KR100371864B1 - 고정화아미노펩티다제엠반응기를이용한천연형인간성장호르몬의생산방법 - Google Patents
고정화아미노펩티다제엠반응기를이용한천연형인간성장호르몬의생산방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100371864B1 KR100371864B1 KR1019950023422A KR19950023422A KR100371864B1 KR 100371864 B1 KR100371864 B1 KR 100371864B1 KR 1019950023422 A KR1019950023422 A KR 1019950023422A KR 19950023422 A KR19950023422 A KR 19950023422A KR 100371864 B1 KR100371864 B1 KR 100371864B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- growth hormone
- human growth
- reaction solution
- methionyl human
- column reactor
- Prior art date
Links
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 title claims abstract description 59
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 title claims abstract description 59
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 102100022749 Aminopeptidase N Human genes 0.000 title claims abstract description 21
- 108010049990 CD13 Antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 73
- 108700031632 somatrem Proteins 0.000 claims abstract description 60
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 33
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims abstract description 16
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 claims abstract description 12
- GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L cobalt dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co+2] GVPFVAHMJGGAJG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 abstract description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 5
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 5
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 5
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 5
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 5
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 1
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101000886298 Pseudoxanthomonas mexicana Dipeptidyl aminopeptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 102000048386 human GH2 Human genes 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 208000003068 pituitary dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/10—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a carbohydrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/11—Aminopeptidases (3.4.11)
- C12Y304/11002—Membrane alanyl aminopeptidase (3.4.11.2), i.e. aminopeptidase N
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
메치오닐 인간성장호르몬의 N-말단 메치오닌을 제거함으로써 천연 인간성장호르몬과 동일한 아미노산 배열을 갖는 천연형 인간성장호르몬을 제조하는데 있어서, 고정화 아미노펩티다제 엠을 충진한 컬럼반응기에 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액을 연속적으로 통과시켜 반응기를 통과하는 동안 반응기 내에서 천연형 인간성장호르몬으로 전환되어 반응기에서 나오는 유출액 중에 천연형 인간성장호르몬이 생성되게 하는 천연형 인간성장호르몬의 연속생산 방법은 전환율, 전환속도 등이 우수하며, 제조원가가 저렴하다.
Description
[산업상 이용분야]
본 발명은 유전자재조합에 의해 생산된 메치오닐 인간성장호르몬(methionyl human growth hormone)으로부터 천연형 인간성장호르몬을 연속 생산할 수 있는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 유전자재조합에 의해 제조된 메치오닐 인간성장호르몬의 N-말단 메치오닌을 제거함으로써 천연형과 동일한 아미노산 배열을 갖는 재조합 인간성장호르몬을 제조하는 데 있어서 고정화 아미노펩티다제 엠을 충진한 컬럼반응기를 이용하여 N-말단 메치오닌을 제거한 천연형 인간성장호르몬을 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.
[종래 기술]
인간성장호르몬은 사람의 뇌하수체에서 생성되는 191개의 아미노산으로 구성된 분자량 약 22,000의 펩타이드호르몬으로 주로 소아의 뇌하수체성 왜소증 치료에 사용되어 왔다(Endocrinol. Rev. 4, 155, 1983).
종래에는 뇌하수체에서 추출한 인간성장호르몬이 사용되었으나, 그 양이 제한되어 치료를 받을 수 있는 사람이 극히 제한되었다. 또한 뇌하수체 유래 인간성장호르몬을 사용한 환자중 치명적 신경계 질환인 Creutzfeldt-Jacob 질병이 발생된 예가 보고되어 뇌하수체 유래 인간성장호르몬의 사용은 중단되었다(Neuropathol. Applied Neurobiol. 12, 509, 1986).
최근에는 유전공학기술이 발전함에 따라 대장균, 효모 등에서 인간성장호르몬의 생산에 성공하였으며(Nature 281, 544, 1979; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5956, 1984; Gene 39, 117, 1985), 유전공학방법으로 대장균에서 생산된 재조합 인간성장호르몬은 독성 및 임상시험을 거쳐 1985년 미국의 Genentech사가 FDA의 허가를 획득하여 시판하였다.
그러나 이와 같이 대장균 또는 효모에서 생산된 인간성장호르몬은, 천연형 인간성장호르몬과 달리, N-말단에 단백질 합성 개시코돈(codon)인 AUG에서 유래한 메치오닌이 하나 더 첨가된 메치오닐 인간성장호르몬이 생산된다. 메치오닐 인간성장호르몬은 왜소증 치료 효과에서 뇌하수체 유래 인간성장호르몬과 생물학적 활성이 동등하였으며 심각한 부작용은 나타내지 않았으나, 성장호르몬에 대한 항체의 생성 정도가 비교적 높게 나타났다(Lancet i, 697, 1986; Archiv. Disease in Childhood, 62, 776, 1987; Acta Paediatr. Scand. 337 (suppl.), 130, 1987).
따라서 재조합 인간성장호르몬의 제조과정에서 N-말단의 메치오닌이 없는 천연형 인간성장호르몬을 제조하고자 하는 많은 시도가 있었다. 상기한 바와 같이 N-말단에 부수적인 아미노산이 없는 천연형 인간성장호르몬을 생산하기 위한 방법으로는, 'Ala-Glu-hGH' 형태 또는 'Ile-Glu-Gly-Arg-hGH' 형태의 인간성장호르몬의 N-말단에 수개의 아미노산이 추가된 형태로 인간성장호르몬을 생산한 후 디펩티딜아미노펩티다제 IV 또는 Factor Xa와 같은 특수한 프로테아제(protease)를 이용하여 부수적인 아미노산을 절단하는 방법(WO 86/04609; Biotechnology 5, 161, 1987; J, Biotechnol. 18, 41, 1991), 성장호르몬이 세포 내에서 생합성된 후 세포의 주변질 또는 배양액 중으로 분비되면서 N-말단의 메치오닌이 제거되도록 하여 천연형 인간성장호르몬을 제조하는 방법(USP 4755465; Biotechnology 4, 991, 1986; Gene 55, 189, 1987; Gene 54, 197, 1987), 메치오닐 인간성장호르몬에 아미노펩티다제를 작용시켜 N-말단 메치오닌을 제거하여 천연형 인간성장호르몬을 제조하는 방법 등이 제시되었다(WO 86/01229; EP 204527 A1; KP 출원 92-25910).
그러나, 상기한 'Ala-Glu' 또는 'Ile-Glu-Gly-Arg'의 아미노산이 추가된 형태의 인간성장호르몬은 숙주 세포에서 발현시킬 경우 그 발현 수율이 전체 단백질에 대하여 각각 20 % 및 5 %로 그 수율이 N-말단에 메치오닌이 추가된 형태의 인간성장호르몬의 경우에 비하여 매우 낮다는 문제점이 있으며, 분비되면서 천연형 인간성장호르몬을 생산하는 방법 역시 발현 수율이 6 내지 10 %로 낮다는 문제점이 있다.
상기한 바와 같이 메치오닌이 첨가된 형태가 아닌 인간성장호르몬을 생산할 경우 수율이 낮음에 따라 N-말단에 메치오닌이 추가된 형태의 인간성장호르몬으로부터 메치오닌을 제거하는 방법이 많이 개발되었는데, 그와 같은 방법으로는 아미노펩티다제로 처리하는 방법 또는 아미노펩티다제엠으로 처리하는 방법이 알려져 있다(Biotechnology 5, 824, 1987; EP 204 527 A1). 그러나 상기한 아미노펩티다제 또는 아미노펩티다제 엠으로 처리하는 방법 역시 만족할 만한 처리 효율을 얻을 수 없다는 단점이 있고, 또 상기의 아미노펩티다제를 이용하는 방법들은 용해된(soluble) 상태로 아미노펩티다제를 이용하기 때문에 효소의 재사용을 위해서는 반응액에서 효소를 분리하거나 반응결과 생성된 천연형 인간성장호르몬의 정제시 효소를 제거해야하는 부가적 노력이 필요하여 정제비용이 증가한다는 단점이 있다.
[본 발명이 해결하려 하는 과제]
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 첫째 메치오닐 인간성장호르몬으로부터 천연형 인간성장호르몬을 고효율로 연속적으로 생산하는 방법을 제공하고, 둘째 아미노펩티다제 엠을 재사용함으로써 메치오닐 인간성장호르몬으로부터 천연형 인간성장호르몬을 저렴하게 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
[과제를 해결하기 위한 수단]
일반적으로 적당한 담체에 고정화된 효소는 효소를 재사용하여 효소를 경제적으로 이용할 수 있으며 효소와 생성물과의 분리가 용이하다는 장점이 있으며 고정화 효소는 여러가지 형태의 반응기를 이용할 수 있다는 장점이 있다(Methods Enzymol., 44, 1, 1976).
고정화 효소 반응기는 교반탱크 반응기, 충진층 반응기, 유동층 반응기 등이 있는데, 운전의 간편성, 높은 효율, 장치의 단순성 등의 이유로 대규모 상업화 운전에서 가장 많이 이용되는 고정화 효소 반응기는 충진층 반응기이다. 층진층 반응기는 제작비가 비교적 싸고 반응 단위 부피당 효소량이 비교적 많아 단위 부피당 생산성이 높다는 장점이 있으며 생성물의 축적으로 인한 생성물에 의한 반응 저해가 최소화되어 연속 생산을 위한 우수한 반응기로 알려져 있다(Science, 232, 1396, 1986).
본 발명자들은 고정화 아미노펩티다제 엠을 충진한 층진층 반응기 형태의 컬럼 반응기를 제작하였으며, 컬럼반응기에서 메치오닐 인간성장호르몬으로부터 천연형 인간성장호르몬을 생산하는 것이, 특히 연속적으로 생산하는 것이, 교반반응기에서 회분식으로 생산하는 방법보다 전환율과 생산 수율이 우수하고, 반응기 크기를 증가시켰을 때도 생산성이 우수하게 유지된다는 것을 발견하게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 유전자재조합을 이용하여 메치오닐 인간성장호르몬을 생산하고, 상기 메치오닐 인간성장호르몬의 N-말단 메치오닌을 제거하는 공정을 포함하는 천연 인간성장호르몬과과 동일한 아미노산 배열을 갖는 천연형 인간성장호르몬의 제조방법에 있어서, 상기한 메치오닐 인간성장호르몬의 N-말단 메치오닌을 제거하는 공정은 고정화 아미노펩티다제 엠을 충진한 컬럼반응기에 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액을 첨가하여 제거하는 것임을 특징으로 하는 천연형 인간성장호르몬의 제조방법을 제공한다.
상기한 본 발명에 있어서, 상기 컬럼반응기의 반응온도는 45℃ 내지 55℃인 것이 바람직하다. 그리고 상기 반응용액은 pH는 6.5 내지 7.5의 완충용액을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 반응용액은 150mM의 염화칼륨과 1mM의 염화코발트를 더욱 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 또한 상기 반응용액에서 메치오닐 인간성장호르몬의 농도는 1.0mg/ml 내지 8.0mg/ml인 것이 더욱 바람직하다.
상기한 본 발명에 있어서, 상기 컬럼반응기에 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액을 첨가하는 방법은, 공급하는 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액을 컬럼반응기에 연속적으로 공급하고, 컬럼반응기 내에서 반응한 반응용액을 연속적으로 유출하는 것이 바람직하며, 상기 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액의 공급 속도와 컬럼반응기 내에서 반응한 반응용액의 유출 속도를 동일하게 하는 것이 더욱 바람직하며, 이 때 상기 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액의 공급 속도는 SV 0.1hr-1내지 2.5hr-1의 유속 범위인 것이 바람직하다.
[실시예]
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 아미노펩티다제 엠(aminopeptidase M)을 셀루핀 포르밀(cellufine formyl)에 고정화시킨 고정화 아미노펩티다제 엠을 충진한 컬럼반응기에 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액을 연속적으로 통과시켜 반응기를 통과하는 동안 반응기 내에서 N-말단의 메치오닌이 제거됨으로써 천연형 인간성장호르몬으로 전환되어 반응기에서 나오는 유출액 중에 천연형 인간성장호르몬이 생성되게 하는 천연형 인간성장호르몬의 연속생산 방법을 제공하는 것이다.
상기의 고정화 아미노펩티다제 엠을 충진한 컬럼반응기의 전체적인 장치는 제1도에 나타내었다. 물 자켓(Water jacket)(5)이 부착된 유리 컬럼 내부에 지지망(8)이 붙어있는 하부의 위치조절기(7)의 위치를 고정한 후 그 위에 고정화 아미노펩티다제 엠(6)을 충진하고 상부의 위치조절기(7)로 충진 수준을 조절한 후 연결고리(9)로 고정시켰다. 항온 수조(3)와 순환 펌프(4)로 컬럼 주변의 물 자켓(5)으로 온도 조절된 물을 순환시켰으며, 반응용액 저장용기(1)에 들어있는 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액은 정량 펌프(peristaltic pump)(2)를 이용해 컬럼 상부로 공급하였고 컬럼 하부로 나오는 반응액은 자외선 검출기(10)를 거친 후 생성물 저장용기(12)에 모이게 하였다. 검출기의 파장 280nm에서 컬럼반응기에서 나오는 반응용액의 흡광도를 기록기(11)에 기록하였다. 컬럼반응기에 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액이 공급되면서 유출액의 흡광도 값이 증가하여 일정시간 경과 후에 흡광도 값이 일정하게 유지되는데 이 때를 반응기의 정상상태(steady-state)로 하였으며 모든 분석은 정상상태에서 수행하였다.
상기의 메치오닐 인간성장호르몬은 통상의 정제 방법으로 얻어진 모든 메치오닐 인간성장호르몬을 사용할 수 있으며, 고정화 아미노펩티다제 엠으로는 본 출원인에 의해 본 출원과 동일자로 출원된 대한민국 특허출원(발명의 명칭: 고정화 아미노펩티다제 엠을 이용한 천연형 인간성장호르몬의 제조방법)에 명시된 것으로 셀루핀 포르밀 g당 1.1 내지 11.2 mg의 아미노펩티다제 엠이 고정화된 것이다.
본 발명에 따르면, 컬럼반응기의 온도는 45 ℃ 내지 55 ℃로 유지하는 것이 바람직하다. 상기한 온도 범위를 벗어날 경우 메치오닐 인간성장호르몬이 천연형 인간성장호르몬으로 전환되는 전환율이 감소할 수 있다. 그리고 반응용액중의 메치오닐 인간성장호르몬의 농도는 1.0 내지 8.0 mg/ml이 되도록 하고 반응용액의 SV(space velocity: 유속(ml/hr)을 반응기부피(ml)로 나눈 값)로 0.1 내지 2.5 hr-1로 하는 것이 바람직하다. 상기한 농도 및 유속의 범위를 벗어날 경우 전환율이 상대적으로 낮아질 수 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 그러나 하기한 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
컬럼 반응기에서 메치오닐 인간성장호르몬의 천연형 인간성장호르몬으로의 연속 전환
고정화 아미노펩티다제 엠 7.2ml을 1.0×9.2cm의 컬럼에 충진하여 제1도의 컬럼반응기를 제작하고 완충액(50mM 테스ㆍ염산, pH7.0, 0.15M 염화칼륨, 1mM 염화코발트)으로 세척하였다. 같은 완충액에 메치오닐 인간성장호르몬을 2mg/ml이 되도록 녹인 반응용액을 유속 0.5 SV hr-1로 공급하였으며, 정상상태에 도달한 후 반응유출액을 릭긴(Riggin) 등의 방법(Anal. Biochem., 167, 199, 1987)에 따라 RP-HPLC로 분석하여 메치오닐 인간성장호르몬의 전환율과 천연형 인간성장호르몬의 생성 수율을 계산하였다. 이매 반응기의 온도를 30℃에서 70℃까지 변화시켰을 때 제2도에서 보는 바와 같이 55℃ 이상의 온도에서 메치오닐 인간성장호르몬은 천연형 인간성장호르몬으로 100% 전환되었으며, 천연형 인간성장호르몬의 수율은 50℃ 내지 55℃에서 약 80%로 가장 높았다.
실시예 2
교반반응기와 컬럼반응기에서의 전환율과 수율의 비교
교반반응기 실험에서는, 고정화 아미노펩티다제 엠 4.0ml을 완충액으로 세척한 후 16ml의 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액(메치오닐 인간성장호르몬의 농도 2mg/ml, 50mM 테스ㆍ염산 완충액, pH7.0, 0.15M 염화칼륨, 1mM 염화코발트)을 가하여 45℃ 배양기에서 교반하면서 반응시킨 후 일정 시간 경과 후에 시료를 취하여 그 상등액을 RP-HPLC로 분석하였다. 컬럼반응기에서는, 4.0ml의 고정화 아미노펩티다제엠을 충진하여 1.0×2.5cm 크기의 컬럼 반응기를 제1도에서와 같이 제작하고 온도를 45℃로 유지하면서 교반반응기에서와 같은 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액을 컬럼반응기에 0.46, 0.92, 1.38, 1.84, 2.30ml/hr의 속도로 연속으로 공급하였다. 각 유속에서 정상상태에 도달하였을 때 시료를 취하여 분석하였다. 교반반응기와 컬럼반응기에서 얻어진 결과를 비교하기 위하여 교반반응기에서 회분식으로 반응시킨 반응용액을 컬럼반응기에서 연속적으로 반응시키는데 소요되는 시간을 계산하였으며, 두 반응기에서 얻어진 결과를 제3도에 나타내었다. 교반반응기에서 38시간에 전환율이 100%였고 천연형 인간성장호르몬의 수율은 71.4%인 반면 컬럼반응기에서는 유속 0.46ml/hr 에서 전환율이 100%이었고 수율은 71.8%이었다. 즉 회분식에서 반응시킨 반응용액(16ml)을 컬럼반응기에서는 34.8 시간에 100% 전환시킬 수 있으며 수율은 71.8%가 된다. 컬럼반응기에서 여러가지 유속에 대하여 동일한 방법으로 환산하여 비교하면(제3도) 회분식 교반반응에서 14시간 후, 24시간 후의 전환율이 각각 66.0%, 90.6%이었고 수율이 54.7%, 70.3%이었는데, 컬럼반응기에서 전환율이 66.0%, 90.6%인 경우 소요시간이 9시간, 14시간이었으며 이 때의 수율은 약 57.5%, 74.5%로 나타났다. 이러한 결과에서 컬럼반응기에서 연속적으로 메치오닐 인간성장호르몬을 전환시키는 방법이 회분식 교반반응 방법보다 우수하다는 것을 알 수 있다.
실시예 3
컬럼반응기에서 메치오닐 인간성장호르몬의 농도와 유속의 영향
실시예 2에서와 같은 크기의 컬럼반응기에서 온도를 45℃로 유지하고 메치오닐 인간성장호르몬의 농도를 1.0 내지 8.0mg/ml로 변화시키고 반응용액의 공급 속도를 SV 0.25∼2.50 hr-1로 변화시켰을 때 메치오닐 인간성장호르몬의 천연형 인간성장호르몬으로의 전환율과 생산 수율의 변화를 검토한 결과를 제4도와 제5도에 나타내었다. 메치오닐 인간성장호르몬의 농도가 1.0mg/ml에서는 유속 SV 1.0 hr-1이하에서, 2mg/ml에서는 SV 0.5 hr-1이하에서, 4mg/ml에서는 SV 0.25 hr-1에서 각각 천연형 인간성장호르몬으로 100% 전환되었으며, 8mg/ml에서는 100% 전환되지는 않았으나 유속이 느린 경우에 전환율이 높은 것을 알 수 있으며(제4도), 메치오닐 인간성장호르몬이 전환되어 천연형 인간성장호르몬이 생성되는 수율은 메치오닐 인간성장호르몬의 농도가 1mg/ml인 경우 100% 전환되는 유속 SV 1.0 hr-1일 때 81.0%로 나타났으며, 2mg/ml의 경우 76.8%, 4mg/ml인 경우 77.7%의 수율을 나타내었다(제5도). 메치오닐 인간성장호르몬의 전환율이 100% 일때 천연형 인간성장호르몬의 생산성(productivity)를 계산하면 메치오닐 인간성장호르몬의 농도가 1mg/ml, 2mg/ml, 4mg/ml인 경우 각각 0.81, 0.77, 0.78 mg/mlㆍh 이었다.
실시예 4
컬럼반응기 크기의 영향
고정화 아미노펩티다제 엠의 충진 부피 1.96ml(1.0×2.5cm) 컬럼반응기와 5배 크기의 9.82ml (1.0×12.5cm) 컬럼반응기를 제1도와 같이 제작하고 45℃로 유지하면서 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액(메치오닐 인간성장호르몬 2mg/ml, 50mM 테스ㆍ염산 완충액, 0.15M 염화칼륨, 1mM 염화코발트)을 유속 SV 0.5∼2.0hr-1로 동일하게 연속으로 공급하였을 때 메치오닐 인간성장호르몬의 천연형 인간성장호르몬으로의 전환율과 수율을 검토하였다. 제6도에서 보는 바와 같이 두 개의 컬럼반응기에서 연속으로 생산할 때 유속 SV 값이 같을 때 SV 값의 변화에 관계없이 메치오닐 인간성장호르몬의 전환율과 천연형 인간성장호르몬의 생산수율이 거의 같은 값으로 나타나, 반응기 크기에 관계없이 생산성이 일정하게 유지되는 것을 알 수 있었다.
[효 과]
상기한 바와 같이 본 발명에 따라 메치오닐 인간성장호르몬을 천연형 인간성장호르몬으로 전환시킬 경우, 다른 방법에 따라 전환시키는 경우에 비하여 전환율, 전환속도가 월등히 우수하였으며, 연속적으로 전환이 가능하여 훨씬 경제적으로 천연형 인간성장호르몬을 제조할 수 있다.
제 1도는 고정화 아미노펩티다제 엠을 충진한 컬럼 반응기와 주변 장치를 나타내는 도면이고,
제 2도는 컬럼반응기에서 메치오닐 인간성장호르몬을 천연형 인간성장호르몬으로 연속적으로 전환시킬 때 온도변화에 따를 전환율과 수율의 변화를 나타내는 그래프이고,
제 3도는 컬럼 반응기와 회분식 반응기에서 메치오닐 인간성장호르몬의 천연형 인간성장호르몬으로의 전환율과 수율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이고,
제 4도는 컬럼반응기에서 천연형 인간성장호르몬을 연속적으로 생산할 때 반응 용액 중의 메치오닐 인간성장호르몬의 농도와 반응용액의 유속의 변화에 따른 전환율의 변화를 나타내는 그래프이고,
제 5도는 컬럼 반응기에서 천연형 인간성장호르몬을 연속적으로 생산할 때 반응 용액 중의 메치오닐 인간성장호르몬의 농도와 반응용액의 유속의 변화에 따른 수율의 변화를 나타내는 그래프이고,
제 6도는 컬럼반응기의 크기를 증가시켰을 때 크기가 다른 두개의 반응기에서 천연형 인간성장호르몬의 전환율과 수율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
Claims (8)
- 유전자재조합을 이용하여 메치오닐 인간성장호르몬을 생산하고, 상기 메치오닐 인간성장호르몬의 N-말단 메치오닌을 제거하는 공정을 포함하는 천연 인간성장호르몬과 동일한 아미노산 배열을 갖는 천연현 인간성장호르몬의 제조방법에 있어서, 상기한 메치오닐 인간성장호르몬의 N-말단 메치오닌을 제거하는 공정은 셀루핀 겔에 고정화시킨 고정화 아미노펩티다제 엠을 충진한 컬럼 반응기에 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액을 첨가하여 제거하는 것임을 특징으로 하는 천연형 인간성장호르몬의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 컬럼반응기의 반응온도는 45℃ 내지 55℃인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 반응용액은 pH는 6.5 내지 7.5의 완충용액을 포함하는 제조방법.
- 제3항에 있어서 , 상기 반응용액은 150mM의 염화칼륨과 1mM의 염화코발트를 더욱 포함하는 것인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 반응용액에서 메치오닐 인간성장호르몬의 농도는 1.0mg/ml 내지 8.0mg/ml인 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 컬럼반응기에 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액을 첨가하는 방법은, 공급하는 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액을 컬럼반응기에 연속적으로 공급하고, 컬럼반응기 내에서 반응한 반응용액을 연속적으로 유출하는 것인 제조방법.
- 제6항에 있어서, 상기 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액의 공급속도와 컬럼반응기 내에서 반응한 반응용액의 유출 속도를 동일하게 하는 것인 제조방법.
- 제7항에 있어서, 상기 메치오닐 인간성장호르몬 반응용액의 공급 속도는 SV 0.1hr-1내지 2.5hr-1의 유속범위인 제조방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019950023422A KR100371864B1 (ko) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | 고정화아미노펩티다제엠반응기를이용한천연형인간성장호르몬의생산방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019950023422A KR100371864B1 (ko) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | 고정화아미노펩티다제엠반응기를이용한천연형인간성장호르몬의생산방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR970006493A KR970006493A (ko) | 1997-02-21 |
| KR100371864B1 true KR100371864B1 (ko) | 2003-06-02 |
Family
ID=37416533
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1019950023422A KR100371864B1 (ko) | 1995-07-31 | 1995-07-31 | 고정화아미노펩티다제엠반응기를이용한천연형인간성장호르몬의생산방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100371864B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0204527A1 (en) * | 1985-06-04 | 1986-12-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Removal of the N-terminal methionine from methionylproteins |
-
1995
- 1995-07-31 KR KR1019950023422A patent/KR100371864B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0204527A1 (en) * | 1985-06-04 | 1986-12-10 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Removal of the N-terminal methionine from methionylproteins |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR970006493A (ko) | 1997-02-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110305223B (zh) | 重组串联融合蛋白制备目标多肽的方法 | |
| KR20070092218A (ko) | 변형된 성장 호르몬 | |
| CN110128552A (zh) | 一种融合蛋白及其制备利拉鲁肽中间体多肽的方法 | |
| JPH01502746A (ja) | インシュリン向性ホルモン | |
| JP2012016354A (ja) | アミド化生成物の調製に有用な酵素を発現させるための細胞株 | |
| WO1990015142A1 (en) | Growth hormone fusion proteins | |
| CN101268097A (zh) | 通过特异的内切蛋白酶对带有碱性氨基酸c-末端的多肽进行酰胺化的方法 | |
| CN112584853B (zh) | 一种新型门冬胰岛素原的结构和制备门冬胰岛素的方法 | |
| CN110498849A (zh) | 一种索玛鲁肽主肽链及其制备方法 | |
| EP2374888A1 (en) | Method for producing human recombinant insulin | |
| US5783558A (en) | Parathormone fragments, their preparation and medicaments containing these | |
| CZ290079B6 (cs) | Způsob produkce inzulinu a meziprodukt pro tento způsob | |
| US5434135A (en) | Growth factor compositions, preparation and use | |
| WO1996007744A1 (en) | A method of improved production of insulin-like growth factor | |
| KR100371864B1 (ko) | 고정화아미노펩티다제엠반응기를이용한천연형인간성장호르몬의생산방법 | |
| BG99844A (bg) | Днк последователности,кодиращи нови биосинтетични предшественици на инсулин и метод за получаване на инсулин | |
| AU705192B2 (en) | Method for producing a correctly folded, biological active recombinant protein | |
| JPH05310789A (ja) | 安定性の改善された新規な合成イソヒルジン | |
| EA022946B1 (ru) | Способ получения инсулина аспарт при помощи штамма дрожжей pichia pastoris | |
| AU660421B2 (en) | Growth factor compositions, preparation and use | |
| CN112646044A (zh) | TFF2-Fc融合蛋白及其高效表达生产方法 | |
| JPH0819397A (ja) | 生理活性ペプチド製造方法およびその産生細胞 | |
| US6590072B2 (en) | Method for extractive refolding of scrambled single-chain polypeptides | |
| KR100754235B1 (ko) | 수성 용매에 저장하는 동안 복합 혼합물중 단백질을안정화시키는 방법 | |
| EP1543031B1 (en) | Monomeric insulin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20121231 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131226 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20141211 Year of fee payment: 13 |