JPH0479898A - コレラ菌及び毒素原性大腸菌を同時検出するためのｄｎａ及びｒｎａプローブとそれらを用いたコレラ菌及び毒素原性大腸菌の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 コレラ菌及び毒素原性大腸菌を同時に検出するためのＤ
ＮＡ及びＲＮＡプローブ、それらを用いたコレラ菌及び
毒素原性大腸菌の検出方法に関する。

〔従来の技術〕

コレラ菌および毒素原性大腸菌（ｅ　ｎ　ｔ　ｅ　ｒ　
。

ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉ）Ｊ、ｌ−共に重篤な下痢を惹起する。これらの病原
性因子はコレラ菌はコレラ毒素（ＣＴ）であり、毒素病
原性大腸菌は、易熱性毒素（ＬＴ）と耐熱性毒素（ＳＴ
）の２つに大別される。ＬＴは抗原性の違いからＬＴｈ
とＬＴｐの２つに分類され、その分子構造、毒素作用機
序の両面で、ＣＴに類似している。ＬＴｈはヒトに病原
性を示す毒素原性大腸菌から分離されたものであり、Ｌ
Ｔｐはブタに病原性を示す毒素原性大腸菌から分離され
たものである。またＳＴはＳＴＩと５ＴＩＩに分類され
る。５ＴＩＩは主にブタ株からのみ分離され、ヒト株か
らの分離例は極めて稀である。

コレラ毒素産生コレラ菌の同定法にはウサギ結さく腸管
法がある。この方法は、食物も水も２４時間与えなかっ
たウサギの小腸を結さくして毛管（ループ）を作り、そ
のループ内にペプトン水中で予め２４時間培養しておい
たコレラ菌を接種し、２４時間後の液体の貯留を観察す
るものである。

このような方法と異なり、ウサギの背部皮膚内に試験菌
培養上清を注射し、生じた色素斑の大きさの程度で判定
１する方法（皮膚毛細血管透過性亢進試験法）、あるい
はまた、チャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＯ）細
胞の形態変化を調べる方法（培養細胞試験法）などがあ
る。

一方、免疫学的試験法としては、抗コレラエンテロトキ
シン感作ウサギ赤血球と試験菌培養上清とを混合し、凝
集の有無で判定する方法（逆受身赤血球凝集試験法）が
ある。毒素原性大腸菌のＬＴは、ＣＴと類似しているた
めに、上記のＣＴの試験法で判定することができる。

毒素原性大腸菌のＳＴの試験法として利用されているの
は乳飲みマウス（乳飲みマウス試験法）を用いる方法で
ある。この方法は、菌の培養上清液１ｍｊ２に、２％エ
バンスブルー液０．０２ｍｊ？を混合して試料を作成す
る。ポリエチレンチューブを装着した注射器に試料を取
り、０．１ｍｆをマウス（生後３日）の胃内に投与する
。その３時間後、ジエチルエーテルで膜処理し、直ちに
全体重と腸管除去後の体重を測定する。この値により〔
（全体重−腸管除去後の体重）／腸管除去後の体重〕を
計算し、ｆｌｕｉｄ　　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ（Ｆ
Ａ）比とする。ＦＡ比が０．０８％以上の場合を陽性と
する。

〔発明が解決しようとする課題〕

コレラ菌及び毒素原性大腸菌が惹起する下痢症は、重篤
であり、海外から輸入された食物の汚染によって感染す
るケースと発展途上国へ渡航した際におこるケースなど
がある。従来のコレラ菌及び毒素原性大腸菌の検出方法
は、生物学的、免疫学的な手法で行われている。しかし
ながら、海外渡航者および海外からの食品の輸入の数は
急増の一途を辿っているのが現状である。このため、能
率的な検出方法が強く要望されていたが、両画の検出を
簡便に検出する方法は未だ確立されていない。

検査法の筒便化と時間の短縮は、下痢症患者の適切な処
置を施すのに重要であり、またコレラ菌および毒素原性
大腸菌による汚染を未然に防止する上でも極めて重要で
ある。

本発明の目的は、コレラ菌及び毒素原性大腸菌の易熱性
毒素と耐熱性毒素の毒素遺伝子をＤＮＡあるいはＲＮＡ
プローブを用いて、コレラ菌および毒素原生大腸菌を同
時にしかも簡便に検出するためのＤＮＡおよびＲＮＡプ
ローブとそれらを用いたコレラ菌及び毒素原性大腸菌の
検出方法を提供するものである。

本発明者らはＬＴｈ、ＳＴ　Ｉ　ａ、ＳＴ　Ｉ　ｂの毒
素を産生ずる毒素性大腸菌を各々に対するＤＮＡプロー
ブを用いて検出することに成功したのであるが（Ｋｉｒ
ｒｉ、Ｙ、、Ｄａｎｂａｒａ、Ｈ，。

Ｋｏｍａｓｅ、に、、Ａｒ　ｉ　ｔａ、Ｈ，、Ｙｏｓｈ
ｉｋａｗａ、Ｍ、らＪ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌ、２５巻、１９６２頁）、５ＴＩａを産生する
毒素原性大腸菌のなかには、ｉｚｐのような放射性同位
元素で標識したものでは検出可能なものの、ビオチン化
したＤＮＡプローブでは検出できないものがあった。放
射性同位元素で標識したプローブは検出感度が高いもの
の、その使用は被爆や汚染などの危険が伴い、臨床レベ
ルでの使用には適していない。

毒素原性大腸菌の５ＴＩａおよび５ＴＩｂは共に７２個
の前駆体を含むアミノ酸から成り、２１６塩基対のＤＮ
Ａによってコードされている。そのためＤＮＡプローブ
としては２００塩基対前後の短いものしか作成できない
。２００塩基対前後の短いプローブはビオチンやホース
ラデイツシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）などで標識し
た場合感度が悪く、さらに標的遺伝子との交雑の低下を
引き起こすために、放射性同位元素を用いないでＳＴの
ような遺伝子を検出するのは非常に困難であった。また
、短いプローブは量的に調製する際にも多大な労力を必
要とする。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らはヒトに病原性を示す毒素原性大腸
菌の３種の毒素遺伝子ＬＴｈ、５ＴＩａ、５ＴＩｂをＴ
４ＤＮリガーゼを用いて連結したプローブ（以下、トリ
バレントプローブと呼称する）を作成した。

トリバレントプローブは１．２キロ塩基対から成り、そ
の結果、ホースラデイツシュパーオキシダーゼまたはア
ルカリフォスファターゼなどによる標識でも放射性同位
元素と同等な検出感度を得ることができる。また、この
プローブの特徴としては、 （１）１つのプローブで毒素原性大腸菌のＬＴｈ。

５ＴＩａ、ＳＴＩ　ｂの３つの毒素が同時検出可能であ
ること。

（２）コレラ菌ＯＣＴはＬＴｈと遺伝子レベルで７８．
２％もの相同性を示すので、ＣＴの検出が可能であるこ
と。

（３）Ｘｂａｌ消化によって簡単にプラスミドから分離
、精製が可能であること。

などが挙げられる。実際にこのトリバレントプローブを
ホースラデイツシュパーオキシダーゼで標識したコロニ
ー交雑法を行ったところ、毒素原性大腸菌のＬＴｈ、５
ＴＩａ、ＳＴ　Ｉ　ｂ、コレラ菌の各毒素遺伝子を検出
することができた。

すなわち、本発明は下記式〔Ａ〕ＣＢ）（Ｃ）で表され
る３種の毒素遺伝子をＴ４ＤＮＡリーガゼを用いて連結
した組換えＤＮＡプローブである。

（Ａ、）毒素原性大腸菌の易熱性毒素のアミノ酸をコー
ドする下記式で表される遺伝子の全部、または一部を含
むことを特徴とする配列。

ＡＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＣＴＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴ
ＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＡＧＣＡＴＣＧＣＣＡＴＴＡＴＡ
ＴＧＣＡＡＡＴＧＧＣＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＡＣＣＧＴ
ＧＣＴＧＡＣＴＣＴＡＧＡＣＣＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡ
ＴＡＡＡＡＣＧＴＴＣＣＧＧＡＧＧＴＣＴＴＡＴＧＣＣ
ＣＡＧＡＣ；ＧＧＣＡＴＡＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＡ
ＴＡＧＡＧＧＡＡＣＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＡＴＴＡＡＴ
ＣＴＴＴＡＴＧＡＴＣＡＣＧＣＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＣ
ＡＡＡＣＣＧＧＣＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＡＴＧＡＴＧＡ
ＣＧＧＡＴＡＴＧＴＴＴＣＣＡＣＴＴＣＴＣＴＴＡＧＴ
ＴＴＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＣＡＣＴＴＡＧＣＡＧＧＡＣ
ＡＧＴＣＴＡＴＡＴＴＡＴＣＡＧＧＡＴＡＴＴＣＣＡＣ
ＴＴＡＣＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＡＴＡＣ；ＣＧＡＣ
ＡＧＣＡＣＣＡＡＡＴＡＴＧＴＴＴＡＡＴＧＴＴＡＡＴ
ＧＡＴＧＴＡＴＴＡＧＧＣＧＴＡＴＡＣＡＧＣＣＣＴＣ
ＡＣＣＣＡＴＡＴＧＡＡＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＣＴＧＣ
ＧＴＴＡＧＧＴＣ、ＧＡＡＴＡＣＣＡＴＡＴＴＣＴＣＡ
ＧＡＴＡＴＡＴＧＧＡＴＧＧＴＡＴＣＧＴＧＴＴＡＡＴ
ＴＴＴＧＧＴＧＴＧＡＴＴＧＡＴＧＡＡＣＧＡＴＴＡＣ
ＡＴＣＧＴＡＡＣＡＧＧＧＡＡＴＡＴＡＧＡＧＡＣＣＧ
ＧＴＡＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＡＴＡＧＣＴ
ＣＣＧＧＣＡＧＡＧＧＡＴＧＧＴＴＡＣＡＧＡＴＴＡＧ
ＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＣＣＧＧＡＴＣＡＣＣＡＡＧＣ
ＴＴＧＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＧＧＡＴＴＣＡＴ
ＣＡＴＧＣＡＣＣＡＣＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧＡＡＡＴＴ
ＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＧＧＴＧＡＴＡＣ
ＴＴＧＴＡＡＴＧＡＧＧＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡＴＣＴＧ
ＡＧＣＡＣＡＡＴＡＴＡＴＣＴＣＡＧＧＡＡＡＴＡＴＣ
ＡＡＴＣＡＡＡＡＧＴＴＡＡＧＡＧＧＣＡＧＡＴＡＴＴ
ＴＴＣＡＧＡＣＴＡＴＣＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＴＧＡＣ
ＡＴＡＴＡＴＡＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＧＡＡＴＧＡＡＴ
ＴＡＴＧＡＡＴＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＧＴＴＡＴＧＴＴ
ＴＴＡＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＴＡＣＴＡＴＣＣＴＣＴＣ
ＴＡＴＧＴＧＣＡＴＡＣＧＧＡＧＣＴＣＣＣＣＡＧＴＣ
ＴＡＴＴＡＣＡＧＡＡＣＴＡＴＧＴＴＣＧＧＡＡＴＡＴ
ＣＧＣＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＴＡＴＡＴＡＣＧＡＴＡＡ
ＡＴＧＡＣＡＡＧＡＴＡＣＴＡＴＣＡＴＡＴＡＣＧＧＡ
ＡＴＣＧＡＴＧＧＣＡＧＧＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＧ
ＧＴＴＡＴＣＡＴＴＡＣＡＴＴＴＡＡＧＡＧＣＧＧＣＧ
ＣＡＡＣＡＴＴＴＣＡＧＧＴＣＧＡＡＧＴＣＣＣＧＣ；
ＧＣＡＧＴＣＡＡＣＡＴＡＴＡＧＡＣＴＣＣＣＡＡＡＡ
ＡＡＡＡＧＣＣＡＴＴＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＣ
ＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＴＣＡＣＡＴＡＴＣＴＧＡＣＣＧ
ＡＧＡＣＣＡＡＡＡＴＴＧＡＴＡＡＡＴＴＡＴＧＴＧＴ
ＡＴＧＧＡＡＴＡＡＴＡＡＡＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＣＡ
ＡＴＴＧＣＧＧＣＡＡＴＣＡＧＴＡＴＧＧＡＡＡＣＴＡ
Ｇ ＣＢ）毒素原性大腸菌の耐熱性毒素（ＳＴＩａ）、のＳ
Ｄ　（Ｓｈ　１ｎｅ−Ｄａ　ｌ　ｇａｎｏ　　（リポソ
ーム配列）〕配列から始まり転写終結シグナルまでコー
ドする下記式で表される遺伝子の全部、または一部を含
むことを特徴とする配列。

ＧＧＡＧＧＴＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＣＴＡＡＴＧＴ
ＴＧＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＴＧＴＡＴＴＡＴＣ
ＴＴＴＣＣＣＣＴＣＴＴＴＴＡＧＴＣＡＧＴＣＡＡＣＴ
ＧＡＡＴＣＡＣＴ’ｌ”ＧＡＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＧＡ
ＧＡＡＡＡＴＴＡＣＡＴＴＡＧＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＧ
ＴＧＴＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＣＡＡＣＡＧＴＧ
ＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＧＡＡＡＡＴＡＴＧＡＡＣＡＡ
ＣＡＣＡＴＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＴＧＡＡＣＴＴＴＣ；
ＴＴＧＴＡＡＴＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＡＴＧＴ
ＴＡＴＴＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＧＡＧＧＧＡＡＴＣＴＴ
ＴＡＴＴＴＴＧＡＴＴＣＣＣＴＣＴＴ （Ｃ）毒素原性大腸菌の耐熱性毒素（ＳＴＩｂ）のＳＤ
　（ｓ　ｈ　ｉ　ｎｅ−Ｄａ　ｌ　ｇａｎｏ）配列から
始まり転写終結シグナルまでコードする下記式で表され
る遺伝子の全部、または一部を含むことを特徴とする配
列。

ＧＧＡＧＧＴＡＡＴＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＣＡＡＴＡＴ
ＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＧＴＡＴＴＧＴＣ
ＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＡＧＧＡＴＧＣＴ
ＡＡＡＣＣＡＧＴＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＡＡＡＧＡＡＡ
ＡＡＡＴＣＡＣＡＣＴＡＧＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧ
ＴＡＡＣＡＴＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＡＡＴＡＡＡ
ＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＡＧＣＡＴＧＡＡＴＡＧＴＡ
ＧＣＡＡＴＴＡＣＴＧＣＴＧＴＧＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧ
ＴＡＡＴＣＣＴＧＣＴＴＧＴＡＣＣＧＧＧＴＧＣＴＡＴ
ＴＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＴＡＡＡＣＡＧ
ＴＴＣＣＣ’ｌ”ＴＴ本発明においては特許請求の範囲
第１項のＤＮＡプローブを組み込んだプラスミドを、制
限酵素処理することによって、式［Ａ）（Ｂ）（Ｃ）で
表される３種の毒素遺伝子が連結した状態で、プラスミ
ドから分離、精製できる。

本発明は特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡプローブを
鋳型として、合成したＲＮＡプローブも含むものである
。

また、本発明は該プローブを放射性同位元素、蛍光色素
、発光色素酵素で標識したＤＮＡまたはＲＮＡプローブ
である。

本発明は本発明のＤＮＡおよびＲＮＡプローブをコレラ
菌または毒素原性大腸菌のＤＮＡと交雑する条件下で、
試料を接触させ、ハイブリッドＤＮＡ複合体の存在を検
出することにより試料中のコレラ菌または毒素原性大腸
菌を検出する方法も含まれている。

更に、本発明はプラスミドと、夾雑反応、続いて行う洗
浄用の試薬と、これらの操作に必要な器具、機器を含む
ことを特徴とするコレラ菌、毒素原性大腸菌検出用キッ
トも含むものである。

以下本発明の実施例について説明するが、これに限定さ
れるものではない。

〔実施例〕

プラスミドの構築法について示したのが第２図である。

第３Ａ図は毒素大腸菌を同定するためのプローブ領域を
示したものである。閣は腸管毒素がコードされている制
限酵素切断片を示す。下線部は毒素遺伝子領域を示す。

ＡｐおよびＴｃはそれぞれアンピシリンおよびテトラサ
イクリン耐性遺伝子領域を示す。第３Ｂ図はトリバレン
トプローブ領域を含むｐＫＡＤＯＯ８の構築法を示した
ものである。−はＬＴｈの遺伝子領域、ロコは５ＴＩａ
の遺伝子領域、；は５ＴＩｂの遺伝子領域を示す、○は
Ｔ７のプロモーター領域を示し、・はＳＦ３のプロモー
ター領域。◎はＴ３のプロモーター領域を示す、制限酵
素部位は以下のアルファベットで示した。すなわち、Ｅ
はＥｃ。

Ｒ１、Ｈは）（ｔｎｄ［［、ＸはＸｂａ　１部位である
。

ＡＰはアンピシリン耐性遺伝子領域を示す。

さて、プラスミドの構築法を詳しく説明すると、プラス
ミド１（１３２Ｈ−１９はＬＴｈ遺伝子のすべての領域
を含む１６８０および６７０塩基対のＨｉｎｄｌＩＩ断
片を、ｐＢＲ３２２の１（ｉｎｄｌ１１部位に挿入した
ものである。次に１（１３２Ｈ−１９をＥｃ　ｏＲＩで
消化し、セルフライゲーションを行いサブユニットＢを
欠損させ、ＬＴｈのサブユニットＡ領域のみを含むプラ
スミド１（１３２Ｈ１９−ｄｅｌ−ＥｃｏＲＩを作製し
た。プラスミドｐＴＥ５０１４は５ＴＩａ遺伝子遺伝子
台む１７キロ塩基対のＰｓｔＩ断片をｐＢＲ３２２のＰ
ｓｔ１部位に挿入したものである。５ＴＩａ遺伝子Ｐｓ
ｔＩ断片上の１５７塩基対のＨｉ　ｎ　ｆ　Ｉ断片上に
存在する。この領域は成熟５ＴＩａ遺伝子の８６塩基対
上流から終止コドンの下流塩基対までを含んでいる。こ
の１５７塩基対のＨ４ｎｆ■断片をＤＮＡポリメラーゼ
Ｋｌｅｎｏｗ断片で修復後、ＥｃｏＲＩリンカ−を付加
してプラスミドｐＳＰ６５の同部位に挿入したのがプラ
スミドｐＫＡＤＯＯ１である。

プラスミド５３４０２Ｔ−１は５ＴＩｂ遺伝子領域を含
む約８５０塩基対のＴａｑｌ断片をｐＢＲ３２２のＣｌ
ａｌ部位に挿入したものである。

５ＴＩｂ遺伝子は、工ｕｌ断片中の２２０塩基対の且ｌ
ｌＩ断片上に存在している。この領域には成熟５ＴＩｂ
上流に存在するシグナルペブチドの上流ｌＯ塩基対から
、成熟５ＴＩｂ遺伝子の終止コドンの１０塩基対上流ま
での配列を含んでいる。この２２０塩基の且ＬｌＵ断片
をＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗ断片で修復後、Ｅｃ
ｏＲＩリンカ−を付加してプラスミドｐＳＰ６５の同部
位の挿入したのがプラスミドｐＫＡＤＯＯ２である。Ｌ
Ｔｈ−ＳＴＩａ−−３ＴＩｂトリバレントプローブを作
製するために、１（１３２Ｈ−１９−ｄｅ　ｌ　−Ｅｃ
　ｏＲ１，、ｐＫＡＤｏ　０１、ｐ　ＫＡＤ　００２を
それぞれ制限酵素Ｘｂａ　Ｔ−Ｅｃ　ｏＲＩ、ＥｃｏＲ
Ｔ、ＥＣ０ＲＩで消化した断片３種を同時にｐＳＰ６５
のＸｂａ　Ｉ−ＥｃｏＲ１部位に挿入し、プラスミドｐ
ＫＡＤ００７を得た。ｐＫＡＤＯＯ７Ｘｂａｌで完全に
消化した後、ＥＣＯＲＩで部分的に消化し１２６８塩基
対のＬＴｈ−３Ｔｌａ−３ＴＩｂトリバレントプロ一ブ
断片を得た。この断片をＢＬＵＥＳＣＲＩ　ＰＴ　　Ｓ
Ｋ　（−）のＸｂａ　Ｉ−ＥｃｏＲ１部位に挿入した、
次に旦ｃｏＲ１部位の３塩基上流にあるＥｃｏＲＶで、
完全に消化してプラスミドを線状化した後、ｘｂａ＋リ
ンカ−を付加し、ｐＫＡＤＯＯ８を得た。

ｐＫＡＤＯＯ８はＸｂａ　Ｉで消化することによって、
容易にトリバレントプローブを得ることが可能である。

Ｓａｎｇｅｒの方法（ＳａｎｇｅｒＦ、５ｃｉｅｎｃｅ
、２１４巻、１２０頁、１９８１年）によってＤＮＡの
塩基配列を決定したところ、このトリバレントプローブ
はＬＴｈ（１分子）、５ＴＩａ（２分子）　、５ＴＩｂ
　（１分子）を含んでいることが明らかになった。この
組換えプラスミドを含む大腸菌ＨＢ　１０１／ｐＫＡＤ
。

０８は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉＨＢＩＯＩ　
　（ｐＫＡＤＯＯ８）微工研菌寄第１１５９９　　ＦＥ
ＲＭ　　Ｐ−１１５９９）。

１２６８塩基対のトリバレントプローブはｐＫＡＤＯＯ
８をＸｂａ　１で消化後、１．０％のアガロースゲルで
分解、精製したものを用いた。このプローブをそれぞれ
、ホースラデイツシュパーオキシダーゼと′Ｐで標識し
て、両者の特異性及び感度について比較した。その結果
において、第４図〔Ａ〕は３２ｐで標識した合成ＲＮＡ
　ｌ−リバレントプローブを使用し、（Ｂ）はホースラ
デイツシュパーオキシダーゼ標識のトリバレントプロー
ブを使用したものである。試験菌株は、ＬＴｈ産生菌、
５ＴＩａ産生菌、５ＴＩｂ産生菌、ＬＴｈ−ＳＴＩａ−
両産生菌、ＬＴｈ−３ＴＩ　ｂ両度生菌、対照として毒
素非産生菌を使用した。

トリバレントプローブへのホースラディシュパーオキシ
ダーゼの付加はアマジャム社のＥＣＬ遺伝子検出システ
ムを用いて行った。また、３Ｚｐによる標識は、ｐＫＡ
ＤＯＯ７をＸｂａｌで線状化し、Ｍｅｌｔｏｎら（Ｍｅ
ｌｔｏｎ、Ｄ、Ａ、。

Ｋｒｉｅｇ、Ｐ、Ａ、、Ｒｅｂａｇｌｉａｔｉ。

Ｍ、Ｒ，、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、Ｚｉｎｎ。

Ｋ、ａｎｄ　　Ｇｒｅｅｎ、Ｍ、Ｒ，らＮｕｎｃｌｅｉ
ｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、１２巻、７（１３５頁、
１９８４年）の方法にしたがいＳ　Ｐ　６　ＲＮＡポリ
メラーゼのｉｎ　　ｖｉｔｒｏの転写系によって、合成
ＲＮＡプローブを作製した。実験には、大阪空港で分離
した大腸菌株を用いた。ＬＴｈ産生性はＥｌｅｋ変法、
および逆受身ラテックス凝集反応で確認し、５ＴＩａ、
５ＴＩｂ両産生性は、乳のみマウスを用いて調べた。大
腸菌からのプラスミドの抽出法は、Ｋａｄｏ＆Ｌｉｕら
（Ｋａｄｏ、　Ｃ，１，ａｎｄ　　Ｌｉｕ、　Ｓ、−Ｔ
、らＪ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４５巻、１３６５頁１９８１年
）の方法に従った。プラスミドＤＮＡ（１，５ｍｌの一
夜培養液から調製）は９０μｌの１０ｍＭ　　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩ！　（８，０）　　０゜１ｍＭ　　ＥＤＴＡ溶
液にけん濁後、２ＮのＮａ０ＨＩＯμｌを加え、室温に
１０分放置した。放置後、２５μｌの５Ｍ　酢酸アンモ
ニウムを加え、直ちにスロットブロック−（ミリプロッ
ト、日本ミリポアリミテッド）を用いてナイロンメンプ
ラン（ハイボンド−Ｎ＋、アマジャム社）に移行させた
。ろ紙上にメンブレンを置き２０分風乾した後、８０℃
の真空オーブンで２時間ベイクした。

３ｔｐで標識した合成ＲＮＡの交雑法の条件について述
べる。ナイロンメンブレンをプラスチックバッグに入れ
る。メンブレンは１００ｃｆｆｌ当たり５ｍ！！となる
ようにプレハイブリダイゼーション液（５０％脱イオン
化したホルムアミド、５Ｘ　　５ＳＰＥ、１０％グリシ
ン、５Ｘデンハルト液、０４　ｍ　ｇ　／　ｍ　１熱変
性サケ精子ＤＮＡ、０．１％５ＤＳ）を加え、４２℃で
１時間振とうする。バッグの端を切り溶液を捨てる。等
量のハイブリダイゼーション溶液（５０％脱イオン化し
たホルムアミド、５Ｘ　　５ＳＰＥ、ＩＸデンハルト液
、０１ｍｇ／ｍＩ！熱変性ＤＮＡ、０．３％５ＤＳ）と
（Ｑ’−”Ｐ）ＵＴＰで標識シタ合成ＲＮＡプローブを
加え、振とうしながら４２℃で１６時間のハイブリダイ
ゼーションを行う。ナイロンメンブレンをプラスチック
バッグから取り出す。清浄な容器に移し、２Ｘ　　５Ｓ
ＰＥ−０１％ＳＤＳ溶液を加え、室温で５分間振とうす
る。この操作を３回行う。新しい容器にメンブレンを移
し、０．１ＸＳＳＰＥ−０，１％ＳＤＳ溶液を加え５０
℃で３００分間振うする。この操作を２回行う。ナイロ
ンメンブレンをろ紙にのせ余分な水分を取り除いた後、
サランラップで包む。３時間から一晩のオートラジオグ
ラフィーを行う。

標識法、交雑法、および検出法は、アマジャム社のＥＣ
Ｌ遺伝子検出システムを用いた。０．５ＭのＮａＣ１を
含むハイブリダイゼーションバッファー（キット添付）
に５％ｗ　／　ｖとなるようにブロッキング試薬を加え
る。ニトロセルロースメンブレンの場合はブロッキング
試薬を加えなくて良い。メンブレンをプラスチックバッ
グに入れる。

それにハイブリダイゼーションバッファーを加え少なく
とも４２℃で１５分間プレハイブリダイゼーションを行
う。標識したプローブを直接メンブレンに掛からないよ
うに注意して加え、穏やかに混ぜる。振とうしながら、
４２℃で１６時間のハイブリダイゼーションを行う。メ
ンブレンをプラスチックバッグから取り出し一次バソフ
ァ　（６Ｍ、尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５ＸＳＳＣ）
を加え４２℃で２００分間振うする。この操作を２回行
う。メンブレンを新しい容器に移し、２ＸＳＳＣを加え
室温で５分間振とうする。この操作を２回繰り返す。

検出は化学発光をＸ線フィルム上で検出するものである
。検出試薬１と検出試薬２を等量混合しメンブレンを覆
うのに十分な量の検出溶液を作り、メンブレンにかける
。室温で正確に１分間放置する。余分な検出溶液を軽く
拭きサランラップで包む。ＤＮＡをスポットした面がフ
ィルムに接するようにフィルムカセットにセットする。

明かりを消し、Ｈｙｐ　ｅ　ｒ　ｆ　ｉ　１ｍ−ＥＣＬ
　（アマジャム社）をメンブレン上に置き、カセットを
閉じ１分間露光させる。新しいフィルムと交換する。最
初のフィルムを現像し、像が見えれば３０分程度の露光
を、なければ１時間行う。

第５図に示されるように、３ｔｐで標識したプローブと
ホースラディシュで標識したプローブは同感度であり、
毒素原性大腸菌とのみハイブリダイズし、毒素非生産株
とはハイブリダイズしないことがわかった。即ち、第５
図〔Ａ〕はＬＴｈ産生菌（１−〇、３−ｂ、５　　ｂ）
、５ＴＩａ産生菌（２−ａ、４−ｃ、５−ａ）　、５Ｔ
Ｉｂ産生菌（１−ｂ、　６−ｃ、　７−ａ＞　、ＬＴｈ
−ＳＴＩａ−両生産菌（２−ｂ、４−ｂ、６−ｂ）　、
ＬＴｈ−３Ｔｌｂ両産生菌（３−ａ、５−ｃ、７−ｂ）
、毒素非産生菌（１−ａ、２−ｃ、３−ｃ、４−ａ、６
−ａ、７−Ｃ）。（Ｂ）においてＣＴはコレラ毒素産生
菌で、１　；Ｏｇａｗａ　１４１８．２；ＯｇａｗａＮ
ＩＨ−４１，３；　Ｉ　ｎ　ａ　ｂ　ａ　５６９　Ｂ、
４　；　ＩｎａｂａＮＩＨ−３５である。対照として、
ＬＴｈ産生菌、毒素非産生菌を２株づつおいた。

トリバレントプローブはホースラデイツシュパーオキシ
ダーゼのような非放射性物質で標識でき、放射性物質と
同等の感度を持つことがわかった。

そこで、このプローブが一度に多数の検体を処理するこ
とができるコロニーハイブリダイゼーションに使用でき
るかどうか検討した。寒天平板培地上にオートクレーブ
滅菌したニトロセルロースメンブレンをのせ、３７°Ｃ
で８時間培養し試験菌を発育させた。細菌ＤＮＡの調製
は、Ｋｉｒｉｉら（Ｋｉ　ｒ　ｉ　ｔ、Ｙ、、Ｄａｎｇ
ａ　ｒａ、Ｈ，、Ｋｏｍａｓｅ、に、、Ａｒｔａ、Ｈｏ
ａｎｄ　　Ｙ。

ｓｈｉｋａｗａ、Ｍ、ら２５巻、１９６２頁、１９８７
年）の方法を改良して行った。メンブレンを１０％ＳＤ
Ｓ溶液で３分間の処理を行い、０゜５Ｍ水酸化ナトリウ
ムで滅菌してから中和後、３７℃でプロテアーゼＫを作
用させて菌体成分を分解した。メンプランを軽く洗浄後
、８０℃で細菌ＤＮＡをメンブレンに固定した。ハイブ
リダイゼーションの条件、検出は、前述と同様な方法で
行った。その結果を第５図〔Ａ〕に示すが、すべての毒
素原性大腸菌がトリバレントプローブによって検出され
、毒素非生産株とは全（反応しなかった。このことから
、トリバレントプローブはコロニーハイブリダイゼーシ
ョン法にも適用できることがわかった。

また、トリバレントプローブが毒素原性大腸菌のみなら
ず、コレラ菌ＯＣＴの検出にも可能であることを示した
のが第５図（Ｂ）である。実験条件は第４図〔Ａ〕と同
様に行った。

以上の結果からトリバレントプローブは毒素原性大腸菌
、およびコレラ菌の検出に有効であることがわかった。

の　　　　　　　　　　　の ホースラデイツシュパーオキシダーゼで標識したトリバ
レントプローブが糞便中の毒素原性大腸菌を検出できる
かを検討した。試験菌株はＬＴｈ、ＳＴＩ　ａ、ＳＴＩ
　ｂの各毒素原性大腸菌、および毒素非生産菌を１０’
から１０′７まで揃えたものに健常人の糞便を加え混合
後、ニトロセルロースメンプラン上に植菌し３７℃で一
夜培養した。

コロニーハイブリダイゼーションの結果を第６図〔Ａ〕
及び（Ｂ）に示す。その結果は、１０２個以上の毒素原
性大腸菌が存在すれば、検出可能であり、臨床検査レベ
ルでの応用が可能であると考えられる。

また、第７図〔Ａ〕はＥＴＥＣ毒素原性大腸菌ｃｈｏｌ
ｅｒａｅｓｕｉｓ）を単独で糞便と混合させた試料であ
り、（Ｂ）は試料としてＥＴＥＣ。

ＳＴａの２菌、ＥＴＥＣ，Ｓａ　１の２菌、５ＴａＳａ
ｔの２菌の混合物と糞便とを混ぜたものである。

ｅｒａｅｓｕｉｓが毒素原性大腸菌と同数糞便中に混合
しても検出には影響をおよぼさなかった。

コレ−び　　　　　　　　　　キット 検査に必要となる試薬類および器具類が含まれる。具体
的にはトリバレントプローブ、トリバレントプローブを
組み込んだプラスミド、標識用の試薬、検体遺伝子を固
定するためのメンブレン、ハイブリダイゼーションの試
薬、ハイブリダイゼーション後に用いる洗浄用の試薬、
ハイブリダイゼーション操作用および洗浄操作用の器具
、交雑の有無を判定するための、ネガティブとポジティ
ブのコントロール試薬、判定結果の表現例等が含まれ、
これらの全であるいは、トリバレントプローブとトリバ
レントプローブを組み込んだプラスミドを必須として他
の部品の一部からなる。各種の試薬は、必要に応じて濃
度を調製できるように使用する濃度よりも濃厚な溶液と
して提供されるのが一般的であるが、検査時の必要濃度
に調製しておいても差し支えない。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図、第１Ｂ図、第１Ｃ図はＬＴｈ、ＬＴｐ、ＣＴ
のサブユニット遺伝子の塩基配列を示しくなお、塩基配
列のアンダーライン個所は重複配列を示す）、 第２Ａ図は５ＴＩａ）ランスポゾン’ｌ’ｎ１６８１と
５ＴＩａオペロンの構造を示し、 第２Ｂ図は５ＴＩａ遺伝子領域と５ＴＩｂ遺伝子領域の
塩基配列（なお、５ＴＩａと同じ部位は・・・・で示し
である）を示し、 第３Ａ図はプラスミドの構築法であり、毒素原性大腸菌
を同定するためのプローブ領域を示し、第３Ｂ図はトリ
バレントプローブ領域を含むｐＫＡ、ＤＯＯ８の構築法
を示し、 第４図〔Ａ〕は３２ｐで標識した合成ＲＮＡｌ−リバレ
ントプロープを使用したスロ・ノトブロソトハイプリダ
イゼーションの結果を、（Ｂ）はホースラデイツシュパ
ーオキシダーゼ標識のトリバレントプローブを使用した
スロットプロットハイブリダイゼーションの結果を示し
、 第５図（Ａ＞はＬＴｈ産生菌、５ＴＩａ産生菌、５ＴＩ
ｂ産生菌、ＬＴｈ−ＳＴＩａ−両産生菌、ＬＴｈ−３Ｔ
Ｉｂ両産生菌、毒素非産生菌のコロニーハイブリダイゼ
ーションの結果を示すもので（Ｂ）はＣＴ産生菌、ＬＴ
ｈ産生菌、毒素非産生菌のコロニーハイブリダイゼーシ
ョンの結果を示し、 第６図〔Ａ〕および（Ｂ）は糞便を菌体試料としたハイ
ブリダイゼーションの結果を示し、第７図〔Ａ〕はＥＴ
ＥＣ，Ｓ　ｔ　ａ、Ｓａ　Ｉを単独で糞便と混合させた
試料のハイブリダイゼーションの結果を示し、（Ｂ）は
ＥＴＥＣ，Ｓｔａの２菌、Ｓｔａ、Ｓａｌの２菌の混合
物と糞便を混ぜたハイブリダイゼーションの結果を示す
ものである。 ム 図面のｉ’＋’＋３ 第１Ｂ図 ＋３０ ム 停止 図面の１７．） 第 ４図 図面の浄Ｉ 第５図 （Ｂ） 図面の浄書 第７図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）、式〔Ａ〕〔Ｂ〕〔Ｃ〕で表される３つの毒素遺
   伝子をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した組換えＤＮ
   Ａプローブ。 〔Ａ〕毒素原性大腸菌の易熱性毒素のアミノ酸をコード
   する下記式で表される遺伝子の全部、または一部を含む
   ことを特徴とする配列。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 〔Ｂ〕毒素原性大腸菌の耐熱性毒素（ＳＴ I ａ）のＳ
   Ｄ（ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ）配列から始まり転写
   終結シグナルまでコードする下記式で表される遺伝子の
   全部、または一部を含むことを特徴とする配列。 【遺伝子配列があります】 〔Ｃ〕毒素原性大腸菌の耐熱性毒素（ＳＴ I ｂ）のＳ
   Ｄ（ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ）配列から始まり転写
   終結シグナルまでコードする下記式で表される遺伝子の
   全部、または一部を含むことを特徴とする配列。 【遺伝子配列があります】 （２）特許請求の範囲第１項記載の式〔Ａ〕〔Ｂ〕〔Ｃ
   〕で表される遺伝子プローブ断片をプラスミドにクロー
   ニングし、これらのプローブ領域を隣あわせに持つトリ
   バレントプローブプラスミド。 （３）プラスミドがＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴＳＫ（−）で
   ある請求項第２項記載のプラスミド。 （４）特許請求の範囲第１項のＤＮＡプローブを組み込
   んだプラスミドの制限酵素処理によって、特許請求の範
   囲第１項記載の式〔Ａ〕〔Ｂ〕〔Ｃ〕で表される３種の
   毒素遺伝子が連結した状態でプラスミドから分離、精製
   されたＬＴｈ−ＳＴ I ａ−ＳＴ I ｂプローブ領域断片
   。 （５）特許請求の範囲第１項のＤＮＡプローブを鋳型と
   して、合成したＲＮＡプローブ。（６）プラスミドがＢ
   ＬＵＥＳＣＲＩＰＴＳＫ（−）であり、少なくとも１つ
   の制限酵素Ｘｂａ I 消化で分離可能な請求項第４項記
   載のプローブ領域断片。 （７）特許請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡプロー
   ブまたは特許請求の範囲第４項記載のプローブ領域断片
   または特許請求の範囲第５項記載のＲＮＡプローブを酵
   素標識した、酵素トリバレントプローブ。 （８）酵素がホースラデイッシュペルオキシダーゼ（Ｈ
   ＲＰ）またはアルカリフォスファターゼである請求項第
   ７項記載の酵素トリバレントプローブ。 （９）特許請求の範囲第１項、同第４項または同第５項
   記載のプローブが放射性同位元素、蛍光色素、発光色素
   で標識したＤＮＡまたはＲＮＡプローブ。 （１０）ＤＮＡまたはＲＮＡプローブが酵素、放射性同
   位元素、蛍光色素、発光色素で標識された標識ＤＮＡプ
   ローブまたは標識ＲＮＡプローブ。 （１１）特許請求の範囲第１項、第４項または同第５項
   記載のＤＮＡまたはＲＮＡプローブをコレラ菌と毒性原
   性大腸菌のＤＮＡと交雑する条件下で、試料を接触させ
   、ハイブリッドＤＮＡ複合体の存在を検出することによ
   り試料中のコレラ菌または毒素原性大腸菌を検出する方
   法。 （１２）特許請求の範囲第２項のプラスミドまたは第４
   項のプローブ領域断片と、交雑反応、続いて行う洗浄用
   の試薬と、これらの操作に必要な器具、機器を含むこと
   を特徴とするコレラ菌、毒素原性大腸菌検出用キット。 （１３）酵素標識トリバレントプローブ、交雑反応用試
   薬、試料、洗浄用試薬を含むことを特徴とするコレラ菌
   、毒素原性大腸菌検出用キット。 （１４）酵素標識がＨＲＰ標識である請求項第１３項記
   載のキット。 （１５）酵素標識がアルカリフォスファターゼである請
   求項第１３項記載のキット。