나리야 몰리나로부터 정제하는 방법을 출원하였고(대한민국 특허출원 제 95-8590 호 참조), 이 QS-L1을 포함하는 면역 보조제를 사용하여 항원의 면역성을 증강시키는 방법 및 상기 면역 보조제를 포함하는 백신 제형을 제공하는 방법 등을 출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제 95-8589 호 및 PCT/KR96/00053 호 참조). 그러나 상기 정제 방법 역시 여러 정제 단계 즉, 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물을 아세트산 수용액에 용해시키고, 이 용액을 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 다음 한외 투석막으로 투석하는 단계, 투석액을 원심분리하여 불용성 물질을 제거하는 단계, 상층액을 동결건조하여 사포닌 분말을 얻는 단계, 수차례의 C4 역상 고압 액체 크로마토그래피로 분리하는 단계 등의 여러 단계를 요하므로, 이 또한 개선될 여지를 많이 내포하고 있다.

따라서 본 발명은 상기한 정제 방법의 단점을 획기적으로 개선하여, 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 보다 간편하고 단시간내에 다량의 QS-L1 사포닌 분획물을 분리 정제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1a 및 1b는 각각 선행 특허 출원(대한민국 특허출원 제 95-8590 호) 및 본 발명의 방법에 따라 준비된 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물(Bark Extract)로부터의 사포닌 추출물을 분석용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 통과시켜 얻은 사포닌 분획물들의 유지 시간 프로필을 나타낸 것이다.

도 2a는 대용량 역상 고압 액체 크로마토그래피 칼럼을 통과시켜 나온 1 차 정제 과정중의 사포닌 분획물의 유지 시간 프로필을 나타낸 것이고; 도 2b는 상기 대용량 역상 고압 액체 크로마토그래피로부터 1 차 정제된 시료를 분석용 역상 고압 액체 크로마토그래피 분석을 통해 1 차 정제 시료의 순도를 확인한 결과이다.

도 3은 클로로포름:메탄올:증류수의 조성비 변화에 따른 QS-L1 사포닌 변이체의 박막 크로마토그래피 상에서의 이동 정도를 나타낸 결과이다.

도 4는 최종 정제된 QS-L1 사포닌 변이체의 순도를 분석용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 통해 확인한 결과이다.

도 5는 본 발명의 정제방법에 의해 최종 정제된 QS-L1 사포닌 변이체의 면역 보조 활성을 측정한 결과이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물을 증류수에 용해시킨 후 원심분리하여 불용성 물질을 제거하는 단계, 상층액을 C4 역상 고압 액체 크로마토그래피로 분리하는 단계, 분획물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 QS-L1 사포닌 변이체를 분리하는 단계를 포함하는, 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 QS-L1 사포닌 변이체를 분리 정제하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

먼저 퀼라야 사포나리야 몰리나의 표피 추출물을 증류수에 용해시킨 다음 원심분리하여 용해되지 않고 남아 있는 불용성 물질을 제거한다. 여기서 얻은 상층액을 0.1 % 트리플루오로아세트산 수용액에 첨가한 후 제조용 용량의 C4역상 고압 액체 크로마토그래피 칼럼에 통과시키고 적절한 농도의 아세토니트릴 농도 구배를 가하여 60-70 % 순도의 원하는 QS-L1 사포닌 면역 보조제를 포함한 분획물을 모은다.

이 분획물로부터 증발기(evaporator)를 사용하여 아세토니트릴을 선택적으로 분별 증류 방법에 의해 제거한 후 남아 있는 QS-L1 면역 보조제를 함유한 수용액을 동결건조시켜 분말을 얻는다. 상기 분말을 클로로포름:메탄올:증류수의 혼합 용액에 용해시킨 후 동일 용액으로 평형화되어 충진되어 있는 200-400 메쉬 크기의 실리카겔 컬럼에 흡착시킨 후 동일 용액으로 용출시킨다. 상기에서 용출된 분획물중 QS-L1만을 포함하고 있는 분획물만을 합한 후 증발기로 클로로포름과 메탄올만을 선별적으로 제거한 후 남아 있는 용액을 동결건조하여 최종 QS-L1 사포닌 분획물을 얻는다.

이와 같은 정제방법으로 98 % 이상의 고순도의 QS-L1 사포닌 변이체를 대량으로 얻을 수 있다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단 본 발명의 범위가 하기 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예

(단계 1) 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물로부터 사포닌 추출물의 제조 및 C4 역상 고압 액체 크로마토그래피에 의한 QS-L1 사포닌 변이체의 조성비 분석

먼저 본 발명자의 대한민국 특허출원 제 95-8590 호(이하 "선행 특허출원"이라 한다)에 의해 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물로부터 QS-L1 사포닌 변이체를 얻는 방법과 본 발명에 따른 QS-L1 사포닌 변이체를 얻는 방법을 비교하였다.

선행 특허 출원에 의한 사포닌 추출물의 제조는 다음과 같다.

퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피를 증류수로 추출한 다음 동결건조시켜 사포닌 분말을 50 % 이상 함유하는 표피 추출물(Berghausen Corp., 제품 번호 제 12/7/93 호)을 40 mM 아세트산 수용액에 최종 농도가 250 mg/ml이 되도록 용해시켰다. 이 용액을 원심분리기(Beckman J2-21, JA14)로 12,000 rpm에서 30 분간 원심분리하여 표피 추출물에 존재하는 불용성 물질을 제거하였다. 그런 다음, 한외 분자량 12 내지 14 kDa의 한외 투석막(Spectrum Medical Industries Inc., 제품번호 제 132676 호, NWCO 12-14,000)을 사용하여 40 mM 아세트산 용액 50 배 부피로 2 회 투석함으로써 사포닌 이외의 저분자량의 수용성 물질을 제거하였다. 투석액을 다시 원심분리하여 상층액만을 분리함으로써 용액에 남아 있는 불용성 물질을 완전히 제거하였다. 얻어진 상층액을 동결건조시켜 고순도의 사포닌 추출물 분말을 얻었다.

이와 대조적으로 본 발명에서는 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물(Berghausen Corp., 제품번호 제 12/7/93 호)을 250 mg/ml 농도로 증류수에 용해시켰다. 이를 상기와 동일한 방법으로 원심분리하여 불용성 물질을 제거하였다.

상기와 같이 준비된 선행 특허 출원 및 본 발명에 따른 사포닌 추출물을 각각 0.1 % 트리플루오로아세트산을 함유한 증류수에 최종농도가 20 mg/ml가 되도록 용해 또는 희석시킨 후, 이 용액 100 ㎕를 증류수:아세토니트릴이 70:30으로 혼합되어 평형화된 C4 역상 고압 액체 크로마토그래피 칼럼(Vydac, C4, RP-HPLC, 4.6 x 250 mm)에 분당 1 ml의 속도로 통과시키고 하기 표 1과 같은 아세토니트릴 농도 구배를 흡착되어 있는 사포닌을 용출시킨 후 분획물의 조성을 관찰하였다. 측정은 214 nm에서 실시하였으며, 그 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1a는 선행 특허 출원에 따른 사포닌 분획물의 유지시간 프로필이고, 도 1b는 본 발명에 따른 사포닌 분획물의 유지시간 프로필이다.

[표 1]

	시간(분)	유속(㎖/분)	A 완충액(%)	B 완충액(%)
1	0.00	1.00	70.0	30.0
2	5.00	1.00	70.0	30.0
3	30.00	1.00	60.0	40.0
4	35.00	1.00	0.0	100.0
5	40.00	1.00	0.0	100.0
6	41.00	1.00	70.0	30.0
7	51.00	1.00	70.0	30.0
8	52.00	1.00	70.0	30.0

A 완충액 : 0.1 %(V/V) 트리플루오로아세트산 수용액

B 완충액 : 0.1 %(V/V) 트리플루오로아세트산을 함유한 아세토니트릴 용액

상기 두가지 방법에 따라 얻어진 사포닌 추출물의 조성은 거의 차이가 없고 다만 QS-L1 사포닌 변이체의 조성비에서만 약간의 차이가 있음을 알 수 있다(선행 특허 출원 : 4.23 %, 본 발명 : 1.67 %).

따라서 본 발명에 따른 사포닌 추출물의 제조는 선행 특허 출원에서 제시하였던 다단계의 준비방법을 거치지 않기 때문에 경제적 및 시간적으로 유리하다. QS-L1 사포닌 변이체의 수율 측면에서도 본 발명에 따른 방법에서 훨씬 높게 나타나는데, 다음 단계에서 더욱 구체적으로 나타내었다.

(단계 2) 제조용 역상 고압 액체 크로마토그래피에 의한 QS-L1 사포닌 분획물의 정제

상기 단계 1에서와 같이 퀼라야 사포나리아 몰리나의 표피 추출물을 증류수에 용해시키고 원심분리하여 불용성 물질을 제거한 후, 상층액을 0.1 %(V/V) 트리플루오로아세트산 수용액에 첨가하여 최종 농도가 60 mg/ml가 되도록 조정하였다. 이 사포닌 용액 50 ml를 A 완충액:B 완충액의 비율이 70:30이 되도록 혼합된 용액으로 평형화되어 있는 대용량 제조용 역상 고압 액체 크로마토그래피 칼럼(Guard Column : 2.51 x 30 mm, 제조용 RP-HPLC, 주컬럼 : 50 x 250 mm Vydac, Cat No. 214TP152022)에 로딩한 후 분당 40 ml의 속도로 통과시키고 하기 표 2와 같은 아세토니트릴 농도구배를 가하여 사포닌 분획물을 용출시키고 사포닌을 포함한 분획물만을 수집하였다. 흡광도 측정은 214 nm의 파장에서 행하였으며 그 결과는 도 2a에 나타내었다.

도 2a에서 빗금친 부위는 QS-L1 면역 보조제를 함유한 부위이며, 이 부위만을 따로 분획한 후 다음 단계에서 최종적으로 실리카겔 크로마토그래피에 의해 QS-L1만을 순수 분리하였다.

[표 2]

	시간(분)	유속(㎖/분)	A 완충액(%)	B 완충액(%)
1	0	40	70	30
2	15	40	70	30
3	55	40	60	40
4	56	40	0	100
5	71	40	0	100
6	72	40	70	30
7	87	40	70	30
8	88	0	70	30

A 완충액 : 0.1 %(V/V) 트리플루오로아세트산 수용액

B 완충액 : 0.1 %(V/V) 트리플루오로아세트산을 함유한 아세토니트릴 용액

상기 제조용 역상 고압 액체 크로마토그래피에서 1 차적으로 얻은 QS-L1 사포닌 포함 분획물의 QS-L1 함유 여부 및 순도를 측정하기 위해, 이중 일부를 취하여 동결건조한 다음, 0.1 %(V/V) 트리플루오로아세트산수용액에 용해시킨 후 상기 단계 1의 분석용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 사용하여 동일한 아세토니트릴 농도구배를 가하여 분석하였다. 이 결과는 도 2b에 나타내었다. 도 2b에서 빗금친 부위는 QS-L1 사포닌을 나타내며, 대략 1차 정제 결과 60-70 % 순도의 QS-L1 분획물을 얻었음을 확인할 수 있었다.

(단계 3) 실리카 겔 크로마토그래피 방법에 의한 최종 QS-L1 사포닌 정제

1 차 정제 단계로 제조용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 통하여 60-70 % 정도의 순도를 갖는 QS-L1을 정제한 후, 이를 증발과 동결건조를 거쳐 분말화하였다. 다음 단계는 이를 2 차로 역상 고압 액체 크로마토그래피를 통과시켜 정제할 수 있으나, 이는 시간과 경제성 면에서 너무 많은 지출을 요구하게 되므로 쉽고 간편하면서도 경제적인 정제방법이 필요하다. 즉, 2 차적인 역상 고압 액체 크로마토그래피 방법을 쓰지 않고 효과적으로 QS-L1을 정제할 수 있는 방법으로서 실리카를 사용한 크로마토그래피 방법을 사용하였다.

실리카 겔 칼럼 크로마토그래피를 시행하기 전에 먼저 박막 크로마토그래피(Thin layer chromatography, 이하 "TLC"라 함) 방법에 따라(대한민국특허출원 제 95-8589 호 및 PCT/KR96/00053 호 참조) 60-70 % 정도의 순도를 갖는 1 차 정제 산물을 1 mg/ml 농도로 50 % 메탄올 수용액에 용해시킨 후, 이중 1 ㎕를 TLC 플레이트에 (Si60HPTLC. E.M Science, U. S. A.) 찍은 후 다양한 조건의 TLC 전개용매하에서 QS-L1이 불순물로부터 분리되는 정도를 관찰하였다. 전개 용매로서 헥산, 이소프로필알코올, 아세톤, 아세트산 등의 용매를 단독 또는 혼합하여 사용하였을 경우에는 원하는 QS-L1 및 불순물 등의 전개가 이루어지지 않고 처음 찍었던 위치에 그대로 남아 있었다. 그러나 본 발명자의 선행 특허 출원에서 TLC 분석에 사용하였던 클로로포름:메탄올:증류수=62:32:6에서는 QS-L1이 어느 정도 전개되어 불순물의 밴드와는 차이가 있게 나타났다. 그러나 이러한 62:32:6의 비율로 혼합된 상기 혼합용액을 사용할 경우 원하는 QS-L1 사포닌 성분을 완전히 용출시키는데는 과량의 전개 용매를 사용하여야 했고, 또한 그만큼 전개시키는데 시간도 많이 걸리는 단점을 나타내었다. 따라서 본 발명자는 이 혼합 용액을 사용하되 성분 구성비를 변경하여, 불순물로부터 분리가 보다 잘 되면서 높은 Rf 값을 보이는 정제 조건을 찾아보기로 하였다.

먼저 클로로포름과 증류수의 양을 일정하게 유지시켜 놓고 메탄올의 농도만 줄여 보았다. 그러나 이 경우는 오히려 Rf 값이 떨어져 원하는 결과와 반대현상을 나타내었다. 따라서 다음에는 메탄올과 증류수의 양을 고정시켜 놓고 클로로포름의 양을 변화시켜 보았다.

사용의 예로써

1. 클로로포름:메탄올:증류수=62:32:6

2. 클로로포름:메탄올:증류수=52:32:6

3. 클로로포름:메탄올:증류수=42:32:6

4. 클로로포름:메탄올:증류수=32:32:6

등의 혼합 비율이 시도되었다. 이 결과는 도 3에 나타내었다. 각각의 Rf값은 대략 0.1875, 0.3125, 0.4680, 0.6875였다. 이 결과로부터 클로로포름의 혼합성분비가 낮아질수록 원하는 QS-L1의 Rf값은 증가함을 알 수 있다. 그러나 4 번의 조성비에서처럼 32:32:6의 경우에는 QS-L1 사포닌 밴드는 분리가 잘 되었으나, 불순물 밴드가 끌려 나오는 양상을 보였으며, 또한 상대적인 메탄올의 성분비(%)가 너무 커 실리카 겔을 용해시킬 가능성이 있으므로 3 번의 조건, 즉 클로로포름:메탄올:증류수=42:32:6의 조건으로 다음부터 TLC 및 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피의 조건으로 사용하였다. 최종 사포닌 정제를 위한 실리카 칼럼의 구성은 실리카 겔 60(230-400 메시 ASTM. Merck Germany)를 상기 클로로포름:메탄올:증류수의 부피비가 42:32:6으로 혼합된 혼합 용매에 넣고 잘 저어주어 현탁액으로 만든 후 충진시켰다. 칼럼의 직경은 정제하고자 하는 QS-L1 사포닌의 양에 따라 다양하게 선택되어 질 수 있다. 예로써 2 cm 직경의 칼럼에 베드 볼륨이 100 ml가 되도록 충진하여 사용하였다. 이렇게하여 충진된 실리카 겔 60 칼럼에 앞서 분말화된 60-70 % 순도의 QS-L1 사포닌 분획물을 상기의 혼합 용매(클로로포름:메탄올:증류수=42:32:6)로 용해시킨 후 서서히 로딩하였다. 이 때 로딩되는 부피는 실리카 겔 60 칼럼의 베드 볼륨의 5 % 이내로 하였다. 이렇게 로딩된 사포닌 분획물은 질소 가스를 위에서 서서히 가해 대략 5 ml/분으로 용출되도록 하였다. 또한 분획 당 20 ml이 되도록 받은 후 이 분획물을 1 ㎕씩 취해 상기 3 번의 조건으로 박막 크로마토그래피에 의해 원하는 QS-L1을 함유하는 분획물만을 확인한 후, 이 분획물들을 모아 증발에 의해 클로로포름과 메탄올을 날려보낸 후 동결건조에 의하여 순수한 QS-L1 사포닌 분말을 획득하였다. 상기 최종 QS-L1 사포닌 분말은 선행 특허 출원에서와 동일한 방법으로 질량분석을 한 결과 956 달톤의 분자량을 갖고 있음을 확인하여 QS-L1이 제대로 분리되어 있음을 확인하였다. 또한 상기 단계 2에서와 동일한 방법으로 분석용 역상 고압액체 크로마토그래피를 사용하여 순도를 확인한 결과 98 % 이상의 순도를 나타내고 있음을 확인하였다(도 4).

단계 4. 수율 분석

본 발명자의 선행 특허 출원에 기재된 방법에 따른 QS-L1 사포닌의 정제는 50 g의 표피추출물로부터 1 차 역상 고압 액체 크로마토그래피를 거치기 전까지 37 g의 불용성 표피추출물이 사라지고, 13 g의 용해성 표피추출물만을 가지고 1 차 역상 고압 액체 크로마토그래피가 진행되게 되며, 이 때 이중 대략 4.23 %가 원하는 QS-L1사포닌 분획물로 나타난다. 그러나 본 발명에 따르면 50 g의 표피추출물로부터 수용성 물질이 49.5 g 이상 되기 때문에 49.5 g 이상이 바로 1 차 역상 고압 액체 크로마토그래피에 이용되며, 이 때는 대략 1.67 %의 QS-L1 사포닌을 얻을 수 있다. 따라서 1 차적으로 얻을 수 있는 QS-L1 사포닌의 이론량은 선행 특허 출원의 방법에 따르면 544 mg이며, 본 발명의 방법에 따르면 826 mg 정도가 되어 선행 특허 방법에 비해 50 % 이상 증가됨을 알 수 있다. 시간적으로도 선행 특허 출원에서는 1 차 역상 고압 크로마토그래피에 들어가기 전까지 4-5 일 이상의 많은 시간이 소요되나, 본 발명에 따르면 이 시간이 필요하지 않고 바로 증류수에 용해시켜 역상 고압 액체 크로마토그래피를 행할 수 있기 때문에 훨씬 유리하다.

시험예

정제된 QS-L1 사포닌 변이체의 면역 보조 활성 측정

본 발명에 따라 정제된 QS-L1 사포닌 변이체의 면역 보조 효과를 측정하기 위하여 알럼에 흡착된 B 형 간염 표면 항원을 제조하였다. 제조 방법은 B 형 간염 백신 제품을 시판하고 있는 (주) LG 화학의 유박스 제조 방법을 참조하여, 50 ㎍의 B 형 간염 표면 항원 대 5 mg의 알럼(Alhydrogel, Suferfos Biosector사, 덴마크)의 비율로 흡착되도록 농도를 조정하였다. 완충액은 10 mM 인산나트륨 완충액(1.2 mM 인산나트륨 이염기·7 H₂O, 8.8 mM 인산칼륨, 0.8 % 염화나트륨, pH 6.5)를 사용하였다. 상기 비율의 농도로 혼합한 B 형 간염 표면 항원과 알럼을 상온에서 6 시간동안 오비탈 교반기에서 교반시켜 알럼에 단백질이 흡착되도록 하였다. 그런 다음 알럼에 흡착된 표면 항원을 생쥐의 면역에 바로 사용하였다.

또한 본 발명의 정제 방법에 의하여 분리된 QS-L1 사포닌 변이체의 면역 보조효과를 알아보기 위하여 알럼에 흡착된 B 형 간염 표면 항원과 혼합하여 측정하였다. 즉 QS-L1 사포닌을 2 mg/ml의 농도로 증류수에 용해시킨 후 이를 다시 최종적으로 상기 10 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)으로 200 ㎍/ml이 되도록 하였다. 이렇게 만들어진 QS-L1 용액을 상기에서 만든 동일 부피의 알럼에 흡착된 B 형 간염 표면 항원에 섞어 혼합 형태의 면역 보조제를 가진 표면 항원 면역 주사액을 만든 다음 100 ㎕씩 생쥐의 등피하에 2 군데씩 총 0.2 ml(5 ㎍ 표면 항원)를 주사하였다. 생쥐는 일본의 찰스 리버 연구소로부터 입수한 생후 7 내지 8 주된 Balb/c 암컷종이며 각 그룹당 16 마리를 사용하였다. 1 차 면역 후 2 주후에 동량의 상기 혼합 항원 주사액을 동일한 방법으로 2 차 면역시키고, 다시 7 일 후 생쥐의 꼬리로부터 혈액을 채취하여 표면 항원에 대한 항체 역가를 측정하여 면역 효과를 비교하였다. 상기 백신 제형과 비교하기 위해 QS-L1 사포닌이 들어가지 않은 10 mM 인산나트륨 완충액(pH 6.5)에 가용화되어 있는 표면 항원 자체와, 알럼에 흡착된 표면 항원 및 프로인드 보조제에 혼합된 B형 간염 표면항원도 동량을 주사하여 면역효과를 상호비교하였다. 생성된 항체의 역가는 시판되고 있는 Abbott 사의 AUSAB EIA 키트(AUSAB kit, Abbot laboratories, U. S. A.)를 사용하여 측정하였으며 동사의 국제 표준 항체 역가와 비교하여 역가를 결정하였다. 이 때의 결과는 기하 평균 역가로 하여 도 5에 나타내었다.

이러한 결과로부터 정제된 QS-L1 사포닌 분획물은 선행특허 출원에서와 같이 알럼에 흡착된 표면 항원에 대해 탁월한 면역증강 효과를 유도함을 알 수 있다.

따라서 본 발명의 정제 방법은 기존의 정제 방법에 비하여 더욱 간편하고 효과적이며, 또한 대량의 QS-L1 사포닌 분획물을 정제할 수 있는 방법을 제공하게 되며, 궁극적으로 경제적이고 효과적인 백신의 개발에 크게 기여할 수 있을 것이다.

Claims (3)

1. 퀼라야 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 표피 추출물을 증류수에 용해시킨 후 원심분리하여 불용성 물질을 제거하는 단계, 원심분리후 얻은 상층액을 C4 역상 고압 액체 크로마토그래피로 분리하는 단계, 분획물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피하여 QS-L1 사포닌 변이체를 분리하는 단계를 포함하는, 퀼라야 사포나리아 몰리나로부터 QS-L1 사포닌 변이체를 분리 정제하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   역상 고압 액체 크로마토그래피는 트리플루오로아세트산을 포함하는 아세토니트릴 농도구배를 가진 용출제를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서,

   실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 사용되는 용출제가 클로로포름:메탄올:증류수의 62 내지 32 : 32 : 6 (V/V) 범위의 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법.

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