CH654013A5 - Physiologisch aktive substanz ch-1 und verfahren zu deren herstellung. - Google Patents

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CH654013A5
CH654013A5 CH6762/82A CH676282A CH654013A5 CH 654013 A5 CH654013 A5 CH 654013A5 CH 6762/82 A CH6762/82 A CH 6762/82A CH 676282 A CH676282 A CH 676282A CH 654013 A5 CH654013 A5 CH 654013A5
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methanol
glucose
folin
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Kanki Komiyama
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Kitasato Inst
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Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die neue physiologisch aktive Substanz CH-1 und ein Verfahren zu deren Herstellung, wie in Patentanspruch 1 bzw. 2 definiert.
Bisher waren zahlreiche Polysaccharide, welche Interferon induzierende Aktivität oder Antitumoraktivität besitzen, bekannt, und Antitumormittel, z.B. PSK, wurden bereits praktisch verwendet. Jedoch war bisher keine Substanz bekannt, welche beide Eigenschaften in sich vereint, nämlich die Antitumoraktivität und die klare Interferon induzierende Aktivität.
Es wurde gefunden, dass eine aus Chlorella pyrenoidosa, welche zur Gattung Chlorella gehört, extrahierte und isolierte Substanz beide oben genannten Eigenschaften in sich vereint.
Die neue physiologisch aktive Substanz CH-1 der vorliegenden Erfindung (im folgenden als CH-1 bezeichnet) ist ein saures Polysaccharid und weist Interferon induzierende Aktivität und Antitumoraktivität auf.
Das CH-1 besitzt die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
(1) Es besteht zum mindesten aus Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff, und die Elementaranalyse ist die folgende: C 38,49%, H 6,07%, N 1,39%.
(2) Molekulargewicht: undurchlässig für Cellophanmem-bran und S = 6,15, gemessen durch Ultrazentrifugieren bei einer Konzentration von 0,2% in 0,2 M Phosphatpuffer vom pH 7,2, Rotor-Typus: RA 6OHC, 51 200 Touren pro Minute.
(3) Schmelzpunkt: gefärbt etwa bei 240 °C, anschliessend Verkohlung bei höherer Temperatur.
(4) Spezifische Drehung: [a]j> = —9,52 (c = 1, H2O).
(5) UV-Spektrum: Endabsorption in 0,125%iger wässeriger Lösung.
(6) IR-Spektrum: dargestellt in Fig. 1, KBr-Tablette, Absorptionsbanden bei 3420,2930, 1640, 1380,1125, 1065, 1040,990, 835 und 800 cm"1.
(7) Löslichkeit: löslich in Wasser, unlöslich in üblichen organischen Lösungsmitteln, z.B. Methanol.
(8) Farbreaktionen: positiv: Anthron, Molisch und Carba-Z0I-H2SO4, negativ: Folin-Lowry und Ninhydrin.
(9) Natur: sauer, Elektrophorese auf Acetatmembran [der Elektrophorese unterworfen bis 0,8 cm für ( + ) unter der Bedingung von 0,1 M Pyridin-Essigsäure, pH 5,0, 200 V
(4 mA), 20 Minuten], siehe Fig. 2.
(10) Farbe: weisses Pulver.
(11) Protein: nicht nachweisbar (gemessen mit Folin-Lowry-Farbreaktion).
(12) Monosaccharid-Analyse: Rhamnose, Arabinose, Glu-
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cose, Galactose und Glucuronsäure (nachgewiesen durch Papierchromatographie und Gaschromatographie nach Hydrolyse in 7%iger H2SO4, während 2 Stunden am Rückfluss erhitzt).
(13) Zuckergehalt: 53% (berechnet als Glucose).
(14) Ultrazentrifugenmuster: siehe Fig. 2.
Die biologischen Eigenschaften von CH-1 sind die folgenden:
I. Interferon induzierende Aktivität:
1) Versuchsmethode A (in vitro): Ein Kaninchen (Japanese white) wird durch Arteriotomie ausgeblutet. Die Milz wird entnommen und mit Trypsin behandelt, um suspendierte Zellen (2-5 x 107 Zellen) zu erhalten. Diese Milzzellen werden mit CH-1 bei 25 °C während 24 Stunden inkubiert, sodann zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit gesammelt und der Interferontiter im Medium bestimmt.
2) Versuchsmethode B (in vivo): In aliquoten Zeitabständen nach der intravenösen Injektion vo 100 mg/kg CH-1 an ddy-Mäuse, 4 Wochen alt, wurden die Mäuse ausbluten gelassen und der Interferontiter im Serum bestimmt.
3) Versuchsmethode von Interferon (IF)-Titer: Der IF-Titer wird bestimmt nach der Methode der 50%igen Abnahme der Kolonien unter Verwendung einer RK13-Kaninchennie-ren-Zellinienkultur und Vescular Stomatitis-Virus als Aggressions-Virus.
4) Resultate:
(1) In-vitro-Methode:
Probenkonzentration (jj.g/ml): 10 1 IF-Titer (u): 49 34
(2) In-vivo-Methode:
Ausblutungszeit: 2 Stunden später IF-Titer (ji.): 240
Wie oben gezeigt weist die erfindungsgemässe Verbindung Interferon induzierende Aktivität auf.
0,1 0,01
20 -
5 Stunden später 15
10
II. Hemmende Aktivität gegen Virusinfektion:
1) Versuchsmethode: CH-1 wird intravenös in die Schwanzvene von ddY-Mäusen injiziert und die Mäuse nach 2 bis 12 Stunden mit ebenfalls in die Schwanzvene intravenös injiziertem Vaccinia-Virus infiziert. Die auf der Schwanzhaut auftretenden Pocken werden 8 Tage nach der Infektion gezählt.
2) Resultat: Die Resultate sind aus der folgenden Tabelle zu ersehen.
Hemmende Wirkung auf Virusinfektion
Dosis (mg/kg)
Behandlungsplan durchschnittliche Anzahl Pocken (5 Mäuse)
Kontrolle
58,7
100
- 2 Stunden
1
25
- 2 Stunden
1,6
100
- 6 Stunden
4
25
- 6 Stunden
26
III. Antitumoraktivität:
(1) Aktivität gegen Mäuse Leukemia P-388: CDFi-Mäuse werden intraperitoneal mit P-388-Zellen, 1 x 102, beimpft und 25 täglich vom 1. bis zum 15. Tag mit CH-1 behandelt.
Resultat
Dosis durchschnittl. Überlebenstage erhöhte Lebensspanne
(mg/kg/Tag) (4 Mäuse) (%)
30
Kontrolle
15
0
50
16,8
8
250
19,5
26
35
Erhöhte Lebensspanne (%) =
durchschnittl. Überlebenstage (behandelt) durchschnittl. Überlebenstage (Kontrolle)
x 100-100
(2)Aktivität gegen S-180 fester Tumor: ICR-Mäuse werden subcutan mit Sarcoma-180 (1 x 10')-Zellen am Tag 0 beimpft und anschliessend wird CH-1 intraperitoneal an den Tagen 1 bis 9 einmal täglich verabreicht.
Dosis durchschnittl. Lebensspanne erhöhte Lebensspanne
(mg/kg/Tag) (Tage, 5 Mäuse)
(%)
42
0
50 50
19
250 61
45
Eine bereits bekannte Antitumor-wirksame Substanz, welche aus der Gattung Chlorella erhalten wird, ist ein aus Chlorella regularis isoliertes Antitumormittel (japanische ungeprüfte Patent-Veröffentlichung Nr. 52-79016). Diese Substanz enthält 3,6% Proteine, während keinerlei Protein in CH-1 gefunden wurde. Ferner ist die oben genannte bekannte Substanz ein Polysaccharid, welche aus 95 ± 2% Glucose und Spuren von Rhamnose und Galactose besteht, also ein Polysaccharid, welches aus Glucose als Hauptbestandteil besteht. Demgegenüber ist CH-1 der vorliegenden Erfindung ein Polysaccharid, welches kleine Mengen an Galactose, Arabi-nose, Glucose und Glucuronsäure enthält und als Hauptbestandteil Rhamnose. Beide Substanzen sind in ihren Zuckerzusammensetzungen verschieden voneinander. CH-1 wird daher als neue Substanz betrachtet.
In den beiliegenden Zeichnungen stellt:
Fig. 1 das IR-Spektrum von CH-1,
Fig. 2 das elektrophoretische Muster von CH-1 auf einer Acetatmembran, und 45 Fig. 3 das Ultracentrifugenmuster von CH-1 dar.
Zur Herstellung der CH-1-Substanz verwendet man Chlorella-Zellen, welche durch Züchtung einer Art Chlorella gewonnen werden können, aus welchen Zellen CH-1 isoliert wird. Das Verfahren ist in Patentanspruch 2 definiert. 50 Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Chlorella ist in der Natur weit verbreitet und ist eine einzellige Alge. Vorzugsweise werden in der vorliegenden Erfindung Zellen von Chlorella pyrenoidosa verwendet, sowie künstliche Mutanten davon, welche durch Einwirkung von Ultraviolett-, 55 Röntgenstrahlen, Strahlen oder chemische Mutagene, erhalten werden, sowie natürliche Mutanten der Chlorella-Zellen, welche CH-1 erzeugen.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden Chlorella-Zellen, welche zur Gattung Chlorella gehören, in einem 60 geeigneten Medium gezüchtet. Das Nährmedium kann Essigsäure, Kohlenstoffdioxid, Calciumsalze, Magnesiumsalze und Calciumsalze enthalten, sowie, falls notwendig, andere Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Stickstoffquellen, wie Harnstoff, und Vitamine. Die Züchtung wird üblicherweise asep-65 tisch in einem luftdichten Gefäss unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Sichtbares Licht, z.B. Sonnenlicht oder Fluoreszenzlicht wird angewandt.
CH-1 kann mit heissem Wasser aus den frisch gezüchteten
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4
Zellen oder gefriergetrockneten Zellen extrahiert werden. Die Extraktion erfolgt im allgemeinen bei 80 bis 90 °C während 1 Stunde. Der Extrakt oder dessen Konzentrat wird mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel behandelt, um das Material auszufällen. Bevorzugte Beispiele von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln sind niedere Alkohole, wie Methanol und Äthanol. Die bevorzugte Konzentration kann im Bereich zwischen 40 und 80% gewählt werden.
Der derart erhaltene Niederschlag wird z.B. durch Zentri-fugieren gesammelt, in Wasser gelöst und durch eine semipermeable Membran, z.B. ein Cellophanrohr, dialysiert, um niedermolekulare Verunreinigungen zu entfernen.
Das Dialysat wird durch Adsorptionschromatographie und Gelfiltration behandelt, um das CH-1 zu reinigen. Beispielsweise wird das Dialysat an einer Säule aus DEAE-Cel-lulose adsorbiert und mit verdünnter alkalischer Lösung elu-iert. Das Eluat wird neutralisiert, durch eine Säule aus CM-Cellulose geleitet und die aktive Fraktion lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in Wasser gelöst und an einer Säule aus DEAE-Sepharcel adsorbiert und anschliessend mit Wasser und IM NaCI/0,01 N-HCI in steigendem Verhältnis eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, der Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-75 oder Sephadex G-100 unterworfen und lyophilisiert, um CH-1 zu erhalten.
Das folgende Beispiel illustriert die vorliegende Erfindung ohne diese einzuschränken.
Beispiel
Ein sprühgetrocknetes Pulver (1 kg) Chlorella pyrenoi-dosa wurde mit heissem Wasser (5 Liter) bei 80 bis 90 °C während 1 Stunde extrahiert. Der Extrakt wurde mit 7000 5 Touren pro Minute während 20 Minuten zentrifugiert. Zu der überstehenden Lösung wurde Methanol bis zu einer Konzentration von 40% zugesetzt und die Lösung über Nacht bei 5 °C stehengelassen, worauf sie mit 9000 Touren pro Minute während 20 Minuten zentrifugiert wurde. Der Niederschlag io wurde in Wasser gelöst und die wässerige Lösung in einem Cellophanrohr (cellophane tube) gegen deionisiertes fliessen-des Wasser über Nacht dialysiert. Das Dialysat wurde an einer Säule (6,4 x 39 cm) aus DEAE-Cellulose, mit 0,005 M Phosphatpuffer (pH 6,0) ins Gleichgewicht gebracht, adsor-15 biert und mit 0,05 N NaOH eluiert. Jede 10-ml-Fraktion wurde auf IF induzierende Aktivität untersucht und die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und mit 1 N-HCI neutralisiert. Die Lösung wurde sodann durch eine Säule (4x15 cm) aus CM-Cellulose geleitet, das Eluat konzentriert und lyophi-20 lisiert. Das Rohpulver wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst und an einer Säule (2,5 x 50 cm) DEAE-Sepharcel adsorbiert und durch steigende Eluierung mit Wasser (500 ml) und IM NaCI/0,01 N-HCI (500 ml) eluiert. Jede 10-ml-Fraktion wurde mit Anthron-HiSCU geprüft und die Fraktio-25 nen, welche eine hohe Saccharidkonzentration aufwiesen, wurde gesammelt, mit 0,02 N-NaOH neutralisiert und dann mit Hilfe eines Cellophanrohres gegen Leitungswasser über Nacht dialysiert. Das Dialysat wurde durch eine Säule (5 x 70 cm) aus Sephadex G-75 geleitet. Das Eluat wurde 30 lyophilisiert und ergab ein weisses Pulver aus CH-1 (200 mg).
G
1 Blatt Zeichnungen

Claims (8)

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  1. (1) Monosaccharid-Analyse: Rhamnose, Galactose, Arabi-nose, Glucose und Glucuronsäure (nachgewiesen durch Papierchromatographie und Gaschromatographie nach Hydrolyse in 7%iger H2SO4, am Rückfluss während 2 Stunden erhitzt),
    (m) Zuckergehalt: 53% (berechnet als Glucose), dadurch gekennzeichnet, dass man Chlorella-Zellen, welche zur Gattung Chlorella gehören, mit heissem Wasser extrahiert, durch Zusatz eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels zum Extrakt fraktioniert ausfällt, die wässerige Lösung des Niederschlages dialysiert und das derart erhaltene Dialy-sat der Adsorptionschromatographie und der Gelfiltration unterwirft, um die physiologisch aktive Substanz CH-1 zu isolieren.
    (1) Monosaccharid-Analyse: Rhamnose, Galactose, Arabi-nose, Glucose und Glucuronsäure (nachgewiesen durch Papierchromatographie und Gaschromatographie nach Hydrolyse in 7%iger H2SO4, am Rückfluss während 2 Stunden erhitzt),
    (m) Zuckergehalt: 53% (berechnet als Glucose).
    1. Physiologisch wirksame CH-1, welche die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:
    (a) sie enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff, und die Elementaranalyse ist die folgende:
    C 38,49%, H 6,07%, N 1,39%,
    (b) Molekulargewicht: undurchlässig für Cellophanmem-bran, und S = 6,15 S (gemessen mit Ultrazentrifuge),
    (c) Schmelzpunkt: gefärbt etwa bei 240 °C, nachher Verkohlung bei höherer Temperatur,
    (d) spezifische Drehung: [a]o = —9,52 (c = 1, H2O),
    (e) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Endabsorption in 0,125%iger wässeriger Lösung,
    (f) Infrarot-Absorptionsspektrum: Fig. 1,
    (g) Löslichkeit: löslich in Wasser, unlöslich in organischen Lösungsmitteln, z.B. Methanol,
    (h) Farbreaktion: positiv auf Anthron, Molisch und Car-bazol-H2SC>4 negativ auf Folin-Lowry und Ninhydrin,
    (i) Natur: sauer, Elektrophorese auf Acetatmembran,
    siehe Fig. 2,
    (j) Farbe: weisses Pulver,
    (k) Protein: nicht feststellbar (gemessen mit Folin-Lowery-Farbreaktion),
  2. 2. Verfahren zur Herstellung der physiologisch aktiven Substanz CH-1, welche die folgenden physikalisch-chemi-schen Eigenschaften aufweist:
    (a) sie enthält Kohlenstoff, Wasserstoff, Sauerstoff und Stickstoff, und die Elementaranalyse ist die folgende:
    C 38,49%, H 6,07%, N 1,39%,
    (b) Molekulargewicht: undurchlässig für Cellophanmem-bran, und S = 6,15 S (gemessen mit Ultrazentrifuge),
    (c) Schmelzpunkt: gefärbt etwa bei 240 °C, nachher Verkohlung bei höherer Temperatur,
    (d) spezifische Drehung: [cc]d = —9,52 (c = 1, H2O),
    (e) Ultraviolett-Absorptionsspektrum: Endabsorption in 0,125%iger wässeriger Lösung,
    (f) Infrarot-Absorptionsspektrum: Fig. 1,
    (g) Löslichkeit: löslich in Wasser, unlöslich in organischen Lösungsmitteln, z.B. Methanol,
    (h) Farbreaktion: positiv auf Anthron, Molisch und Car-bazol-H2SC>4 negativ auf Folin-Lowry und Ninhydrin,
    (i) Natur: sauer, Elektrophorese auf Acetatmembran,
    siehe Fig. 2,
    (j) Farbe: weisses Pulver,
    (k) Protein: nicht feststellbar (gemessen mit Folin-Lowery-Farbreaktion),
    2
    PATENTANSPRÜCHE
  3. 3. Verfahren nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die fraktionelle Ausfällung durch ein Lösungsmittel mit einem niederen Alkohol durchgeführt wird.
  4. 4. Verfahren nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die fraktionierte Ausfällung mit einem niederen Alkohol mit Methanol durchgeführt wird.
  5. 5. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die fraktionierte Ausfällung mit Methanol mit einer Methanolkonzentration von 40 bis 80% erfolgt.
  6. 6. Verfahren nach einem der Patentansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Adsorptionsmittel für die Adsorptionschromatographie Diäthylaminoäthylcellulose und Carboxymethylcellulose ist.
  7. 7. Verfahren nach einem der Patentansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Gelfiltrationsmedium für die Gelfiltration ein von Dextran abgeleitetes, dreidimensional vernetztes Polysaccharid ist.
  8. 8. Verfahren nach einem der Patentansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Chlorella Chlorella pyre-noidosa ist.
CH6762/82A 1981-12-02 1982-11-19 Physiologisch aktive substanz ch-1 und verfahren zu deren herstellung. CH654013A5 (de)

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