CN1134552A - 淋病快速诊断药盒及其生产工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及疾病诊断试剂及其生产工艺，包括药盒试剂的总体配备；淋病双球菌抗原筛选、分离与纯化，免疫淋球菌抗体制备和提纯工艺。药盒经临床试用具有较高的特异性和敏感性，通过检测血清，30分钟左右即可作出诊断，且阳性检出率高；药盒生产工艺流程简洁，分离纯化方法温和，对膜蛋白破坏性低，回收得率高，所得淋球菌蛋白抗原纯度达电泳级，反应活性较原粗菌液提高500—1000倍，药盒价格仅国际已有产品1/10。
Description
本发明淋病快速诊断药盒及其生产工艺，涉及疾病诊断试剂及其生产工艺。
淋病(Gonor rhea)即淋菌性尿道炎，是由淋病双球菌侵袭男性前尿道，女性尿道或子宫颈等处引起的泌尿生殖系统粘膜的炎症性疾病，占所有性传播性疾病(STD)的70-80％。淋病对人类的危害是众所周知的，淋球菌主要侵袭粘膜组织，不仅引起尿道炎症，导致尿频、尿痛、脓血尿，炎症结缔组织反复发作可出现纤维化，导致尿道、输卵管、输精管狭窄，恶性发展为盆腔炎、腹膜炎、宫外孕、不育症等。当粘膜上皮的淋球菌侵入血液时，还可引起播散性感染(DGI)，导致淋菌性关节炎、皮肤损害、心内膜炎、心包炎及脑膜炎，严重时可发展为淋菌性败血症。
淋球菌感染后，如确诊迅速，越早治疗效果就越好。目前淋病的诊断方法已有多种，如传统的显微镜(涂片)检查和培养法，前者虽快速简便，但特异性和敏感性差，后者确诊性高，但取样困难，且诊断周期长，一般需要48-72小时方能确诊；近年来发展起来的玻片协同凝集法、荧光抗体染色法、乳胶凝集法操作简便，但阳性率低，PCR法敏感度高，但假阳性多，且操作繁琐，需要特定仪器设备。
七十年代初，酶联免疫吸附试验(ENZYME LINKEDIMMUNOSORBENT ASSAY，ELISA)方法建立以来，应用于临床诊断学方面取得了飞速进展，酶联法淋病快速检测法(即ELISA)由于其以血清为标本，可用于检测抗原也可用于检测抗体，且具有采样方使，易于操作，全程检测仅需三十余分钟，是一种具有临床诊断价值的免疫学诊断新方法，尤其适用于医院、海关、防疫、计划生育、性防系统和中心血站等大批量、高危人群体检筛选检测。酶联快速检测药盒生产的首要问题是要解决淋球菌膜蛋白特异性抗原的大量生产及其分离纯化的工艺问题。该法的诊断药盒，美国ABBOTT公司已有G0NOZYME KIT商品出售，但价格昂贵，并需要配套购置专用的酶标检测仪，且未见淋球菌膜蛋白特异性抗原的大量生产及其分离纯化工艺的批露。
本发明的目的在于要提供一种生产成本较低，能大量生产的淋病双球菌快速诊断盒及其生产工艺。
本发明是这样实现的：
1，淋病快速诊断药盒，包括：酶标抗体稀释液，稀释原液，底物液，显色液和终止液，抗原包被板条以及阴、阳性对照标准品，其中：
一，酶标抗体稀释液：1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50-200mg
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 700-950ml
酶标抗体(SPA-HRP) 1-2mg(1∶200，1∶2000)
每瓶分装2.0-2.5ml
二，稀释原液：1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50-250mg
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01-0.03M，
pH7.0-7.8PBS 700-950ml
每瓶分装2.0-2.5ml；
三，底物液：1000ml
0.2M磷酸氢二钠 500ml
0.1M柠檬酸 500ml
新鲜30％H2O2 300-800μl
PM抑菌剂 50-75mg
每瓶分装2.0-2.5ml；
四，显色液：1000ml中含：
四甲基联苯胺(TMB) 200-1500mg
甲酵 750ml
以上摇匀，溶解后加入
纯甘油 250ml
每瓶分装2.0-2.5ml；
五，终止液：1000ml
98％浓硫酸 100ml
蒸馏水 900ml
每瓶分装2.0-2.5ml；
六，特异性淋球菌膜蛋白抗原包被板(每孔加入10μg/ml抗原包被液100μl)；
七，阴、阳性对照标准品
(一)阴性标准 1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50-200ml
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 680-930ml
正常人血清 20ml
每瓶分装0.5-2.1.0ml；
(二)阳性标准 1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50-200ml
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 680-930ml
兔抗淋球菌阳性血清 10-20ml
每瓶分装0.5-1.0ml；
2，本发明的生产工艺包括：
(1)淋病双球菌抗原的筛选、分离和纯化；
(2)免抗淋球菌抗体制备和提纯；
(3)高效SPA制备及标记辣根过氧化物酶；
(4)药盒检测反应条件的建立等。其中：
一，淋球菌的繁殖与保存
(一)，专用培养基的配制：
配方：
每1000ml蒸馏水中含：
(1)蛋白胨 10-18g
(2)酵母浸出粉 5-15g
(3)葡萄糖 1-2g
(4)氯化钠 1-2g
(5)磷酸氢二钾 4g
(6)磷酸二氢钾 1g
(7)琼脂 12g
(8)脱纤维羊血50-100ml
制法：将(1)-(7)加入上述蒸馏水混匀，在15磅高压下灭菌15分钟，待冷却至54-56℃，加入(8)，摇匀，分装至培养皿待用。
(二)，将淋病菌划线接种于上述培养基中，置CO2环境37℃培养24-48小时。以5％甲醛生理水浸润培养皿30分钟，用滴管洗脱，收集至0.02M PBS，pH7.4，3000转离心15分钟，重复三次，收集沉淀，保存于质膜匀浆液内，-27℃低温储藏；
(三)淋球菌的菌种保存
制备淋球菌浓悬液于灭菌脱脂牛奶中，用干冰速冻，迅速移入冷冻干燥机内，迅速抽真空达到升华，保持真空状态4-5小时，到菌液完全抽干，取出，用煤气灯封口，并抽气保证内部干燥，于4℃冰箱保存；
二，特异性膜蛋白抗原的纯化
(1)，大量收集淋球菌培养菌液，37℃纯培养18-36小时，涂片染色，显微镜检查，证明属革兰氏阴性双球菌；氧化酶阳性，触酶阳性；生化鉴定仅发酵葡萄糖，不发酵麦芽糖、蔗糖和果糖；
(2)，在上述培养菌液中加入5％甲醛生理盐水浸泡30分钟左右，用吸管洗涤，将培养皿表面菌落洗脱并收集入离心管；
(3)，将(2)所得菌落洗脱液置冷冻离心机，4-10℃，3000转/分离心15分钟，弃上清液，沉淀以PBS洗涤，重复离心洗涤三次，沉淀液保存于匀浆器内待用，储藏于-27℃冰箱；
(4)，上述菌液自冰箱内取出，置室温融化，冻融反复三次；
(5)，将(4)所述菌液用匀浆器反复匀浆10-15分钟，再用超声波粉碎，65μA粉碎5-10分钟，至镜检无完整细胞壁；
(6)，冷冻高速离心，4℃，10,000转/分，离心30分钟，取上清液，弃去沉淀；
(7)，冰冻超高速离心，4℃，100,000转/分，离心60-120分钟，取沉淀，弃去上清液；
(8)，沉淀用两相法精制，再用两性离子洗涤剂洗脱杂质，4℃搅拌过夜；
(9)，冰冻高速离心，4℃，10,000-15,000转/分，转30-60分钟，取上清液，弃去未溶解沉淀；
(10)，上清液以0.5μ滤膜过滤，滤液用紫外分光法检测蛋白质浓度；
(11)，上Sephadex G-200柱层析，以PBS为洗脱液，280nm检测，收集峰值，即得电泳纯的特异性淋球菌膜蛋白抗原，测浓度，冰水浴保存；
(12)，以该膜蛋白包被固相酶板或浓缩后免疫家兔，制备抗体；三，免抗淋球菌抗体的制备与纯化
(一)，免疫血清的制备
(1)，药品：
纯化抗原
灭活卡介苗
佐剂
(2)，免疫动物：
健康新西兰白兔，雄性，年令六个月以上，体重2千克左右，2-3只。
(3)免疫方法：
a，制备抗原浓度为5mg/ml，与1ml完全佐剂混合(使用注射器法)，制成油包水乳剂，乳剂的粘稠度为保证佐剂抗原滴于冷水表面保持完整而不分散；
b，第一次免疫：抗原总量5mg，注射体积2ml，注射部位为四足下数点，每点0.2ml，脊背皮下数点，每点0.2ml；
c，第二次免疫：为第一史疫后7-10天，抗原用量1mg，可用不完全佐剂，途径为脊背皮下多点；
d，第三次免疫：第二次免疫后7-10天，方法同第二次；
e，间隔7天后采血，测定效价；
f，颈动脉放血，无菌手续分离血清，分装，低温冰箱保存待用；
(二)，免疫血清的纯化
(1)用常规饱和硫酸铵沉淀法进行粗提纯；
(2)用常规琼脂糖珠免疫吸附亲和层析法，进行精提纯；
四，辣根过氧化物酶标记SPA
采用常规的过碘酸钠法标记SPA纯品；
五，药盒检测反应条件
(一)，包被抗原最佳工作浓度为1.0μg。包被时间：4℃24-48小时，或37℃2-4小时；
(二)，血清标本稀释最佳浓度为1∶50.反应时间：37℃10分钟；
(三)，SPA酶标最佳应用浓度为1∶400-1∶1 200，反应时间：37℃5分钟；
(四)，洗涤剂0.01M pH7.4 PBS为最佳，洗涤时间为：第一次浸泡2-3分钟，以后三次可快速洗涤；或每次洗涤浸泡1分钟，连续五次，最后在吸水纸内用力拍干。
本发明药盒由于血清采样方便，且检测速度快，经164例临床检测验证：其敏感性，特异性与国外文献报导相符，用本药盒检测病人抗体1gG，不需特殊仪器(在无酶标仪的实验室可用肉眼判读结果)，半小时左右即可获得检测结果，操作简便快速；对感染7天以上的慢性患者有更高的阳性检出率，可以弥补传统涂片、培养法在这一阶段的局限性；抗体测定不需采集分泌物标本，仅需微量血清，因此更适宜于在非一般条件下作人群普查及流行病学调查。
本发明药盒的生产工艺，流程简洁，分离纯化方法较温和，对膜蛋白破坏性不小，膜蛋白回收率高，纯度可达电泳级，反应活性较原粗菌液提高500-1000倍，药盒价格仅为国际已有产品的1/10。
以下附图和实施例将对本发明的技术方案作进一步说明：
图1为本发明的纯特异性淋球菌膜蛋白抗原(PI)Sephadex G
-200层析洗脱图谱。
图2为本发明纯特异性淋球菌膜蛋白抗原(PI)等SDS-PAGE电
泳图谱。
图3为本发明药盒生产工艺流程图。
图面标号：
1.低分子量蛋白标准，2.纯化PI，3.粗提PI，
4.5.29404菌体裂解物。
实施例1：
1.本药盒试剂包括：
一，酶标抗体稀释液：1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50mg
新鲜小牛血清 50mg
灭菌0.01M，pH7.4 PBS 950ml
酶标抗体(SPA-HRP) 1mg(1∶200，1∶2000)
每瓶分装2.0-2.5ml；
二，稀释原液：1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50mg
新鲜小牛血清 50ml
灭菌0.01-0.03M，
pH7.0-7.8PBS 950ml
每瓶分装2.0-2.5ml；
三，底物液：1000ml
0.2M磷酸氢二钠 500ml
0.1M柠檬酸 500ml
新鲜30％H2O2 300μl
PM抑菌剂 50mg
每瓶分装2.0-2.5ml；
四，显色液：1000ml中含：
四甲基联苯胺(TMB) 200mg
甲醇 750ml
以上摇匀，溶解后加入
纯甘油 250ml
每瓶分装2.0-2.5ml；
五，终止液：1000ml
98％浓硫酸 100ml
蒸馏水 900ml
每瓶分装2.0-2.5ml；
六，特异性淋球菌膜蛋白抗原包被板(每孔加入10μg/ml抗原包被液100μl)；
七，阴、阳性对照标准品
(一)阴性标准1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50mg
新鲜小牛血清 50ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 930ml
正常人血清 20ml
每瓶分装0.5-1.0ml；
(二)阳性标准品1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50mg
新鲜小牛血清 50ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 940ml
免疫淋球菌阳性血清 10ml
每瓶分装0.5-1.0ml；。2，本发明淋病快速诊断药盒生产工艺一，淋球菌的繁殖与保存(一)菌种选择、培养分离(1)菌种：A.标准菌种
a.中国药品检定所提供(W1，W11/W111型，菌种编号
29401/29403)；
b.捷克流行病学微生物研究所提供，菌种编号：29106/29107
(1993年版中国医学细菌菌种目录)
B.野生菌种选自上海及中国野生分离株，菌种编号：F29/F76
(2)培养分离
将上述菌种划线接种于专用培养基中，置5％CO2环境37℃培养24-48小时。以5％甲醛生理水浸润培养皿30分钟，用滴管洗脱，收集至0.02M PBS，pH7.4，3000转离心15分钟，重复三次，收集沉淀，保存于0.01-0.03M，pH7.0-7.8PBS中，-27℃低温储藏；(二)淋球菌的菌种保存
制备淋球菌浓悬液于0.2-0.5ml灭菌脱脂牛奶的菌种管内，用干冰速冻，迅速移入冷冻干燥机内，迅速抽真空达到升华，保持真空状态4-5小时，到菌液完全抽干，取出，菌种管用煤气灯封口，同时抽气，保证内部干燥，于4℃冰箱保存；
二，特异性膜蛋白抗原的纯化
(1)，取上述淋球菌培养粗菌液100mg，划线接种于专用培养基平皿中，置5％CO2环境，37℃纯培养18-36小时，涂片染色，显微镜检查，证明属革兰氏阴性双球菌；氧化酶阳性，触酶阳性；生化鉴定仅发酵葡萄糖，不发酵麦芽糖、蔗糖和果糖；
(2)，在上述培养基平皿中加入5％甲醛生理盐水浸泡30分钟左右，用吸管洗涤，将培养皿表面菌落洗脱并收集入离心管；
(3)，将(2)所得菌落洗脱液置冷冻离心机，4-10℃，3000转/分离心15分钟，弃上清液，沉淀以PBS洗涤，重复离心洗涤三次，沉淀液保存于试管内待用，储藏于-27℃冰箱；
(4)，上述菌沉淀液自冰箱内取出，置室温融化，冻融反复三次；
(5)，将(4)所述菌沉淀液用组织匀浆器反复匀浆10-15分钟，再用超声波粉碎，65μA粉碎5-10分钟，至镜检无完整细胞壁；
(6)，冷冻高速离心，4℃，10,000转/分，离心30分钟，取上清液，弃去沉淀；
(7)，冰冻超高速离心，4℃，100,000转/分，离心60-120分钟，取沉淀，弃去上清液；
(8)，沉淀用两相法精制，再用两性离子洗涤剂chaps洗脱杂质，4℃搅拌过夜；
(9)，冰冻高速离心，4℃，10,000-15,000转/分，转30-60分钟，取上清液，弃去未溶解沉淀；
(10)，上清液以0.5μ滤膜过滤，滤液用紫外分光法检测膜蛋白抗原浓度；
(11)，上Sephadex G-200柱层析，以PBS为洗脱液，280nm检测，收集峰值(见图1)，即得电泳纯的特异性淋球菌膜蛋白抗原(见图2)1-2mg，测浓度，冰水浴保存；
(12)，以该膜蛋白包被固相酶板或浓缩后免疫家兔，制备抗体；三，免抗淋球菌抗体的制备与纯化
(一)，免疫血清的制备
(1)，药品：
纯化抗原
灭活卡介苗
佐剂
(2)，免疫动物：
健康新西兰白兔，雄性，年令六个月以上，体重2千克左右，2-3只；
(3)免疫方法：
a，制备抗原浓度为5mg/ml，与1ml完全佐剂混合(使用注射器法)，制成油包水乳剂，乳剂的粘稠度为保证佐剂抗原滴于冷水表面保持完整而不分散；
b，第一次免疫：抗原总量5mg，注射体积2ml，注射部位为四足下多点，每点0.2ml，脊背皮下多点，每点0.2ml；
c，第二次免疫：为第一史疫后7-10天，抗原用量1mg，可用不完全佐剂，途径为脊背皮下多点；
d，第三次免疫：第二次免疫后7-10天，方法同第二次；
e，间隔7天后采血，测定效价；
f，颈动脉放血，无菌手续分离血清，分装，低温冰箱保存待用；
(二)，免疫血清的纯化
(1)用常规饱和硫酸铵沉淀法进行粗提纯；
(2)用常规琼脂糖珠免疫吸附亲和层析法，进行精提纯；
四，辣根过氧化物酶标记SPA
采用常规的过碘酸钠法标记SPA纯品；
五，药盒检测反应条件
(一)，包被抗原最佳工作浓度为1.0μg。包被时间：4℃ 24-48小时，或37℃ 2-4小时
(二)，血清标本稀释最佳浓度为1∶50.反应时间：37℃ 10分钟；
(三)，SPA酶标最佳浓度为1∶400-1∶1200，反应时间：37℃ 5分钟；
(四)，洗涤剂0.01M pH7.4PBS为最佳，洗涤时间为：第一次浸泡2-3分钟，以后三次可快速洗涤；或每次洗涤浸泡1分钟，连续五次，最后在吸水纸上用力拍干。
实施例2：
1.本药盒试剂包括：
一，酶标抗体稀释液：1000ml中含：
柳硫汞钠盐 150mg
新鲜小牛血清 200ml
灭菌0.01M，pH7.4 PBS 800ml
酶标抗体(SPA-HRP) 1mg(1∶200，1∶2000)
二，稀释原液：1000ml中含：
柳硫汞钠盐 150mg
新鲜小牛血清 250ml
灭菌0.01-0.03M，
pH7.0-7.8PBS 750ml
三，底物液：1000ml
0.2M磷酸氢二钠 500ml
0.1M柠檬酸 500ml
新鲜30％H2O2 600μ1
PM抑菌剂 55mg
四，显色液：1000ml中含：
四甲基联苯胺(TMB) 1000mg
甲醇 750ml
以上摇匀，溶解后加入
纯甘油 250ml
五，终止液：1000ml
98％浓硫酸 100ml
蒸馏水 900ml
六，特异性淋球菌膜蛋白抗原包被板(每孔加入10μg/ml抗原包被液100μl)；
七，阴、阳性对照标准品
(一)阴性标准1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50mg
新鲜小牛血清 100ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 880ml
正常人血清 20ml
(二)阳性标准品1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50ml
新鲜小牛血清 100ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 890ml
免疫淋球菌阳性血清 10ml
2，本发明淋病快速诊断药盒生产工艺同实施例1。
实施例3：
1.本药盒试剂包括：
一，酶标抗体稀释液：1000ml中含：
柳硫汞钠盐 100mg
新鲜小牛血清 300ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 700m1
酶标抗体(SPA-HRP) 1mg(1∶200，1∶2000)
二，稀释原液：1000ml中含：
柳硫汞钠盐 125mg
新鲜小牛血清 150ml
灭菌0.01-0.03M，
pH7.0-7.8PBS 850ml
三，底物液： 1000ml
0.2M磷酸氢二钠 500ml
0.1M柠檬酸 500ml
新鲜30％H2O2 550μl
PM抑菌剂 65mg
四，显色液：1000ml中含：
四甲基联苯胺(TMB) 1000mg
甲醇 750ml
以上摇匀，溶解后加入
纯甘油 250ml
五，终止液：1000ml
98％浓硫酸 100ml
蒸馏水 900ml
六，特异性淋球菌膜蛋白抗原包被板(每孔加入10μg/ml抗原包被液100μl)；
七，阴、阳性对照标准品
(一)阴性标准品1000ml中含：
柳硫汞钠盐 150mg
新鲜小牛血清 200ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 680ml
正常人血清 20ml
(二)阳性标准品1000ml中含：
柳硫汞钠盐 100mg
新鲜小牛血清 200ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 780ml
免疫淋球菌阳性血清 20ml
2，本发明淋病快速诊断药盒生产工艺同实施例1。
实施例4：
1.本药盒试剂包括：
一，酶标抗体稀释液：1000ml中含：
柳硫汞钠盐 200mg
新鲜小牛血清 150ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 850ml
酶标抗体(SPA-HRP) 2mg(1∶200～1∶2000)
二，稀释原液：1000ml中含：
柳硫汞钠盐 250mg
新鲜小牛血清 300ml
灭菌0.01-0.03M，
pH7.0-7.8PBS 700ml
三，底物液：1000ml
0.2M磷酸氢二钠 500ml
0.1M柠檬酸 500ml
新鲜30％H2O2 800μl
PM抑菌剂 75mg
四，显色液：1000ml中含：
四甲基联苯胺(TMB) 1500mg
甲醇 750ml
以上摇匀，溶解后加入
纯甘油 250ml
五，终止液：1000ml
98％浓硫酸 100ml
蒸馏水 900ml
六，特异性淋球菌膜蛋白抗原包被板(每孔加入10μg/ml抗原包被液)100μl
七，阴、阳性对照标准品
(一)阴性标准品1000ml中含：
柳硫汞钠盐 200mg
新鲜小牛血清 400ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 580ml
正常人血清 20ml
(二)阳性标准1000ml中含：
柳硫汞钠盐 200mg
新鲜小牛血清 300ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 6480ml
免疫淋球菌阳性血清 20ml
2，本发明淋病快速诊断药盒生产工艺同实施例1。
实施施5：
淋球菌繁殖专用培养基的配制：
配方：
每1000ml蒸馏水中含：
(1)蛋白胨 13g
(2)酵母浸出粉 8g
(3)葡萄糖 1g
(4)氯化钠 1g
(5)磷酸氢二钾 4g
(6)磷酸二氢钾 1g
(7)琼脂 12g
(8)脱纤维羊血 80ml
制法：将(1)-(7)加入上述蒸馏水混匀，在15磅高压下灭菌15分钟，待冷却至54-56℃，加入(8)，摇匀，分装至培养皿待用。
实施像6：
其中专用培养基的配制：
配方为：
每1000ml蒸馏水中含：
(1)蛋白胨 l0g
(2)酵母浸出粉 5g
(3)葡萄糖 lg
(4)氯化钠 lg
(5)磷酸氢二钾 4g
(6)磷酸二氢钾 lg
(7)琼脂 12g
(8)脱纤维羊血 50ml
配制方法同实施例5。
实施例7：
专用培养基的配制：
配方为：
每1000ml蒸馏水中含：
(1)蛋白胨 15g
(2)酵母浸出粉 10g
(3)葡萄糖 1g
(4)氯化钠 1g
(5)磷酸氢二钾 4g
(6)磷酸二氢钾 1g
(7)琼脂粉 12g
(8)脱纤维羊血 75ml
配制方法同实施例5。
实施例8：
专用培养基的配制：
配方为：
每1000ml蒸馏水中含：
(1)蛋白胨 18g
(2)酵母浸出粉 15g
(3)葡萄糖 2g
(4)氯化钠 2g
(5)磷酸氢二钾 4g
(6)磷酸二氢钾 1g
(7)琼脂粉 12g
(8)脱纤维羊血 100ml
配制工艺同实施例5。
Claims (3)
1，一种淋病快速诊断药盒，包括：酶标抗体稀释液，稀释原液，底物液，显色液和终止液，抗原包被板条以及阴、阳性对照标准品，其特征在于：
一，酶标抗体稀释液：1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50-200mg
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 700-950ml
酶标抗体(SPA-HRP) 1-2mg(1∶200，1∶2000)
二，稀释原液：1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50-250mg
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01-0.03M，
pH7.0-7.8PBS 700-950ml
三，底物液：1000ml
0.2M磷酸氢二钠 500ml
0.1M柠檬酸 500ml
新鲜30％H2O2 300-800μl
PM抑菌剂 50-75mg
四，显色液：1000ml中含：
四甲基联苯胺(TMB) 200-1500mg
甲醇 750ml
以上摇匀，溶解后加入
纯甘油 250ml
五，终止液：1000ml
98％浓硫酸 100ml
蒸馏水 900ml
六，特异性淋球菌膜蛋白抗原包被板(每孔加入10μg/ml抗原包被液100μl)；
七，阴、阳性对照标准品
(一)阴性标准品1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50-200mg
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 680-930ml
正常人血清 10-20ml
(二)阳性标准品1000ml中含：
柳硫汞钠盐 50-200mg
新鲜小牛血清 50-300ml
灭菌0.01M，pH7.4PBS 680-930ml
兔抗淋球阳性血清 10-20ml。
2，一种淋病快速诊断药盒的生产工艺，包括淋病双球菌抗原的筛选、分离和纯化；免抗淋球菌抗体制备和提纯；高效价SPA制备及标记辣根过氧化物酶；药盒检测反应条件的建立等，其特征在于：
一，淋球菌的繁殖与保存
(1)，将淋病菌划线接种于专用培养基中，置5％CO2环境37℃培养24-48小时。
(2)淋球菌的菌种保存
制备淋球菌浓悬液于灭菌脱脂牛奶中，用干冰速冻，迅速移入液完全抽干，取出，用煤气灯封口，并抽气保证内部干燥，于4℃冰箱保存；
二，特异性膜蛋白抗原的纯化
(1)，收集淋球菌培养菌液，37℃纯培养18-36小时，涂片染色，显微镜检查，证明属革兰氏阴性双球菌；氧化酶阳性，触酶阳性；生化鉴定仅发酵葡萄糖，不发酵麦芽糖、蔗糖和果糖；
(2)，在上述培养菌液中加入5％甲醛生理盐水浸泡30分钟左右，用吸管洗涤，将培养皿表面菌落洗脱并收集入离心管；
(3)，将(2)所得菌落洗脱液置冷冻离心机，4-10℃，3000转/分离心15分钟，弃上清液，沉淀以PBS洗涤，重复离心洗涤三次，沉淀液保存于匀浆器内待用，储藏于-27℃冰箱；
(4)，上述菌液自冰箱内取出，置室温融化，冻融反复三次。
(5)，将(4)所述菌液用匀浆器反复匀浆10-15分钟，再用超声波粉碎，65μA粉碎5-10分钟，至镜检无完整细胞壁；
(6)，冷冻高速离心，4℃，10,000转/分，离心30分钟，取上清液，弃去沉淀；
(7)，冰冻超高速离心，4℃，100,000转/分，离心60-120分钟，取沉淀，弃去上清液；
(8)，沉淀用两相法精制，再用两性离子洗涤剂洗脱杂质，4℃搅拌过夜；
(9)，冰冻高速离心，4℃，10,000-15,000转/分，转30-60分钟，取上清液，弃去未溶解沉淀；
(10)，上清液以0.5μ滤膜过滤，滤液用紫外分光法检测蛋白质浓度；
(11)，上柱Sephadex G-200，以PBS为洗脱液，280nm检测，收集峰值，即为特异性淋球菌膜蛋白抗原，测浓度，冰水浴保存；
(12)，以该膜蛋白包被固相酶板或浓缩后免疫家兔，制备抗体；
三，免抗淋球菌抗体的制备与纯化
(一)，免疫血清的制备
(1)，药品：
纯化抗原
灭活卡介苗
佐剂
(2)，免疫动物：
健康新西兰白兔，雄性，年令六个月以上，体重2千克左右，2-3只；
(3)免疫方法：
a，制备抗原浓度为5mg/ml，与1ml完全佐剂混合(使用注射器法)，制成油包水乳剂，乳剂的粘稠度为保证佐剂抗原滴于冷水表面保持完整而不分散；
b，第一次免疫：抗原总量5mg，注射体积2ml，注射部位为四足下数点，每点0.2ml，脊背皮下数点，每点0.2ml；
c，第二次免疫：为第一次疫后7-10天，抗原用量1mg，可用不完全佐剂，途径为脊背皮下多点；
d，第三次免疫：第二次免疫后7-10天，方法同第二次；
e，间隔7天后采血，测定效价；
f，颈动脉放血，无菌手续分离血清，分装，低温冰箱保存待用；
(二)，免疫血清的纯化
(1)用常规饱和硫酸铵沉淀法进行粗提纯；
(2)用常规琼脂糖珠免疫吸附亲和层析法，进行精提纯；
四，辣根过氧化物酶标记SPA
采用常规的过碘酸钠法标记SPA纯品；
五，药盒检测反应条件
(一)，包被抗原最佳工作浓度为1.0μg/孔。包被时间：4℃24-48小时，或37℃，2-4小时，封闭，以20％小牛血清PBS，37℃，2小时(PBS，pH7.0-7.8，0.01-0.03m)；
(二)，血清标本稀释最佳浓度为1∶50.反应时间：37℃ 10分钟；
(三)，SPA酶标最佳应用浓度为1∶400-1∶1200，反应时间：37℃5分钟；
(四)，洗涤剂0.01MpH7.4PBS为最佳，洗涤时间为：第一次浸泡2-3分钟，以后三次可快速洗涤；或每次洗涤浸泡1分钟，连续五次，最后用力拍干；
3.一种淋球菌繁殖专用培养基，其特征在于其配方组成为：
每1000ml蒸馏水中含：
(1)蛋白胨 10-18g
(2)酵母浸出粉 5-15g
(3)葡萄糖 1-2g
(4)氯化钠 1-2g
(5)磷酸氢二钾 4g
(6)磷酸二氢钾 1g
(7)琼脂粉 10-12g
(8)脱纤维羊血 50-100ml
其配制方法为：将(1)-(7)所述各组份加入上述蒸馏水中混匀，在15磅高压下灭菌15分钟，待冷却至54-56℃，加入(8)，摇匀，分装至培养皿即得。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 95111738 CN1134552A (zh) | 1995-08-25 | 1995-08-25 | 淋病快速诊断药盒及其生产工艺 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 95111738 CN1134552A (zh) | 1995-08-25 | 1995-08-25 | 淋病快速诊断药盒及其生产工艺 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1134552A true CN1134552A (zh) | 1996-10-30 |
Family
ID=5078992
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 95111738 Pending CN1134552A (zh) | 1995-08-25 | 1995-08-25 | 淋病快速诊断药盒及其生产工艺 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1134552A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1307422C (zh) * | 2005-01-31 | 2007-03-28 | 上海市血液中心 | 一种质控品稀释液及其形成的质控品 |
| CN100385237C (zh) * | 2001-02-01 | 2008-04-30 | 上海新新医学生物工程公司 | 乙肝病毒前s1抗体酶免测定试剂盒及制备方法 |
-
1995
- 1995-08-25 CN CN 95111738 patent/CN1134552A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100385237C (zh) * | 2001-02-01 | 2008-04-30 | 上海新新医学生物工程公司 | 乙肝病毒前s1抗体酶免测定试剂盒及制备方法 |
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