HU188599B

HU188599B - Process for preparing physiologically active substance designated as ch-1

Info

Publication number: HU188599B
Application number: HU823481A
Authority: HU
Inventors: Iwao Umezawa; Kanki Komyyama
Original assignee: The Kitasato Institute,Jp
Priority date: 1981-12-02
Filing date: 1982-10-29
Publication date: 1986-04-28
Also published as: JPS5896025A; FR2517204B1; ATA436782A; BE894925A; AT380488B; CH654013A5; FR2517204A1; US4533548A; GB2111070A; DE3241990A1; DE3241990C2; GB2111070B; IT8224447A0; IT1205279B; NL8204323A

Description

A találmány tárgya eljárás új, fiziológiásán hatásos CH-1 jelű anyag előállítására.

Mindeddig számos olyan poliszacharid volt ismeretes, amelyeknek vagy interferon-képződést előidéző hatásuk vagy tumor ellenes hatásuk volt; poliszacharid típusú, tumor ellenes szert a gyakorlatban használnak (PSK, Japánban kurestin néven van forgalomban, 52—79016 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés).

Azonban olyan anyag, amelynek tumor ellenes hatása is és biztosan interferon-képződést előidéző hatása is lett volna, idáig nem volt ismeretes.

Azt találtuk, hogy az algacsaládba tartozó zöld egysejtű Chlorella nemhez tartozó Chlorella pyrenoidosa törzsből kivont és izolált anyag mindkét fent leírt tulajdonsággal rendelkezik.

A jelen találmány szerinti új, fiziológiásán hatásos CH-1 jelű anyag (az anyag jelölése a továbbiakban CH-1) olyan savanyú poliszacharid, amelynek mind interferonképződést előidéző, mind tumor ellenes hatása is van.

A CH-1-nek a következő fiziko-kémi^i tulajdonságai vannak:

1) legalább szenet, hidrogént, oxigént és nitrogént tartalmaz és az elem-analízis eredménye a következő:

C: 38,49%, H:6,07%, N:l,39%;

2) molekulasúly: cellofán membránon impermeábilis és ultracentrifugában mért S értéke 6,15, ha az anyag koncentrációja 0,2 %, 0,2 mólos pH = 7,2 foszfát pufferben. A rotor típusa: RA 60HC, fordulatszám 51.200/perc;

3) olvadáspont: 240 °C-nál elszíneződik, majd magasabb hőmérsékleten elszenesedik;

4) specifikus forgatóképesség: [a]⁷⁹ = -9,52 (c — 1, H₂O);

5) UV-spektrum: vég-abszorpció 0,125 %-os vizes oldatban;

6) IR-spektrum (lásd az 1. ábrát) KBr tabletta, abszorpciós sávok 3420, 2930, 1640, 1380, 1125, 1065, 1040, 990, 915, 835 és 800 cm'¹ -nél;

7) oldhatóság: oldódik: vízben, oldhatatlan: általában szerves oldószerben, pl. metanolban;

8) színreakció: pozitív: aptron, Molisch és karbazol-kénsav reagenssel, negatív: Folin-Lowry és ninhidrin reagenssel;

9) jellemzői: savanyú kémhatású, acetát-típusú membrán elektroforézisnél 0,8 cm-re vándorol a pozitív sarok felé a következő feltételek esetén: 0,1 mólos, pH = 5,0 piridin-ecetsav közeg, 200 v, 4 mA, 20 perc;

10) szín: fehér por;

11) protein: nem mutatható ki (Folin-Lowry színreakcióval vizsgálva);

12) monoszacharld analízis: ramnóz, arabinóz, glükóz, galaktóz és glükoronsav (az anyagot 7 %-os kénsavval hidrolizáltuk 2 órán át visszafolyatással, s a hidrolizátumot papírkromatográfiával és gázkromatográfiával vizsgáltuk);

13) cukor tartalom: 53 % (glükózra számítva);

14) uítracentrifugás kép: lásd a 3. ábrát.

A CH-1 biológiai tulajdonságait a következőkben ismertetjük.

I. Interferonképződest előidéző hatás

1. A vizsgáló módszeren vitro)

Fehér japán nyulat az artéria megnyitásával elvéreztettünk. A lépet eltávolítottuk és tripszinnel kezeltük, s így sejtszuszpenziót készítettünk (2,5 · 10⁷ sejt). A lépsejt szuszpenziót a CH-l-el ínkuháltuk 25 °C-on 24 óra hosszat, majd centrifugáltuk és a feliilúszóban meghatároztuk az interferon titert.

2. B vizsgáló módszer /in vivő)

Négyhetes ddy egereket oltottunk 100 mg/kg CH-1gyel intravénásán, majd egyenlő időközönként elvéreztettük az egereket és a szérumok interferon titerét meghatároztuk.

3. Az interferon (IF) titer meghatározás módszere

Az IF titert 50 %-os plakk-csökkentő módszerrel határoztuk meg, RK13 nyúl vese sejtvonal tenyészetet használtunk és agressziós vírusként a Vesicular stomatitis vírust alkalmaztuk.

4. Eredmények

1) in vitro módszerrel: minta koncentrációja (Mg/ml) 10 1 0,1 0,01

IF titer (egység) 49 34 20 2) in vivő módszerrel:

elvéreztetés ideje 2 óra múlva 5 óra múlva IF titer (egység) 240 15

Fentiek alapján a találmány szerint előállított vegyületnek interferon-képződést előidéző hatása van.

11. Vírusfertőzést gátló hatás 1. Vizsgáló módszer ddY egereknek CH-l-et adtunk intravénásán, farokvénába oltva, majd az egereket 2 12 óra múlva Vaccinia vírussal fertőztük intravénásán, a farokvénába oltva. A farok bőrön megjelenő pokkokat a fertőzés utáni 8. napon megszámoltuk.

188 599

2. Eredmény

Az eredményt az alábbi táblázat szemlélteti.

Vírusfertőzést gátló hatás

Dózis (mg/kg)	Kezelés ideje	Átlag pokkszám • (5 egér)
kontroll	_	58,7
100	—2 óra	1
25.	—2 óra	1,6
100	—6 óra	4
25	—6 óra	26

III. Tumor ellenes hatás

1) A P-388 egér-leukémia elleni hatás

CDFj egereket oltottunk intraperitoneálisan 1Ί0² 25 P-388 sejttel, majd 1-15 napon keresztül, naponta kezeltük az egereket CH-l-gyel.

Eredmény: 30

Dózis (mg/kg/nap)	Átlag túlélési napok (4 egér)	Túlélés meghosszabbodás, %
kontroll	15	0
50	16,8	8
250	19,5	26

Az eddig ismert, Chlorella nemhez tartozó organizmusból előállított, tumor ellenes hatású anyagot a Chlorella regulárisból izolálták (52-79016 számú nyilvánosságra hozott japán szabadalmi bejelentés). Ez az anyag 3,6 % proteint tartalmaz, míg a CH-l-ben proteint nem tudtunk kimutatni. Továbbá a fenti, régebben ismert anyag 95 ± 2 % glükózt tartalmazó poliszacharid, amelyben nyomnyi mennyiségű ramnóz és galaktóz van, azaz a poliszacharid fő alkotórésze a glükóz. Ezzel szemlen a jelen találmány szerint előállított CH-1 olyan poliszacharid, amely kevés galaktózt, arabinózt, glükózt és glükuronsavat tartalmaz, s fő komponense a ramnóz. A két anyag, cukor tartalmukat tekintve, különbözik egymástól. Ennélfogva a CH-1 új anyagnak tekintendő.

A jelen találmány a CH-1 anyag előállítására eljárást h le, amely a Chlorella pyrenoidosa tenyésztését és a CH-1 sejttenyészetből történő izolálását foglalja magában.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott chlorella a természetben igen elterjedt egysejtű alga. A sejtek közli legelőnyösebb a jelen találmányban alkalmazott Chlorella pyrenoidosa, de felhasználhatók azok a CH-1 termelő chlorella sejtek is, amelyeket ultraibolya- és röntgen-besugárzással vagy mutagén kémiai anyagokkal mesterségesen előidézett mutációval állítottunk elő, továbbá a természetes mutánsok.

A Chlorella nemhez tartozó chlorella sejteket, jelen találmány szerint, megfelelő tápoldatban tenyésztjük. Olyan tápoldat használható, amely ecetsavat, széndioxidot, kalcium-, magnézium- és káliumsót, ha szükséges más szénforrásokat, így glükózt, nitrogén forrásokat, így karbamidot és vitaminokat tartalmaz. A tenyésztést rendszerint aszeptikus körülmények közt, zárt tartályban, aerob módon végezzük. Látható fényt, például napfényt vagy fluoreszcens fényt alkalmazunk.

A CH-1 sejttenyészetből vagy porlasztva szárított sejtekből forró vízzel extrahálható. Az extrakciót 8090 °C-on egy órán át végezzük. Az anyagot úgy csapjuk ki, hogy az extraktumot vagy ennek koncentrátuniát vízzel elegyedő szerves oldószerrel kezeljük. Előnyös vízzel elegyedő oldószerek a rövid szénláncú alkoholok, pélTúlélés meghosszabbodás (%) = _átlagos túlélés napokban (kezeiteknél) átlagos túlélés napokban (kezeletleneknél)

100-100.

2) Az S-180 szolid tumor elleni hatás

ICR egereket oltottunk szubkután 1 · 10^-7 Sarcoma180 sejttel a 0 napon, majd folyamatosan, 1-9 napig, naponta egyszer adtunk az egereknek intraperitoneálisan CH-l-et.

Adag (mg/kg/nap)	Átlag túlélés (nap, 5 egér)	Túlélés meghosszabbodás, %
_	42	0
50	50	19
250	61	45

dául a metanol és etanol. Az alkohol koncentrációja előnyösen 40—80 %.

Az így kapott csapadékot centrifugálással gyűjtjük össze, majd vízben oldjuk és féligáteresztő hártyán, például cellofán hurkában, dializáljuk és ezzel a kis molekulasúlyú szennyezéseket eltávolítjuk.

A tisztított CH-1 előállítására a dializátumot adszorpciód kromatográfiával és gélszűréssel kezeljük. Például a dializátumot DEAE-cellulóz oszlopra adszorbeáljuk és híg lúgos oldattal eluáljuk. Az eluátumot semlegesítjük, majd CM-cellulóz oszlopon kromatografáljuk, s a hatékony frakciót liofilizáljuk. A liofilizált frakciót vízben feloldjuk, DEAE-Sephacel oszlopra adszorbeáljuk, majd gradiens kroinatografálást végzünk vízzel és 0,01 n sósavban oldott 1 mólos nátrium-kloriddal. A CH-l-et úgy kapjuk meg, hogy a hatékony frakciókat egyesítjük, Sephadex G-75 oszlopon gélszűrést végzünk, s az így kapott anyagot liofilizáljuk.

188 599

A találmány szerinti eljárás kiviteli módját a példával szemléltetjük anélkül, hogy a találmány oltalmi körét a példára korlátoznánk.

Példa

Chlorella pyrenoidosa porlasztva szárított porának 1 kg-ját 5 liter forró vízzel 80—90 C-on 1 órát extraháltak. Az extraktumot 7000 fordulatszám/perc mellett 20 percig centrifugáltuk. A felülúszó folyadékhoz metanolt adtunk 40% koncentrációig és az anyagot egy éjszakán át állni hagytuk 5 °C-on, majd 9000 ford./perc mellett lecentrifugáltuk. A csapadékot vízben feloldottuk és a vizes oldatot cellofán hurkában dializáltuk folyó g ionmentes vízzel szemben egy éjszakán át. A dializáturnot 6,4·39 cm-es DEAE-cellulóz oszlopon adszorbeáltuk, 0,005 mólos pH = 6,0 foszfát pufferrel kiegyensúlyoztuk és 0,05 n nátrium-hidroxid-oldattal eluáltuk. Minden 10 ml-es frakciót IF indukciós hatásra megvizs- 20 gáltunk, a hatékony frakciókat egyesítettük és 1 n sósavval semlegesítettük. Az oldatot egy 4· 15 cm-es CMcellulóz oszlopon engedtük át, az eluátumot betöményítettük és liofilizáltuk. A nyers port kismennyiségű vízben feloldottuk és az oldatot 2,5*50 cm-es DEAE- 25 Sephacel-oszlopon adszorbeáltuk, majd gradiens elúciót végeztünk 500 ml vízzel és 500 ml 0,01 n sósavban oldott 1 mólos nátrium-klorid-oldattal. Minden 10 ml-es frakciót kénsavas antron reagenssel megvizsgáltunk és azokat a frakciókat, amelyekben a cukor nagy koncentrációban volt jelen, egyesítettük, 0,02 n nátriumhidroxid-oldattal semlegesítettük, majd cellofán hurkában dializáltuk csapvízzel szemben egy éjszakán át.

A dializátumot ezután 5 · 70 cm-es Sephadex G-75 oszlopra vittük fel. Az eluátumot liofilizáltuk, s így a 200 mg CH-l-et fehér por alakjában kaptuk meg.

Az ábrák rövid magyarázata:

1. ábra: A CH-1 IR-spektruma;

2. ábra: A CH-1 elektroforetikus viselkedése acetát membránon;

3. ábra: A CH-1 ultracentrifugás képe.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás a fiziológiásán hatásos CH-1 jelű anyag előállítására, amelynek fizikai-kémiai tulajdonságai a következők:

1) legalább szenet, hidrogént, oxigént és nitrogént tartalmaz és elemi analízise a következő:

C: 38,49%, H: 6,07 %, · N: 1,39 %;
2) molekulasúlya: cellofán membránon impermeábilis és ultracentrifugában mért S-értéke 6,15;
3) olvadáspontja: 240°C-nál elszíneződik, majd magasabb hőmérsékleten szenesedik;

.
4) specifikus forgatóképessége: [ajp⁹ = —9,52° (c = = 1, vízben);
5) UV-spektruma: végabszorpció 0,125 %-os vizes oldatban;
6) Infravörös abszorpciós spektruma: KBr tabletta, abszorpciós sávok 3420, 2930,1640,1380,1125, 1065, 1040, 990, 915, 835 és 800 cm'^{1 2 3}-nél;
7) oldhatósága: oldódik vízben oldhatatlan szerves oldószerben, így metanolban;
8) színreakció: pozitív: antron, Molisch és karbazol-kénsav reagenssel, negatív: Folin-Lowry és ninhidrin reagenssel;
9) jellemzői: savanyú kémhatású, cellulóz-acetát típusú membrán elektroforézisnél 0,8 cm-re vándorol a pozitív sarok felé a következő feltételek esetén: 0,1 mólos, pH = 5,0 piridin-ecetsavas közegben, 200 v,4 inA, 20 perc;
10) színe: fehér por;
11) protein: nem mutatható ki (Folin-Lowry színreakcióval);
12) monoszacharid analízis: ramnóz, arabínóz, glükóz, galaktóz és glükuronsav (papírkromatografálással és gázkromatografálással kimutatva 7 %-os kénsavval 2 óra hosszat visszafolyatás közben való hidrolízis után);
13) cukortartalom: 53 % (glükózra számítva), azzal jellemezve, hogy Chlorella pyrenoidosa sejteket forró vízzel extrahálunk, az extrakthoz vízzel elegyedő 30 szerves oldószert adva frakcionáltan lecsapjuk, a csapadék vizes oldatát dializáljuk és az így kapott dializátumot adszorpciós kromatografálásnak és gélszűrésnek vetjük alá.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, 35 hogy az oldószerrel végzett frakcionált lecsapáshoz 1-4 szénatomos alkanolt használunk.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy 1-4 szénatomos alkanolként metanolt használunk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, 40 hogy a frakcionált lecsapást 40-80 %-os metanollal végezzük.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az adszorpciós kromatogra falashoz adszorbensként DEAE-cellulőzt használunk.

45 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a gélszűréshez 40-120 pírt szemcseátmérőjű, 1000-150 000 molekulasúly elválasztási tartományú, cpiklórhidrinnel térhálósított dextránt használunk.

7. Eljárás hatóanyagként az 1. igénypontban megha50 tározott, fiziológiásán hatásos CH-1 jelű anyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított hatóanyagot a gyógyszerkészítmények szokásos hordozó-, hígító-, töltő- és/vagy egyéb

55 segédanyagaival együtt gyógyszerkészítménnyé kikészít-