BG99844A - Днк последователности,кодиращи нови биосинтетични предшественици на инсулин и метод за получаване на инсулин - Google Patents

Днк последователности,кодиращи нови биосинтетични предшественици на инсулин и метод за получаване на инсулин Download PDF

Info

Publication number
BG99844A
BG99844A BG99844A BG9984495A BG99844A BG 99844 A BG99844 A BG 99844A BG 99844 A BG99844 A BG 99844A BG 9984495 A BG9984495 A BG 9984495A BG 99844 A BG99844 A BG 99844A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
insulin
dna sequence
transformed
cells
dna
Prior art date
Application number
BG99844A
Other languages
English (en)
Other versions
BG62336B1 (bg
Inventor
Silvija Mestric
Peter J Punt
Radovan Valinger
Den Hondel Cees A Van
Original Assignee
Pliva Pharm & Chem Works
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pliva Pharm & Chem Works filed Critical Pliva Pharm & Chem Works
Publication of BG99844A publication Critical patent/BG99844A/bg
Publication of BG62336B1 publication Critical patent/BG62336B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до ДНК последователности, кодиращи инсулинови предшественици с формула B-Pg-A, където В и А представляват съответно В- и А- вериги, Pg представлява модифициран С-пептид или няка къв брой от аминокиселини, съдържащ най-малко един N-гликозилационен противоположен сайт. Изобретението се отнася също до метод за получаване на инсулин чрез култивиране на подходящи клетки, за предпо читане плесенни (фунги) клетки, трансформирани с вектор, съдържащ ДНК последователност, кодираща инсулинов предшественик с дадена формула. Изобретението се отнася също до ДНК последователности, кодира щи фармацевтични пептиди и протеини, в които N- гликозилационен противоположен сайт е въведен в неосновен сайт в която и да е спейсер област за висока експресия и секреция на протеини. 13 претенции , 12 фигури

Description

Това изобретение се отнася до ДНК последователности, кодиращи нови биосинтетични инсулинови предшественици и до метод за получаване на инсулин чрез култивиране на трансформирани клетки, съдържащи такива ДНК последователности.
Предшестващо състояние на техниката
Инсулинът е хормон, чиято основна роля е да контролира пренасянето на глюкозата от кръвния ток в клетките, където той се обменя чрез метаболизъм.
Инсулинът е съставен от две вериги от аминокиселини: А-верига, състояща се от 21 аминокиселини и В-верига, включваща 30 аминокиселини. Веригите са свързани една с друга чрез две дисулфидни мостови Връзки. Трета дисулфидна мостоВа връзка се намира вътре в А-веригата.
Основната форма на инсулиновата молекула е синтезирана като насцентна полипептидна верига, наречена препроинсулин, който е съставен от сигнален пептид и проинсулин. Сигналният пептид насочва насцентната верига през ендоплазмичния ретикулум (мрежеста ретикулярна тъкан). Проинсулинът се получава от препроинсулин в кухата поВърхност от ендоплазмичния ретикулум, веднага щом като полипептидната верига премине през мембраната. Проинсулинът съдържа полипептидна верига, Включваща Верига от 35 аминокиселини, която не присъства в инсулина. Този свързващ пептид или С-пептида съединява С-краят на В-веригата към N-края на А-веригата в бъдещата инсулинова молекула. От кухата повърхност на ендоплазмичния ретикулум, проинсулинът се изпраща в Golgi апарата, където започва протеолизата на свързващия пептид. СвързВащият или С-пептидът се измества от ензимна система подобно на трипсин/ карбоксипептидазната В-система, която действа на две следващи една след друга основни аминокиселинни последователности и се продуцира инсулин (Steiner et al., J. Cell Biol., 24 (1984) 121-130).
Значението на C-nenmuga е, че той свързва В- и A-Веригите така, че позволява да се създаде устойчива структура на дисулфидните мостови връзки в инсулиновата молекула (Bell et al., Nature, 284 (1980) 26-32) или че той насочва трипсина - като превръщащ ензим да репродуцира проинсулин сайт с двете основни аминокиселини (Thim et al., PNAS, 83 (1986) 6766-6770).
Продуцирането на биосинтетичен човешки инсулин беше описано главно при бактериите Escherichia coli и дрождите Saccharomyces cerevisiae. Общото за всички тях е, че ДНК последователността кодира и по единия, и по другия начин чист проинсулин, модифицирана част от проинсулин или отделно за А- и В-Веригите.
В бактерия Е. coli инсулин се продуцира или чрез отделяне на А- и Вверигите (Chance et al., Diabetes Care, 4/1982) 147-154) или като проинсулин (EP 55945).
В дрождите 5. cerevisiae инсулин се продуцира чрез проинсулин, досега с много нисък добив (ЕР-А 121 884). Различни модификации на С-пептида подобряват добива и устойчивата структура на инсулиновата молекула в дрождите.
Инсулиновите предшественици от формула В-Х-А, където В и А означават В- и А-веригите и X означава пептид, съдържащ от 2 до 35 аминокиселини, са описани в DK-A 5284/87.
Инсулинови предшественици от формула В-Х-У-А, където В и А означават В- и А-веригите и X и У Всяка означава лизин или аргинин, са описани в ЕР-А 195 691.
В ЕР-А 163 529 са описани инсулинови предшественици, съдържащи пептидната верига В (1-29) - А (1-21), свързана с къс пептид, имащ 2 до 8 аминокиселини. Модификациите на des-B(30) инсулинови предшественици от формула В (1-29) - X, - Х2 - У2 - У, - А (1-21) са описани в ЕР-А 347 845.
В ЕР 249 350 са описани глюкоамилазен стимулатор и сигнална последователност за отделяне на протеини във фунги като гостоприемници. Така например, експресивен проинсулинов тример беше Вмъкнат също В такъв експресионен Вектор.
Много полипептиди за терапевтична или диагностична употреба, например еритропоетин, tPA и фактор VIII са N-гликозилирани (Parekh et al., TIBTECH, 1 (1989) 117-121).
Описан е също тройно увеличен добив на бичешки химозин (гликохимозин) във фунги A. niger var. awamori, постигнат чрез въвеждането на N-гликозилационен противоположен сайт в кодирана последователност. Чрез стопилка на прохимозин и глюкоамилазен ген се постига даже по-висок добив, но чрез стапяне на гликохимозин в глюкоамилаза не бе постигнато по-нататъшно увеличаване на добива (Berka et al., Biochem. Soc. Trans, 19 (1991) 681-685).
В случай на аспергинова протеиназа (ренин), който е от микробиален произход и служи като заместител на химозина, беше наблюдавано, че хипергликозилирането може да намали ензимната активност, ако тя настъпва в критичния сайт на молекулата (Berka et al., Biochem. Soc. Trans. 19 (1991) 681-685; Aikawa et al., Biol. Chem. 265 (1990) 13955-13959).
Мутация на гликозилиран аспаргин в кодираната област от ренин води до значително намаляване на секрецията в дрождени клетки (Aikawa et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 13955-13959).
Същност на изобретението
Обект на изобретението са ДНК последователности, кодиращи нови биосинтетични инсулинови предшественици и използване на еукариотни клетки, по-специално плесенни клетки за получаване на инсулин.
Предметът на изобретението беше осъществен посредством ДНК последователност, съдържаща кодирана последователност за инсулинови предшественици от формулата B-Pg-A, където В и А представляват В- и А-вериги респективно и Pg представлява модифициран С-пептид или някакъв брой от аминокиселини, съдържащи най-малко един Nгликозилационен противоположен сайт. Pg свързва В- и А-веригите чрез протеолитични процесинг (произвеждащи) сигнали или специфични химически раздробени сайтове.
Модификацията на проинсулиновия ген се предпочита чрез създаВане на N-гликозилационен сайт AsnXSer. ТоВа може да бъде осъществено В Спептидна последователност, т.е. чрез промяна на кодона GCC за А1а-С20 аминокиселина В кодон ААС за Asn.
Същият принцип може да бъде използВан при des-B(30) проинсулин.
Изобретението се осноВаВа на откриването, че добиВът на имунореактиВен инсулин, измерен чрез RIA метода е доста по-Висок В трансформациите, съдържащи ДНК последователност на формулата B-Pg-A, разтворени В защитен протеин, отколкото В трансформациите, съдържащи немодифицирана ДНК последователност на проинсулин ръзтВорен със защитен протеин. Клетките, трансформирани с Вектор съдържащ ДНК-последоВателност от неразтворим проинсулин или неразтворим модифициран проинсулин с N-гликозилационен противоположен сайт дават много по-нисък добив или не дават нищо при имунореактиВен инсулин, измерен чрез RIA метод.
Следователно, Въвеждането на N-гликозилационен противоположен сайт към спеисер (нуклеотидна последователност, разделяща кодираща област В генома) областта, която не е част от отлежалата (готова) инсулинова молекула, увеличава извънредно експресията В плесенните клетки, които са трансформирани с ДНК последователност, кодираща такива разтворими инсулинови предшественици. Разтворим протеин и проинсулин могат също така да се произвеждат В собствения организъм на гостоприемника или да се отстраняват по-късно чрез ферментативно или химично разлагане.
ДНК последователността, кодираща така наречения модифициран инсулинов предшественик, може да бъде получена чрез олигонуклеотидни синтези на чистата ДНК последователност в комбинация с PCR или чрез in vitro мутагенези. ДНК последователността може също да бъде кодон, оптимизиран за експресия в подходящ организъм, за предпочитане В плесенен щам.
Изобретението се отнася също до метод за получаване на инсулин чрез културални подходящи клетки, за предпочитане плесенни клетки, трансформирани с вектор, съдържащ ДНК последователност, кодираща инсулинов предшественик от формулата B-Pg-A в подходяща културална среда.
Експресията и секрецията на пептида от горната формула могат да бъдат осъществени чрез използването на вектор, в който кодирането на последователността се регулира чрез промотор, сигнална последователност и функционаления терминатор в подходящ организъм. Например, това може да бъде Р и сигнална последователност Hag/aA ген или част от тях, подходяща за експресия в Aspergillus sp. (Cullen et al., Biotechnology, 5_(1987) 369-376). Експресията и секрецията на пептида могат да бъдат постигнати също чрез използване на експресионен вектор, в който ДНК последователност, кодираща инсулиновия предшественик от горната формула е разтворена в гена на защитен протеин посредством процесинг сигнал (Ward et aL, Biotechnology, 8 (1990) 435-440; Broekhuijsen et ai., J. Biotech., 31 (1993) 135-145) или химически раздробяващ сайт.
Изобретението се отнася също до ДНК последователности, кодиращи фармацеВтични пептиди или протеини, В които N-гликозилационния противоположен сайт е ВъВеден в неосновен сайт В която и да е спейсер област, така че да не кодира чист протеин за по-висока експресия или секреция на протеините.
Описание на приложените фигури фиг.1 показва нуклеотидна последователност от два, естествения и кодон-оптимизирания проинсулинов ген и кореспондиращата аминокиселинна последователност, използвайки конвенционалните абревиатури за нуклеотиди и аминокиселини.
фиг.2 описва дВа типа генни експресионни касети от чоВешки проинсулин и схематично показва човешкия проинсулинов ген и гена-мутант, съдържащ N-гликозилационен противоположен сайт.
фиг.3 пояснява стратегията в конструирането на човешки проинсулинен ген и мутантет ген, съдържащ N-гликозилационен противоположен сайт за два типа на експрестионни касети чрез фрагменти, синтезирани отделно чрез “препокривани олигонуклеотиди в комбинация с PCR”. фиг.4 показва 14 олигонуклеотида, предназначени за синтези на чоВешки проинсулинен ген и мутантен ген, съдършащ N-гликозилационен противоположен сайт.
фиг.5 пояснява, върху примера на фрагмент I синтези, новият подход, който беше използван за синтезите на човешки проинсулинен ген чрез използване на препокриване, допълващ се от олигонуклеотиди в комбинация с PCR.
Фиг.6 показва схематично синтезите на фрагмент IV (олигонуклеотидшпе са посочени само чрез стрелки).
фиг.7 показва схематично синтезите на фрагмент II, фрагмент III и фрагмент V (олигонуклеотидите са посочени само чрез стрелки).
Фиг.8 показва конструкцията на плазмиди pPZG301, pPZG302, pPZG303, pPZG3()4, pPZG305.
фиг.9 показва конструкцията на плазмиди pPZG311, pPZG312.
Фиг. 10 показва конкрукцията на нишковидни плесенни експресионни вектори за експресионни касети от тип I.
Фиг. 11 показва конструкцията на филаментозни (нишковидни) плесенни експресионни вектори за експресионни касети от тип II.
фиг. 12 показва последователността на GIaG2 място на съединяване при glaA гена.
Примери за изпълнение на изобретението
Пример 1
Синтези иа човешки проинсулинен ген и мутантен ген, съдържащ Nгликозилационен противоположен сайт чрез припокриване олигонуклеотиди в комбинация с полимеразна верижна реакция (PCR)
а) Методология
Всички ДНК манипулационни експерименти бяха направени, използвайки стандартни молекулярно-биологични методи както са описани в Maniatis, Т., et al., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, USA (1982).
Всички химикали, ензими и плазмиди, освен ако са съобщени други различни, са тези които са на разположение от различните търговски източници. Буферите и реакционните условия за усвоените рестриктивни ендонуклеази бяха използвани както са препоръчани от производителя, освен ако не са означени по друг начин.
Химическите синтези на олигонуклеотидите се изпълняваха под ред, чрез “ISOGEN Bioscience; Amsterdam, The Netherlands. ДНК пробите са представени в лиофилизирана форма като натриеви соли със свободни групи на 5' и 3' остатъци. Такава ДНК бе разтворена в стерилна MQ Н2О. Концентрацията на единичната верига ДНК олигонуклеотиди бе определена чрез измерване на оптичната плътност на А^. Пробите от разтворими ДНК олигонуклеотиди се съхраняваха при -2(t‘C.
Полимеразната верижна реакция, по-нататък отбелязвана като PCR, бе изпълнявана чрез Perkin Elmer Cetus (761 Main Ave., Norwalk CT 06859) апарати u GeneAmp™ ДНК усилващ реактивен кит c AmpliTag™ рекомбинантна Tag ДНК полимераза. Концентрираните разтвори и реакционни смеси се приготвяха съгласно “Perkin Elmer Cetus Protocol for DNA Amplification” както се препоръчваха от производителя, с изключение на това, че в реакционната смес липсваше матрична ДНК, а присъстваха само олигонуклеотиди в концентрация от 100 pmol за реакция (100 1). Температурните циклични профили за всяка PCR бяха:
температура на топене 94°С /1 min; температура на хибридизация 40°С/ 1 min (за фрагменти I и IV) или 50°С/1 min (за фрагменти II, III и V); полимеризационна температура 72°С/1 min. Бяха проведени 25 цикъла. След последения цикъл, времето за полимеризация се задържаше за 7 минути до пълна полимеризация на всички вериги. След това пробите се охлаждаха go 4UC. PCR продуктите се отделяха от реакционната смес чрез две стъпала на хлороформна екстракция, ДНК се утаяваше с изопропанол, сушеше се във вакуум и се разтваряше в 50 ml ТЕ буфер.
Бактерия Е. coli К12, JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene 33 (1985) 103-119) беше използвана в експериментите за трансформация и амплификация (увеличаване на числеността) на плазмидите. Трасформацията и електропорацията на Е coli бе направена съгласно по-рано описани методи (Hanahan, D. J. Mol. Bol. 166 (1983) 557-580; Biorad Genepulser).
Олигонуклеотидно моделиране
Синтетичният човешки проинсулинен ген произхожда от оповестената последователност на човешкия инсулинен ген (Bell et al., Nature 284 (1980) 26-32). Трябва да бъде посочено, че когато се синтезираше гена, можеха да бъдат създадени определени модификации: възможно бе да се използВат различни, в повечето случаи предпочитани кодони, да се въВеждат допълнителни функционални ДНК последователности и рестрикционни сайтове, в смисъл да сс позволи лигиране на експресионни (изразени) Вектори, да се променят един или поВече кодони на кодирана област, по установена процедура да се произведе структуриран модифициран полипептид по същество със същата активност или полза.
В настоящето изобретение бе модифициран синтетичният човешки проинсулинен ген за експресия във фунги. Бяха използВани по-често употребявани кодони на глюкоамилазния G] ген от нишковидни фунги A. niger, които се експресираха в големи количества (Boel et al., EMBO J., 3 (1984) 1097-1102; Nunberg et al., Mol. Biol., 4.(1984) 2306-2315) u me бяха в повечето случаи същите като човешките кодони, освен В някои зони, където чрез избор на предпочитан кодон олигонуклеотидът би могъл да се превърне много изобилно в CG нуклеотиди, което може да създаде проблеми в определяне на първичната структура на макромолскулите и може би даже в PCR. По тази причина някои, главно Gly кодони бяха променяни от GGC на GGT, който е вторият предпочитан Glv кодон в глюкоамилазния ген от нишковидни фунги A. nigrer (фиг.1).
Ha 5' край om синтетичния проинсулинен ген бяха Въведени допълнителни ДНК последователности, кодиращи или 18 аминокиселини от глюкоамилазния ген (glaA) сигнален пептид или 6 аминокиселини от ген glaA пропептид, съдържащ Lys-Arg протеолитичен разпаден сайт, в смисъл да се направи Възможна конструкцията на дВа типа експресионни касети. В пърВия случай синтетичният чоВешки проинсулинен ген беше регулиран чрез глюкоамилазен промотор (Р 1аА) и сигнална последователност (SS^aA) от глюкоамилазния ген, докато ВъВ Втория случай (II) проинсулинният ген бе смесВан с чистия ген glaA от нишковидните фунги A. niger чрез спейсер пептид, съдържащ КЕХ-2като протеин процесинг сигнал под контрола на Р (фиг.2).
Подготвен беше също мутант на синтетичния чоВешки проинсулинен ген, носещ N-гликозилационен противоположен сайт за изучаване влиянието Върху експресионните и секреционни ниВа. Тъй като Спептида не е осноВен за инсулиноВата функция, защото той се отделя при секреционния процес, беше ВъВедена мутация В С-пептидната кодираща зона на чоВешкия проинсулинен ген (ВСА). Мутантът (BPgA), транспортиращ N-гликозилационния противоположен сайт Asn XSer беше приготВен чрез заменяне кодона GCC за А1а-С-20 аминокиселина с кодона ААС за Asn аминокиселина (фиг.2).
За синтезите на чоВешкия проинсулинен ген беше ВъВеден ноВ подход, В който беше използвано припокриване, допълващо олигонуклеотиди В комбинация с PCR. Принципът на метода беше да се използват през PCR два съседни, припокривани, допълващи олигонуклеотиди едновременно като матрица и праймери (капсули), така позволяващи Tag ДНК полимераза да ги увеличава”, т.е. да ги удължава през първия цикъл. Във втория цикъл такива “увеличени” олигонуклеотиди се припокриват със съседния 3’ или 5' олигонуклеотид и по такъв начин позволяват Tag ДНК полимеразата допълнително да увеличи вече увеличените средни олигонуклеотиди. Така Tag ДНК полимераза фактически пълни пролуките между химически синтезирани, припокривани олигонуклеотиди и създава ДНК двойна спирала. Синтезите на чоВешки проинсулиноВ ген и неговите мутанти, съдържащи N-гликозилационен противоположен сайт бяха представяни ВъВ фрагмети, които бяха синтезирани поотделно чрез PCR.
Раздробяването на гените във фрагменти беше постигнато посредством наличието на два раздробяващи участъка за рестрикционен ензим PstI в С-пептид кодиращата област (фиг.З).
Определени бяха четиринадесет олигонуклеотида: десет олигонуклеотида (ВЗ, В4, В5, В6, Cl, С2, СЗ, Al, А2 и АЗ) бяха изведени от кодираща човешки проинсулин ДНК последователност с предпочитани кодони за експресия в нишковидни фунги A. niger, два олигонуклеотида (Bl и В2) бяха определени за Въвеждане HnglaA генна сигнална последователност и допълнителни рестрикционни сайтове за да се направи възможно лигиране в тип I експресионен вектор; един олигонуклеотид (В7) беше определен за въвеждане на glaA (G2) генна последователност на спейсър зона и допълнителни рестрикционни сайтове за да бъде възможно лигиране с тип II експресионен вектор и един олигонуклеотид (С4) бе определен за въвеждане на мутация, носеща N-гликозилационен противоположен сайт (фиг.4).
б) PCR синтези на фрагмерти I-V
Фрагменти I и IV
Фрагменти I и V бяха синтезирани “стъпка по стъпка”. В първата стъпка на PCR беше извършена реакция с олигонуклеотиди ВЗ и В4, резултираща В продукта ВЗ/В4. В следващата “стъпка”, 1 1 от продукта ВЗ/В4 беше смесен в PCR реакционна смес с: а/ В2 и В5 олигонуклеотиди за фрагмент I и б/ В7 и В5 олигонуклеотиди за фрагмент IV. Бяха получени продукти В2/ВЗ/В4/В5 и В7/ВЗ/В4/В5. В третата “стъпка”; 1 1 от продукта В2/ВЗ/В4/В5 беше използван за PCR с олигонуклеотиди В1 и В6 за фрагмент I и 1 I от прудукта В7/ВЗ/В4/В5 беше примесен В PCR реакционната смес с олигонуклеотиди В 7 и В6 за фрагмента IV. Бяха получени PCR продукти В1/В2/ВЗ/В4/В5/В6 и В7/ВЗ/В4/В5/В6. Тяхната големина кореспондира на една очаквана такава и продуктите бяха усвоени със съответните рестрикционни ензими, резултиращи Във фрагмент I и фрагмент IV (фиг.5 и 6).
Фрагменти II, III и V бяха синтезирани в една “стъпка”. PCR бе изпълнен с олигонуклеотиди: а/ Cl, С2, СЗ; б/ Al, А2, АЗ; В/ С2, С4, С5. PCR продукти С1/С2/СЗ, А1/А2/АЗ и С1/С4/СЗ бяха с очаквана големина и те бяха усвоени със съответни рестрикционни ензими, резултиращи Във фрагмент II, фрагмент III и фрагмент V (фиг.7).
Клониране на PCR синтезирани фрагменти В pUC19 Вектор и анализи на ДНК последователност
Плазмидът pUI19 бе усвоен с: a/Pstl, 6/ Pstl/EcoRI и В/ Pstl/Sall рестрикционни ензими и лигиран със съответните фрагменти I-V, резултиращи В плазмиди pPZG301, pPZG302, pPZG303, pPZG304 и pPZG305 (фиг.8). C тези плазмиди беше трансформирана бактерията Е. coli JM109. От получените трансформанти рДНК беше изолирана чрез “мини преработка” и анализирана с рестрикционни ензими. Трансформанти Е. coli, съдържащи подходящи плазмиди нарастваха, техните рДНК се изолираха чрез QIAGEN тип 20 колона и отделяха чрез “SEQUENASE Version 2.0 кит”.
Вектори, транспортиращи коректно синтезирана и Вмъкната последователност се използваха за по-нататъшни конструкции.
pPZG311 и pPZG312
Вектори, транспортиращи комплекта човешки проинсулинен ген и ген мутант с N-гликозилационен противоположен сайт с glaA ген сигнална последователност се конструираха както следва: pPZG311 се конструираше чрез лигиране на 713 вр EcoRI-PstI фрагмент изолиран от pPZG301, 75 вр Pstl-PstI фрагмент изолиран от pPZG3()2 и 74 Bp PstlSa.ll фрагмент изолиран от pPZG303 вмъкнат В EcoRl/Sall, усвоен от pUC19 вектор. pPZG312 се конструираше чрез лигиране на 713 вр EcoRIPstl фрагмент изолиран от pPZG301, 75 вр Pstl-PstI фрагмент изолиран от pPZG3()5 и 74 вр Pstl-Sall фрагмент изолиран от pPZG303 вмъкнат в EcoRI/Sall, усвоен om pUC19 Вектор (фиг.9).
Пример 2
Конструиране на нишковиден плесенен експресионен вектор
I. Експресионна касета тип I pAN52-.7NotBCA и pAN52-7NotBPgA pAn52-7.VuZwiiM (Verdoes et ai., Gene (1994) in press) бе усвоен частично c Ncol u Sall. 7,55 kB Sall-Ncol фрагмент, транспортиращ glaA промотор u trpC ген от терминационна област бе изолиран и лигиран с 317 Вр NcoSall фрагмент на плазмида pPZG311, получен В плазмида pAN52-7NotBCA и 317 Вр Ncol-Sall фрагмент на плазмид pPZG312, резултиращ В плазмид pAN52-7NoBPgA (фиг. 1(1).
pAN52-7BCAamdS u pAN52-7BPgAamdS
5.0 kB Notl фрагмент, транспортиращ ацетиламидазен (amdS) ген от A. nidulans бе лигиран в Notl сайт на пхазмиди pAN52-7NotBCA и pAN527NotBPgA, резултиращи В плазмиди pAN52-7BCAamdS и pAN527BPgAamdS (фиг. 10).
И. Експресионна касета тип II pAN5.6r7BCAamdS и j2AN56-7BPgAamdS
Вектори за смесени глюкоамилазен проинсулин протеин и глюкоамилазен проинсулин мутант с N-гликозилационен противоположен сайт бяха конструирани както следВа: плазмид pPZ304 бе усВоен с EcoRV и AlwNI. фрагмент EcoRV-AlwNI от 25 Вр, транспортиращ последователност за 6 аминокиселинен спейсер бе лигиран с 3.07 kB Sall-EcoRV фрагмент от pAN56-7 транспортиращ g£4(G2) ген, резултиращ Във фрагмент SallAlwNI. Вектор pAN56-7 бе получен от Вектор pAN56-4 (Broekhuijsen et al., J. Biotech., 31 (1993) 135-145) В който gpdA промотор бе заместен c 4.2 kB Notl-Ncol фрагмент от pAN52-7 транспортиращ glaA промотор и В които интерлейкин гена беше отместен, оставайки EcoRV сайт, да се дВижи нагоре от GlaG2. фрагмент AlwNI-Sall тогаВа бе лигиран с
10.6 kB Hind III - Sall фрагмент от pABl-6S (Den Herder et al., Mol. Gen. Genet. 233 (1992) 404-410) който uMag/αΑ промотор u amdS ген и c: а/ 1.06 kB AlwNI-Hind Ш-Sall фрагмент от pAN52-7BCA резултиращ В плазмид pAN56-7BCAamdS иб/ 1.06 kBAlwNl-Hind III фрагмент от pAN52-7BPgA, резултиращ Във вектор pAN56-7BPgAamdS (фиг. 11). В спейсера има двуосновен процесинг сайт Lys-Arg. Последователността около сайта на сливане на глюкоамилазния ген с човешкия проинсулинен ген (ВСА) и проинсулинен мутант (BPgA) посредством спеисер областта е показан на фиг. 12.
Пример 3
Трансформация на нишковидни фунги Aspergillus niger
Трасформацията на нишковидните фунги Aspergillus niger бе осъществена съгласно Вече описаните методи (Goosen et al., Curr. Genet. 11 (1987) 499503; Kelly and Hynes, Embo J. £(1985) 475-479; Van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 206 (1987) 71-75).
Нишковидните фунги A. niger N402 (Bos, C.J. et al., Curr. Genet. 14 (1988) 437-443) бяха трансформирани c експресионни вектори pAN52-7BCAamdS, pAN52-7BPgAamdS, pAN56-7BCAamdS u pAN56-7BPgAamdS. Колониите бяха селекционирани върху културални среди с ацетамид или акриламид като единствен източник на въглерод и азот. Започвайки от единични спори, по-нататък бяха извършвани анализи на трасформанти.
Пример 4
Секреция на човешки инсулин β културална среда ген и ген мутант с М-гликозилационец противоположен сайт
Около 108 спори от селекционирани трансформанти бяха инокулирани в 500 ml Ерленмаерови колби, съдържащи КМ) ml от течна културална среда, съдържаща: 70 тМ NaNO3, 7 тМ KO, И тМ КН;РО4, 2 тМ MgSO4, 4% декстрин, микроелементи (1:1000; 76 тМ ZnSOr 178 тМ Н3ВО3, 25 тМ МпСЦ, 18 тМ FeSO4, 7.1 тМ СоС12,6.4 тМ CuSO4> 6.2 тМ Na2MoO4, 174 тМ F.DTA) и витамини (1:1000) 100 mg/l от тиамин (витамин В(), 100 mg/l рибофлавин (витамин ВД 1(Х) mg/l никотинамид, 50 mg/l пиридоксин (витамин В6), 10 mg/l пантотенова киселина, 0.2 mg/l биотин (витамин Н). Трансформантите нарастваха при 32°С за 36 часа. Щамовете бяха анализирани в инсулиново присъствие.
2- Експреснала -инсулин
Експресия на имунореактивен човешки инсулин бе демонстрирана чрез “Pharmacia INSULIN RIA 100” кит, Kabi Pharmacia Diagnostics. Щамовете от трансформанти, култивирани чрез ферментация бяха филтрирани, филтратите бяха неутрализирани, разреждани ако е необходимо и тогава подлагани на R1A (радиоимуноанализ) детерминация (Livessy et al., Clin. Biochem. 13 (1980) 151-55). Експресионното ниво на имунореактивния човешки инсулин (mU/L) в A. niger трансформанти е показано в Таблица 1.
Експресионно ниво в имунореакшивен човешки инсулин в различни A. niger трансформанти:
Трансформант
Плазмид Имунореактивен реактив (mU/L)
A. niger 7650 [NCAIM (Р) F 001215]
A. niger 7651 [NCAIM (Р) F 001216]
A. niger 7649 [NCAIM (P) F 001214]
PAN52-7BCAz#n4S
PAN52-7BPgAamcZ5
PAN56-7BCAu/?iiZS
A. niger 7638 [NCAIM (P) F 001213]
PAN56-7BPgAamdS
776
Трансформантите A. niger 7650, A. niger 7651, A. niger ΊΜ9 uA. niger 7638 бяха депозирани в “Национална колекция за селскостопански и индустриални микоорганизми, Н-1502 Будапеща, P.O. В. 53, Унгария на 18 юли 1994 г. под каталожни номера NCAIM (Р) F (ХИ 215, NCAIM (Р) F 001216, NCAIM (Р) F 001214 и NCAIM (Р) F 001213 и в съответствие с Будапещенския договор за национално признаване депозита на микроорганизми за целите на патентната процедура, излагане в случай на оригинален депозит, съобразен с правило 6.1.
От таблицата се доказва, че има специфични различия в трасформантите, съдържащи различни вектори. Несравнено наи-доб ьр резултат е показан чрез трансформант, получен от трансформация с вектор имащ човешки проинсулинов ген, носещ N-гликозилационен противоположен сайт, смесен с глюкоамилазен протеин.

Claims (13)

1. ДНК последователност, включваща последователност кодираща инсулинов предшественик с формула B-Pg-A, където В и А представляват В- и A-Вериги от човешки инсулин, съответно Pg представлява модифициран С-пептид или някакъв брой аминокиселини, съдържащи наймалко един N-гликозилационен противоположен сайт и Pg свързва В- и А-вериги чрез протеолитични процесинг сигнали или специфични химически раздробяващи сайтове.
2. ДНК последователност, включваща последователност кодираща инсулинов предшественик с формула B(29)-Pg-A, където В(29) означава В(1-29), А означава А-верига, Pg представлява модифициран С-пептид или някакъВ брой от аминокиселини, включващи най-малко един Nгликозилационен противоположен сайт и Pg свързва В- и А-веригите чрез протеолитични процесинг сигнали или специфични химически раздробяващи сайтове.
3. ДНК последователност, съгласно претенции 1 и 2 с предпочитани кодони за експресия в специфични гостоприемници.
4. ДНК последователност, съгласно претенции от I до 3, смесвана със защитен протеинов ген посредством спеисер област, транспортиращ протеолитичен процесинг сигнал или специфичен химически раздробяващ сайт.
5. ДНК последователност, включваща последователност кодираща фармацевтичен пептид или протеин, в който N-гликозилационен противоположен сайт е въведен в неосновен сайт в която и да е спейсер област.
6. Трансформирани клетки на подходящ гостоприемник, включващ ДНК последователност съгласно претенции от 1 до 5.
7. Трансформирани плесенни клетки, включващи ДНК последователност съгласно претенции от 1 до 5.
8. Трансформирани Aspergillus sp. плесенни клетки, включващи ДНК последователност съгласно претенции от 1 до 5.
9. Трансформирани клетки, Включващи ДНК сегмент съгласно претенции от 1 до 5.
10. Трансформирани плесенни клетки, Включващи ДНК сегмент съгласно претенции от 1 до 5.
11. Трансформирани Aspergillus sp. плесенни клетки, включващи ДНК сегмент съгласно претенции от 1 до 5.
12. Метод за получаване на инсулин чрез култивиране на подходящи клетки, за предпочитане плесенни клетки, трансформирани с вектор, включващ ДНК последователност съгласно претенции от 1 до 4.
13. Метод за получаване на фармацевтични пептиди или протеини чрез култивиране на подходящи клетки, за предпочитане плесенни клетки, трансформирани с вектор, включващ ДНК последователност съгласно претенция 5.
BG99844A 1994-08-05 1995-08-03 Днк последователности,кодиращи нови биосинтетични предшественици на инсулин и метод за получаване на инсулин BG62336B1 (bg)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HR940432A HRP940432B1 (en) 1994-08-05 1994-08-05 Dna sequences encoding biosynthetic insulin precursors and process for preparation of insulin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG99844A true BG99844A (bg) 1996-02-28
BG62336B1 BG62336B1 (bg) 1999-08-31

Family

ID=10946142

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG99844A BG62336B1 (bg) 1994-08-05 1995-08-03 Днк последователности,кодиращи нови биосинтетични предшественици на инсулин и метод за получаване на инсулин

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP0704527B1 (bg)
CN (1) CN1126761A (bg)
AT (1) ATE239791T1 (bg)
BG (1) BG62336B1 (bg)
CA (1) CA2155451A1 (bg)
CZ (1) CZ199995A3 (bg)
DE (1) DE69530647T2 (bg)
ES (1) ES2198428T3 (bg)
HR (1) HRP940432B1 (bg)
PL (1) PL309882A1 (bg)
PT (1) PT704527E (bg)
SI (1) SI9500250A (bg)
SK (1) SK97195A3 (bg)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9513967D0 (en) * 1995-07-08 1995-09-06 Univ Leicester Insulin
AU5504999A (en) * 1998-07-20 2000-02-14 Frenken, Leon Gerardus Joseph Production of proteins
JP3971108B2 (ja) 1999-01-06 2007-09-05 ジェネンテック・インコーポレーテッド インシュリン様成長因子（ｉｇｆ）ｉ突然変異体
JP3406244B2 (ja) * 1999-04-30 2003-05-12 伊藤ハム株式会社 新規な融合蛋白質からの組み換えインスリンの製造方法
DE19947456A1 (de) 1999-10-02 2001-04-05 Aventis Pharma Gmbh C-Peptid zur verbesserten Herstellung von Insulin und Insulinanaloga
DK1265630T3 (da) 2000-03-24 2006-10-09 Genentech Inc Anvendelse af insulin til behandling af brusksygdomme
WO2002100887A2 (en) * 2001-06-08 2002-12-19 Novo Nordisk A/S Method for making insulin precursors and insulin precursor analogs
CA2806399A1 (en) * 2010-07-28 2012-02-02 Smartcells, Inc. Recombinantly expressed insulin polypeptides and uses thereof
AR087433A1 (es) * 2011-08-08 2014-03-26 Merck Sharp & Dohme Analogos de insulina n-glicosilados

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0196056B1 (en) * 1985-03-28 1991-05-22 Chiron Corporation Improved expression using fused genes providing for protein product
FI872102A (fi) * 1986-06-06 1987-12-07 Panlabs Inc Expressionssystem hos filamentala fungi.
CA1340772C (en) * 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
DK300090D0 (da) * 1990-12-19 1990-12-19 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser
BR9400600A (pt) * 1994-02-17 1995-10-24 Finep Financiadora De Estudos Processos para produção de uma protéina recombinante e/ou de glicosilfosfatidilinositol (GPI) em células de microorganismos eucariontes e para a obtenção de leveduras de S. cerevisae; célula de levedura sequência de nucleotídios; meio de cultura; medicamento ou vacina; e produto dos ditos processos

Also Published As

Publication number Publication date
CA2155451A1 (en) 1996-02-06
DE69530647T2 (de) 2004-03-11
HRP940432A2 (en) 1997-08-31
CN1126761A (zh) 1996-07-17
SI9500250A (en) 1996-02-29
EP0704527B1 (en) 2003-05-07
PT704527E (pt) 2003-09-30
DE69530647D1 (de) 2003-06-12
HRP940432B1 (en) 2003-10-31
CZ199995A3 (en) 1996-02-14
ATE239791T1 (de) 2003-05-15
ES2198428T3 (es) 2004-02-01
EP0704527A3 (en) 1997-08-27
SK97195A3 (en) 1996-02-07
BG62336B1 (bg) 1999-08-31
EP0704527A2 (en) 1996-04-03
PL309882A1 (en) 1996-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5324639A (en) Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
US5324641A (en) DNA sequences encoding insulin precursors and methods of production
US6642029B1 (en) Hybrid DNA synthesis of mature insulin-like growth factors
JP2793215B2 (ja) 先端を切断したα―因子リーダー配列を用いた酵母における異種タンパクの改良された発現および分泌
JP5503968B2 (ja) 成熟インスリンポリペプチドの作製方法
JP2733602B2 (ja) ヒルジンをコードする発現カセット、プラスミド及び形質転換酵母
JP5366546B2 (ja) 成熟インスリンポリペプチドの作製方法
JPH04504846A (ja) プロセッシング部位に隣接する負に帯電したアミノ酸からなる酵母プロセッシングシステム
US20160115216A1 (en) Method for Making Mature Insulin Polypeptides
WO1988009795A1 (en) Yeast expression vector
US6861237B2 (en) Production of heterologous polypeptides in yeast
BG99844A (bg) Днк последователности,кодиращи нови биосинтетични предшественици на инсулин и метод за получаване на инсулин
EP1364030B1 (en) Supersecretable peptides, processes for their production, and parallel improvement of the secreted form of one or more other polypeptides
AU2002247696A1 (en) Use of supersecretable peptides in processes for their production and for parallel improvement of the exported forms of one or more other polypeptides
EP1211314A2 (en) Expression of a human insulin precursor in p. pastoris
US5104795A (en) Shortened phosphoglycerate kinase promoter
EP0245479B1 (en) Shortened phosphoglycerate kinase promoter
US7638618B2 (en) Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest
HUT72848A (en) Dna sequences encoding novel biosynthetic insulin precursors and process for preparation of insulin
JP2004514450A (ja) 酵母における異種ポリペチドの産生