HU214641B - Eljárás pörk és elhalt szövetek eltávolítására használható, eszkaráztartalmú proteolitikus keverék előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány szerinti eljárás sőrán a brőmelaint egy antiőxidánsjelenlétében extrahálják, majd a kívánt keveréket fehérjeprecipitálóreagens adagőlásával nyerik ki őly módőn, hőgy a precipit ciót azeszkaráz izőelektrőmős pőntjánál savasabb körülmények között hajtjákvégre. ŕ

Description

Az eszkaráz egy hidrolitikus aktivitású enzim, amelynek nincs kazeinolitikus aktivitása, izoelektromos pontja 6 körül van, körülbelül 45 000 dalton a molekulatömege és három, valószínűleg azonos, egyenként 15000 dalton molekulatömegű alegységből áll.

Az eszkaráz és az eszkaráztartalmú keverékek igen jól használhatók fel az emlősszervezetből származó élettelen szövetek, különösen az égési sérülések következtében elhalt szövetek eltávolítása során.

A termék, valamint előállításának és alkalmazásának módszerei jól ismertek, és többek között az alábbi publikációkban kerültek ismertetésre: Houck, Chang és Klein, Int. J. Tiss. Reac., V(2) 125-134 (1983), és az

1980. április 8-án megadott 4197291 számú, az 1980. október 7-én megadott 4 226 854 számú, valamint az

1981. december 22-én megadott 4 307 081 számú USA-beli szabadalmi leírása, továbbá a 4 329 430 számú USA-beli szabadalmi leírás.

Houck és társai közleménye, valamint a szabadalmi leírásai tartalmazták magának az eszkaráznak és az eszkarázt tartalmazó proteolitikus keveréknek az előállítására szolgáló módszerek leírását. Ezeket az eljárásokat nagy vonalakban az 1. ábra mutatja be.

Az eszkarázt tartalmazó proteolitikus keverék és természetesen maga az eszkaráz jól használható az elhalt emlősszövetek feltisztítására.

Ahogy azt az ábra is mutatja, az izolációs folyamat első lépése az (A. lépés), hogy tioglikolsavat tartalmazó acetátpuffenel extraháljuk a kereskedelmi forgalomban beszerezhető bromelaint, majd átszűijük. Pontosabban, a kereskedelmi bromelaint (10 gramm/200 ml) 0,1 mol/1 koncentrációjú és 5,5 pH-jú, maximálisan 1 t% tioglikolsavat tartalmazó acetátpufferben extraháljuk. Az oldat pH-ja 4 körüli érték (lásd US 4329430).

Az oldatot XM 50 Amicon Diaflo filteren (Amicon Corp., Boston, Mass:) szüljük át, és PM 30 Diaflo filter segítségével koncentráljuk (B. lépés). A proteolitikus enzimeket tartalmazó aktív oldatot, amely 30000 és 50000 dalton közötti molekulatömegű molekulákat tartalmaz, ezek után kétféleképpen is kezelhetjük. Egyfelől dializálhatjuk az oldatot (C. lépés) 2-6 °C-on, 200szoros térfogatú desztillált vízzel szemben, majd centrifugálással történő tisztítás után a tiszta felülúszót fagyasztva szárítjuk, másfelől viszont az oldat aktív frakcióját 70% acetonnal is precipitálhatjuk (D. lépés). Mindkét eljárással használható proteolitikus keveréket állíthatunk elő.

Ahogy az 1. ábráról is leolvasható, az eszkaráz a proteolitikus enzimkeverékből - amit az XM 50 Amicon Diaflo ultrafilteren keresztül történő szűréssel, a fentiekben leírtak szerint állítunk elő - izolálható.

Az egyik előállítási eljárás során az enzimkeveréket fenilamalgámos sója formájában [ezt Óta et. al. Biochem. 3:180 (1960) leírásának megfelelően úgy állítottuk elő, hogy a keveréket a sóval telített 0,2 mol/liter koncentrációjú vizes citrátpufferrel elegyítettük] Sephadex G 75 oszlopon végzett molekuláris exklúziós kromatográfiának vetettük alá (E. lépés). Az oszlopot eluálva az eszkaráztermék a tiszta bromelaint megelőzve jelenik meg, ezért az eszkaráz molekulatömege bizonyosan nagyobb, mint a bromelainé, úgy 32000 dalton körül lehet.

A Sephadex G 75 egy poliszacharid gél, amelyet a Pharmacia cég gyárt (Upsala, Svédország). A gél molekuláris exklúziós kromatográfiás célokra a szakemberek által jól ismert módszereknek megfelelően alkalmazható.

Az exklúziós kromatográfíával előállított keveréket izoelektromos fókuszálással frakcionáljuk, majd 1 t% nátrium-docecil-szulfátot (SDS-t) tartalmazó poli(akril-amid)gélen végzett analitikai elektroforézisnek vetjük alá.

Az izoelektromos fókuszáláshoz (F. és H. lépés) a keveréket eleinte 3-10, majd 5-8 pH-jú LKB Ampholine amfolitok segítségével cukor gradiensre vittük. Az aktív anyag 5,85 és 6,12 pH-nál koncentrálódott, és 6,04 pH-nál adott csúcsot. Ez az izoelektromos pont határozottan különbözik a bromelainnál leírt 4,7es és 9,9-es pH-értéktől [ld. Vestbert Acta Chem. Scand. 20:820 (1966)].

Ez a megfigyelés egybeesik azzal a jelenséggel, hogy a kisózásos ffakcionálásoknál (például ammónium-szulfáttal végzettnél) optimálisan akkor járunk el, ha az oldat pH-ját az izoelektromos pont körül tartjuk (Róbert K. Scopes, Protein Purification, 1982, 43-52. oldalak).

Az izoelektromos fókuszálás során használt LKB Ampholine a svéd LKB Companytól vásárolható, és valószínűleg kis molekulatömegű amfolitokat tartalmaz.

Az izoelektromos fókuszálással előállított termékek feltűnően nagy eszkarázaktivitást mutatnak, azonban 1%-nál nagyobb kitermelést nem sikerült így elérni.

Az izoelektromosan fókuszált, aktív anyag további tisztítása 9-es pH-jú, 1 t% SDS-t tartalmazó poli(akrilamid) gélelektroforézissel történik. [Weber et al.: J. Viol. Chem. 244:4406 (1969)]. A mért elektroforetikus mobilitás alapján csak egy fehéijeként festődő csík látható, amely ismert molekulatömegű fehérjékkel történő összehasonlítás után 14300 és 15000 dalton közötti molekulatömeget mutat. Mivel az közismert, hogy az SDS hatására a fehérjék alegységeikre esnek szét, ha egyáltalán vannak alegységeik, nyilvánvaló, hogy az ebben a találmányban ismertetett eszkaráztermék legalább kettő, de inkább három alapjában véve azonos molekulatömegű alegységből áll.

Az ebben a szabadalmi leírásban ismertetett eljárás olyan, az eddigieknél jobb minőségű proteolitikus keverék előállítását teszi lehetővé, amely az eszkarázt azoknál lényegesen magasabb koncentrációban tartalmazza. A találmányban leírt eljárás különleges előnye továbbá az, hogy aranyosan megváltoztatott körülmények között a bromelain lényegesen nagyobb mennyiségénél is alkalmazható, mégpedig egyenletesen ugyanazzal a magas hozammal. Továbbmenve ez az eljárás az eddigi módszereknél gazdaságosabb, egyrészt a magasabb hozama miatt, másrészt azért, mert maga az eljárás kevésbé költséges.

A találmány tárgya tehát eljárás pörk és elhalt szövetek eltávolítására használható, eszkaráztartalmú, bro2

HU214 641 Β melainból származó keverék előállítására, melynek során a bromelaint egy antioxidáns jelenlétében extraháljuk, majd a kívánt keveréket fehérjeprecipitáló reagens adagolásával nyerjük ki, a precipitációt az eszkaráz izoelektromos pontjánál savasabb körülmények között hajtjuk végre.

A „bromelain” kifejezés, amelyet a találmány leírásában és a szabadalmi igénypontok ismertetésekor használunk, bármely jelenleg elérhető bromelainkészítményre vonatkozik, így például a Taiwan McKay által forgalmazott TMBC bromelainra is. A bromelaint az ananász növény szárából állítják elő. Az ebben a szabadalmi leírásban használt bromelain előállítására jelenleg a legmegfelelőbbnek az az eljárás bizonyult, amelynek során a növényi szárból származó folyadék pH-ját foszforsavval 3-4 körüli értékre állítják be. Az oldathoz a szulfhidril gyökök oxidációjának megakadályozása érdekében nátrium-hidridet vagy nátrium-szulfhidridet adagoltunk, ahogy az a fentebb említett szabadalmi leírásokban és közleményekben is olvasható. A semleges anyagot körülbelül 30 t%-os acetonban precipitáltuk (az oldathoz olyan mennyiségű acetont adagoltunk, hogy az végkoncentrációban legyen 30 t%-os az acetonra nézve), és a szűrés után a tisztított folyadékot 70 t%-os acetonnal precipitáltuk. A precipitátumot centrifugálással gyűjtöttük össze, és ezek után nátrium-hidrid- vagy nátrium-szulfhidridtartalmú vízben visszaoldottuk, majd foszforsavval történő savanyítás után újra precipitáltuk, vagy pedig szárítószekrényben egyenesen kiszárítottuk. Ha az anyagot újra precipitáltuk, 70 t%-os acetont használtunk. Bármelyik eljárással nyertük is a szárított anyagot, az alkalmas arra, hogy az ebben a szabadalmi leírásban ismertetett termékek előállításának kiindulási anyaga legyen.

A hígított vizes antioxidáns oldatok, mint például az aszkorbinsav (C-vitamin) olyan vizes oldatokat jelölnek, amelyek az aszkorbinsavat 0,5-2 tömeg%-ban, előnyösen 0,75-1,25 tömeg%-ban, de még előnyösebben 1 tömeg%-ban tartalmazzák.

A hígított vizes aszkorbinsavoldatokat az ebben a leírásban ismertetett eljárás folyamán a bromelain extrahálására használtuk. Az extraktumot - például szűréssel - tisztítottuk, és az eszkaráztartalmú proteolitikus keveréket egy fehéijeprecipitáló reagens, mint például az ammónium-szulfát hozzáadásával precipitáltuk. Általában azért, hogy az ammónium-szulfátos precipitálás megfelelően hatékony legyen, annyi ammónium-szulfátot kell az oldathoz adni, hogy az legalább 30 tömeg%os legyen, bár az alkalmazott mennyiség egyébként elegendő a telített oldat kialakulásához. Általában az oldat ammónium-szulfátra nézve 35-45 tömeg%-os. Más precipitánsok esetén (lásd alább) ezzel összevethető mennyiségeket ajánlatos alkalmazni.

Az ebben a leírásban ismertetett eszkaráztartalmú proteolitikus keveréket abból a bromelainból nyerhetjük ki, amelyet az előzőekben már leírt módon egy nem illékony antioxidánst tartalmazó vizes közeggel történő extrahálással állítottunk elő. A bromelaint az extraktumból izoláltuk, és esetlegesen tovább tisztítottuk.

A jelenleg leggyakrabban alkalmazott eljárás folyamán a bromelaint az eszkaráz izoelektromos pontjánál savasabb körülmények között, előnyösen 3-4-es pH-jú vizes aszkorbinsavoldattal vonjuk ki, és a kívánt terméket az extraktumból egy precipitáns, például az ammónium-szulfát felhasználásával precipitáljuk.

Meglepő módon így az izoelektromos pontnál lényegesen savasabb körülmények között sikerült az eddig ismertnél jóval nagyobb (kb. 25-szörös) kitermeléssel kinyerni az eszkarázt.

A precipitált proteolitikus keverék már ebben a formájában is használható, de előnyösebb, ha tovább tisztítjuk és növeljük az eszkaráz koncentrációját.

A felhasználható antioxidánsok közül az aszkorbinsav a legelőnyösebb, mert könnyen hozzáférhető, fiziológiai szempontból nem idegen és rendkívül hatékony, de más antioxidánsok is alkalmazhatók, így többek között a dihidrokinon, a butil-hidroxi-toluol vagy a ditiotreit.

Ehhez hasonlóan, bár a precipitánsok közül messze az ammónium-szulfát a legelőnyösebb, más fehéijeprecipitáló anyagok is alkalmazhatók, szervesek és szervetlenek egyaránt, többek között alacsony értékű alkánok, mint a metanol és az etanol, az aceton, a polietilénglikol, szulfátok, mint a magnézium-, a kálium- és a nátrium-szulfát, valamint halogénidek, mint a nátriumés a kálium-klorid.

A kiválasztott antioxidánssal és precipitánssal szemben az az elvárás, hogy mindkettő semleges legyen és ne denaturálja a fehérjét.

Az ebben a találmányban leírt proteolitikus keverék előállítására szolgáló egy jellegzetes eljárás például a következő:

1. 1 kg bromelaint (Waring Blender) 4-10 °C-on, 60 másodpercen át 10 liter desztillált vízben oldott, 1 tömeg%-os aszkorbinsavval (10 mg/ml) keverünk.

2. Ennek a szuszpenziónak a pH-ját 4 mol/1 sósavval 3,5-3,9 közötti értékre állítjuk be.

3. A szuszpenziót 18 órán át 4 -10 °C-on keverjük.

4. Az oldhatatlan anyagokat (20-25 t%) és az oldódó frakciót szűréssel vagy alacsony hőmérsékleten (4-10 °C) történő centrifugálással elkülönítjük egymástól, majd az oldódó frakciót kb. 40 t%-os ammónium-szulfáttal (2842 g/10 1) telítjük, és 4-10 “C-on egy éjen át állni hagyjuk.

5. A precipitátumot alacsony hőmérsékleten történő centrifugálással vagy szűréssel elkülönítjük, majd a precipitátumot 10 liter 0,1 tömeg% aszkoibinsavtartalmú (1 mg/ml) 0,3 mol/1 koncentrációjú ecetsavban (pH=3,0) alacsony hőmérsékleten feloldjuk.

6. Ezek után az extraktumot 40 liter desztillált vízzel 10000 daltonos szűrőn (Amicon DC-30 A rendszer, H10P1020, DF-40 típusú porc szűrő membrán) átmossuk. A szűrést 300-400 ml/perc sebességgel, (1,31-1,58) 10⁵ Pa nyomáson, 10 C-on körülbelül két óráig végezzük úgy, hogy az oldat végtérfogata 4,5-5,0 liter legyen.

7. A szűrés eredményeként kapott oldatot ezek után liofilizáljuk és lemérjük. (Rendszerint 250 g tömegű anyagot kapunk).

HU 214 641 Β

Az ebben a találmányban leírt eljárás lényegesen jobb minőségű eszkaráztartalmú proteolitikus keveréket eredményez, mint az előzőekben említett szabadalmi leírásokban és közleményben ismertetett módszerek. Ezzel az új eljárással lényegesen nagyobb mennyiségű proteolitikus keverék állítható elő, így például a kitermelés 25%-os, szemben a régebbi módszerek kb. 1%-os hatásfokával.

Az ebben a találmányban ismertetett proteolitikus keverék különös jellegzetessége, hogy a keverék teljes tömegére vonatkoztatva 1-1,5 tömeg%-ban tartalmaz eszkarázt. A korábbiakban leírt eljárásokkal csak olyan proteolitikus keverékek állíthatók elő, amelyek átlagosan sokkal kisebb mennyiségű eszkarázt tartalmaznak. Az új eljárással előállított keverék hosszabb ideig marad stabil. Továbbmenve: úgy tűnik, hogy a kezelés során állandó jelleggel olyan sebfelületet eredményez, amely alkalmasabb az átültetett bőr befogadására, mint azok a keverékek, amelyeket az előzőekben ismertetett eljárások eredményeképpen kapunk.

Az előállított keverékre az jellemző, hogy 1-1,5 t%-ban eszkarázt tartalmaz, és ezenkívül olyan proteolitikus enzimeket, amelyek a bromelainból az aszkorbinsav vizes oldatával extrahálhatók.

Az ebben a találmányban leírt proteolitikus keverékből az eszkaráz a következő eljárással izolálható, amennyiben ez szükséges:

1. G-75 Sephadex oszlopon végzett kromatográfia

4-7 g proteolitikus keveréket 50 ml 0,3 mol/1 koncentrációjú ecetsavban oldunk fel. Az ecetsav 1 mg/ml koncentrációban aszkorbinsavat tartalmaz. 1200-1500 g-vel történő centrifugálás után a tiszta folyadékot exklúziós oszlopkromatográfiával (G-75) választjuk szét. A biológiai szempontból aktív frakció (az aktivitást biopróbával határozzuk meg) a teljes oszloptérfogat után és a legnagyobb általános proteáz aktivitást mutató csúcs (az aktivitást denaturált hemoglobinon végzett biopróbával határozzuk meg) előtt jelenik meg. Az aktív frakciókat összegyűjtjük, dializáljuk és liofilizáljuk. Ez a frakció kb. az ovalbumin helyén, 45 000 daltonnái jelenik meg, és a kiindulási proteolitikus keverék 15-20%-át tartalmazza.

2. Izoelektromos fókuszálás

Miután az összegyűjtött, biológiai szempontból aktív terméket a G-75 oszlopon többször átfolyattuk, izoelektromos fókuszálással tovább tisztítjuk. Az izoelektromos fókuszálást az előzőekben említett szabadalmi leírásokban leírtaknak megfelelően, LKB-8102 készüléken, 1 t% LKB Ampholine-t tartalmazó 0-40 t%-os cukorgradiensen, 5-8 pH értékek között, 4 °C-on végezzük. Az eluálás során a különböző frakciók abszorbanciáját 280 nm-en meghatározzuk, a frakciókat összegyűjtjük, dializáljuk és meghatározzuk az aktivitásukat. A kívánt aktivitást (azaz hogy különbséget tegyen a denaturált és a natív szövet között) csak a 6,4-es pH-nál megjelenő frakció mutatja. Ha a G-75 oszlopról származó frakciót 4 mol/1 karbamidban oldjuk fel, ennek hatására izoelektromos pontja 6,4-ről 6,8-ra változik.

Ennek a frakciónak az ismételt izoelektromos fókuszálásával olyan anyagot kaptunk, amely 280 nm-nél abszorbciós csúcsot adott, és amely leválasztja az égési sérülést szenvedett, már elhalt szövetet a még élőtől, és így megfelelő alapot képez a bőrátültetéshez. Ez a frakció akrilamid gélen végzett korong elektroforézissel vizsgálva két különböző pH-értéken is homogénnek bizonyult.

Ez a frakció természetesen ugyanaz az eszkaráz, amelyet az előzőekben leírt eljárásokkal is előállíthatunk. Az eszkaráz képes arra, hogy elkülönítse egymástól az elhalt és az élő szöveteket, de denaturált hemoglobinnal, zselatinnal vagy kazeinnel vizsgálva kimutatható, hogy nincs általános proteáz aktivitása. Ugyanígy hialuronsavval, dermatán-szulfáttal vagy a bőr savas mukopoliszacharidjaival vizsgálva belátható, hogy ennek a frakciónak nincs hidrolitikus aktivitása sem.

Az eszkaráz a G-75 oszlop eluálása során 45000 dalton molekulatömegnél jelenik meg. Az izoelektromos fókuszálást követően végzett SDS-PAGE elektroforézissel kb. 15000 dalton, Sephadex G-50 oszlopon végzett exklúziós kromatográfiával kb. 14000 dalton molekulatömeget mutat. Mindezekből arra következtettünk, hogy az eszkaráz három azonos, kb. 15000 dalton molekulatömegű alegységből álló komplex molekula, amely az izoelektromos fókuszálás során alegységeire esik szét.

A tiszta eszkaráz aminosavanalízisének eredménye a következő:

alanin	nmol/eszkaráz nmol (14000 D) 16
arginin	7
aszparaginsav	12
cisztin/2	6,6
glutaminsav	10,6
glicin	16,8
hisztidin	nincs
izoleucin	6,4
leucin	6,4
lizin	5,6
fenilalanin	3,4
prolin	nyomokban
szerin	14
treonin	7
tirozin	nyomokban
valin	7,6
metionin	nincs
összesen	115 nmol
	a 13800 molekulatömegre.

Az eszkarázmolekula egyáltalán nem tartalmaz metionint, hisztidint, és csak nyomokban prolint és tirozint. A prolin és a tirozin elenyésző mennyisége különlegessé teszi ezt a fehérjét.

A precipitált eszkaráztartalmú proteolitikus keverék visszanyerhető, például centrifugálással, és amennyiben szükséges, liofilizálással tovább tisztítható és koncentrálható. Ehhez a tisztítási lépéshez a precipitált proteolitikus keveréket ecetsavban oldjuk fel, és legalább ötször liofilizáljuk.

HU 214 641 Β

Az ebben a találmányban leírt proteolitikus keverék és a belőle származó eszkaráz ugyanolyan módon alkalmazható az égési seben keletkező pörk eltávolítására, mint ahogy azt a előzőekben ismertetett szabadalmi leírások és a közlemény leírj ák.

Az itt ismertetett eljárások, reagensek és műszerek helyett természetesen mások is alkalmazhatók, ezek a változtatások a szakembereknek számára kézenfekvőek. Másfajta szűrők is használhatók. Az elektroforézis során számos más, szabványosított fehérjemolekula is alkalmazható. Az izoelektromos fókuszálás során nemcsak cukorgrádiensen lehet szétválasztani a keverék komponenseit. Mindezek az eljárások egyes részleteikben eltérhetnek a fent leírtaktól.

1. példa

Összesen 250 g bromelaint homogenizáltunk 60 másodpercen át, 4 °C-on, 2,5 liter 1 t%-os vízben oldott aszkorbinsavban. A habzás megakadályozása érdekében néhány csepp oktanolt adtunk az oldathoz. Az oldat pH-ját 4 mol/1 sósavval 3,5-re állítottuk be. A keveréket ezek után kb. 15 órán át 4 °C-on lassan kevertük, majd ugyanezen a hőmérsékleten 30 percen át 10000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A felülúszót (2,525 liter) összegyűjtöttük, és gyors keverés közben, 4 perc alatt 742,4 g ammónium-szulfátot adagoltunk hozzá, majd a gyors keverést további 10 percen át folytattuk. A keveréket ezután lassan keverve 4 °Con, kb. 15 órán át állni hagytuk. Végül az elegyet 4 °Con, 30 perc alatt, 10000 fordulat/perc sebességgel végzett centrifugálással alkotórészeire választottuk szét.

A precipitátumot 0,1 tömeg%-ban aszkorbinsavat tartalmazó 0,3 mol/1 ecetsavban oldottuk fel. Az oldat pHját 4 mol/1 sósavval 3-ra állítottuk, térfogatát további vízben oldott ecetsav/aszkorbinsav keverékkel 2500 ml-re egészítettük ki, majd 4 °C-on 2 órán át tovább kevertük.

Az oldat 4 °C-on kb. 15 órát áll, majd egy 10000 dalton kizárású spirál szűrővel ellátott CH2RS Amicon Concentrator segítségével koncentráltuk és dializáltuk. Ezután néhány óra alatt 3 pH-jú, 10-12 liter, hideg, 0,3 mol/1 koncentrációjú ecetsavat adagoltunk hozzá. Az oldat végtérfogata az eredeti érték fele (1/25 liter), ammónium-ion-koncentrációja pedig EMI mérőpálcával (Nessler-reakció) mérve elhanyagolhatónak tekinthető. A koncentrátumot 4 °C-on, 30 percen át, 10000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk. A felülúszót kb. 15 órán át -70 °C-on tároltuk, majd 25 °C-on 933 Pa nyomáson liofilizáltuk. Az eljárás kitermelése a kiindulási anyag tömegét 100%-nak tekintve 29% volt.

2. példa

Érzéstelenített malacokon szabványszerű égési sebeket idézünk elő olyan módon, hogy 4,4 cm² bőrfelületet 45 másodpercig 182 °C hőmérsékletnek tettünk ki. A felhólyagzott keratint száraz gézzel ledörzsöltük. Az égési sebeket a további kezelésig normál sóoldattal tartottuk nedvesen.

Az égett területet egy rögzíthető keret segítségével különítettük el a sértetlen bőrtől. Az égett részt normál sóoldattal itattuk át, majd az 1. példában ismertetett eljárással előállított porból 200 mg-ot szórtunk szét egyenletesen az égett területen. Ezután a sebre cseppenként normál sóoldatot adagoltunk, amelyben a por feloldódott, majd a sebfelületet steril géllel letakartuk. A gélt műanyag hálóval borítottuk, és újabb gélrétegeket vittünk fel rá. Végül, az anaerob körülmények fenntartása érdekében Saran-kötéssel szorosan lezártuk az egészet. A kezelt területet hősugárzó alatt 39 °C hőmérsékleten tartottuk.

A kötést 4 óra múlva eltávolítottuk, és a seben keletkezett égési pörköt normál sóoldattal átitatott gézzel letöröltük. A pörköt kifogástalanul megemésztett állapotban és a sebtől jól elkülönülve találtuk. Szárítással a proteolizált pörk nagy részét el tudtuk távolítani, csak néhány láthatóan bazális cirkulációval ellátott sávban maradtak pörkmaradékok. Száraz gézzel végzett 20 törlés után már majdnem az összes pörk eltűnt, és a helyén jól láthatóan egyre több pontszerű vérzés keletkezett. Normál sóoldattal átitatott gézzel további 20 törlést végeztünk, ekkor néhány pörkcsík kivételével az összes égési pörk eltűnt, és tiszta sebfelület maradt vissza. 10 perces normál sóoldattal végzett mosás után a sérült felület teljesen tisztának, és az új bőr befogadására tökéletesen alkalmasnak látszott. A seb bazális részén ekkor még néhány csík égési pörk látható volt ugyan, de ez nyilvánvalóan nem akadályozhatta meg az új bőr átültetését.

Szabályos hisztológiai vizsgálatot végeztünk annak megállapítására, hogy a sebfelület valóban alkalmas-e a bőrátültetésre. Ez a vizsgálat megerősítette azt a megfigyelésünket, mely szerint a maradék központi égési pörk kevesebb mint 0,1 mm vastag volt, és a sebtisztulás folyamata tökéletesen ment végbe.

A kísérletet az említett USA-beli szabadalmi leírásokban leírt eljárással nyert proteolitikus keverékkel is megismételtük. Azt figyeltük meg. hogy bár a sebfelület a bőrátültetésre alkalmassá vált, a maradék központi égési pörk 0,1-0,2 mm vastag volt.

Claims (5)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás pörk és elhalt szövetek eltávolítására használható, eszkaráztartalmú, bromelainból származó proteolitikus keverék előállítására, melynek során a bromelaint egy antioxidáns jelenlétében extraháljuk, majd a kívánt keveréket fehéijeprecipitáló reagens adagolásával nyerjük ki, azzal jellemezve, hogy a precipitációt az eszkaráz izoelektromos pontjánál savasabb körülmények között hajtjuk végre.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antioxidánsként aszkorbinsavat alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy fehéijeprecipitáló reagensként ammónium-szulfátot alkalmazunk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy antioxidánsként aszkorbinsavat, fehéijeprecipitáló reagensként ammónium-szulfátot alkalmazunk.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a precipitáció során a pH-t a 3-4 intervallumba állítjuk be.