JPS62106100A - タンパク質アミノ末端残基の選択的化学的除去法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子改造した原核細胞内でタンパク質を生合成させろ
と、アミノ末端に結合しているＮ−ホルミルメチオニン
を持ったタンパク質が発現される。

天然のタンパク質へのＮ−ホルミルメチオニンの付加は
、その生物学的活性、コンホーメーション安定性および
抗原性等を変化させることがあるので、できればそれを
除去することが非常に望ましい。

アミノ末端メチオニンと所望の天然ペプチ゛３）間に切
断部位を挿入することによって、理、１？、・、所望の
天然ペプチドを製造するノ２めの方法４−より自由に選
択することができるようになる３、　かじながら、選択
的切断を達成するための実際的な方法は、事実」二、非
常に限られている。

例えば、メチオニンが存在していない天然のタンパク質
では、臭化シアンによる切断（メチオニンは選択的切断
部位である）が、天然のタンパク質を製造するための非
常に効果的な方法であることが証明されている。しかし
ながら、実際には、清適のサイズのペプチドおよびタン
パク質において、メチオニンが含有されていないことは
希である。従−て、非常に重要な課題は、天然の生合成
タンパク質の生成を伴なった、アミン末端メチオニンの
切断方法を見い出ヤことである。

アミノ末端メチオニルタンパク質から、天然のタンパク
質を製造するためのアプローチを決定すろ重要な、予想
外の観察は、生合成発現産物、例えばＮ　〜メチオニル
ー（ヒＩ・成長ホルモン）のα−アミノ基は、ホルミル
化されないということである。この事実は、最初、シア
ネートを用いた発現産物の化学修飾を通して観察され、
後に自動エドマン（Ｅｄｍａｎ）アミノ酸配列分析によ
って確認された。Ｅ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）発現微生
物は、開始メチオニンを切断することはできないが、多
分酵素的に、Ｎａ−示ルミル基を実際に除去する。従っ
て、このアミノ末端メチオニン発現産物のα−アミノ基
を、切断のために直接（少な（とら可能性として）使用
することができる。

アミノ末端メヂオニル発現産物に遊離α−アミノ基か存
在することは、メチオニルの除去のための別のアプロー
チの可能性を生じる。１つのアプローチとして、フェニ
ルイソチオシアネートを使用して選択的エドマンタイプ
アミノ末端配列切断を実際に行なうためには、天然のタ
ンパク質にリジン残基が含まれていないことが必要であ
る。しかしながら、リジンを含有していないタンパク質
は非常に福である。

別の可能なアプローチは、エクソペブヂグーセの使用で
あり、これらは、原（川として、段階的にアミノ酸を切
断する。合成の研究におけるエクソベプチダーゼの利用
は、その不均質な性質、費用がかかること、変性し易い
こと、および最ら重要な要素として、異なった基質に対
する特異的および非特異的作用が非常に多様であること
などの多数の理由から、成功の報告が非常に少ない。

本発明者らは、所望の最終ペプチド産物を製造する目的
で、選択的アミノ末端切断を行なうのに有用な、新規な
化合物を得ろための新しい化学的方法を見い出した。

本発明は、この様な方法およびそれに有用な化合物を提
供する乙のである。

従って、本発明は、式。

Ｈ−Ｘ−Ｐｒｏ−（ペプチド） ［式中、Ｘは天然のアミノ酸の残基であり、（ペプチド
）は生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質のアミ
ノ酸残基配列を規定するアミノ酸残基配列であるコ て示される一連の化合物に関するものである。

本発明は、式： ％式％） ０式中、Ｘは天然のアミノ酸残基であり、（ペプチド）
は生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質を規定す
るアミノ酸の配列である］で示される化合物から、生物
学的に活性なペプチドまたはタンパク質を規定するアミ
ノ酸配列を有する化合物を製造するための方法を提供す
るものである。本方法の１態様は、Ｉ−ｔ−Ｘ−Ｐｒｏ
−（ペプチド）を、非プロトン性溶媒中、弱い酸条件に
おくことからなる。本方法の第２の態様では、Ｉ−Ｉ−
Ｘ−Ｐｒｏ−（ペプチド）を、緩衝化水性媒体中、酸、
中性、またはアルカリ条件におく。いずれの態様におい
てら、Ｈ−Ｘ　−Ｐ　ｒｏ部分のジケトピペラジンか生
成すると共に、（ペプチド）の切断および脱離が起こる
。

本発明者らが見い出し、本発明の物質を１悦明する方法
には、式： ％式％） 「式中、Ｘおよび（ペプチド）は前記と同色義を有する
３ で示される化合物のデザインされた生合成的生産が含ま
れる。この化合物は、現在では広く行なわれている組換
えＤＮＡ法を使用して製造することができ、直接発現産
物として、または＋ｉｉｉ駆発現産物の処理の結果とし
て間接的に得ることかできる。

化合物、Ｈ−Ｘ−Ｐｒｏ−（ペプチド）は、今まで組換
えＤＮＡ法で直接製造することができなかった、［（ペ
プチド）−ｊなる語句で示されろ所望の化合物を得るた
めに非常に有用である。化合物、Ｈ−Ｘ−Ｐｒｏ−（ペ
プチド）を本発明の方法で処理すると、中間体ジケトピ
ペラジンの生成を経て、所望の生成物（ペプチド）か得
られろ。非プロトン性溶媒中の切断は、通常、以下の反
応式で示されるＹ　　　　　Ｈ，Ｏ ｌＩ 上記式中、基・Ｙは天然のアミノ酸の側鎖である。

Ｉ−［−Ｘ　−Ｐｒｏ−（ペプチド）（こお（する基二
Ｘは、仝ゆる天然のアミノ酸の残基を表わす。しかじな
から、Ｐ　ｒｏ　−Ｐ　ｒｏ配ｙ１ｊは、これを経て切
断か進行する所望のノケトベペラノン中間体の生成を非
常に遅く４−ろたけなので、Ｘて表わされるアミノ酸残
基はプロリン以外であることか好ましい。ｔ−ｒ　−Ｘ
−Ｐｒｏ−（ペプチド）は、組換えＤＮＡ法によって製
造されることが多い。この化合物が発現産物として直接
、製造される場合、基：Ｘはメチオニルであり、従って
、本発明の状況において最も好ましいＸはメチオニルで
ある。しかしながら、基・Ｘがメチオニル以外である時
には、化合物の供給踪は生合成であってらよい。しかし
ながら、１（−Ｘ−Ｐｒｏ−（ペプチド）を得るために
、発現産物をまず、多数の方法のいずれかによって処理
する。

本明細書で使用するｒＰｒｏｊなる語句は、天然のアミ
ノ酸であるプロリンのアミノ酸残基を色味する。

「（ペプチド）」で表わされる基は、例えばプロインシ
ュリン、ヒト成長ホルモン、ウノ成長ホルモン、α−イ
ンターフェロン、β−インターフェロン、γ−インター
フェロン、インターロイキン−１、インターロイキン−
２、成長ホルモン放出因子、イン／ニリン様成長因子、
組織プラスミノーゲン活性化因子、プコテインＣ等、お
よび既知の生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質
の適切に改良された形態を包含する、広範な生物学的に
活性なペプチドおよびタンパク質のアミノ酸残基の配ク
リを規定するアミノ酸残基の配列である。

ｌ−１−Ｘ−Ｐｒｏ−（ペプチド）の例はＭｅｔ−Ｐｒ
ｏ−（ヒト成長ホルモン）、Ａ　Ｉａ−Ｐ　ｒｏ−Ｃａ
−インターフェロン）、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−（インターロ
イキン−２）、Ｍｅｔ−利’ｒｏ−（γ−インターフェ
ロン）、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ　−（ウソ成長ホルモン）、Ｍ
ｅｔ−Ｐ　ｒｏ　−（組織プラスミノーゲン活性化因子
）、 Ｓ　ｅｒ　−Ｔ）ｒｏ−（ヒト成長ホルモン）、Ａ　ｓ
ｐ　−１）ｒｏ　−（ヒト成長ホルモン）、Ｍｅｔ−Ｐ
ｒｏ−（成長ホルモン放出因子）、Ｍｅｔ−Ｐ　ｒｏ　
−（プロティンＣ）、１、ｅｕ　−Ｐ　ｒｏ　−（イン
／ニリン様成長因子）等てあこれらによって例示される
、２側の具体的に示されたアミノ酸残基か所望の最終産
物ペプチドに付加された配列を有する化合物から、広範
な、池の方法では入手し得ない、生物学的に活性なポリ
ペプチドおよびタンパク質が得られる。そのアミノ末端
に、天然のアミノ酸残基、次いでプロリン残基で構成さ
れているジペプチドをａしている化合物は、このジペプ
チドの切断、即ち所望の最終生成物の生成を行なうのに
適している。最後尾から２番目のプロリンは、アミノ末
端／ペプヂトにおいてノスー配置を示し、それによって
、末端α−アミノをプロリンカルボニルの攻撃のために
より好ましい位置に固定する「ギノン（Ｇｉｓｉｎ、　
Ｂ。

Ｐ、）およびメリフィールｌ；’（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌ
ｄ、　ｎ。

Ｂ　）のツヤ−ナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソ
サエティ（Ｊ　、　Ａｍ、　Ｃｈｃｍ、　　ＳＯＣ，）
−リー、３１０２−３１００（１９７２）参ｊｊｊｉ　
］。この部位における求核攻撃は、脱離Ｊ舌としての所
望のペプチドの放出を伴った、エネルギー的に何利な環
状のアミノ酸−プロリンノケトピベウシンの生成により
、（−Ｔ　１１となる。非プロトン性溶媒中のこの反応
の主要な特徴は、弱酸によるその触媒現象である。１つ
の問題、即ち、本発明の方法のこの態様を実施し得るか
否かを決めろ手掛かり、および予測することができない
これに対する答えは、所望の最終生成物が安定、かつ可
溶性である条件下で、ノケトピペウシンの生成を伴って
脱離するように、所望の最終生成物のアミノ末端残基が
適当な脱離基として作用するかどうかである。出版され
ている固相ペプチド合成の文献の量は非常に多いにもか
かイっらず、ノケトビペラジンの生成は、加水分解か機
能化された樹脂エステル結合のものである合成のノペブ
チジル工程において報告されているに過ぎないようであ
る。アミドの加水分解が必要な、Ｘ　−Ｐ　ｒｏ配列に
おけろノケトピペラジンの生成について報告かないとい
うことは、エステルに比較するとアミドの酸安定性が高
いという一般に受は入れられている原理から、驚くには
当たらない。この沈黙は、本発明方法の成功の可能性に
強く反論する乙のである。

本発明方法の第１の態様によろｌ−１−Ｘ−Ｐ　ｒｏ　
−（ペプチド）化合物の処理は、好ましく：よ実質的に
水を含４ＴＩ、ない非プロトン性溶媒中て行なわれる。

この条件は通常、積極的な水の添加を避けろた（Ｊで満
たずことができる。非プロトン性溶媒の例は、ｌ−メチ
ルピロリジノン（Ｎ　Ｍ　Ｐ　）、Ｎ　、Ｎ−ツメデル
ポルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキンド（ＤＭ
ＳＯ）、ポルムアミド、ヘキザメヂルポスポラミド（Ｈ
ＭＰＡ）等である。好ましい溶媒は、ＮＭＩ）、Ｄ　Ｍ
　Ｉ”およびＤＭＳＯであり、これらの内、ＮＭＰが最
も好ましい。

非プロトン性溶媒中での反応は、酢酸、リン酸、亜リン
酸、硫酸、トリフルオロ６′「酸、ギ酸、マレイン酸、
酒石酸、グリシン等を使用し、弱い酸性条件丁で行なう
。非常Ｚこ好ましい酸は、酢酸でうる。

この脱離反応は、緩衝化水性媒体中で行なうことらでき
ろ。水が反応媒体である場合、リン酸緩衝液中で反応さ
せるのが好ましい。

非プロトン性溶媒中で行なう場合、通常約１５℃〜約５
０’Ｃ１好ましくは約２５℃〜約４０℃の範囲内の温度
で本発明の方法を行なう。酸濃度は、通常的０．１Ｍ〜
約１Ｍ、好ましくは約０２５Ｍ〜約０　５Ｍ、非常に好
ましくは約０．３０Ｍ〜約０３５Ｍの範囲であり、特に
約０．３３Ｍが好ましい。

水性媒体中で行なう場合、温度は幾分高いことが必要で
ある。従って温度は、例えば、通常約２５℃〜約６０℃
１好ましくは約３５℃〜約５０℃の範囲である。反応温
度の選択は、「（ペプチド）」の安定性およびＨ−Ｘ−
Ｐｒｏ−（ペプチド）におけろ３番目のアミノ酸の性質
に依存する。３番目のアミノ酸残基の安定性および性質
に適合する限り、温度は高いほど好ましい。緩衝液の濃
度は、通常的０．１Ｍ〜約２Ｍ、好ましくは約０，５Ｍ
〜約１Ｍ、非常に好ましくは約０．８Ｍ〜約Ｉ　Ｍであ
る。

好ましい緩衝化塩は、リン酸塩である。切断の収率は、
高いｐＨ値でもわずかに増大するだけであり、高い値で
は望ましくない副作用の可能性が人きくなるので、約８
のＩ）Ｉ（か好ましい［マソケロー（ＭｃＫｃｒｒｏｗ
、、Ｊ　、　Ｉｌ、　）およびロヒノソン（ＩＬ　ｏｂ
　１ｎｓｏｎ、Ａ、　Ｂ、　）のアナリティカル・バー
（オケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　　［３ｉｏ
ｃｈｅｍ、　）４２．５６５−５６８（１９７２）参、
明］。

脱離反応は、ノケＩ・ピペラジノの生成を定期的に監視
しながら行なう。ｌｒ！ｉ当と思われろ時に反Ｌ１Ｓを
柊γさ什、既知の子離方法を使用し、反応混合物から脱
離生成物を回収する。

以下に実施例を挙げて本発明を説明するか、これらの実
施例は、本発明の範囲を限定する乙のではない。

本発明のためのモデルとして何月な、選択さイコ。

たペプチドを、固相合成法によって調製した。高性能液
体クロマトグラフィーによって、その純度を確認した。

切断前に、ペプチドを、ｌｉ（定形の凍結”ＯＥ燥固形
物として保Ｈ−１，た。多数の実験上のパラメーターを
変化さｕ′ｆこ。切断におけろその１１杉′！〒を、本
明細書に記ｌｉＩ！　４−ろ。

以下に、それぞれｒ１機および水性媒体を使用（７、ペ
プチド、ＭｅＬ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎｌ１２に
適用した時の最適条件を１記載する。ただし、ｌ−Ｎ　
Ｈ２ｊは、ペプチドのＣ−末端におけるアミド部分の存
在を色味する。

Ａ、ａ機切断条件 Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨｔｌ　Ｏミリグ
ラムを、４人のモレキュラーシーブを加えて１週間保存
することによって予め無水にしておいたＮ−メチルピロ
リジノンｌ、ψＱに溶解した。混合物を絶えず撹拌しな
から２５℃に維持し、氷酢酸（１−１０Ａｃ）を０３３
Ｍの濃度まで添加することによって、反応を開始させた
。逆相クロマトグラフィー分析により、メチオニループ
ロリンジケトピペラノン生成物の出現、および出発物質
であるペプチドの消失を調べることによって、切断の速
度をモニターした。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ
）に入れたウルトロスフェアー（ｔＪ　１ｔｒｏｓｐｈ
ｅｒｅ）Ｃ＋ｓの０，４６Ｘ２５ｃｍカラムを用い、ア
セトニトリルグラノエントを使用して、クロマトグラフ
ィーを行なった。それぞれの分析時点で、０．１％トリ
フルオロ酢酸を加えて１０倍希択４−ることによって、
反応を終了さけた。７ケトピペラノンのピークを集め、
アミノ酸分析およびマススペクトル分析によって同定し
た。

以下の表１−８は、ａ機切断条件を使用し、選択パラメ
ーターを変化させて得た結果を示す。

表１は、切断をＤＭＦ中、２５℃で行なう時の、種々の
酸濃度におけるノケトピベラジン生成物の濃度を示す。

反応の評価し得る速度を記録すると、これは、弱酸の濃
度に依存することが観察される。

ＤＭＳＯ中で同じ弱酸処理を行なうと、切断の速度が低
下する。表２に示す様に、ＤＭＳＯ中、切断の温度を４
０℃に上昇さけると、ＤＭＰ中、２５℃で逓成される速
度に匹敵する反応の速度を示す。

表１ 酸濃度（２５℃における、Ｍｅｔ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　
ｌｙ　−Ｇｌｙ　　Ｎｌ２からのメチオニンープロリン
ジケトビペラノンの生成） 表炎 酸濃度（４０℃における、Ｍｅｔ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　
！ｙ　−Ｇ　１ｙ−Ｎ　ｆ−［２からのメチオニン−プ
ロリンジケトピペラジンの生成） 上の表から明らかな様に、見掛けの最適酸濃度は、約０
．２５Ｍ〜約０．５Ｍである。

表３は、３番目の残基の側鎖だけが穴な−でいる一連の
ペプチドにおけろ温度の影響を凋へた結果を示す。この
１１；位において立体障害が高まると、反応の速度か遅
くなるということか非常に明白である。しかしながら、
すべての場合において、評価し得ろ切断が記録された。

表３ 温度の影響（１Ｍ酢酸／ＤＭＦ中、２つの温度における
、メチオニン−プロリンジケトピペラジンの生成） ａ：　　Ｎ、Ｄ、　　”試験せず ｂ：ＭＰＧＧ−ＮＨｘ＝Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−ＮＨ２ＭＰＴＧ−Ｎｔｌ、＝Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｔｈ
ｒ−Ｇｌｙ−ＮＨ。

ＭＰＰＧ　−Ｎｔｌ２　＝　Ｍｅｔ　−Ｐｒｏ　−Ｐｒ
ｏ　−Ｇｌｙ　−ＮＩ＋ｔＭＰＦＣ−ＮＨｔ　＝　Ｍｅ
ｔ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ　−Ｇｌｙ　−ＮＨ２重要な因
子は、非プロトン性溶媒の選択である。

溶媒は、所望の最終産物を生成する切断を伴ったジケト
ピペラジンの形成を助けるか、または少なくとも阻害し
ないものであって、同時に、最終ペプチド生成物に対す
る分解効果が最小であるものてなければならない。表４
−８は、有機切断条件下で使用されろ種々の溶媒の特性
についての情報を引き出すためにデザインされた試験か
らの結果を示す。

表４は、有機切断条件に置いた時の多数のタンパク質お
よびペプチドの安定性の情報を示す。選ばれたタンパク
質またはペプチドを、記載の反応媒体に、記載の時間さ
らした後に残留している量を逆相高性能液体クロマトグ
ラフィー（ＨＰＬＣ）で求め、パーセントで示す。ＤＭ
ＦとＤ　Ｍ　Ｓ　Ｏでは、ＤＭＳＯが相対的に優位であ
ることがわかる。

表４ タンパク質の安定性 □□口 □□□□」 ａ：　　ｂＰＩ’−ウシすい臓ポリペプチドＧＲＦ−成
長ポルモン放出因子 Ａ（ＳＯ−３）４−インシュリンＡ−鎖Ｓ−スルボネー
ト Ｂ（ＳＯ−３）、＝インシュリンＢ−鎖Ｓ−スルボネー
ト ｂ・　非処理外部対照に対し、残留物の相対パーセント
を求めた。

表５は、表４と同様に、メチオニルヒト成長ホルモンを
使用して行なった安定性試験の結果を示す。この結果か
ら、ＮＭＰは、ＤＭＦよりもＤＭＳＯに類似しているこ
とがわかる。

表ｉ・ メチオニルヒト成長ホルモンの安定性 ａ：　逆相１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃによって求めたものｂ・
　陰イオン交換ＨＰ　Ｌ　Ｃによって求めたもの表６は
、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨｙの切断にお
ける多数の溶媒の影響を調べた結果を示す。

表６ 溶媒の影響（Ｍｅｔ−Ｐｒｏジケトピペラジン生成の関
数としての、Ｍｅｔ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　
ｌｙ　−Ｎ　Ｈｚの消失） ａ：　残留している出発物質の量を表わす。

ｂ：　　１１．ｐ、＝試験せず Ｃ：　４０℃において求めた。

上から、非常に好ましい溶媒は、ＮＭＰ、ＤＭＦおよび
ＤＭＳＯの、全て非プロトン性有機溶媒である。

表７は、溶媒としてＤＭＦまたはＤＭＳＯを使用し、種
々のペプチドに対する温度の影響を調べた結果を示す。

友工 温度の影響（選ばれた２溶媒中、１ＭＨＯＡｃ。

４０℃におけろ、メチオニンープロリンジヶトピａ：　
　ＭＰＧＧ　　ＮＨ，＝Ｍｅｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌ
ｙ−Ｎｌｌ。

ＭＰＴＧ　−Ｎｉ１Ｎ１１２＝　−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇ
ｌｙ　−Ｎｉｌ。

ＭＰＰＧ　−ＮＨ２”Ｍｅｔ　−Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ−Ｇ
ｌｙ　−Ｎｉ１２ＭＰＦＣ−ＮＩＩｔ＝Ｍｅｔ　−Ｐｒ
ｏ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ　−Ｎ１１ｔ表７および前記のそ
の他の表からのデータが示すように、ＤＭＦは、ジケト
ピペラジンの生成およびそれに伴う切断において、ＤＭ
ＳＯよりも大きい効果を有しているが、一方、生成物で
あるタンパク質またはペプチドに対し、より大きい分解
効果ら有している。最適の結果を達成するためには、個
々のペプチドまたはタンパク質生成物についてバウシス
のよい反応条件を選択し、適用しなければならない。

表８は、グループ：（ペプチド）がヒト成長ホルモンで
ある本発明の化合物を模造したモデルペプチドに有機切
断条件を適用し、得られたデータを示す。ヒト成長ホル
モンの最初の２アミノ酸はＰｈｅ　−Ｐ　ｒｏなので、
ヒト成長ホルモンは特別の状況を表わすということに注
意すべきである。従って、本発明の化合物のＸ−Ｐｒｏ
からジケトピペラジンを生成させ、得られたヒト成長ホ
ルモンの開始Ｐｈｅ　−Ｐ　ｒｏから次のジケトピペラ
ジン形を見い出だすことが可能である。表８は、Ｍｅｔ
　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−’Ｉ”ｈｒ　−１ｉｅ
−ＮＨｔとＰ　ｈｅ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｔ　ｈｒ−Ｉｌｅ
　　ＮＨｔの比較である。この結果から、後者からのジ
ケトピペラジンの生成の方が遅いことがわかる。従って
、本発明の化合物である、化合物Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−ヒト
成長ホルモンの処理の条件を、単一のジケトピペラジン
の生成を最大にするように、およびそれに伴う開裂が、
２次的なジケトピペラジンの生成を最小とするように正
確に決定することができる。この点については、ジケト
ピペラジンの生成のレベルがＤＭＳＯ中におけるレベル
より￥−Ｔ意に大きく、後の時点では、ＤＭＦ中で達成
されるレベルとほぼ同じなので、ＮＭＦは非常に望まし
い溶媒である。成長ホルモンの安定性が、ＤＭＦに対す
るよりもＮＭＰに対して高い（表５）ということを考慮
すると、少なくともこの適用のためには、Ｎ　Ｍ　Ｐは
、明らかに望ましい溶媒である。

表８ 成長ホルモンモデルペプチドからのジケトピペラジンの
生成 Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ　−１１ｅ−
ＮＨ２Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉ　１ｅ−ＮＨ２Ｂ、
水性切断条件 ペプチドｌａｇを１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶
解することによって、Ｍｅｔ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｙ
　−Ｇ　ＩｙＮＨ２の最適な水性切断を行なった。切断
の速度を速めるために、温度を２４時間、５５℃に維持
した。有機切断のための記載と同じ方法で、切断の割合
を調べた。

以下の表９〜１２は、緩衝化水性媒体中、酸、中性、ア
ルカリ条件を使用して得た結果を示す。

表９は、基質としてペプチド、Ｍｅｔ　−Ｐ　ｒｏ　−
Ｇ　１ｙ−Ｇｕｙ−ＮＨ２を使用し、ｐＨ７、０で切断
した時の収率を示す。２種類の緩衝化塩および濃度を使
用し、異なった３温度を調べた。この結果から、最も良
い結果か得られた１、０Ｍの濃度の酢酸塩よりも、リン
酸塩緩衝液か好ましいということがイっかる。

贋腎−２− ｐＨ７、０における、Ｍｅｔ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｙ
　−Ｇ　１ｙ−Ｎ　Ｈ、からのメチオニン−プロリンジ
ケトピペラジンの生成に対する、種々の緩衝液系および
濃度の影響 ＊　１００℃におけるメチオニンープロリンジケトピペ
ラノンの生成は、２時間後に調べた。４０℃および２５
℃における生成は、７２時間後に調べた。

緩衝化水性媒体中、４０℃における、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ　
　Ｇｌｙ　　Ｇｌｙ　　ＮＨｔからのメチオニン−プロ
リンジケトピペラジンの生成に対するＩ）Ｈの影響の試
験結果を表１０に示す。リン酸ナトリウムを緩衝化塩と
して使用した。この結果から、アルカリのｐＨが好まし
いことがわかる。より高いｐＨ値では、脱アミドおよび
脱硫の様な望ましくない副反応が促進されるので、約８
のｐＨが好ましい。

聚上立 １．０Ｍリン酸ナトリウム中、４０℃における、メチオ
ニン−プロリンジケトピペラジンの生成に対するｐ）（
の影響 表１１は、ｐ＋−ｒ　８　、０および４０℃における、
Ｍｅｔ　−Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｎ　
Ｈ２からの切断収率に対する種々の緩衝化塩の影響の試
験結果を示す。

リン酸ナトリウムが好ましい緩衝剤である。

表！■ ｐ）１８．０および４０℃における、Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−
Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｎ　［Ｉ、からのメチオニン
−プロリンジケトピペラジンの生成に対する種々の緩衝
化塩の影響 表１２は、Ｎ−末端から３番目の残基の側鎖だけが異な
っている一連のペプチドにおける、メチオニンープロリ
ンジケトビペウシンの生成に対する温度の影響の試験結
果を示す。面記、表３に記載した試験と同様（と、３番
目の残基の部位における立体障害が高まると、反応が遅
くなるということが明白である。しかしながら、２例を
除く全てに評価し得る切断が記録された。温度を４０℃
から５５℃に上昇させると、試験した４つのテトラペプ
チドの全てにおいて、切断の速度および割合が著しく高
まる。

聚１主 温度の影響（ｐＨ８、０の１．０Ｍリン酸緩衝液中、２
つの温度における、メチオニン−プロリンジケトペラジ
ンの生成） ａ　　ＭＰＧＧ−ＮＨ，＝Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−ＮＩｌ＊ＭＰＴＧ　−ＮＨ，；Ｍｅｔ　−Ｐｒｏ
−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ　−ＮＨｚＭＰＰＧ　−ＮＨｔ　＝　
Ｍｅｔ　−Ｐｒｏ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ　−ＮｌｌｔＮ
ｌｌｔ　−ＮＨｔ＝Ｍｅｔ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ−Ｇｌ
ｙ　−ＮＨ。

ペプチドおよびタンパク質の代表的なサンプルについて
上記の切断方法を行なうことによって得た生成物を、高
性能陰イオン交換および逆相クロマトグラフィーによっ
て分析し、評価した。陰イオン交換クロマトグラフィー
は、３０％のアセトニトリルを含有している０、０５Ｍ
トリス、ｐＨ８０の緩衝液に入れたモノ（Ｍｏｎｏ）Ｑ
カラムで行なった。塩化ナトリウムの直線グラジェント
を使用し、溶離した。逆相分析は、０．１Ｍリン酸アン
モニウム、４５℃、ｐＨ７，０中、アセトニトリルグラ
ジェントを使用し、ゾルパックス（Ｚｏｒｂａｘ　Ｃｅ
、１５０人細孔サイズのカラムで行なった。

特許出願人　イーライ・リリー・アンド・カンパニー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式： Ｈ−Ｘ−Ｐｒｏ−（ペプチド） ［式中、Ｘは天然のアミノ酸の残基であり、（ペプチド
   ）は生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質のアミ
   ノ酸残基配列を規定するアミノ酸残基配列である］ で示される化合物。 ２、ＸがＭｅｔである第１項に記載の化合物。 ３、（ペプチド）が、プロインシュリン、ヒト成長ホル
   モン、ウシ成長ホルモン、α−インターフェロン、β−
   インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロ
   イキン−１、インターロイキン−２、成長ホルモン放出
   因子、インシュリン様成長因子、組織プラスミノーゲン
   活性化因子、プロテインＣ、またはこれらの生物学的に
   活性な形の改良体からなる群から選ばれるペプチドを規
   定するアミノ酸残基の配列である第１項または第２項に
   記載の化合物。 ４、（ペプチド）がヒト成長ホルモンである第３項に記
   載の化合物。 ５、（ペプチド）がウシ成長ホルモンである第３項に記
   載の化合物。 ６、式： Ｈ−Ｘ−Ｐｒｏ−（ペプチド） ［式中、Ｘは天然のアミノ酸の残基であり、（ペプチド
   ）は生物学的に活性なペプチドまたはタンパク質を規定
   するアミノ酸の配列である］ で示される化合物から、生物学的に活性なペプチドまた
   はタンパク質を規定するアミノ酸配列を有する化合物を
   製造するための方法であって、Ｈ−Ｘ−Ｐｒｏ−（ペプ
   チド）を、 ａ）非プロトン性溶媒中、弱い酸条件 または ｂ）緩衝化水性媒体中、酸、中性またはアルカリ条件に
   おき、 （ペプチド）の切断および脱離を伴って、Ｈ−Ｘ−Ｐｒ
   ｏ部分のジケトピペラジンを生成させることを特徴とす
   る方法。 ７、ＸがＭｅｔである第６項に記載の方法。 ８、（ペプチド）が、プロインシュリン、ヒト成長ホル
   モン、ウシ成長ホルモン、α−インターフェロン、β−
   インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロ
   イキン−１、インターロイキン−２、成長ホルモン放出
   因子、インシュリン様成長因子、組織プラスミノーゲン
   活性化因子、プロテインＣ、またはこれらの生物学的に
   活性な形の改良体を規定するアミノ酸残基の配列である
   第６項または第７項に記載の方法。 ９、（ペプチド）がヒト成長ホルモンである第８項に記
   載の方法。 １０、（ペプチド）がウシ成長ホルモンである第８項に
   記載の方法。 １１、非プロトン性溶媒が、Ｎ−メチルピロリジノン、
   Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド
   、ホルムアミドまたはヘキサメチルホスホラミドである
   第６項〜第１０項のいずれかに記載の方法。 １２、非プロトン性溶媒がＮ−メチルピロリジノンであ
   る第１１項に記載の方法。 １３、弱い酸条件が、酢酸、リン酸、亜リン酸、硫酸、
   トリフルオロ酢酸、ギ酸、マレイン酸、酒石酸またはグ
   リシンの添加によって作られる第６項〜第１２項のいず
   れかに記載の方法。 １４、酸が酢酸である第１３項に記載の方法。 １５、約１５℃〜約５０℃の温度で行なわれる第６項〜
   第１４項のいずれかに記載の方法。 １６、酸濃度が約０．１Ｍ〜約１Ｍである第６項〜第１
   ５項のいずれかに記載の方法。 １７、酸濃度が約０．３０Ｍ〜約０．３５Ｍである第１
   ６項に記載の方法。 １８．Ｈ−Ｘ−Ｐｒｏ−（ペプチド）を、緩衝化水性媒
   体中、中性またはアルカリ条件におくことからなる第６
   項〜第１０項のいずれかに記載の方法。 １９、緩衝化塩が、リン酸塩、亜リン酸塩または亜鉛酸
   塩である第１８項に記載の方法。 ２０、緩衝化塩が約０．１Ｍ〜約２．０Ｍの濃度で含ま
   れているリン酸塩である第１９項に記載の方法。 ２１、リン酸塩が約０．８Ｍ〜約１．０Ｍの濃度で含ま
   れている第２０項に記載の方法。 ２２、約７〜約９のｐＨで行なわれる第１８項〜第２１
   項のいずれかに記載の方法。 ２３、約ｐＨ８で行なわれる第２２項に記載の方法。 ２４、約２５℃〜約６０℃の温度で行なわれる第１８項
   〜第２３項のいずれかに記載の方法。 ２５、約３５℃〜約５０℃の温度で行なわれる第２４項
   に記載の方法。