BG62336B1

BG62336B1 - Днк последователности,кодиращи нови биосинтетични предшественици на инсулин и метод за получаване на инсулин

Info

Publication number: BG62336B1
Application number: BG99844A
Authority: BG
Inventors: Silvija Mestric; Peter Punt; Radovan Valinger; Den Hondel Cees Van
Original assignee: Pliva Farmaceutska,Kemijska,Prehrambena Ikozmeticka Industrija, Dionicko Drustvo
Priority date: 1994-08-05
Filing date: 1995-08-03
Publication date: 1999-08-31
Also published as: PT704527E; CN1126761A; CZ199995A3; ES2198428T3; DE69530647D1; SK97195A3; PL309882A1; SI9500250A; CA2155451A1; ATE239791T1; EP0704527A3; BG99844A; HRP940432A2; HRP940432B1; DE69530647T2; EP0704527A2; EP0704527B1

Abstract

Изобретението се отнася до ДНК последователности,кодиращи инсулинови предшественици с формула В-Pg-A, където В и А представляват съответно В- и А-вериги, Pg представлява модифициран С-пептид или някакъв брой от аминокиселини, съдържащ най-малко един N-гликозилационен противоположен сайт. Изобретението се отнася също до метод за получаване на инсулин чрез култивиране на подходящи клетки, за предпочитане плесенни (фунги) клетки, трансформирани с вектор, съдържащ ДНК последователност, кодираща инсулинов предшественик с дадена формула. Изобретението се отнася също до ДНК последователности, кодиращи фармацевтични пептиди и протеини, в които N-гликозилационен противоположен сайт е въведен в неосновен сайт в която и да е спейсер област за високаекспресия и секреция на протеини.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до ДНК последователности, кодиращи нови биосинтетични инсулинови предшественици, и до метод за получаване на инсулин чрез култивиране на трансформирани клетки, съдържащи такива ДНК последователности.

Предшестващо състояние на техниката

Инсулинът е хормон, чиято основна роля е да контролира пренасянето на глюкозата от кръвния ток в клетките, където се метаболизира.

Инсулинът е съставен от две вериги от аминокиселини: А-верига, състояща се от 21 аминокиселини, и В-верига, включваща 30 аминокиселини. Веригите са свързани една с друга чрез два дисулфидни моста. Трети дисулфиден мост се намира вътре в А-веригата.

Основната форма на инсулиновата молекула е синтезирана като зародишна полипептидна верига, наречена препроинсулин, който е съставен от сигнален пептид и проинсулин. Сигналният пептид насочва зародишната верига през ендоплазмичния ретикулум (мрежеста ретикулярна тъкан). Проинсулинът се получава от препроинсулин в лумена на ендоплазмичния ретикулум веднага, щом като полипептидната верига премине през мембраната. Проинсулинът съдържа полипептидна верига, включваща верига от 35 аминокиселини, която не присъства в инсулина. Този свързващ пептид или С-пептидът съединява С-края на В-веригата към N-края на Аверигата в бъдещата инсулинова молекула. От лумена на ендоплазмичния ретикулум проинсулинът се изпраща в апарата на Golgi, където започва протеолизата на свързващия пептид. Свързващият или С-пептид се изрязва от ензимна система, подобна на трипсин/карбоксипептидаза В-системата, която действа на две последователни основни аминокиселинни последователности и се продуцира инсулин (Steiner et al., J. Cell Biol., 24 (1984) 121-130).

Значението на С-пептида е, че той свързва В- и А-веригите така, че позволява да се създаде устойчива структура на дисулфидните мостове в инсулиновата молекула (Bell et al., Nature, 284 (1980) 26-32) или че той насочва подобния на трипсин превръщащ ензим да продуцира проинсулин в сайта с двете основни аминокиселини (Thim et al., PNAS, 83 (1986) 6766-6770).

Продуцирането на биосинтетичен човешки инсулин е описано главно при бактериите Escherichia coli и дрождите Saccharomyces cerevisiae. Общото за всички тях е, че ДНК последователността кодира както за целия проинсулин, за модифицирана част от проинсулин или поотделно за А- и В-веригите.

В бактерия Е. coli инсулин се продуцира или чрез отделяне на А- и В-веригите (Chance et al., Diabetes Care, 4 (1982) 147-154), или като проинсулин (ЕР 55945).

В дрождите S. cerevisiae инсулин се продуцира чрез проинсулин, досега с много нисък добив (ЕР-А 121 884). Различните модификации на С-пептида подобряват добива и образуването на инсулиновата молекула в дрождите.

Инсулиновите предшественици с формула В-Х-А, в която В и А означават В- и Аверигите и X означава пептид, съдържащи от 2 до 35 аминокиселини, са описани в DK-A 5284/87.

Инсулинови предшественици с формула В-Х-У-А, в която В и А означават В- и Аверигите и X и У всеки означава лизин или аргинин, са описани в ЕР-А 195 691.

В ЕР-А 163 529 са описани инсулинови предшественици, съдържащи пептидната верига В (1-29) - А (1-21), свързана с къс пептид, имащ 2 до 8 аминокиселини. Модификациите на des-B(30) инсулинови предшественици с формула В (1-29) - X, - Х₂ - У₂ - У, - А (1-21) са описани в ЕР-А 347 845.

В ЕР 249 350 са описани глюкоамилазен стимулатор и сигнална последователност за отделяне на протеини в плесени като гостоприемници. Така например, експресивен проинсулинов тример е вмъкнат също в такъв експресионен вектор.

Много полипептиди за терапевтична или диагностична употреба, например еритропоетин, tPA и фактор VIII, са N-гликозилирани (Parekh et al., TIBTECH, Ί (1989) 117-121).

Описан е също тройно увеличен добив на бичешки химозин (гликохимозин) във фунги A. niger var. awamori, постигнат чрез въвеждането на N-гликозилационен противоположен сайт в кодирана последователност. Чрез стопилка на прохимозин и глюкоамилазен ген се постига дори по-висок добив, но чрез стапяне на гликохимозин в глюкоамилаза не се увеличава повече добивът (Berka et al., Biochem. Soc. Trans, 19 (1991) 681-685).

В случай на аспаргинова протеиназа (ренин), който е от микробиален произход и служи като заместител на химозина, се наблюдава, че хипергликозилирането може да намали ензимната активност, ако тя настъпва в критичния сайт на молекулата (Berka et al., Biochem. Soc. Trans. 19 (1991) 681-685; Aikawa et al., Biol. Chem. 265 (1990) 13955-13959).

Мутация на гликозилиран аспаргин в кодираната област от ренин води до значително намаляване на секрецията в дрождени клетки (Aikawa et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 1395513959).

Същност на изобретението

Обект на изобретението са ДНК последователности, кодиращи нови биосинтетични инсулинови предшественици, и използване на еукариотни клетки, по-специално плесенни клетки за получаване на инсулин.

Изобретението се осъществява чрез ДНК последователност, съдържаща кодирана последователност за инсулинови предшественици от формулата B-Pg-A, в която В и А представляват съответно В- и А-вериги и Pg представлява модифициран С-пептид или някакъв брой от аминокиселини, съдържащи най-малко един N-гликозилационен противоположен сайт. Pg свързва В- и А-веригите чрез протеолитични процесинг (произвеждащи) сигнали или специфични химически раздробени сайтове.

Модификацията на проинсулиновия ген се предпочита чрез създаване на N-гликозилационен сайт AsnXSer. Това може да се осъществи в С-пептидна последователност, т.е. чрез промяна на кодона GCC за А1а-С-20 аминокиселина в кодон ААС за Asn.

Същият принцип може да се използва при des-B(30) проинсулин.

Изобретението се основава на факта, че добивът на имунореактивен инсулин, измерен чрез RIA метода, е доста по-висок в трансформациите, съдържащи ДНК последователност на формулата B-Pg-A, разтворени в защитен протеин, отколкото в трансформациите, съдържащи немодифицирана ДНК последователност на проинсулин, разтворен със защитен протеин. Клетките, трансформирани с вектор, съдържащ ДНК-последователност от неразтворим проинсулин или неразтворим модифициран проинсулин с N-гликозилационен противоположен сайт, дават много по-нисък добив или не дават нищо при имунореактивен инсулин, измерен чрез RIA метод.

Следователно, въвеждането на N-гликозилационен противоположен сайт към спейсер (нуклеотидна последователност, разделяща кодираща област в генома) областта, която не е част от зрялата инсулинова молекула, увеличава извънредно експресията в плесенните клетки, които са трансформирани с ДНК последователност, кодираща такива разтворими инсулинови предшественици. Разтворим протеин и проинсулин могат също така да се произвеждат в собствения организъм на гостоприемника или да се отстраняват по-късно чрез ферментативно или химично разлагане.

ДНК последователността, кодираща т. нар. модифициран инсулинов предшественик, може да се получи чрез олигонуклеотидни синтези на чистата ДНК последователност в комбинация с PCR или чрез in vitro мутагенези. ДНК последователността може също да бъде кодон, оптимизиран за експресия в подходящ организъм, за предпочитане в плесенен щам.

Изобретението се отнася също до метод за получаване на инсулин чрез подходящи културални клетки, за предпочитане плесенни клетки, трансформирани с вектор, съдържащ ДНК последователност, кодираща инсулинов предшественик с формулата B-Pg-A в подходяща културална среда.

Експресията и секрецията на пептида от горната формула могат да се осъществят чрез използването на вектор, в който кодирането на последователността се регулира чрез промотор, сигнална последователност и функционалния терминатор в подходящ организъм. Например, това може да бъде Ρ^_Α и сигнална последователност на glaA ген или част от тях, подходяща за експресия в Aspergillus sp. (Cullen et al., Biotechnology, 5 (1987) 369-376).

Експресията и секрецията на пептида могат да се постигнат също чрез използване на експресионен вектор, в който ДНК последователност, кодираща инсулиновия предшественик от горната формула, е разтворена в гена на защитен протеин чрез процесинг сигнал (Ward et al., Biotechnology, 8 (1990) 435-440; Broekhuijsen et al., J. Biotech., 31 (1993) 135-145) или химически сайт на скъсване.

Изобретението се отнася също до ДНК последователности, кодиращи фармацевтични пептиди или протеини, в които N-гликозилационният противоположен сайт е въведен в неосновен сайт в която и да е спейсерна област, така че да не кодира зрял протеин за по-висока експресия или секреция на протеините.

Описание на приложените фигури

Фигура 1 представлява нуклеотидна последователност от два - естествения и кодоноптимизирания проинсулинов, гена и съответна аминокиселинна последователност, като се използват конвенционалните съкращения за нуклеотиди и аминокиселини;

фигура 2 - два типа генни експресионни касети от човешки проинсулин и схематично човешкия проинсулинов ген и гена-мутант, съдържащ N-гликозилационен противоположен сайт;

фигура 3 пояснява стратегията в конструирането на човешки проинсулинов ген и мутантен ген, съдържащ N-гликозилационен противоположен сайт за два типа на експресионни касети чрез фрагменти, синтезирани отделно чрез “препокривани олигонуклеотиди в комбинация с PCR”;

фигура 4 представлява 14 олигонуклеотида, предназначени за синтез на човешки проинсулинен ген и мутантен ген, съдържащ N-гликозилационен противоположен сайт;

фигура 5 пояснява върху примера на фрагмент I синтези новия подход, който се използва за синтезите на човешки проинсулинен ген чрез използване на препокриване, допълващ се от олигонуклеотиди в комбинация с PCR;

фигура 6 представлява схематично синтезите на фрагмент IV (олигонуклеотидите са посочени само чрез стрелки);

фигура 7 - схематично синтезите на фрагмент II, фрагмент III и фрагмент V (олигонуклеотидите са посочени само чрез стрел ки);

фигура 8 - конструкцията на плазмиди pPZG301, pPZG302, pPZG303, pPZG304, pPZG305;

фигура 9 - конструкцията на плазмиди pPZG311, pPZG312;

фигура 10 - конструкцията на нишковидни плесенни експресионни вектори за експресионни касети от тип I;

фигура 11 - конструкцията на филаментозни (нишковидни) плесенни експресионни вектори за експресионни касети от тип II;

фигура 12 - последователността на GlaG2 сайт на съединяване при glaA гена.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1. Синтез на човешки проинсулинов ген и мутантен ген, съдържащ N-гликозилационен противоположен сайт чрез препокриване олигонуклеотиди в комбинация с полимеразна верижна реакция (PCR)

а) Методология

Всички ДНК манипулационни експерименти са направени, като се използват стандартни молекулярно-биологични методи, както са описани в Maniatis, Т., et al., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, USA (1982).

Всички химикали, ензими и плазмиди, освен ако са съобщени други различни, са тези, които са на разположение от различните търговски източници. Буферите и реакционните условия за усвоените рестрикционни ендонуклеази се използват, както са препоръчани от производителя, освен ако не са означени по друг начин.

Химическите синтези на олигонуклеотидите се изпълняват под ред, чрез “ISOGEN Bioscience; Amsterdam, The Netherlands. ДНК пробите са представени в лиофилизирана форма като натриеви соли със свободни групи на 5' и 3' остатъци. Такава ДНК се разтваря в стерилна MQ Н₂0. Концентрацията на единичната верига ДНК олигонуклеотиди е определена чрез измерване на оптичната плътност на А₂₆₀. Пробите от разтворими ДНК олигонуклеотиди се съхраняват при -20°С.

Полимеразната верижна реакция, по-нататък отбелязвана като PCR, се изпълнява чрез Perkin Elmer Cetus (761 Main Ave., Norwalk CT 06859) апарати и GeneAmp™ ДНК усил ващ реактивен кит с AmpliTag™ рекомбинантна Tag ДНК полимераза. Концентрираните разтвори и реакционни смеси се приготвят съгласно “Perkin Elmer Cetus Protocol for DNA Amplification”, както се препоръчва от производителя, с изключение на това, че в реакционната смес липсва матрична ДНК, а присъстват само олигонуклеотиди в концентрация от 100 pmol за реакция (ΙΟΟμΙ). Температурните циклични профили за всяка PCR са: температура на топене 94°С/1 min, температура на хибридизация 40°С/1 min (за фрагменти I и IV) или 50°С/1 min (за фрагменти II, III и V), полимеризационна температура 72°С/1 min. Провеждат се 25 цикъла. След последния цикъл времето за полимеризация се задържа за 7 min до пълна полимеризация на всички вериги. След това пробите се охлаждат до 4°С. PCR продуктите се отделят от реакционната смес чрез два етапа на хлороформна екстракция, ДНК се утаява с изопропанол, суши се във вакуум и се разтваря в 50 ml ТЕ буфер.

Бактерия Е. coli К12, JM109 (YanischPerron et al., Gene 33 (1985) 103-119) е използвана в експериментите за трансформация и амплификация (увеличаване на числеността) на плазмидите. Трансформацията и електропорацията на Е. coli е извършена съгласно по-рано описани методи (Hanahan, D. J. Mol. Bol. 166 (1983) 557-580; Biorad Genepulser).

Олигонуклеотидно моделиране

Синтетичният човешки проинсулинов ген произхожда от известна последователност на човешкия инсулинов ген (Bell et al., Nature 284 (1980) 26-32). Трябва да се посочи, че когато се синтезираше генът, могат да се създадат определени модификации: възможно е да се използват различни, в повечето случаи предпочитани кодони, да се въвеждат допълнителни функционални ДНК последователности и рестрикционни сайтове, в смисъл да се позволи лигиране на експресионни вектори, да се променят един или повече кодони на кодираща област, по установена процедура да се произведе структурен модифициран полипептид по същество със същата активност или полза.

В изобретението е модифициран синтетичният човешки проинсулинов ген за експресия в плесени. Използвани са по-често употребявани кодони на глюкоамилазния G, ген от нишковидни плесени A. niger, които се експ ресират в големи количества (Boel et al., EMBO J., 3 (1984) 1097-1102; Nunberg et al., Mol. Biol., 4 (1984) 2306-2315) и те са в повечето случаи същите като човешките кодони, освен в някои области, където чрез избор на предпочитан кодон олигонуклеотидът би могъл да се обогати на CG нуклеотиди, което може да създаде проблеми при секвенирането на макромолекулите и може би дори при PCR. По тази причина някои, главно Gly кодони се променят от GGC на GGT, който е вторият предпочитан Gly кодон в глюкоамилазния ген от нишковидни плесени A. niger (фиг.1).

На 5' край от синтетичния проинсулинен ген са въведени допълнителни ДНК последователности, кодиращи или 18 аминокиселини от глюкоамилазния ген (glaA) сигнален пептид, или 6 аминокиселини от ген glaA пропептид, съдържащ Lys-Arg протеолитичен сайт на разцепване, с цел да се направи възможно конструирането на два типа експресионни касети. В първия случай синтетичният човешки проинсулинов ген се регулира чрез глюкоамилазен промотор (Р^) и сигнална последователност (SS_glaA) от глюкоамилазния ген, докато във втория случай (II) проинсулиновият се слива с ген glaA от нишковидните плесени A. niger чрез спейсер пептид, съдържащ КЕХ-2-като протеин процесинг сигнал под контрола на Р (фиг.2).

Подготвя се също мутант на гена на синтетичния човешки проинсулин, носещ N-гликозилационен консенсус сайт за изучаване влиянието върху експресионните и секреционни нива. Тъй като С-пептидът не е основен за действието на инсулина, защото той се отделя при секреционния процес, се въвежда мутация в С-пептидната кодираща област на човешкия проинсулинов ген (ВСА). Мутант (BPgA), транспортиращ N-гликозилационния консенсус сайт Asn XSer, се приготвя чрез заменяне кодона GCC за А1а-С-20 аминокиселина с кодона ААС за Asn аминокиселина (фиг.2).

За синтезите на човешкия проинсулинов ген се въвежда нов подход, в който се използва препокриване комплементарни олигонуклеотиди в комбинация с PCR. Принципът на метода е да се използват по време на PCR два средни, препокриващи се комплементарни олигонуклеотида едновременно като матрица и праймери, така позволяващи Tag ДНК полимераза да ги “увеличава”, т.е. да ги удължава през първия цикъл. Във втория цикъл такива “увеличени” олигонуклеотиди се препокриват със съседния 3' или 5' олигонуклеотид и по такъв начин позволяват Tag ДНК полимеризатът допълнително да увеличи вече увеличените средни олигонуклеотиди. Така Tag ДНК полимераза фактически пълни пролуките между химически синтезирани, препокривани олигонуклеотиди и създава ДНК двойна спирала. Синтезите на човешки проинсулинов ген и неговите мутанти, съдържащи N-гликозилационен противоположен сайт, са представени във фрагменти, които са синтезирани поотделно чрез PCR.

Разцепването на гените във фрагменти се постига чрез наличието на два сайта на разцепване за рестрикционен ензим PstI в С-пептид кодиращата област (фиг.З).

Определят се четиринадесет олигонуклеотида: десет олигонуклеотида (ВЗ, В4, В5, В6, Cl, С2, СЗ, Al, А2 и АЗ) са изведени от кодираща човешки проинсулин ДНК последователност с предпочитани кодони за експресия в нишковидни плесени A. niger, два олигонуклеотида (В1 и В2) са определени за въвеждане на glaA генна сигнална последователност и допълнителни рестрикционни сайтове, за да се направи възможно лигиране в тип I експресионен вектор, един олигонуклеотид (В7) е определен за въвеждане на glaA (G2) генна последователност на спейсър зона и допълнителни рестрикционни сайтове, за да бъде възможно лигиране с тип II експресионен вектор и един олигонуклеотид (С4) е определен за въвеждане на мутация, носеща N-гликозилационен противоположен сайт (фиг.4).

б) PCR синтез на фрагменти I-V

Фрагменти I и IV

Фрагменти I и IV се синтезират “стъпка по стъпка”. В първата стъпка на PCR се извършва реакция с олигонуклеотиди ВЗ и В4, водеща до продукта ВЗ/В4. В следващата “стъпка” 1 μΐ от продукта ВЗ/В4 се смесва в PCR реакционна смес с: а/ В2 и В5 олигонуклеотиди за фрагмент I, и б/ В7 и В5 олигонуклеотиди за фрагмент IV. Получават се продукти В2/ВЗ/В4/В5 и В7/ВЗ/В4/В5. В третата “стъпка” Ιμΐ от продукта В2/ВЗ/В4/В5 се използва за PCR с олигонуклеотиди В1 и В 6 за фрагмент I и 1 μΐ от продукта В7/ВЗ/В4/В5 се примесва в PCR реакционната смес с олиго нуклеотиди В 7 и В 6 за фрагмента IV. Получават се PCR продукти В1/В2/ВЗ/В4/В5/В6 и В7/ВЗ/В4/В5/В6. Тяхната големина съответства на една очаквана големина и продуктите се смилат със съответните рестрикционни ензими, водещи до фрагмент I и фрагмент IV (фиг. 5 и 6).

Фрагменти II, III и V

Фрагменти II, III и V се синтезират в една “стъпка”. PCR се изпълнява с олигонуклеотиди: а/ Cl, С2, СЗ; б/ Al, А2, АЗ; в/ С2, С4, С5. PCR продукти С1/С2/СЗ, А1/А2/АЗ и С1/С4/СЗ са с очаквана големина и те се смилат със съответни рестрикционни ензими, водещи до фрагмент II, фрагмент III и фрагмент V (фиг.7).

Клониране на PCR синтезирани фрагменти в pUC 19 вектор и анализи на ДНК последователност

Плазмидът pUI19 се смила с: а/ PstI, б/ Pstl/EcoRI и в/ Pstl/Sall рестрикционни ензими и се лигира със съответните фрагменти Ι-V, като дава плазмиди pPZG301, pPZG302, pPZG303, pPZG304 и pPZG305 (фиг.8). C тези плазмиди се трансформира бактерията Е. coli JM109. От получените трансформанти рДНК се изолира чрез “минипреработка” и се анализира с рестрикционни ензими. Трансформанти Е. coli, съдържащи правилни плазмиди, се култивират, техните рДНК се изолират чрез “QIAGEN тип 20” колона и се отделят чрез “SEQUENASE Version 2.0 кшп”.

Вектори, пренасящи коректно синтезирана и инсерирана последователност, се използват за по-нататъшни конструкции.

PPZG311 и pPZG312

Вектори, пренасящи комплекта човешки проинсулинов ген и ген мутант с N-гликозилационен противоположен сайт с glaA ген сигнална последователност, се конструират, както следва: pPZG311 се конструира чрез лигиране на 713 вр EcoRI-PstI фрагмент, изолиран от pPZG301, 75 вр Pstl-PstI фрагмент, изолиран от pPZG302 и 74 вр Pstl-Sall фрагмент, изолиран от pPZG303 в EcoRI/Sall, смлян с pUC19 вектор. pPZG312 се конструира чрез лигиране на 713 вр EcoRI-PstI фрагмент, изолиран от pPZG301, 75 вр PstlPstl фрагмент, изолиран от pPZG305 и 74 вр Pstl-Sall фрагмент, изолиран от pPZG303 в EcoRI/Sall, смлян с p(JC19 вектор (фиг.9).

Пример 2. Конструиране на нишкови6 ден плесенен експресионен вектор

I. Експресионна касета тип I pAN52-7NotBCA и _PAN52-7NotBPgA pAn52-7NotuidA (Verdoes et al., Gene (1994) in press) се смила частично c Ncol и Sall. 7,55 кв Sall-Ncol фрагмент, пренасящ glaA промотор и trpC ген от терминационна област, се изолира и лигира с 317 вр Nco-Sall фрагмент на плазмида pPZG311, получен в плазмида pAN52-7NotBCA и 317 вр Ncol-Sall фрагмент на плазмид pPZG312, резултиращ в плазмид pAN52-7NoBPgA (фиг.10).

pAN52-7BCAamdS и pAN52-7BPgAamdS 5.0 кв Notl фрагмент, пренасящ ацетиламидазен (amdS) ген от A. nidulans, е лигиран в Notl сайт на плазмиди pAN52-7NotBCA и pAN52-7NotBPgA, резултиращи в плазмиди pAN52-7BCAamdS и pAN52-7BPgAamdS (фиг.10).

II. Експресионна касета тип II pAN56-7BCAamdS и pAN56-7BPgAamdS Вектори за смесени глюкоамилазен про- инсулин протеин и глюкоамилазен проинсулин мутант с N-гликозилационен противоположен сайт са конструирани както следва: плазмид pPZ304 е усвоен с EcoRV и AlwNI. Фрагмент EcoRV-AlwNl от 25 вр, транспортиращ последователност за 6 аминокиселинен спейсер, е лигиран с 3.07 кв Sall-EcoRV фрагмент от pAN56-7 транспортиращ glA (G2) ген, резултиращ във фрагмент Sall-AlwNI. Вектор ρΑΝ56-7 е получен от вектор ρΑΝ56-4 (Broekhuijsen et al., J. Biotech., 31 (1993) 135145), в който gpdA промотор е заместен c 4.2 кв Notl-Ncol фрагмент от pAN52-7 транспортиращ glaA промотор и в който интерлевкин генът се отстранява, оставайки EcoRV сайт, в посока upstream от GlaG2. Фрагмент AlwNISall тогава е лигиран с 10.6 кв Hind III - Sall фрагмент от pABl-6S (Den Herder et al., Mol. Gen. Genet. 233 (1992) 404-410), който има glaA промотор и amdS ген и с: а/ 1.06 кв AlwNIHind ΙΙΙ-Sall фрагмент от pAN52-7BCA, резултиращ в плазмид pAN56-7BCAamdS, и б/ 1.06 кв AlwNI-Hind III фрагмент от pAN527BPgA, резултиращ във вектор pAN567BPgAamdS (фиг. 11). В спейсера има сайт за двуосновен процесинг Lys-Arg. Последователността около сайта на сливане на глюкоамилазния ген с човешкия проинсулинов ген (ВСА) и проинсулинов мутант (BPgA) чрез спейсер областта е показана фиг. 12.

Пример 3. Трансформация на нишковидни фунги Aspergillus niger

Трансформацията на нишковидните фунги Aspergillus niger е осъществена съгласно описаните методи (Goosen et al., Curr. Genet. 11 (1987) 499-503; Kelly and Hynes, Embo J. 4 (1985) 475-479; Van Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 206 (1987) 71-75).

Нишковидните фунги A. niger N402 (Bos, C.J. et al., Curr. Genet. 14 (1988) 437-443) ca трансформирани c експресионни вектори pAN52-7BCAamdS, pAN52-7BPgAamdS, pAN56-7BCAamdS и pAN56-7BPgAamdS. Колониите са селекционирани върху културални среди с ацетамид или акриламид като единствен източник на въглерод и азот. Започвайки от единични спори, по-нататък са извършени анализи на трансформанти.

Пример 4. Секреция на човешки инсулин в културална среда

1. Култивиране на A. niger трансформанти, носещи човешки проинсулинов ген и ген мутант с N-гликозилационен консенсус сайт

Около 10’ спори от селекционирани трансформанти се инокулират в 500 ml Ерленмайрови колби, съдържащи 100 ml от течна културална среда, съдържаща: 70 mM NaNO₃, 7 mM КС1, 11 mM КН₂РО₄, 2 mM MgSO₄, 4% декстрин, микроелементи (1:1000; 76 mM ZnSO₄, 178 тМ Н₃ВО₃, 25 mM MnCLj, 18 mM FeSO₄, 7.1 mM CoCi,, 6.4 mM CuSO₄, 6.2 mM Na₂MoO₄, 174 mM EDTA) и витамини (1:1000) 100 mg/Ι от тиамин (витамин Bj), 100 mg/1 рибофлавин (витамин В₂), 100 mg/Ι никотинамид, 50 mg/Ι пиридоксин (витамин В₆), 10 mg/Ι пантотенова киселина, 0,2 mg/1 биотин (витамин Н). Трансформантите се култивират при 32°С за 36 h. Щамовете се анализират в присъствие на инсулин.

2. Експресия на инсулин

Експресия на имунореактивен човешки инсулин е демонстрирана чрез “Pharmacia INSULIN RIA 100” kum, Kabi Pharmacia Diagnostics. Щамовете от трансформанти, култивирани чрез ферментация, са филтрирани, филтратите са неутрализирани, разредени, ако е необходимо, и тогава се подлагат на RIA (радиоимуноанализ) определяне (Livessy et al., Clin. Biochem. 13 (1980) 151-55). Нивото на експресията на имунореактивния човешки инсулин (mU/L) в A. niger трансформанти е показано в таблица 1.

Таблица 1

Ниво на експресия в имунореактивен човешки инсулин в различни трансформанти на A. niger

Трансформант

Плазмид

Имунореактивен инсулин (mU/L)

A.niger 7650 [NCAIM (Р) F 001215]	PAN52-7BCAamdS	0
A.niger 7651 [NCAIM (P) F 001216]	PAN52-7BPgAamdS	2
A.niger 7649 [NCAIM (P) F 001214]	PAN56-7BCAamdS	56
A.niger 7638 [NCAIM (P) F 001213]	PAN56-7BPgAamdS	776

Трансформантите A. niger 7650, A, niger 7651, A. niger 7649 и A. niger 7638 са депозирани в “Национална колекция за селскостопански и индустриални микроорганизми”, Н-1502 Будапеща, P.O.В. 53, Унгария, на 18 юли 1994 г., под каталожни номера NCAIM (Р) F 001215, NCAIM (Р) F 001216, NCAIM (Р) F 001214 и NCAIM (Р) F 001213 и съгласно Будапещенския договор за национално признаване депо- 25 зита на микроорганизми за целите на патентната процедура, излагане в случай на оригинален депозит, съобразен с правило 6.1.

С таблицата се доказва, че има специфични различия в трансформантите, съдържащи различни вектори. Несравнено най-добър резултат е показан чрез трансформант, получен от трансформация с вектор, имащ човешки проинсулинов ген, носещ N-гликозилационен консенсус сайт, слят с глюкоамилазен протеин.

Claims

Патентни претенции

1. ДНК последователност, включваща последователност, кодираща инсулинов предшественик с формула B-Pg-A, в която В и А представляват В- и А-вериги на човешки инсулин, съответно Pg представлява модифициран С-пептид или някакъв брой аминокиселини, съдържащи най-малко един N-гликозилационен консенсус сайт и Pg свързва В- и А-вериги чрез протеолитични процесинг сигнали или специфични химически сайтове за разцепване.
2. ДНК последователност, включваща последователност, кодираща инсулинов предшественик с формула В(29)-Ра-А, в която В (29) означава В (1-29), А означава А-верига,

Pg представлява модифициран С-пептид или някакъв брой аминокиселини, включващи наймалко един N-гликозилационен консенсус сайт и Pg свързва В- и А-веригите чрез протеолитични процесинг сигнали или специфични химически сайтове за разцепване.
3. ДНК последователност съгласно претенции 1 и 2, характеризираща се с това, че включва предпочитани кодони за експресия в специфични гостоприемници.
4. ДНК последователност съгласно претенции от 1 до 3, характеризираща се с това, че е слята със защитен протеинов ген чрез спейсер област, транспортиращ протеолитичен процесинг сигнал или специфичен химически сайт на разцепване.
5. ДНК последователност, включваща последователност, кодираща фармацевтичен пептид или протеин, в който N-гликозилационен консенсус сайт е въведен в неосновен сайт в която и да е спейсер област.
6. Трансформирани клетки на подходящ гостоприемник, включващ ДНК последователност съгласно претенции от 1 до 5.
7. Трансформирани плесенни клетки, включващи ДНК последователност съгласно претенции от 1 до 5.
8. Трансформирани Aspergillus sp. плесенни клетки, включващи ДНК последователност съгласно претенции от 1 до 5.
9. Трансформирани клетки, включващи ДНК сегмент съгласно претенции от 1 до 5.
10. Трансформирани плесенни клетки, включващи ДНК сегмент съгласно претенции от 1 до 5.
11. Трансформирани Aspergillus sp. пле сенни клетки, включващи ДНК сегмент съгласно претенции от 1 до 5.
12. Метод за получаване на инсулин, характеризиращ се с това, че се култивират подходящи клетки, за предпочитане плесенни 5 клетки, трансформирани с вектор, включващ ДНК последователност съгласно претенции от 1 ДО 4.
13. Метод за получаване на фармацевтични пептиди или протеини, характеризиращ се с това, че се култивират подходящи клетки, за предпочитане плесенни клетки, трансформирани с вектор, включващ ДНК последователност съгласно претенция 5.