DE3241990A1

DE3241990A1 - Physiologisch aktive substanz ch-1 und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE3241990A1
Application number: DE19823241990
Authority: DE
Inventors: Kanki Yokohama Komiyama; Iwao Tokyo Umezawa
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 1981-12-02
Filing date: 1982-11-12
Publication date: 1983-06-16
Also published as: JPS5896025A; FR2517204B1; ATA436782A; BE894925A; AT380488B; CH654013A5; FR2517204A1; HU188599B; US4533548A; GB2111070A; DE3241990C2; GB2111070B; IT8224447A0; IT1205279B; NL8204323A

Description

- 4 Beschreibung

Die Erfindung betrifft die neue physiologisch aktive Substanz CH-1 und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Es sind schon viele Polysaccharide mit einer interferoninduzierbaren Aktivität oder Antitumoraktivität bekannt. Solche Antitumormittel, wie PSK, sind auch schon in der Praxis verwendet worden. Jedoch ist bislang noch keine Substanz bekannt, die beide Eigenschaften einer Antitumoraktivität und einer klaren interferoninduzierbaren Aktivität besitzt.

Es wurde nun gefunden, daß eine aus Chlorella pyrenoidosa, die zur Gattung Chlorella gehört, extrahierte und isolierte Substanz beide Eigenschaften aufweist.

Die neue physiologisch aktive Substanz CH-1 gemäß der Erfindung (nachstehend als CH-1 bezeichnet) ist ein saures Polysaccharid und sie hat eine interferoninduzierbare Aktivität und eine Antitumoraktivität.

Das CH-1 hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

1) Die Substanz besteht mindestens aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff und hat folgende Elementaranalyse:

C: 38,49%, H: 6,0796, N: 1,39%,

2) Molekulargewicht:, impermeabel für eine Cellophan-

membrane und S = 6,15,' gemessen in der Ultrazentrifuge bei einer Konzentration von 0,2%, in 0,2M

Phosphatpuffer pH 7,2. Rotortyp: RA 6OHC, 51200 Upm,

l 3) Schmelzpunkt: gefärbt ungefähr bei 240⁰C, danach

Carbonisierung bei höherer Temperatur,

5 4) spezifische Drehung: [a]|⁹ = -9,52 (c = 1, H₂O),

5) UV-Spektrum: Endabsorption in 0,125%. wäßriger Lösung,

₁₀ 6) IR-Spektrum: gemäß Figur I₉ KBr-Tablette, Absorptionsbanden bei 3420, 2930, 1640, 1380, 1125, 1065, 1040, 990, 915, 835 und 800 cm™¹ ,

₁₅ 7) Löslichkeit: löslich: Wasser

unlöslich: übliche organische Lösungsmittel, wie Methanol,

8) Farbreaktion: positiv: Anthron, Molisch und Car-

ZO 2 A·

negativ: Folin-Lowry und Ninhydrin,

9) Natur: sauer, Elektrophorese auf Acetatmembrane

(elektrophoretisiert zu 0,8 cm für (+) bei

25 der Bedingung von 0,1M Pyridin-Essigsäure,

pH 5,0, 200 V (4 mA), 20 min),

10) Farbe: weißes Pulver,

30 11) Protein: nicht festgestellt (gemessen durch Folin-

Lowry-Farbreaktion),

12) Monosaccharidanalyse: Rhamnose/ Arabinose, Glucose, Galactose und Glucuron-

35 säure (festgestellt durch

Papierchromatographie und Gaschromatographie nach Hy-

BAD ORIGINAL

drolyse in 7#iger H₂SO^,

RUckflußbehandlung über 2 h),

13) Zuckergehalt: 53% (berechnet als Glucose),

14) Ultrazentrifugiermuster: gemäß Figur 3. CH-1 hat die folgenden biologischen Eigenschaften:

!0 I. Interferoninduzierende Aktivität:

1) Analysenmethode A (in vitro):

Ein Kaninchen (Japanisches Weißkaninchen) wird X5 durch Arteriotomie verbluten gelassen. Die herausgeschnittene Milz wird trypsinisiert, um suspendierte Zellen herzustellen (2 bis 5 χ 10' Zellen). Die Milzzellen werden mit CH-1 bei 25°C 24 h lang inkubiert, zentrifugiert und das überstehende Produkt wird gesammelt. Der Interferontiter in dem Medium wird bestimmt.

2) Analysenmethode B (in vivo):

Zu aliquoten Zelten nach intravenöser Injektion an ddy-Mäuse mit einem Alter von 4 Wochen von 100 mg/kg CH-1 wurden die Mäuse verbluten gelassen und der Interferontiter in dem Serum wurde bestimmt.

3) Analysenmethode des Interferon(IP)titers:

Der IF-Titer wird durch die Plättchen-5Ö%-Verminderungsmethode unter Verwertung einer RK13-Kaninchennierenzellinienkultur und von Vescular-Stomatitisvirus als Aggressionsvirus untersucht.

• ft

-Τι 4) Ergebnisse;

(1) bei der in-vitro-Methodeι
Probenkonzentration (iig/ml): 10 1 0₉1 0,01

IF-Titer (u): 49 34 20 -

(2) bei der in-vivo-Methodei

Zeltpunkt des Verblutenss 2 h später 5 h später IF-Titer (u): 240 15

Aus dem Obigen ergibt slch_r daß die erfindungsgemäße Verbindung eine interferoninduzierende Aktivität hat„

II. Hemmaktivität auf die Virusinfektion;

1) Analysenmethodes

CH-1 wird Intravenös in die Schwanzvene von ddy-Mäusen verabreicht. Nach 2 bis 12 h erfolgt eine Provokation durch Intravenöse Verabreichung des Vacclnvirus In dl© Schwanzvene. Die Anzahl der Pusteln, die auf der Haut d©s Schwanzes auftreten, wird am 8. Tag nach der Provokation gezählt.

2) Ergebnisses

Die Ergebnisse sind in folgender Aufstellung zusammengestellt.
30

- 8 Hemmaktivität auf die Virusinfektion:

	Dosis (mg/kg)	Behandlungs schema	Antitumoraktivität:	durchschnittliche zahl der Pusteln Mäuse)	P-388:	,7	An (5-
	Kontrolle	-"	Aktivität geger	58,
	100	-2 h	L Mäuse-Leukämie	1	,6
	25	-2 h	1,
	100	-6 h	4
	25	-6 h	26
III.
D

CDF., -Mäuse* wurden intraperitoneal mit P-388-Zel-

len, 1x10, inokuliert und vom Tag 1 bis 15 täglich mit CH-1 behandelt.

Ergebnisse:

Dosis (mg/kg/Tag)

durchschnittliche Überlebenstage (4 Mäuse)

erhöhte Lebensspanne (%)

Kontrolle

50 250

erhöhte Lebensspanne (%)

15
16,8

19,5

26

durchschnittliche Uberlebenstage (behandelt) durchschnittliche Uberlebenstage (Kontrolle)

oc 100 -100

2) Aktivität gegen S-180-Festtumor:

ICR-Mäuse werden subkutan mit Sarcoma-I80(i χ 10')· Zellen am Tag 0 inokuliert. CH-1 wird an den Tagen 1 bis 9 einmal täglich aufeinanderfolgend intraperitoneal verabreicht.

-	42
50	50
250	61

Dosis durchschnittliche erhöht® Lebens-(mg/kg/Tag) Lebensspanne (Tage, spanne {%) 5 Muse)

0 19 45

Eine bislang bekannte antitumoraktive Substanz, die aus der Gattung Chlorealla erhalten worden ist, ist ein Anti-

IQ tumormittel, das aus Chlorella regularis isoliert worden ist (JA-OS 52-79016). Diese Substanz enthält 3,6% Proteine, während in CH-1 kein Protein gefunden wird» Die bekannte Substanz ist weiterhin ein Polysaccharide das zu 95 - 2% aus Glucose und Spurenmengen von Rhamnose und Galactose, nämlich einem Polysaccharide bestehend aus Glucose als Hauptkomponente, besteht. Demgegenüber ist das erfindungsgemäße CH-1 ein Polysaccharide das aus kleinen Mengen von Galactose* Arabinose, Glucose und Glucuronsäure und als Hauptkomponente aus Rhamnose besteht. Beide Substanzen unterscheiden sich voneinander hinsichtlich ihrer Zuckerkomponenten. CH-1 wird daher als neue Substanz bezeichnet» '

Durch die Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstel-'lung der Substanz CH-1 zur Verfügung gestellt, das dadurch gekennzeichnet·ist, daß man Chlorella der Gattung Chlorella züchtet und aus den so gezüchteten Zellen CH-1 isoliert.

Erfindungsgemäß verwendete Chlorella ist in der Natur weit verteilt und es handelt sich um eine einzellige Alge. Eine bevorzugte Ausführungsform der .erfindungsgemäß verwendeten Zellen ist Chlorella pyrenoldosa und künstliche Mutanten, hergestellt durch Ultraviolettbestrahlung, Röntgenbestrahlung oder Behandlung mit chemischen Mutagenen, sowie eine natürliche Mutante der Chlorella-Zellen, die CH-1 erzeugt. Diese Chlorella·» Ar ten können für die vorliegende Erfindung verwendet werden.

-ΙΟΙ Erfindungsgemäß wird Chlorella der Gattung Chlorella in einem geeigneten Medium gezüchtet. Es kann ein Nährmedium, das Essigsäure, Kohlendioxid, Calciumsalz, Magnesiumsalz und Kaliumsalz und erforderlichenfalls andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Stickstoffquellen, wie Harnstoff, und Vitamine enthält, verwendet werden. Die Kultivierung wird gewöhnlich aseptisch in einem abgeschlossenen Tank unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Sichtbares Licht, z.B. Sonnenlicht oder Fluoreszenzlicht, kann angewendet werden.

CH-1 kann durch heißes Wasser aus den gezüchteten Zellen oder sprühgetrockneten Zellen extrahiert werden. Die Extraktion wird 1 h lang bei 80 bis 90⁰C durchgeführt. Der Extrakt oder sein Konzentrat wird mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel behandelt, um das Material auszufällen. Bevorzugte Beispiele für mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel, sind niedere Alkohole, wie Methanol oder Ethanol. Die bevorzugte Kon- zentration kann im Bereich von 40 bis 8096 ausgewählt werden.

Das so erhaltene Präzipitat wird durch Zentrifugieren gesammelt, in Wasser aufgelöst und mittels einer halbpermeäblen Membpah, wie einem Cellophanröhrchen, dialysiert, um Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht zu entfernen. .

Das Dialysat wird durch Adsorptionschromatographie und Gelfiltration behandelt, um das CH-1 zu reinigen. So wird beispielsweise das Dialysat in einer Säule von DEAE-Cellulose adsorbiert und mit einer verdünnten alkalischen Lösung eluiert. Das Eluat wird neutralisiert, durch eine Säule von CM-Cellulose geleitet und die aktive Fraktion wird lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in Wasser aufgelöst und auf einer Säule yon DEAE-Sephareel adsorbiert und sodann mit Wasser und 1M NaCl/0,01 N-HCl un-

ter Anwendlang eines Gradienten chromatographiert. Die Aktivfraktionen werden gesammelt und einer Gelfiltration unterworfen, wobei Sephadex G-75 verwendet wird» Sie werden lyophllisiert, wodurch CH-1 erhalten wird.

Die Erfindung wird in dem Beispiel erläutert.

Beispiel

₁ Q Sprühgetrocknetes Pulver (1 kg) von Chlorella pyrenoidosa wurde mit heißem Wasser (5 1) bei 80 bis 90⁰C 1 h lang extrahiert. Der Extrakt wurde bei 7000 Upm 20 min lang zentrifugiert. Zu der überstehenden Lösung wurde Methanol bis zu einer Konzentration von 40% gegeben und das Ganze wurde über Nacht bei 5°C stehen gelassen» Danach wurde bei 9000 Upm 20 min lang zentrifugiert. Der Niederschlag bzw. das Präzipltat wurde in Wasser aufgelöst und die wäßrige Lösung wurde in einem Cellophanröhrchen.gegen entionisiertes Fließwasser über Nacht dlalysiert. Das DIalysat wurde In einer Säule (6,4 χ 39 cm) von DEAE-Cellulos®, die mit einem Oj,OO5M Phosphatpuffer (pH 6J₁O) Ins GleichgeY/icht gebracht worden war,, adsorbiert und mit 0,05N-NaOH eluiert. Jede 10-ml-Fraktion wurde auf die IF-induzierende Aktivität untersucht.

Die gesammelten aktiven Fraktionen wurden mit 1N-HCl neutralisiert. Die Lösung, wurde durch eine Säule (4 χ 15 cm) von CM-Cellulose geleitet,, das Eluat wurde konzentriert und lyophillslerto Rohes Pulver- das In einer kleinen Menge Wasser gelöst worden war„ wurde auf einer Säule (2j 5 x 50 cm) von DEAE-Sepharcel adsorbiert und unter Anwendung eines Gradienten mit Wasser (500 ml) und 1M NaCl/0,01 N-HCl (500 ml) eluiert. Jede 10-cl-Fraktion wurde durch Anthron-^SO^ untersucht und die Fraktionen, die eine hohe Konzentration an Saccharid enthielten, wurden gesammelt und mit 0,02N-NaOH neutralisiert. Sie wurden mit einem Cellophanröhrchen gegen Leitungswasser über Nacht dialyslerto Das Dialysat wurde durch eine

l Säule (5 χ 70 cm) von Sephadex G-75 geleitet. Das Eluat wurde lyophilisiert, wodurch ein weißes Pulver von CH-1 (200 mg) erhalten wurde.

5 Die Erfindung wird weiterhin in den Zeichnungen erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 das IR-Spektrum von CH-1.;

!0 Fig. 2 das Elektrophoresemuster von CH-1 auf Acetatmembrane; und

Fig. 3 das Ultrazentrifugenmuster von CH-1.

-ß:

Leerseite

Claims

· O «β OO ft O KRAUS AWEISERT PATENTANWÄLTE UND ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PATENTAMT DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-IN G. ANNEKÄTE WEISERT DlPL-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 16 · D-8O00 MÜNCHEN 71 ■ TELEFON 089/79 70 77-7 9 70 78 · TELEX Ο5-212156 kpatd TELEGRAMM KRAUSPATENT 3498 WK/rm THE KITASATO INSTITUTE^ Tokyo / Japan Physiologisch aktive Substanz CH-1 und Verfahren zu ihrer Herstellung - Patentansprüche

1. Physiologisch aktive Substanz CH-1 mit den folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:

1) mindestens bestehend aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff mit folgender Elementaranalyse ϊ

■ C: 38,49%, Hj 6„07%_s N: 1,3956»

2) Molekulargewichts impermeabel für eine Cellophan-

membrane und S = 6,15 S (gemessen in der Ultrazentrifuge),

3) Schmelzpunkt: ungefähr bei 240⁰C Verfärbung, danach bei höherer Temperatur Carbonisierung,

PQ

4) spezifische Drehung: LaJ₀" = -9,52 (c = 1, H₂O),

5) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Endabsorption

in 0,125%iger wäßriger Lösung,

6) Infrarot-Absorptionsspektrum: gemäß Figur 1,

7) Löslichkeit: löslich: Wasser

unlöslich: organische Lösungsmittel, .' wie Methanol,

8) Farbreaktion: positiv: Anthron, Molisch und Car-

negativ: Folin-Lowry und Ninhydrin,

■

9) Natur: sauer, elektrophorese auf Acetatmembrane

gemäß Figur 2,

10) Farbe: weißes Pulver,

11) Protein: nicht festgestellt (gemessen durch Folin-

Lowry-Farbreaktion),

12) Monosaccharidanalyse: Rhamnose, Galactose, Arabinose, Glucose und Glucuronsäure (festgestellt durch Papierchromatographie und Gaschromatographie nach 2-stündiger Hydrolyse unter Rückfluß in 796iger H₂SO^,

13) Zuckergehalt: 53% (berechnet als Glucose).

2. Verfahren 2ur Herstellung der physiologisch aktiven Substanz CH-1, dadurch gekennzeichne t , daß man Zellen von Chlorella der Gattung Chlorella mit heißem Wasser extrahiert, durch Zugabe eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels zu dem Extrakt fraktioniert ausfällt, die wäßrige Lösung des Niederschlags dialysiert und das so erhaltene Dialysat einer Adsorptionschromatographie und Gelfiltration zur Isolierung der physiologisch aktiven Substanz CH-1 unterwirft.

3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der fraktionierten Ausfällung als Lösungsmittel einen niedrigen Alkohol verwendet.

4. Verfahren nach Anspruches» dadurch gekennzeichnet, daß man als niedrigen Alkohol Methanol verwendet. .

5» Verfahren nach Anspruch 4_f dadurch gekennzeichnet, daß man die fraktionierte Ausfällung mit Methanol unter Anwendung einer Methanolkonzentration von 40 bis 80% durchführte

6« Verfahren nach Anspruch 2₉ dadurch gekennzeichnet, daß man als Adsorbens für die Adsorptionschromatographie DEAE-Cellulose und/oder CM-Cellulose verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gelflltrationsmedium für die Gelfiltration Sephadex G-75 oder Sephadex G-100 verwendet.

8. . Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Chlorella Chlorella pyrenoidosa verwendet»

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