CN112457425B - 一种具有抗肝癌细胞增殖活性的小球藻多糖的提纯方法 - Google Patents

一种具有抗肝癌细胞增殖活性的小球藻多糖的提纯方法 Download PDF

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Abstract

本申请提供一种具有抗肝癌细胞增殖活性的小球藻多糖的提纯方法，所述方法包括，通过离子交换层析法和苯酚‑硫酸比色法联用，对小球藻粗多糖PCA分离得到PCA1、PCA2以及PCA3粗多糖提取物；通过分子排阻层析法和苯酚‑硫酸比色法联用，对所述提取物净化，得到精PCA1与精PCA2；通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法，检测精PCA1与精PCA2对SMMC‑7721的抗增殖作用；通过氯化钡‑浊度法检测精PCA1与精PCA2中硫酸根含量。本申请提供的纯化方法得到PCA2，以1g/L的浓度干预人肝癌细胞SMMC‑7721经过24小时后，SMMC‑7721的细胞增殖明显降低75.49％。

Description

一种具有抗肝癌细胞增殖活性的小球藻多糖的提纯方法
技术领域
本申请涉及多糖分离纯化及生物活性检测技术领域，尤其涉及一种具有抗肝癌细胞增殖活性的小球藻多糖的提纯方法。
背景技术
小球藻(CV)由于具有多种生物学功能，近年来得到了广泛的研究。研究表明，小球藻(CV)具有免疫调节、抗胆固醇和抗肿瘤活性。
多糖作为小球藻的活性成分，已被发现具有抗炎和免疫调节作用。小球藻粗多糖提取物可通过下调抗凋亡蛋白、上调凋亡执行蛋白诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡，为抗肝癌药物的筛选提供了新思路。然而，对于小球藻粗多糖提取物中具有抗人肝癌细胞SMMC-7721增殖作用的具体成分并不清楚。目前存在小球藻粗多糖中具体活性组分有待进一步分离的问题。
发明内容
本申请提供了一种具有抗肝癌细胞增殖活性的小球藻多糖的提纯方法，以解决小球藻粗多糖中具体活性组分有待进一步分离的问题。
本申请提供一种具有抗肝癌细胞增殖活性的小球藻多糖的提纯方法，包括：
通过离子交换层析法和苯酚-硫酸比色法联用，对小球藻粗多糖PCA分离得到PCA1、PCA2以及PCA3粗多糖提取物；
通过分子排阻层析法和苯酚-硫酸比色法联用，对所述提取物净化，得到精PCA1与精PCA2；
通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法，检测精PCA1与精PCA2对SMMC-7721的抗增殖作用；
通过氯化钡-浊度法检测精PCA1与精PCA2。
可选的，通过离子交换层析法和苯酚-硫酸比色法联用，对小球藻粗多糖(PCA)
分离得到粗PCA1、PCA2以及PCA3提取物的步骤包括：
将DEAE-琼脂糖凝胶产品进行溶胀预处理，真空脱气后装柱，柱长7cm，直径3cm；用300mL，pH＝7.2的Tris-HCl缓冲液300mL平衡；
将浓度为5mg/mL离心后的粗多糖溶液3mL加入平衡好的柱内，打开柱出口，粗多糖溶液开始缓慢渗入凝胶柱中，待完全渗入后加洗脱液洗脱，采用溶于Tris-HCl缓冲液的NaCl溶液浓度梯度洗脱，流速为100mL/h；洗脱液中NaCl浓度依次如下：0.00mol/L(100mL)、0.50mol/L(100mL)、1.00mol/L(100mL)；
每10mL收集一分样，各分样用苯酚-硫酸比色法测吸光值，绘制吸光值—洗脱体积的洗脱曲线；
将剩余多糖重复分离纯化，合并洗脱曲线中峰对应的分样，将剩余多糖继续处理，并将每个峰的所有样品结合起来；
得到粗PCA1、PCA2与PCA3提取物，于-35℃，24h冻干备用。
可选的，通过分子排阻层析法和苯酚-硫酸比色法联用，对所述提取物净化，得到精PCA1与精PCA2的步骤包括：
将葡聚糖G-25凝胶颗粒经溶胀处理后装柱，柱长40cm，直径1.0cm；
将葡萄糖标准品及所述粗多糖提取物分别溶解于蒸馏水中，充分搅拌使其溶解，离心取上清液，将上清液加入凝胶柱内，打开柱出口，待样品溶液完全渗入凝胶后，加入洗脱液开始洗脱；
每1mL收集一分样，用苯酚—硫酸法测定各分样的吸光值，绘制吸光值—洗脱体积的洗脱曲线，合并洗脱曲线中峰对应的分样；
将洗脱后的产物于-35℃，24h冻干备用。
可选的，通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法，检测精PCA1与精PCA2对SMMC-7721的抗增殖作用的步骤包括：
用0.25％的胰蛋白酶消化SMMC-7721细胞，然后用RPMI-1640培养基悬浮，添加10％的小牛血清，得到反应液；
将所述反应液在37℃在96孔平板引导微板中与5％CO2培养箱中孵育；
培养24h后，去除原代营养液，分别加入含精PCA1或PCA2的培养基，最终浓度为1g/L，培养24h；
每孔加入20μL四甲基偶氮唑盐溶液，继续培养4h；
复孔平行，取不同批次获取的精PCA1与PCA2，平行实验三次，取平均值；
取平行实验平均值，计算抑制率，公式如下：抑制率＝1-(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔A值-空白孔OD值)×100％。
可选的，通过氯化钡-浊度法检测精PCA1与精PCA2的步骤包括：
称量1mg PCA1或PCA2，溶解在1mL盐酸中，密封100℃水浴7h并冷却后，进行冷冻干燥得到冻干粉末；用1mL蒸馏水溶解冻干粉末得到溶液，然后溶液稀释成2mL得到稀释液；
配制BaCl2明胶溶液、三氯乙酸水溶液以及标准液；
稀释液中加入8％三氯乙酸水溶液和0.5％BaCl2明胶溶液，混合后室温下静置15min；
于360nm处测量吸光度值，以10μg/mL硫酸钾水溶液绘制标准曲线并计算得到硫酸盐浓度。
可选的，所述小球藻粗多糖是从自养小球藻通过超声破碎和碱萃取法制备得来；其中，自养小球藻煮过三次后在12小时黑暗以及12小时光循环中生长。
可选的，所述自养小球藻中干物质组分：蛋白质为55～67％；粗纤维为1～4％；脂质为8～13％；灰分为5～8％；糖类为10～20％为水分3～5％；小球藻多糖中含有以下几种已知糖基与示活的单糖；已知糖基的摩尔比如下：D-岩藻糖：D-鼠李糖：D-2-氨基葡萄糖：D-半乳糖：D-葡萄糖＝1.3：1.0：1.4：1.2：3.1。
由以上技术方案可知，本申请提供一种具有抗肝癌细胞增殖活性的小球藻多糖的提纯方法，所述方法包括，通过离子交换层析法和苯酚-硫酸比色法联用，对小球藻粗多糖PCA分离得到PCA1、PCA2以及PCA3粗多糖提取物；通过分子排阻层析法和苯酚-硫酸比色法联用，对所述提取物净化，得到精PCA1与精PCA2；通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法，检测精PCA1与精PCA2对SMMC-7721的抗增殖作用；通过氯化钡-浊度法检测精PCA1与精PCA2中硫酸根含量。本申请提供的分离纯化方法得到PCA2，以1g/L的浓度干预人肝癌细胞SMMC-7721经过24小时后，SMMC-7721的细胞增殖明显降低75.49％。说明本申请提供的分离纯化方法可得到对人肝癌细胞SMMC-7721的具有抗增殖作用的小球藻多糖PCA2。
附图说明
为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为离子交换层析法和苯酚-硫酸比色法联用得到的自养小球藻粗多糖的洗脱曲线；
图2为分子排阻层析法和苯酚-硫酸比色法联用得到的标准葡萄糖溶液的洗脱曲线；
图3为分子排阻层析法和苯酚-硫酸比色法联用得到的PCA1洗脱曲线；
图4为分子排阻层析法和苯酚-硫酸比色法联用得到的PCA2洗脱曲线；
图5为PCA1、PCA2分别对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制率；
图6为氯化钡-浊度法得到的硫酸盐浓度标准曲线；
图7为本申请提供的一种具有抗肝癌细胞增殖活性的小球藻多糖的提纯方法流程图。
具体实施方式
下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的系统和方法的示例。
本申请提供一种具有抗肝癌细胞增殖活性的小球藻多糖的提纯方法，包括：
通过离子交换层析法和苯酚-硫酸比色法联用，对小球藻粗多糖PCA分离得到PCA1、PCA2以及PCA3粗多糖提取物；
通过分子排阻层析法和苯酚-硫酸比色法联用，对所述提取物净化，得到精PCA1与精PCA2；
通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法，检测精PCA1与精PCA2对SMMC-7721的抗增殖作用；
通过氯化钡-浊度法检测精PCA1与精PCA2中硫酸根含量。
实施例
1.制备小球藻多糖
1.1自养小球藻的培养
自养小球藻种群来源于辽宁省海洋水产科学研究院。该库存被转移到10L煮沸过三次的海水中，并在F/2Mediam(12小时黑暗：12小时光循环)中生长。
自养小球藻生长条件：F/2(Guillard.1962)改良配方(海水)
Figure BDA0002825833950000041
Figure BDA0002825833950000051
自养小球藻的生长周期：迟缓期：0～2d；生长期：2～8d；死亡期：8～11d。
自养小球藻中干物质组分：蛋白质：55～67％；粗纤维：1～4％；脂质：8～13％；灰分：5～8％；糖类：10～20％；水分3～5％。
小球藻多糖组分：小球藻多糖中含有以下几种已知糖基与示活的单糖。已知糖基的摩尔比如下：D-岩藻糖：D-鼠李糖：D-2-氨基葡萄糖：D-半乳糖：D-葡萄糖＝1.3：1.0：1.4：1.2：3.1。
1.2粗多糖提取物的制备
自养小球藻细胞于4500rpm离心10min，60℃干燥，称重。用4％氢氧化钠溶液以1：25的物料比溶解干粉，然后在提取前用超声细胞破碎仪破碎干粉。将得到的样品溶液在80℃水中孵育1h，然后在4500r pm离心10min，取出颗粒。在样品中加入三氯乙酸(TCA)，然后在4500r pm离心15min。上清液用98％乙醇沉淀，然后冻干24小时。
1.3粗多糖分离
利用不同多糖的荷电性不同，通过离子交换层析法对粗PCA进行分离；通过苯酚-硫酸比色法检测不同洗脱时间产物的糖基含量。
分离柱预处理：将DEAE-Sepharose Fast Flow产品进行溶胀预处理，真空脱气后装柱，柱长7cm，直径3cm。用300mL，pH＝7.2的Tris-HCl缓冲液300mL平衡。
样品洗脱：将浓度为5mg/mL离心后的粗多糖溶液3mL在玻璃棒引流下缓慢加入平衡好的柱内，打开柱出口，粗多糖溶液开始缓慢渗入凝胶柱中，待完全渗入后加洗脱液洗脱，采用溶于Tris-HCl缓冲液(pH＝7.2,0.05M)的NaCl溶液浓度梯度洗脱，流速为100mL/h。洗脱液(100mL)中NaCl浓度依次如下：0.00mol/L、0.50mol/L、1.00mol/L。
分样与鉴定：每10mL收集一分样，各分样用苯酚-硫酸比色法测其吸光值，作洗脱曲线，如图1所示。可见3个多糖含量较高的峰分别出现在0～5管、10～15管、20～25管处。
重复分离与合并：将剩余多糖按此步骤重复分离纯化，合并洗脱曲线中峰对应的分样，将剩余多糖作为这种方法处理，并将每个峰的所有样品结合起来。
后处理：得到粗PCA1、PCA2与PCA3，-35℃24h冻干备用。
图1为离子交换层析法和苯酚-硫酸比色法联用得到的自养小球藻粗多糖的洗脱曲线。其中，横坐标为自养小球藻粗多糖通过DEAE-Sepharose Fast Flow柱不同洗脱时间的管号，纵坐标为苯酚-硫酸比色法测得的各管中洗脱液在490nm处的吸光度值。
1.4粗多糖的净化
得到的粗PCA1、PCA2与PCA3中含有大量离子，通过分子排阻层析法和苯酚-硫酸比色法联用，去除其离子，对其进行净化，得到精PCA1与精PCA2。
纯化柱预处理：将Sephadex G-25凝胶颗粒经溶胀处理后装柱，柱长40cm，直径1.0cm。
样品洗脱：将葡萄糖标准品及所得多糖分别溶解于蒸馏水中，充分搅拌使其溶解，离心(2000rpm,10min)取上清液，所得溶液浓度约为100mg/mL，移取3mL此溶液加入预先准备好的凝胶柱内，打开柱出口，待样品溶液完全渗入凝胶后，加入洗脱液(蒸馏水)开始洗脱。
分样与鉴定：每1mL收集一分样，用苯酚—硫酸法测定各分样的吸光值，作吸光值—洗脱体积的洗脱曲线。
采用凝胶过滤色谱(GFC)，通过尺寸排除来识别成分和消除离子。葡萄糖，作为标准实现，会比离子早流出，但比多糖晚流出，因为它们的分子量不同：多糖4000-9000，葡萄糖180.1，Tris121.14，NaCl 58.44。结果表明，多糖和离子被分离，PCA1或PCA2是单组分峰。
重复分离与合并：合并洗脱曲线中峰对应的分样。
后处理：-35℃，24h冻干备用。
图2为分子排阻层析法和苯酚-硫酸比色法联用得到的标准葡萄糖溶液的洗脱曲线；图3为分子排阻层析法和苯酚-硫酸比色法联用得到的PCA1洗脱曲线；图4为分子排阻层析法和苯酚-硫酸比色法联用得到的PCA2洗脱曲线。横坐标为上述三种溶液通过SephadexG-25柱不同洗脱时间的管号，纵坐标为苯酚-硫酸比色法测得的各管中洗脱液在490nm处的吸光度值。采用梯度洗脱法获得了三种组分，即PCA1、PCA2和PCA3。其中，负电荷的内容为增量。将PCA1和PCA2冷冻干燥以进一步分离，但PCA3不足以进行后续分析。结果表明，逐步洗脱得到三个峰，分别为0.0、0.5和1M氯化钠溶液。所显示的数据是三个独立实验的一个代表，结果相似。
1.5检测PCA1与PCA2对人肝癌细胞SMMC-7721的抗增殖作用
小球藻的粗多糖具有抗肿瘤和诱导凋亡的活性。由于它是杂多糖，本申请的目的是检测多糖的活性成分。
细胞培养：用0.25％的胰蛋白酶消化SMMC-7721细胞，然后用RPMI-1640培养基悬浮，添加10％的小牛血清。样品在37℃在96孔平板引导微板中与5％CO2培养箱中孵育。
精PCA干预：培养24h后，去除原代营养液，分别加入含PCA1或PCA2的培养基，最终浓度为1g/L，培养24h。
MTT显色：每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h。用酶标仪(Thermo电子公司，美国)在490nm处测量细胞的吸光度。
平行实验：复孔平行，取不同批次获取的精PCA1与PCA2，平行实验三次，取平均值。
计算：取平行实验平均值，计算抑制率，公式如下：抑制率＝1-(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔A值-空白孔OD值)×100％。
小球藻的粗多糖具有抗肿瘤和诱导凋亡的活性。由于它是杂多糖，本申请的目的是检测多糖的活性成分，MTT的结果显示了PCA1和PCA2对人肝癌细胞SMMC-7721起到抗增殖作用。浓度为1.0g/L的PCA2暴露出显著的致死性，超过75％的癌细胞在处理24h后具有抗增殖作用。然而，由于PCA1的分子量和电荷不同，其抗肿瘤活性明显降低。
图5为PCA1、PCA2分别对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖抑制率。结果显示浓度为1.0g/L的PCA2暴露出显著的致死性，超过75％的癌细胞在处理24h后具有抗增殖作用。
2硫酸盐的测定
2.1样品预处理：准确称量1mg PCA1或PCA2，溶解在1mL盐酸中，密封100℃水浴7h并冷却后，将管内容物冷冻干燥。用1mL蒸馏水溶解干粉，然后将0.1mL本溶液稀释成2mL。
2.2溶液配制：
2.2.1明胶溶液：2g明胶在60～70℃溶于400mL水中，4℃保存，静置过夜。称取多糖样品10mg(1mg)，加入盛有10mL(1mL)1mol/L的HCl的水解管中，干燥CO2密封，100℃水解7h，用干燥CO2吹干水解液。
2.2.2BaCl2明胶溶液：0.5g BaCl2溶于100mL明胶溶液中，4℃保存。
2.2.3三氯乙酸(TCA)：8％水溶液。
2.2.4标准液配制：
六支试管(HNO3浸泡过夜后去离子水冲洗)，编号，按下表加入试剂(单位：mL)。
Figure BDA0002825833950000071
Figure BDA0002825833950000081
震荡，静置15min，1号试剂为空白，用紫外分光光度计在360nm波长下测定浊度(L＝1)。
2.3样品反应：加入8％TCA水溶液和0.5％氯化钡-明胶溶液，混合后室温下保存15min。
2.4样品检测：于360nm处测量吸光度值，以10μg/mL硫酸钾水溶液绘制标准曲线。
2.5浓度计算：依据标准曲线计算样品硫酸盐浓度。
本申请采用氯化钡-浊度法进行。准确地称重1mg的PCA1或PCA2，溶解在1mL盐酸中。然后将样品转移到密封管中，在100℃水浴中保存7h。冷却后，将管的含量冷冻干燥。用1mL蒸馏水溶解干粉，然后将0.1mL这些溶液稀释成2mL。后加入8％三氯乙酸和0.5％氯化钡-明胶试剂。混合后，样品在室温下保存15min，然后在360nm处对适当的试剂空白进行测量。以硫酸钾溶液为标准曲线。
一种具有抗肝癌细胞增殖活性的小球藻多糖的提纯方法根据标准曲线，计算PCA中硫酸盐的含量。因此，在PCA1和PCA2之间发现了明显的区别。PCA2的硫酸盐含量为1.814×10-3摩尔/g，但PCA1不含硫酸盐。发现这一结果与阴离子交换色谱的结果相似。因此，认为PCA的负电荷很可能主要是硫酸盐。
图6为氯化钡-浊度法得到的硫酸盐浓度标准曲线。
由以上技术方案可知，本申请提供一种具有抗肝癌细胞增殖活性的小球藻多糖的提纯方法，所述方法包括，通过离子交换层析法和苯酚-硫酸比色法联用，对小球藻粗多糖PCA分离得到PCA1、PCA2以及PCA3粗多糖提取物；通过分子排阻层析法和苯酚-硫酸比色法联用，对所述提取物净化，得到精PCA1与精PCA2；通过四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法，检测精PCA1与精PCA2对SMMC-7721的抗增殖作用；通过氯化钡-浊度法检测精PCA1与精PCA2。本申请提供的分离纯化方法得到PCA2，以1g/L的浓度干预人肝癌细胞SMMC-7721经过24小时后，SMMC-7721的细胞增殖明显降低75.49％。说明本申请提供的分离纯化方法可得到对人肝癌细胞SMMC-7721的具有抗增殖作用的小球藻多糖PCA2。
本申请提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本申请总的构思下的几个示例，并不构成本申请保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本申请方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本申请的保护范围。

Claims (3)

1.一种小球藻多糖精PCA2在制备抗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述小球藻多糖的制备方法包括如下步骤：
（1）粗多糖PCA的制备
自养小球藻细胞于4500rpm离心10min，60℃干燥，称重；
用4%氢氧化钠溶液以1：25的料液比溶解干粉，在提取前用超声细胞破碎仪破碎；将得到的样品溶液在80℃水中孵育1h，4500r pm离心10min，取出颗粒；在离心所得溶液中加入三氯乙酸TCA后，4500r pm离心15min，得到上清液；上清液用98%乙醇沉淀，冻干24h，得到粗多糖PCA；
（2）对PCA分离
通过离子交换层析法对PCA进行分离，具体步骤如下：
分离柱预处理：将DEAE-Sepharose Fast Flow产品进行溶胀预处理，真空脱气后装柱，柱长7 cm，直径3 cm；用300 mL，pH＝7.2的Tris-HCl缓冲液300 mL平衡；
样品洗脱：将浓度为5 mg/mL的PCA溶液3 mL在玻璃棒引流下缓慢加入平衡好的柱内，打开柱出口，PCA溶液开始缓慢渗入凝胶柱中，待完全渗入后加洗脱液洗脱，采用溶于Tris-HCl缓冲液的NaCl溶液浓度梯度洗脱，流速为100 mL/h，所述Tris-HCl缓冲液参数：pH＝7.2,0.05M；其中，100 mL洗脱液中NaCl浓度依次如下：0.00 mol/L、0.50 mol/L、1.00 mol/L；收集第二个主洗脱峰PCA2，并于-35℃ 24h冻干备用；
（3）PCA2的净化
纯化柱预处理：将Sephadex G-25凝胶颗粒经溶胀处理后装柱，柱长40 cm，直径1.0cm；
样品洗脱：将PCA2溶解于蒸馏水中，充分搅拌使其溶解，离心取上清液，所得溶液浓度为100 mg/mL，移取3 mL此溶液加入预先准备好的凝胶柱内，打开柱出口，待样品溶液完全渗入凝胶后，加入蒸馏水开始洗脱；
收集精PCA2。
2.根据权利要求1所述的小球藻多糖精PCA2在制备抗肝癌药物中的应用，其特征在于，PCA2的净化步骤中的离心条件为2000 rpm,10 min。
3.根据权利要求1所述的小球藻多糖精PCA2在制备抗肝癌药物中的应用，其特征在于，将收集的精PCA2于-35℃，24h冻干。
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