DE2519935A1 - Acetylierte escherichia coli-extrakte, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung in arzneimittelzubereitungen - Google Patents

Acetylierte escherichia coli-extrakte, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung in arzneimittelzubereitungen

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DE2519935A1
DE2519935A1 DE19752519935 DE2519935A DE2519935A1 DE 2519935 A1 DE2519935 A1 DE 2519935A1 DE 19752519935 DE19752519935 DE 19752519935 DE 2519935 A DE2519935 A DE 2519935A DE 2519935 A1 DE2519935 A1 DE 2519935A1
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DE
Germany
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water
acetylated
soluble
extracts
escherichia coli
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DE19752519935
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English (en)
Inventor
Pierre Jolles
Geb Samour Daniele Migliore
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Bpifrance Financement SA
Original Assignee
Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
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    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria

Description

VON KREfSLER SChONWALD ΜΪΥΕ?. EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING
PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler f 1973
Dr.-ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selling, Köln
AvK/Ax 5. Mai 1975
5 KÖLN 1
DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF
Agence Nationale de Valorisation de la Recherche (A N V A R), 13, Rue Madeleine Michelis, Neuilly sur Seine (Hauts-de-Seine) (Frankreich)
Acetylierte Escherichia coil-Extrakte, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Anwendung in Arzneimittelzubereitungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von acetylierten wasserlöslichen niedrigmolekularen Extrakten von Zellen von Escherichia coli, die hierbei erhaltenen wasserlöslichen Extrakte und sie enthaltende Arzneimittelzubereitungen, die als immunologische Adjuvantia wertvoll sind.
Die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung enthalten Diaminopimelinsäure (DAP) und haben ein Molekulargewicht zwischen 1000 +' 200 und 8000 + 200.
Ein Verfahren zur Herstellung von immunostimulierenden Mitteln, die aus Acylpolysacchariden bestehen, wurde bereits beschrieben, beispielsweise in der CH-PS 314 792. Die in dieser Patentschrift beschriebenen Verbindungen sind in Wasser schwerlöslich.
Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen Extrakten aus Esche-
5 0 9848/1065 0RlG^AL JNSPE°TE
Telefon: (02 21J 23 45 41 - 4 - Telex: 888 2307 dopa d ■ Telegramm: Dompatent Köln
richia coli. Diese wasserlöslichen Extrakte haben ausgezeichnete Eigenschaften als Adjuvantia und Immunostimulantien.
Das Verfahren gemäß der Erfindung besteht darin, daß man die von Lipiden befreiten Bakterienreste von Zellen von Escherichia coli einer Acetylierung unterwirft und die wasserlöslichen Extrakte nach bekannten physikalisch-chemischen Verfahren isoliert. Die in dieser Weise erhaltenen wasserlöslichen Extrakte werden vorteilhaft auf üblichem physikalisch-chemischem Wege gereinigt. ·■ i
* ι
Die Acetylierung wird im allgemeinen in einem Essigsäureanhydrid-Pyridin-Gemisch, das vorzugsweise 2 Raumteile Essigsäureanhydrid pro 3 Raumteile Pyridin enthält, bei einer Temperatur zwischen 20 und 35 C durchgeführt. Die Reaktion ist beendet, nachdem während einer Zeit zwischen etwa 50 und 75 Stunden gerührt '. worden ist.
Den in das Verfahren gemäß der Erfindung eingesetzten Zellen von Escherichia coli werden vorher die Lipide entzogen. Dies geschieht beispielsweise nach dem Verfahren, das von A.Aebi und Mitarbeitern in Bull.Soc. Chim. Biol. 35 (1953) 661 beschrieben wird. Beim Verfahren gemäß der Erfindung können alle Varietäten von Escherichia coli verwendet werden, jedoch werden Zellen von Escherichia coli B (nicht-virulente Varietät) bevorzugt.
Die wasserlöslichen Extrakte werden anschließend durch Extraktion mit einem Alkohol und anschließende Extraktion mit Wasser isoliert. Gemäß einer bevorzugten Aus-
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führungsform der Erfindung werden die wasserlöslichen
Extrakte wie folgt isoliert:
1) durch Behandlung des nach der Acetylierung erhaltenen Reaktionsgeinisches mit Alkohol, z.B. Äthanol,
2) Abtrennung der unlöslichen Bestandteile durch : Zentrifugieren, j
3) Einengen der alkoholischen Lösung, i
• i
4) Behandlung des hierbei erhaltenen Rückstandes mit
destilliertem Wasser,
5) Abtrennen der in Wasser unlöslichen Fraktion durch
Zentrifugieren und
6) Gefriertrocknen des wäßrigen Überstandes der die j acetylierten wasserlöslichen Extrakte enthält, die | somit sowohl in dem Alkohol-Pyridin-Gemisch als auch [
in Wasser löslich sind. j
j Vorzugsweise wird ein Gemisch"von Alkohol und Pyridin ; im Volumenverhäü-tnis von etwa 10:1 verwendet. ·
Beim Verfahren gemäß der Erfindung werden alle Zentri- '■-fugierungen vorteilhaft bei niedriger Temperatur, ■ vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 0° und ■ 60C durchgeführt.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der
Erfindung werden die wasserlöslichen Extrakte nach
geeigneten physikalisch-chemischen Verfahren, insbesondere durch Chromatographie an Adsorptionsmitteln,
z.B. DEAE-Cellulose, dem unter der Bezeichnung "DEAE-Biogel A" bekannten Produkt, oder durch Filtration
mit einem Polyacrylamidgel beispielsweise unter Ver- I Wendung der unter den Handelsbezeichnungen "Biogel
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PlO", "Biogel P6" oder "Biogel P4" bekannten Produkte, gereinigt und in ihre Bestandteile getrennt.
Die in dieser Weise erhaltenen wasserlöslichen Extrakte, ! die einen weiteren Gegenstand der Erfindung darstellen,
bestehen im wesentlichen aus einem Gemisch von wasser- '. löslichen acetylierten Zellwandtrümrnern in unterschied- . liehen Mengenanteilen gegebenenfalls zusammen mit nicht-: aininierten acetylierten reduzierenden Zuckern. Die Menge der in den Extrakten gemäß der Erfindung enthaltenen wasserlöslichen Fragmente der Zellwand ist verschieden in Abhängigkeit von den jeweiligen Bedingungen der Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung, insbesondere (der Reinigung.
Die wasserlöslichen Fragmente der Zellwand bestehen im wesentlichen aus einem Disaceharid-Tetrapeptid, einem Tetrasaccharid-Heptapeptid und aus dem Dimeren, Trimeren und Tetrameren des letzteren.
I Das Disaccharid-Tetrapeptid hat die folgende molekulare . Zusammensetzung: N-Acetylglucosamin (1), N-Acetylmuraminsäure (1), Alanin (2), Glutaminsäure (1), Diaminopimelin-;
•säure (1), und sein Gerüst kann durch das folgende Schema dargestellt werden:
NAG-NAM
AIa-GIu-DAP-Ala
Hierin bedeuten:
NAG = N-Acetylglucosamin /
NAM = N-Acetylmuraminsäure (acide N-acetylmuramlque) AIa = Alanin
GIu = Glutaminsäure
DAP = Diaminopimelinsäure
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- 5 - j
Das Tetrasaecharid-Heptapeptid hat die folgende molekulare Zusammensetzung: N-Acetylglucosamin (2), N-Acetylmuraminsäure (2), Alanin (3), Glutaminsäure (2), Diaminopimelinsäure (2), und sein Gerüst kann durch das folgende Schema dargestellt werden:
NAG - NAM - NAG - NAM
Ala AIa
ι ι
GIu GIu
DAP
AIa-
Die nicht aminierten reduzierenden Zucker bestehen im wesentlichen aus Glucose und gegebenenfalls Mannose und Galactose.
Die Konstitution der in der beschriebenen Weise er-
i haltenen acetylierten wasserlöslichen Extrakte kann nach üblichen Methoden der Bestimmung des Gehalts an Aminosäuren, Aminozuckern und nicht-aminierten reduzierenden Zuckern nachgewiesen werden.
Da die Aktivität der wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung an die Anwesenheit der Diaminopimelinsäure" gebunden ist, ist es besonders zweckmäßig, aus dem rohen Gemisch die Substanzen zu isolieren, die in genügend großen Mengen vorhanden sind und einen hohen Gehalt an Diaminopimelinsäure haben. Beispielsweise können nach Reinigungsverfahren, wie sie vorstehend beschrieben wurden, wasserlösliche Extrakte isoliert werden, die hauptsächlich acetyliertes Tetrasaecharid-Heptapeptid gegebenenfalls in Verbindung mit acetylierten nicht-aminierten reduzierenden Zuckern enthalten.
Die gemäß der Erfindung hergestellten wasserlöslichen Extrakte oder ihre Bestandteile haben interessante biologische Aktivitäten. Sie sind immunologische
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Adjuvantia und Immunostimulantien, die keine arthrogene ; Wirkung aufweisen. . j
Die Wirksamkeit als Adjuvans wird am Meerschweinchen, Hartley-Stamm, nach der Methode von R.G.White und Mit- , arbeitern, Immunology 7 (1964) 158 bestimmt. Die arthrogene Wirkung u-nd die Schutzwirkung werden nach den ; .Methoden "bestimmt, die von F.Bonhomme in C.R.Acad.Sci., Serie D, 263 (1966) 1422 und CR. Acad. Sei. Serie D, i 265 (1967) 2115 beschrieben werden. - |
Beim Meerschweinchen bewirken die wasserlöslichen j Extrakte gernäß der Erfindung eine Verstärkung der Anti-
körperbildung bei intrakutaner Verabreichung von Dosen von 0,1 mg oder höheren Dosen.
Bei der Maus steigern die wasserlöslichen Extrakte bei einer Dosis von 25 mg/kg intravenös in erheblichem Maße die Zahl der Milzzellen, die Hämolysestellen nach der Methode von N.K. Jerne und A.A.lNardin, Science 140 (1963) 405.bilden.
Die Produkte gemäß der Erfindung können in der Human- ; oder Veterinärmedizin verwendet werden, um'die Wider- ; Standskraft gegen Infektionen durch Viren oder Bakterien zu steigern. Sie bewirken eine Verstärkung der Bildung^ von Antikörpern, die gegen pathogene Mikroorganismen : wirksam sind, und können in Verbindung mit Impfstoffen ' verabreicht werden, um eine maximale Antikörperreaktion : sicherzustellen.
Die Erfindung umfasst ferner Arzneimittelzubereitungen, '
die die wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung ;
in Verbindung mit einem oder mehreren verträglichen und ■
pharmazeutisch unbedenklichen Verdünnungsmitteln oder ;
Hilfsstoffen und gegebenenfalls mit anderen Arzneimit- ;
teln, z.'B. Antibiotika, Mitteln gegen Hyperämie und . j Impfstoffen, enthalten. In diesen Zubereitungen sind die;
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wasserlöslichen Extrakte gemäß der Erfindung im all- ; gemeinen in Mengen von mehr als 0,1 Gew.-% enthalten. '
Die Zubereitungen können oral, rektal, parenteral oder in Form von Aerosolen verabreicht werden. In der Humantherapie hängen die Dosen von der gewünschten Wirkung ab. Sie können beim Erwachsenen zwischen 10 und. 50 mg
pro Tag liegen. j
Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel weiter
erläutert. ,.
Beispiel j
20 g Bakterienreste, die von Lipiden befreit und aus Zellen von Escherichia coil nach der Methode von ' A.Aebi und Mitarbeitern, Bull. Soc. Chem. Biol.35 ( (1955) 661, erhalten worden sind, werden 66 Stunden bei 280C in 500 ml eines Gemisches von Essigsäureanhydrid und Pyridin ("Volumenverhältnis 2:5) gerührt. Nach Zugabe von 5000 ml Äthanol wird weitere 5 Stu'nden gerührt. Der unlösliche Teil wird durch.Zentrifugieren (4000 U/ ■ Min.) abgetrennt. Der Überstand wird unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird in 100 ml destilliertem Wasser aufgenommen. Der in V/asser unlösliche Teil wird durch Zentrifugieren (4000 U/Min..) abgetrennt. Der Überstand wird gefriergetrocknet. Hier-"bei werden 2 g eines rohen acetylierten wasser lös- · liehen Extrakts erhalten.
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Claims (12)

Patentansprüche
1) Verfahren zur Herstellung von acetylierten, wasserlöslichen, Diaminopimelinsäure enthaltenden Extrakten aus Zellen von Escherichia coil, dadurch gekennzeichnet, daß man die von Lipiden befreiten Bakterienreste der Zellen von Escherichia coli acetyliert und . die wasserlöslichen Extrakte auf physikalisch/- I chemischem Wege isoliert.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, '·
i daß man die erhaltenen wasserlöslichen Extrakte | außerdem einer Reinigung unterwirft.
3) Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Acetylierung mit einem Gemisch von Essigsäureanhydrid und Pyridin durchführt.
4) Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Acetylierung mit einem Gemisch von Essigsäureanhydrid und Pyridin im Volumenverhältnis von 2:3 etwa 50 bis 75 Stunden bei einer Temperatur zwischen etwa 20 und 350C durchführt.
5) Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekenrizeich- \ net, daß man die wasserlöslichen Extrakte durch Extraktion mit Alkohol, anschließende Extraktion mit Wasser und Gefriertrocknen isoliert.
6) Verfahren nach Anspruch 1 bis 5> dadurch gekennzeich- ; net, daß man als Alkohol Äthanol verwendet.
7) Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die wasserlöslichen Extrakte durch Behandeln mit Äthanol, Entfernen der unlöslichen Bestandteile, Trocknen des äthanolischen. Uberstandes, Aufnehmen des Produktes in destilliertem Wasser, Entfernen der in Wasser unlöslichen
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Fraktion und Gefriertrocknen der hierbei erhaltenen
wäßrigen überstehenden Schicht isoliert. !
8) Verfahren nach Anspruch 1 bis "J, dadurch gekennzeichnet, daß man die wasserlöslichen Extrakte durch Filtration und/oder Chromatographie an Adsorptionsmitteln reinigt.
9).Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Chromatographie an DEAE-Cellulose oder an dem Produkt der Handelsbezeichnung "DEAE-Biogel A" durchführt.
10) Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Filtration mit einem Polyacrylamidgel durchführt. · ■
11) Acetylierte, wasserlösliche, Diaminopimelinsäure enthaltende Extrakte mit niedrigem Molekulargewicht, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Molekulargewicht zwischen 1000 + 200 und 8000 + 200 haben und aus wasserlöslichen Fragmenten der Zellwand von Escherichia coli gegebenenfalls in Verbindung mit acetylierten nichtaminierten reduzierenden Zuckern bestehen.
12) Extrakte nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Gemisch eines acetylierten Disaccharid-Tetrapeptide und eines acetylierten Tetrasaccharid-Heptapeptids gegebenenfalls in Verbindung mit acetylierten nicht-aminierten reduzierenden Zuckern bestehen.
Arzneimittelzubereitungen, enthaltend eine wirksame Menge eines acetylierten wasserlöslichen Extrakts nach Anspruch 11 und 12 und einen verträglichen und pharmazeutisch unbedenklichen Träger oder Hilfsstoff.
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DE19752519935 1974-05-06 1975-05-05 Acetylierte escherichia coli-extrakte, verfahren zu ihrer herstellung und ihre anwendung in arzneimittelzubereitungen Pending DE2519935A1 (de)

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IL47208A0 (en) 1975-06-25
FR2269964A1 (en) 1975-12-05
BE828638A (fr) 1975-10-30
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DK195275A (da) 1975-11-07

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