KR100327971B1 - 아미노 말단 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α의 제조방법 - Google Patents
아미노 말단 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 형질전환된 재조합 대장균으로부터 아미노 말단에 존재하는 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 아미노 말단 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α의 제조방법은 부분정제된 재조합 인터페론-α에 아미노펩티다제를 처리하고, 양이온교환 크로마토그래피를 이용하여 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α을 정제하는 공정을 포함한다. 본 발명에 의하면, 체내투여를 목적으로 하는 치료제용 재조합 단백질에 적합하도록, 단일성이 더욱 확실하고 임상적으로 보다 안전한 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α를 간단한 공정을 통하여 제조할 수 있다.
Description
본 발명은 형질전환된 재조합 대장균으로부터 아미노 말단에 존재하는 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α의 제조방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 재조합 인터페론-α에 아미노펩티다제를 처리하여 아미노 말단의 메티오닌을 제거하고, 양이온 교환 크로마토그래피(cation-exchange chromatography)를 이용하여 정제하는 공정을 포함하는, 형질전환된 재조합 대장균으로부터 아미노 말단에 존재하는 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α를 제조하는 방법에 관한 것이다.
유전공학의 발달과 함께, 재조합 미생물을 이용하여 필요한 단백질을 제조하는 방법이 급속도로 발전하여 왔다. 그러나, 일반적으로 유전자 재조합 기술로 발현된 단백질 생산물은 아미노 말단에 그 단백질 생산물의 유전자가 지정하는 아미노산 서열 이외에 추가로 메티오닌(N-met)을 가지는 비천연형의 재조합 단백질이 만들어지며 대장균의 경우도 예외는 아니다. 재조합 단백질은 인체내의 단백질과 동일한 구조를 가지지 못하므로, 체내 투여를 목적으로 하는 치료제용 재조합 단백질을 대장균으로부터 발현하여 생산할 경우, N-met은 숙주로부터 예기치 못했던 면역반응을 유발시키거나, 단백질 자체가 불안정하여 기능을 완전히 수행하지 못하기도 하였다. 예를 들어, 사람의 뇌하수체에서 분비되며 아미노 말단이 페닐알라닌-프롤린-트레오닌(Phe-Pro-Thr)으로 시작되는 191개의 아미노산으로 구성된 인간성장호르몬은 유전자 재조합 방법으로 제조되어 왜소증의 치료에 사용되고 있다. 그러나, 상기의 재조합 인간성장호르몬에는 191개의 아미노산 이외에도 아미노 말단에 메티오닌이 제거되지 않은 채 남아 있는 경우가 많으며, 이러한 메티오닌이 부가된 인간성장 호르몬에의해 예기치 못했던 항체형성이 유발된다는 보고가 있었다.
따라서, 이러한 재조합 단백질의 문제를 해결하기 위하여 다양한 방법들이 개발되어 왔으며, 예를 들면, 아미노 말단에 위치한 메티오닌을 제거하기 위해 재조합 융합단백질을 생산하여 절단하는 방법(참조: WO 89/12678, EP 20209, EP321940)이나, 재조합 단백질을 숙주세포 밖으로 분비되는 과정에서 메티오닌이 절단되도록 하는 방법(참조: EP 008832, USP 4,755,464) 등이 제안된 바 있다. 그러나, 이러한 방법들은 발현벡터의 재조작 및 숙주세포의 형질변환과 같은 추가조작이 필요하고, 발효의 최적화를 위한 조건을 설정해 주어야 한다는 문제점을 노출하였다.
한편, 재조합 단백질의 아미노 말단에 위치하는 메티오닌만을 선택적으로 절단하는 효소인 아미노펩티다제(methionine aminopeptidase)를 이용하여 천연형의 단백질을 제조하는 방법이 제시되었다(참조: WO 86/01229, WO 86/204527, EP6296695, USP 5,569,598). 그러나, 이 방법에 의하면, 재조합 단백질을 비교적 간단하게 천연형의 단백질로 전환시킬 수는 있었으나, 전기 아미노펩티다제가 재조합 단백질에 작용하여 천연형의 단백질로 전환시키기 위해서는, 아미노 말단의 메티오닌만을 제거하고 절단반응을 정지하여야 하며, 소량만으로도 재조합 단백질을 천연형의 단백질로 전환할 수 있어야 함은 물론, 아미노펩티다제의 메티오닌 제거활성이 메티오닌 다음에 오는 인접 아미노산의 종류에 크게 영향을 받는다는 단점을 내포하고 있었다. 따라서, 각각의 재조합 단백질의 구조적, 생화학적 특성에 맞게 효율적으로 아미노 말단의 메티오닌을 제거하고 정제하는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.
이에, 본 발명자들은 대장균으로부터 발현된 재조합 인터페론-α의 아미노 말단 메티오닌을 효율적으로 제거하여, 재조합 단백질로서 단일성이 더욱 확실하고 임상적으로 인체에 보다 안전한 아미노 말단 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α를 제조하기 위해 예의 노력한 결과, 재조합 인터페론-α가 그 구조적인 특이성으로 인해 아미노 말단의 메티오닌만이 선택적으로 제거될 수 있으며, 또한 양이온 교환 크로마토그래피를 통해 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 천연형의 인터페론-α가 손쉽게 정제될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 형질전환된 대장균으로부터 아미노 말단에 존재하는 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 부분정제된 인터페론-α의 등전점분획전기이동법(IEF: iso- electrofocusing)에 의한 젤 사진이다.
도 2는 부분정제된 인터페론-α에 아미노펩티다제(aminopeptidase)처리 후 양이온 교환 크로마토그래피로 분리한 시료의 IEF에 의한 젤 사진이다.
도 3은 부분정제된 인터페론-α의 아미노 말단의 아미노산 서열 분석결과를 보여주는 크로마토그램이다.
도 4는 부분정제된 인터페론-α에 아미노펩티다제 처리 후, 양이온 교환 크로마토그래피로 분리한 시료의 아미노 말단의 아미노산 서열 분석결과를 보여주는 크로마토그램이다.
본 발명의 아미노 말단 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α의 제조방법은 부분정제된 재조합 인터페론-α에 아미노펩티다제를 처리하고, 양이온교환 크로마토그래피를 이용하여 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α를 정제하는 공정을 포함한다.
본 발명에서는 부분정제된 인터페론으로부터 아미노 말단 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α를 제조한다. 후술하는 실시예에서는 형질전환된 재조합 대장균으로부터 봉입체(inclusion body) 형태로 발현된 인터페론-α(참조: 대한민국특허 제 134856호)를 8M 우레아(urea)에 용해시킨 후 다시 활성화(refolding)시키고, Cu2+-킬레이트 세파로오스를 이용한 금속-킬레이트 친화성 크로마토그래피 및 SP 세파로오스를 이용한 이온교환 크로마토그래피를 수행하여 부분정제한 인터페론-α를 채용한 예를 들어 설명하고 있으나, 본 발명의 아미노 말단 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α의 제조방법에서 사용될 수 있는 부분정제된 인터페론-α의 범위는 후술하는 실시예에 국한되지 않고, 다양한 재조합 단백질 발현체로부터 부분정제된 인터페론-α를 포함한다.
부분정제된 인터페론-α 시료의 pH를 조절한 후 ZnCl2를 첨가하고, 아미노펩티다제를 부분정제된 단백질 mg당 0.2 내지 10 unit이 되도록 넣은 후, 20 내지 30℃, 가장 바람직하게는 25℃에서, 12 내지 20 시간, 보다 바람직하게는 14 내지 18 시간, 가장 바람직하게는 16 시간 동안 반응시켜 아미노 말단의 메티오닌을 제거한다. 상기 공정에서 수득한 아미노펩티다제가 처리된 시료의 pH를 4.0으로 낮춘 후, 완충용액으로 2배 희석한 시료를 0.45μm 필터로 여과한 후, 강력한 이온교환성질을 가진 이온교환 수지를 이용하여 양이온 교환 크로마토그래피를 수행한다. 이어, 50 내지 200mM NaCl이 첨가된 완충용액을 이용하여 단계별로 용출시키고, 단계별로 용출된 시료를 등전점분획전기이동법(IEF: isoelectrofocusing)를 이용하여, 아미노 말단의 메티오닌이 완전히 제거된 분획을 확인한 후, 인터페론-α를 수득한다.
아미노펩티다제에 의하여 인터페론-α 의 아미노 말단 메티오닌(N-met)이 특이적으로 제거될 수 있는 것은 인터페론-α의 디설파이드 결합 구조에 기인하며, 인터페론-α은 두 개의 디설파이드 결합(disulfide bond; cys1-cys98, cys29-cys138)를 가진다. 두 개의 디설파이드 결합을 모두 가진 것을 빠른 단위체(fast monomer)라 하고, 그 중 하나(cys29-cys138)만을 가진 것을 느린 단위체(slow monomer)라 하며, 두 가지 형태 모두는 생물학적 활성에 있어서 동일하고 대부분의 인터페론-α은 빠른 단위체로 존재한다. 빠른 단위체의 첫번째 시스테인은 디설파이드 결합에 의하여 98번째 시스테인과 내부결합(internal bridge)을 형성하고 있으므로, 아미노펩티다제 처리에 의하여 N-met이 제거된 이후 효소반응은 정지하게 되며, 이러한 구조적 특이성은 사용한 아미노펩티다제에 의하여 특이적으로 N-met만이 제거될 수 있도록 하는 원리를 제공한다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상적인 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다 .
실시예 1: 부분정제된 인터페론-α의 수득
부분정제된 인터페론-α를 수득하기 위하여, 살모넬라 균주의 L-아라비노스 오페론을 이용한 유도성 발현벡터에 인간의 인터페론-α 유전자가 삽입된 플라즈미드로 형질전환된 재조합 대장균(E.coli△pMAIFNα, KCCM 10053)으로 부터 봉입체(inclusion body) 형태로 발현된 인터페론-α(참조: 대한민국특허 제 134856호)을 8M 우레아(urea) 용액에 용해시킨 후, 점차적으로 희석함으로써 활성화(refolding)과정을 수행하였고, 활성화된 인터페론-α을 흡착용액(1M NaCl을 함유하는 20mM 인산염 완충용액(pH 7.2))으로 평형화된 Cu2+-킬레이트 세파로오스(Cu2+-chelate Sepharose, Pharmacia Biotech, Sweden)에 흡착시킨 후, 5 내지 20mM의 이미다졸(imidazole)로 용출시켰다. 용출된 시료를 한외여과 과정을 통해 농축한 후, 다시 SP 세파로오스(SP Sepharose, Pharmacia Biotech, Sweden)에 붙여 50 내지 250mM의 NaCl로 용출하여 부분정제된 인터페론-α를 수득하였다. 부분정제된 인터페론-α 시료에 있어서 아미노 말단의 아미노산을 492 Protein Sequencer(Perkin Elmer, U.S.A.)를 이용하여 서열분석한 결과, 전체 인터페론-α의 30% 이상이 N-met을 가지고 있음이 확인되었다.
실시예 2: 등전점분획전기이동법을 이용한 인터페론-α의 분리확인
실시예 1에 의해 부분정제된 시료와 pI 표준시료를 pI 범위가 3 내지 9인 IEF 젤(NOVEX, U.S.A.)의 각 웰에 넣은 후, 100V로 1시간, 200V로 1시간, 500V로30분동안 전개하여 IEF 젤 전기영동을 하였다. 음극과 양극에는 각각 음극 완충용액과 양극 완충용액을 넣고, NOVEX 지침서(pp.19-20, NOVEX pre-cast gel instruction)와 동일하게 전개하여, 전개된 IEF 젤을 caps(3-[cyclohexylamino]-1-propane-sulphonic acid) 완충용액(조성: 10mM caps(pH 11), 10% methanol)를 매개로 PVDF 막(Biorad, U.S.A.)에 전기이동(electroblotting)시켰고, 단백질이 이동되어 붙어 있는 PVDF 막을 쿠마씨 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색하여 각각의 밴드 위치를 확인하였다(참조: 도 1). 도 1에서, 레인 1은 부분정제된 인터페론-α이며; 및, 레인 2는 pI 표준시료를 각각 나타낸다. 이때, PVDF 막으로 전기이동된 각 밴드를 잘라내어, 492 Protein Sequencer(Perkin Elmer, U.S.A.)를 이용하여 아미노 말단의 아미노산 서열을 분석하였다(참조: 표 1). 하기 표 1 및 도 1에서 보듯이, 아미노 말단에 메티오닌을 가진 인터페론-α(met-IFN)는 pI 6.2부근의 위쪽 밴드에 높은 비율로 존재하며 중간 밴드와 아래쪽 밴드에는 메티오닌이 완전히 제거된 인터페론-α(IFN)만이 존재하였다. 이로부터, met-IFN와 IFN이 이온교환 크로마토그래피로 분리될 수 있음을 암시하였다.
| 구분 | 아미노산 검출 순서 | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | |
| 위쪽 밴드 | Met | Asp | Leu | Pro |
| 중간 밴드 | X | Asp | Leu | Pro |
| 아래쪽 밴드 | X | Asp | Leu | Pro |
X: 아미노산이 검출되지 않음
실시예 3: 아미노펩티다제 처리
부분정제된 인터페론-α 시료의 pH를 8.0으로 조절한 후, ZnCl2를 0.01 내지 0.1mM이 되도록 첨가하고, 에어로모나스 프로테오리티카(Aeromonas proteolytica)에서 유래한 아미노펩티다제(Sigma, U.S.A.)를 부분정제된 인터페론-α 단백질 mg당 0.2 내지 10 unit이 되도록 넣은 후, 25℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 이어, 실시예 2와 같은 방법으로 IEF 젤 전기영동을 하여 아미노 말단 메티오닌의 제거를 확인하였다(참조: 도 2). 도 2에서 레인 1은 pI 표준시료이며; 레인 2는 부분정제된 인터페론-α 시료; 레인 3은 Resource S로 분리된 인터페론-α 시료; 및, 레인 4는 부분정제된 인터페론-α에 아미노펩티다제를 처리한 시료이다. 도 2에서 보듯이, 상기 방법으로 아미노펩티다제를 처리한 결과, IEF 상에서 met-IFN 밴드가 IFN 밴드로 전환되는 것을 확인하였다.
실시예 4: 양이온교환 크로마토그래피
실시예 3에서와 같이, 아미노펩티다제가 처리된 시료의 pH를 4.0으로 낮춘 후, pH 4.3 내지 5.5인 20mM 제일인산나트륨 완충용액(이하, '완충용액 1'이라 함)으로 2배 희석시키고, 희석된 시료를 0.45μm 필터로 여과한 후 완충용액 1로 평형화(equilibration)시킨 Resource S(Pharmacia Biotech, Sweden) 컬럼을 통과시켰다. Resource S에 붙은 시료를 50 내지 200mM NaCl이 첨가된 완충용액 1을 이용하여 단계별로 용출시키고, 단계별로 용출된 시료를 사용하여 실시예 2와 같이 IEF를 이용하여 met-IFN이 완전히 제거된 분획을 확인하였고(참조: 도 2, 레인 3), 최종적으로 아미노 말단의 아미노산 서열분석을 통하여 공정 전과 후를 비교해 볼 때, N-met 이 완전히 제거된 것을 확인하였다(참조: 도 3, 도 4). 도 3의 아미노 말단의 아미노산 서열분석 결과에서 보듯이, 부분정제된 인터페론-α의 상당부분은 아미노 말단에 메티오닌을 갖고 있음이 확인되었고, 도 4에서 보듯이 아미노펩티다제 처리 후에 Resource S로 분리한 인터페론-α의 첫번째 아미노 말단 서열에서는 아미노산이 검출되지 않았다. 전기와 같은 에드만 분해(Edman degradation) 과정을 통해 서열분석되는 경우 아미노산이 검출되지 않았다는 사실은 상기 공정을 통해 메티오닌이 제거되어, 인터페론-α(IFN)의 첫번째 아미노 말단 서열이 시스테인이 되었다는 것을 의미하며, 이 첫번째 시스테인이 디설파이드 결합을 통한 내부결합(internal bridge)을 형성하여 98번 시스테인과 연결되어 있음에 기인한 것이다. 검출된 두번째 아미노산은 아스파르트산(aspartic acid)이 검출되었으며, 이 결과는 이미 보고된 바와 일치하는 것이었다(참조: H.S. Park, Korean Biochem.J., Vol.20, No.4, pp.336-344, 1987).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해서 정의된다고 할 것이다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 형질전환된 재조합 대장균으로부터 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 의하면, 체내투여를 목적으로 하는 치료제용 재조합 단백질에 적합하도록, 단일성이 더욱 확실하고 임상적으로 보다 안전한 아미노 말단의 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α를 간단한 공정을 통하여 제조할 수 있다.
Claims (6)
- 재조합 대장균(E.coli△pMAIFNα, KCCM 10053)으로부터 발현된 봉입체 형태의 재조합 인터페론-α에 유레아를 처리하여 활성화시킨 후, 에어로모나스 프로테오리티카(Aeromonas proteolytica)에서 유래한 아미노펩티다제를 처리하고, 20 내지 30℃, 12 내지 20 시간 동안 반응시킨 다음, Resource S 수지를 채용한 양이온교환 크로마토그래피에 적용하고, 50 내지 200mM NaCl이 첨가된 pH 4.3 내지 5.5인 20mM 제일인산나트륨 완충용액을 이용하여 용출시켜서, 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α을 정제하는 공정을 포함하는 아미노 말단 메티오닌이 제거된 재조합 인터페론-α의 제조방법.
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