KR101782174B1 - 한정된 이성체 함량을 갖는 디케토피페라진 마이크로입자 - Google Patents

한정된 이성체 함량을 갖는 디케토피페라진 마이크로입자 Download PDF

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Abstract

본원은 푸마릴 디케토피페라진(FDKP) 조성물 및 약 45% 내지 약 65%의 특정한 트랜스 이성체 함량을 갖는 마이크로입자를 개시한다. FDKP 마이크로입자는 약물, 예컨대 내분비 호르몬, 예를 들면 펩티드, 예컨대 인슐린, 글루카곤, 부갑상선 호르몬 등을 포함할 수 있고 약물의 폐 전달을 위한 분말 제제를 제조하기 위해 사용될 수 있다.

Description

한정된 이성체 함량을 갖는 디케토피페라진 마이크로입자{DIKETOPIPERAZINE MICROPARTICLES WITH DEFINED ISOMER CONTENTS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 35 U.S.C. § 19(e) 하에 2009년 6월 12일자에 출원된 미국 가출원 제61/186,779호로부터의 이익을 청구하고, 이의 내용은 그 전문이 참조문헌으로 본원에 포함된다.
기술 분야
본원은 약 45% 내지 약 65%의 특정한 트랜스 이성체 함량을 갖는 푸마릴 디케토피페라진(FDKP) 조성물 및 마이크로입자를 개시한다. 당뇨병 및 비만을 비롯하여 내분비 기관의 질환 또는 질병과 같은 질환 또는 질병의 치료에 있어서 약물 또는 활성제에 대한 전달 시스템으로서 FDKP 마이크로입자를 사용할 수 있다.
약물 전달은, 특히 전달하고자 하는 화합물이 피험체에게 경구 투여될 때 이의 표적 위치에 도달하기 전에 위장관에서 마주치는 조건 하에 불안정할 때, 수년 동안 주요 문제점을 갖는다. 예를 들면, 특히 투여 용이성, 환자 순응도 및 바람직한 비용의 면에서 약물을 경구로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 많은 화합물이 경구로 투여될 때 비효과적이거나 낮거나 가변적인 효능을 나타낸다. 아마도, 이것은 약물이 소화관에서의 조건에 불안정하거나, 약물이 비효율적으로 흡수되기 때문이다.
경구 약물 전달과 관련된 문제점으로 인해, 폐로의 약물 전달을 조사하였다. 예를 들면, 혈관확장제, 계면활성제, 화학요법 물질, 또는 독감 또는 다른 호흡기 질환용 백신과 같은 통상적으로 폐로 전달된 약물은 폐의 조직에 효과를 미치도록 설계된다. 뉴클레오티드 약물을 비롯한 다른 약물이 폐로 전달되는데, 왜냐하면 이것은 낭포성 섬유증에서의 유전자 치료와 같은 치료에 특히 적절한 조직을 나타내기 때문이며, 여기서 결함 아데노신 데아미나제를 발현하는 레트로바이러스 벡터가 폐에 투여된다.
전신 효과를 갖는 물질에 대한 폐로의 약물 전달을 또한 수행할 수 있다. 전신 물질의 전달을 위한 폐의 이점으로는 넓은 표면적 및 폐의 점막에 의한 흡수의 용이성을 들 수 있다. 모든 이러한 형태의 폐 약물 전달과 관련된 하나의 문제점은 약물이 기관에 늘어선 섬모와 같은 모든 천연 장벽을 통과하게 하고 균일한 용적 및 중량의 약물을 투여하려고 시도하는 데 있어서의 문제점으로 인해 약물을 폐로 전달하기 어렵다는 것이다.
따라서, 약물의 폐 전달에서 개선을 위한 여지가 존재한다.
본 개시내용은 폐로의 개선된 약물 전달을 허용하는 시스템, 마이크로입자 및 방법을 제공한다. 본원에 개시된 실시양태는 한정된 이성체 함량을 포함하는 디케토피페라진 마이크로입자를 제공함으로써 개선된 전달을 성취한다. 특히, 디케토피페라진 마이크로입자는 약 45% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 갖는 푸마릴 디케토피페라진(FDKP) 화합물로 예시된다. 이 범위에서 트랜스 이성체 함량을 갖는 FDKP 마이크로입자는 개선된 공기역학적 성능과 같은 폐로의 약물 전달에 유리한 특징을 나타낸다.
본원에 개시된 일 실시양태는 약 45% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 포함하는 FDKP 마이크로입자를 포함한다. FDKP 마이크로입자의 다른 실시양태에서, 트랜스 이성체 함량은 약 50% 내지 약 65%, 약 52% 내지 62%, 또는 약 53% 내지 약 65%일 수 있다. FDKP 마이크로입자의 다른 실시양태에서, 트랜스 이성체 함량은 약 53% 내지 약 63%이다.
다른 실시양태에서, FDKP 마이크로입자는 약물 또는 활성제를 포함한다. FDKP 마이크로입자의 다양한 실시양태에서, 약물은 예를 들면 펩티드, 예를 들면, 인슐린, 글루카곤 유사 펩티드-1(GLP-1), 글루카곤, 엑센딘, 부갑상선 호르몬, 칼시토닌, 옥신토모듈린 등일 수 있다. FDKP 마이크로입자의 다른 실시양태에서, 펩티드 함량은 다운스트림 가공 조건에 따라 달라질 수 있다. 특정한 예에서, 표적 또는 전달하고자 하는 용량에 따라 변할 수 있는 약물/펩티드 함량을 갖도록 FDKP 마이크로입자를 제조할 수 있다. 예를 들면, 약물이 인슐린인 경우, 인슐린 성분은 마이크로입자를 포함하는 분말 제제 중에 약 3 U/㎎ 내지 약 4 U/㎎일 수 있다.
본원에 개시된 실시양태는 또한 마이크로입자를 포함하는 건조 분말을 포함한다. 일 실시양태에서, 건조 분말은 약 45% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 포함하는 FDKP 마이크로입자를 포함한다. 건조 분말의 다른 실시양태에서, FDKP 마이크로입자는 약 50% 내지 약 65%, 약 52% 내지 62%, 또는 약 53% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 가질 수 있다. FDKP 마이크로입자를 포함하는 건조 분말의 다른 실시양태에서, 트랜스 이성체 함량은 약 53% 내지 약 63%이다.
건조 분말의 다른 실시양태에서, FDKP 마이크로입자는 약물을 포함한다. 건조 분말의 다른 실시양태에서, 약물은 다양한 분자 크기 또는 질량의 펩티드, 예컨대 인슐린, 글루카곤 유사 펩티드-1, 글루카곤, 엑센딘, 부갑상선 호르몬, 칼시토닌, 옥신토모듈린 등이다. 푸마릴 디케토피페라진의 트랜스 이성체 함량이 45% 내지 65% 범위이고 약물이 인슐린인 건조 분말의 일 실시양태에서, FDKP 마이크로입자의 인슐린 함량은 약 3 U/㎎ 내지 약 4 U/㎎이다. 특정한 실시양태에서, 약물은 마이크로입자의 표면에 흡착된다.
추가의 실시양태는 흡입기, 단위 용량 건조 분말 약제 용기, 예를 들면, 카트리지 및 본원에 개시된 마이크로입자 및 활성제를 포함하는 분말을 포함하는 약물 전달 시스템에 관한 것이다. 일 실시양태에서, 건조 분말에 사용하기 위한 전달 시스템은 분말을 탈응집 및 분산하기 위한 공기로를 통한 기류에 높은 저항을 부여하는 공기로를 갖는 높은 저항의 흡입기를 포함하는 흡입 시스템을 포함한다. 일 실시양태에서, 흡입 시스템은 예를 들면 분당 약 0.065 내지 약 0.200(√kPa)/리터의 저항 값을 갖는다. 특정한 실시양태에서, 분당 약 7 내지 70 리터의 최종적 피크 유속을 생성할 수 있는, 피크 흡입 압력 차이가 약 2 내지 약 20 kPa 범위일 수 있는 흡입 시스템에 의한 흡입에 의해 건조 분말을 효과적으로 전달할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 환자에게 전달되는 분말의 1 이상의 펄스로 또는 연속 흐름으로 흡입기로부터 분말을 배출시킴으로써 단일 용량을 제공하도록 흡입 시스템을 구성한다. 본원에 개시된 몇몇 실시양태에서, 건조 분말 흡입기 시스템은 흡입기 내에 소정의 질량 흐름 균형을 포함한다. 예를 들면, 기류가 분말 제제를 포함하는 면적을 통해 통과하게 하는 1개 이상의 분배 포트에 의해 흡입기로부터 환자로 배출되는 전체 흐름의 대략 10% 내지 70%의 흐름 균형이 전달되고, 기류의 대략 30% 내지 90%가 흡입기의 다른 공기로로부터 생성된다. 더욱이, 우회 흐름, 또는, 예컨대 카트리지를 통해 분말 오염물질의 면적에 진입하고 이로부터 배출되는 흐름은 흡입기 내 분말 분배 포트로부터 배출되는 흐름과 합해져, 흡입구로부터 배출되기 전 유동화 분말을 희석하고, 가속하고 궁극적으로 탈응집할 수 있다. 일 실시양태에서, 분당 약 7 내지 70 리터 범위의 유속은 1 내지 30 ㎎의 충전 질량으로 분배되는 용기 또는 카트리지 함량의 75% 초과를 발생시킨다. 특정한 실시양태에서, 상기 기재된 흡입 시스템은 단일 흡입에서 40% 초과, 50% 초과, 60% 초과 또는 70% 초과의 백분율로 분말 용량의 호흡성 분율/충전을 배출할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 건조 분말 흡입기, 45% 내지 65%의 FDKP 트랜스 이성체 함량을 갖는 푸마릴 디케토피페라진의 마이크로입자 및 1종 이상의 활성제를 포함하는 건조 분말 제제를 포함하는 흡입 시스템을 제공한다. 흡입 시스템의 이 실시양태의 몇몇 양태에서, 단위 용량 카트리지 내의 건조 분말 제제를 제공한다. 대안적으로, 건조 분말 제제를 흡입기 중에 예비 로딩할 수 있다. 이 실시양태에서, 흡입 시스템의 구조 배치는 흡입기의 탈응집 메커니즘이 50% 초과의 호흡성 분율 제공하게 하고; 즉, 흡입기(카트리지)에 포함된 분말의 절반 이상이 5.8 ㎛ 미만의 입자로서 배출된다. 흡입기는 투약 동안 용기 내에 포함된 분말 의약의 85% 초과를 배출할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 흡입기는 단일 흡입에 포함된 분말 의약의 85% 초과를 배출할 수 있다. 일 실시양태에서, 흡입기는 30 ㎎ 이하 범위의 충전 질량으로 2 내지 5 kPa의 압력 차이에서 3 초 미만으로 카트리지 함량 또는 용기 함량의 90% 초과를 배출할 수 있다.
본원에 개시된 실시양태는 또한 방법을 포함한다. 일 실시양태에서, 내분비 관련 질환 또는 질병을 치료하는 방법은 약 45 내지 약 65%의 FDKP 트랜스 이성체 함량을 포함하는 FDKP 마이크로입자 및 상기 질환 또는 질병을 치료하기에 적합한 약물을 포함하는 건조 분말 제제를 치료를 필요로 하는 사람에게 투여하는 것을 포함한다. 일 실시양태는 상기 기재된 FDKP의 마이크로입자를 포함하는 건조 분말을 치료를 필요로 하는 사람에게 투여하는 것을 포함하는 인슐린 관련 질병의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 약 45% 내지 65% 또는 약 45% 내지 약 63% 범위의 트랜스 이성체 함량을 갖는 푸마릴 디케토피페라진의 마이크로입자를 포함하는 건조 분말 제제를 개체에게 투여하는 것을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 인슐린 관련 질병은 구체적으로 임의의 또는 모든 전당뇨병, 1형 당뇨병(소실 단계, 소실 단계 후 또는 둘 다), 2형 당뇨병, 임신성 당뇨병, 저혈당증, 고혈당증, 인슐린 저항, 분비 장애, 인슐린의 손상된 초기 단계 방출, 췌장 β 세포 기능 소실, 췌장 β 세포 소실 및 대사 질병을 포함하거나 배제할 수 있다. 일 실시양태에서, 건조 분말은 인슐린을 포함한다. 다른 실시양태에서, 건조 분말은 글루카곤, 엑센딘 또는 GLP-1을 포함한다.
본원에 개시된 다른 실시양태는 (a) 약 45% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 갖는 FDKP 화합물을 합성하는 단계; (b) FDKP 화합물의 트랜스 이성체 함량을 측정하여 트랜스 이성체 함량 범위가 약 45% 내지 약 65%라는 것을 평가하는 단계; (c) 단계 (b)의 FDKP 화합물을 염기성 pH를 갖는 용액 중에 용해하여 FDKP 용액을 형성하는 단계; (d) 휘발성 산의 용액을 제공하는 단계; 및 (e) 고전단 혼합기 내에서 FDKP 용액을 휘발성 산의 용액과 함께 혼합하여 마이크로입자를 생성하는 단계를 포함하는, 건조 분말로서 폐 투여에 적합한 마이크로입자를 제조하는 방법을 포함한다. 일 실시양태에서, FDKP 화합물의 트랜스 이성체 함량을 측정하는 단계를 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 수행한다. 대안적인 실시양태에서, 입자 형성에 후속하여 이성체 함량을 측정한다.
다른 실시양태에서, 에스테르 기를 갖는 디케토피페라진을 제공하는 단계; 염기성 pH에서 물과 수혼화성 용매의 혼합물 중에서 디케토피페라진의 에스테르 기를 비누화하는 단계; 및 각각 약 0.4 내지 약 0.7 범위의 최종적 비로 트리플루오로아세트산 및 빙초산을 포함하는 반응 혼합물 중에서 디케토피페라진을 재결정하는 단계를 포함하는, 약 45% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 갖는 디케토피페라진을 합성하는 방법을 개시한다. 이런 및 다른 실시양태에서, 재결정 단계에서의 반응 혼합물을 약 4 시간 또는 4 시간 초과의 기간 동안 유지시키거나 계속되게 한다.
합성 방법의 일 실시양태에서, 수혼화성 용매는 알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올이다. 테트라하이드로푸란, 디옥산, 아세톤, 및 아세토니트릴과 같은 다른 용매를 또한 사용할 수 있다. 이런 및 다른 실시양태에서, 상기 방법은 디케토피페라진의 트랜스 이성체 함량을 측정하는 단계를 더 포함한다.
구체적인 실시양태에서, 약 45% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 갖는 디케토피페라진을 제조하는 방법은 화학식 3,6-비스(N-X-4-아미노부틸)-2,5-디케토피페라진(여기서, X는 푸마릴, 숙시닐, 말레일, 및 글루타릴로 이루어진 군으로부터 선택됨)을 이용한다. 예시적인 실시양태에서, 디케토피페라진은 화학식 3,6-비스(N-푸마릴-4-아미노부틸)-2,5-디케토피페라진을 갖는다.
특정한 실시양태에서, 약 45% 내지 약 65%의 DKP 트랜스 이성체 함량을 갖는 DKP 화합물을 제조하는 방법은 비누화 반응 및 재결정 반응을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 방법은 에스테르 보호기, 예를 들면, 알킬 에스테르, 예컨대 에틸 에스테르, 또는 메틸 에스테르를 포함하는 디케토피페라진 화합물의 비누화 반응을 포함한다. 일 실시양태에서, 약 45% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 갖는 FDKP 화합물을 합성하는 단계는 수계 용매와 같은 용매 중에서 FDKP의 에스테르를 비누화하는 것 및 염기를 첨가하는 것을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 상기 방법은 DKP, 예컨대 푸마릴 디케토피페라진 에틸 에스테르를 용매 중에 예컨대 각각 1:1 내지 약 3:1의 물:메탄올 비로 용해하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 다른 알콜, 테트라하이드로푸란, 디옥산, 아세톤, 아세토니트릴 등을 포함하는 다른 수혼화성 용매를 사용할 수 있다. 일 실시양태에서, 용매는 물만 포함할 수 있다. 이런 및 다른 실시양태에서, 비누화 반응은 수산화나트륨을 포함하는 용액을 첨가하는 단계; 반응 혼합물을 약 20℃ 내지 약 60℃ 범위의 온도에서 또는 환류 조건으로 유지시키는 단계; 반응 혼합물을 여과하여 여액을 생성시키는 단계; 산성 용액을 여액에 첨가하는 단계; 및 여과에 의해 형성된 고체 물질을 수집하고 FDKP 고체 물질로 세척하는 단계를 더 포함한다. 이어서, 고체 물질을 분석하여 형성된 FDKP 입자의 트랜스 이성체 함량을 측정할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 상기 방법은 트리플루오로아세트산 중의 FDKP의 현탁액을 약 40℃ 내지 약 85℃로 약 1 분 내지 약 2 시간 동안 가열하고 반응물을 냉각하는 단계; 빙초산을 그 용액에 첨가하고 현탁액을 약 20℃에서 약 1 내지 약 24 시간 동안 냉각하는 단계를 포함하는 FDKP 물질을 재결정하는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 결정 단계는 각각 약 0.4 내지 약 0.7 범위의 비로 트리플루오로아세트산:빙초산을 포함하는 용액 중에서 약 15℃ 내지 약 25℃ 범위의 결정 온도에서 약 1 시간 내지 약 6.5 시간 동안 반응을 수행하는 것을 포함한다. 이 실시양태에서, 상기 방법은 반응 혼합물을 빙초산으로 세척하고 반응의 온도를 시간당 약 7℃ 내지 약 10℃의 속도로 냉각하는 것을 더 포함한다. 원하는 이성체 함량을 갖는 FDKP 물질을 얻기 위해 다른 냉각 속도를 이용할 수 있다.
본원에 개시된 다른 실시양태는 환자가 본원에 개시된 디케토피페라진 마이크로입자를 포함하는 건조 분말을 흡입함으로써 그 건조 분말을 폐에 깊게 투여하는 것을 포함하는 인슐린을 필요로 하는 환자에게 인슐린을 전달하는 방법을 포함한다. 이 실시양태의 양태에서, 흡입기 시스템의 특정한 특징이 기재되어 있다.
하기의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 추가로 본원에 개시된 실시예의 특정한 양태를 설명하도록 포함된다. 본 개시내용은, 본원에 제시된 특정한 실시양태의 상세한 설명과 조합되어, 도면 중 1개 이상에 대한 참조로 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 트랜스 이성체 함량(%)의 함수로서 공기역학적 분말 성능을 도시한 것이다.
도 2는 약 45 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 갖는 FDKP를 제조하기 위해 제어될 수 있는 합성식에서의 단계를 도시한 것이다.
도 3은 도 2에 도시된 반응식의 비누화 단계 동안 저속 NaOH 첨가의 함수로서 트랜스 이성체 함량(%)을 도시한 것이다.
도 4는 신속 냉각 램프를 이용한 트리플루오로아세트산(TFA) 재결정 후 트랜스 이성체 함량(%)을 도시한 것이다.
도 5는 약 45% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 갖는 인슐린 로딩 FDKP 마이크로입자를 제조하기 위한 공정 도식을 도시한 것이다.
도 6은 트랜스 이성체 함량에 대한 반응 표면 방법론 분석을 도시한 것이다.
기재된 바대로, 폐로의 약물 전달은 여러 이점을 제공한다. 그러나, 균일한 용적 및 중량의 약물로 약물이 천연 물리적 장벽을 통과하여 수송되게 하는 데 있어서의 문제점으로 인해 약물을 폐로 전달하는 것이 어렵다. 한정된 트랜스 이성체 함량을 갖는 디케토피페라진, 약물 전달 물질로서의 마이크로입자, 마이크로입자의 제조 방법 및 마이크로입자를 사용하는 치료 방법이 본원에 개시되어 있다.
본원에 사용되는 "마이크로입자"란 용어는 정확한 외부 또는 내부 구조와 무관하게 약 0.5 내지 약 1000 ㎛의 직경을 갖는 입자를 의미한다. 약 0.5 내지 약 10 마이크론의 직경을 갖는 마이크로입자가 대부분의 천연 장벽을 성공적으로 통과하면서 폐에 도달할 수 있다. 목을 돌아다니기 위해 약 10 마이크론 미만의 직경이 필요하고 호기를 피하기 위해 약 0.5 마이크론 이상의 직경이 필요하다. 가장 효율적인 흡착이 일어나는 것으로 생각되는 폐(또는 폐포 영역)에 깊게 도달하기 위해, 예를 들면 Andersen Cascade Impactor에 의해 표준 기술을 이용하여 측정할 때, 일부 참조문헌이 다소 상이한 범위를 이용하기는 하지만, 약 0.5 내지 약 5.7 마이크론의 공기역학적 직경을 갖는 입자인 것으로 일반적으로 인정되는 "호흡성 분율"(RF)에 포함된 입자의 비율을 최대화하는 것이 바람직하다. 공기역학적 입자 크기를 측정하기 위해 호흡성 분율이 6.4 ㎛ 미만과 같은 유사한 공기역학적 크기에 의해 한정되는 Next Generation Impactor™(NGI™, MSP Corporation)와 같은 다른 임팩터를 사용할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 입자 크기를 측정하기 위해 관련 교시를 위해 전문이 본원에 포함된 2010년 3월 18일자에 출원된 미국 특허 출원 제12/727,179호에 개시된 레이저 회절 장치와 같은 레이저 회절 장치를 사용하고, 여기서 입자의 용적측정 중앙 기하 직경(VMGD)을 측정하여 흡입 시스템의 성능을 평가하다. 예를 들면, 다양한 실시양태에서, ≥80%, 85% 또는 90%의 카트리지 엠프팅 및 ≤12.5 ㎛, ≤7.0 ㎛ 또는 ≤4.8 ㎛의 배출 입자의 VMGD는 진보적으로 더 우수한 공기역학적 성능을 나타낼 수 있다. 본원에 개시된 실시양태는 약 45% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 갖는 FDKP 마이크로입자가 개선된 공기역학적 성능과 같은 폐로의 약물의 전달에 유리한 특징을 나타낸다는 것을 나타낸다.
충전당 호흡성 분율(RF/충전)은, 마이크로입자 공기역학적 성능의 측정치인, 용량으로 사용하기 위해 충전된 분말 함량의 배출시 흡입기로부터 배출되는 용량에서의 분말의 백분율, 즉 폐 전달에 적합한 크기에 의해 배출되는 충전된 용량으로부터의 입자의 백분율을 나타낸다. 본원에 기재된 바대로, 40% 또는 40% 초과의 RF/충전 값은 허용가능한 공기역학적 성능 특징을 반영한다. 본원에 개시된 특정한 실시양태에서, 충전당 호흡성 분율은 50% 초과일 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 충전당 호흡성 분율은 약 80% 이하일 수 있고, 충전량의 약 80%가 표준 기술을 이용하여 측정할 때 5.8 ㎛ 미만의 입자 크기로 배출된다.
본원에 사용되는 "건조 분말"이란 용어는 압축가스, 운반체 또는 다른 액체 중에 현탁되거나 용해되지 않은 미세한 미립자 조성물을 의미한다. 모든 물 분자의 완전한 부재를 반드시 의미하는 것으로 의도되지 않는다.
특정한 RF/충전 값은 분말을 전달하기 위해 사용되는 흡입기에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 분말은 일반적으로 응집하는 경향이 있고 결정질 DKP 마이크로입자는 특히 응집성 분말을 형성한다. 건조 분말 흡입기의 기능 중 하나는 생성된 입자가 흡입에 의해 용량을 전달하기에 적합한 호흡성 분율을 포함하도록 분말을 탈응집하는 것이다. 그러나, 응집성 분말의 탈응집은 통상적으로 불완전하여 흡입기에 의해 전달되는 호흡성 분율을 측정할 때 관찰되는 입자 크기 분포가 1차 입자의 크기 분포와 일치하지 않을 것이고, 즉 프로파일이 더 큰 입자를 향해 이동할 것이다. 흡입기 설계는 이의 탈응집 효율이 변하고, 따라서 상이한 설계를 이용하여 관찰된 RF/충전의 절대 값도 또한 변한다. 그러나, 이성체 함량의 함수로서의 최적 RF/충전은 흡입기마다 유사할 것이다.
본원에 사용되는 "약"이란 용어는 그 값을 결정하기 위해 이용되는 장치 또는 방법에 대한 측정의 표준 편차를 포함한다는 것을 나타내기 위해 사용된다.
디케토피페라진
약물 불안정성 및/또는 빈약한 흡수와 같은 약학 분야에서의 문제점을 극복하기 위해 사용되는 약물 전달 물질의 1종은 2,5-디케토피페라진이다. 2,5-디케토피페라진은 하기 도시된 일반식 1의 화합물로 표시되고, 여기서 E1 및 E2는 독립적으로 N 또는 더욱 특히 NH이다. 다른 실시양태에서, E1 및/또는 E2는 독립적으로 산소 또는 질소이어서, E1 및 E2에 대한 치환기 중 1개가 산소이고, 다른 1개가 질소인 경우 이 화학식은 치환 유사체 디케토모르폴린을 생성하거나, E1 및 E2 둘 다 산소인 경우 이 화학식은 치환 유사체 디케토디옥산을 생성한다.
Figure 112012002726374-pct00001
예를 들면, 모두 디케토피페라진 및 디케토피페라진 매개 약물 전달과 관련하여 교시하고 있다는 점에서 각각 전문이 참조문헌으로 본원에 포함된, 발명의 명칭이 "Self Assembling Diketopiperazine Drug Delivery System"인 미국 특허 제5,352,461호; 발명의 명칭이 "Method For Making Self-Assembling Diketopiperazine Drug Delivery System"인 제5,503,852호; 발명의 명칭이 "Microparticles For Lung Delivery Comprising Diketopiperazine"인 제6,071,497호; 및 발명의 명칭이 "Carbon-Substituted Diketopiperazine Delivery System"인 제6,331,318호에 기재된 바대로, 이러한 2,5 디케토피페라진, 특히 산성 R1 및 R2 기를 보유하는 것은 약물 전달에서 유용한 것으로 나타났다. 디케토피페라진은 약물이 혼입된 마이크로입자 또는 약물이 흡착된 마이크로입자에 형성될 수 있다. 약물 및 디케토피페라진의 조합은 개선된 약물 안정성 및/또는 흡착 특징을 부여할 수 있다. 다양한 투여 경로에 의해 이 마이크로입자를 투여할 수 있다. 건조 분말로서, 폐를 비롯한 호흡기의 특정 면적에 대한 흡입에 의해 이 마이크로입자를 전달할 수 있다.
응집된 결정질 판으로 구성된 자가 조립 마이크로입자를 생성시키는 유리 산(또는 염기)의 pH 기반 침전에 의해 이 마이크로입자를 통상적으로 얻는다. 입자가 침전된 DKP 용액 중에 소량의 계면활성제, 예컨대 폴리소르베이트-80에 의해 입자의 안정성이 증대될 수 있다(예를 들면, 모두 DKP 마이크로입자 및 이의 건조 분말의 형성 및 로딩과 관련하여 교시하고 있다는 점에서 전문이 참조문헌으로 본원에 포함된, 발명의 명칭이 "Method of drug formulation based on increasing the affinity of crystalline microparticle surfaces for active agents"인 US 공개 특허 제2007/0059373호 참조). 궁극적으로, 건조 분말을 얻기 위해 용매를 제거할 수 있다. 용매 제거의 적절한 방법은 동결건조 및 분무 건조(예를 들면, 모두 DKP 마이크로입자 및 이의 건조 분말의 형성 및 로딩과 관련하여 교시하고 있다는 점에서 각각 전문이 참조문헌으로 본원에 포함된, 발명의 명칭이 "A method for improving the pharmaceutic properties of microparticles comprising diketopiperazine and an active agent"인 US 공개 특허 제2007/0196503호 및 발명의 명칭이 "Purification and stabilization of peptide and protein pharmaceutical agents"인 미국 특허 제6,444,226호 참조)를 포함한다. 본원에 개시된 마이크로입자는 DKP 염으로 이루어진 마이크로입자와 구별된다. 이 입자는 통상적으로 (건조와는 반대로) 분무 건조에 의해 형성되어, (유리 산 또는 염기와 반대로) 비결정질 염의 구 및/또는 붕괴 구를 생성하여, 이것은 화학적으로, 물리적으로 및 형태학적으로 전체와 구별된다. 본 개시내용은 유리 산 또는 용해 음이온으로서 이해되는 FDKP에 관한 것이다.
디케토피페라진의 합성 방법은 예를 들면 교시내용이 전문이 참조문헌으로 본원에 포함된 문헌[Katchalski, et al., J. Amer. Chem. Soc. 68, 879-880 (1946); Kopple, et al., J. Org. Chem. 33(2), 862-864 (1968)]에 기재되어 있다. 2,5-디케토-3,6-디(아미노부틸)피페라진(Katchalski 등은 이것을 리신 무수물이라 칭함)을 또한 Kopple 방법과 유사하게 용융 페놀 중의 N-ε-P-L-리신의 고리생성 이합체화, 이어서 적절한 시약 및 조건에 의한 블록(P) 기의 제거에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 아세트산 중에 4.3 M HBr을 사용하여 CBz 보호기를 제거할 수 있다. 이 방식이 바람직할 수 있는데, 왜냐하면 이것이 상업적으로 이용 가능한 출발 물질을 사용하고, 이것은 생성물에서의 출발 물질의 입체화학을 보존하는 것으로 보고된 반응 조건을 포함하고, 모든 단계를 용이하게 제조에 대해 규모 확장할 수 있기 때문이다. 디케토피페라진의 합성 방법은 또한 동일 내용과 관련하여 교시를 위해 참조문헌으로 본원에 또한 포함된 발명의 명칭이 "Catalysis of Diketopiperazine Synthesis"인 미국 특허 제7,709,639호에 기재되어 있다.
푸마릴 디케토피페라진(3,6-비스(N-푸마릴-4-아미노부틸)-2,5-디케토피페라진; FDKP)은 폐 적용에 대한 하나의 바람직한 디케토피페라진이다:
Figure 112012002726374-pct00002
.
FDKP는 산에서 낮은 용해도를 갖지만 중성 또는 염기성 pH에서 용이하게 가용성이므로, 이것은 유리한 마이크로입자 매트릭스를 제공한다. 이 특성은 FDKP가 결정되게 하고 결정이 산성 조건 하게 마이크로입자로 자가 조립되게 한다. 이 입자는 pH가 중성인 생리학적 조건 하에 용이하게 용해한다. 기재된 바대로, 약 0.5 내지 약 10 마이크론 직경을 갖는 마이크로입자는 성공적으로 대부분의 천연 장벽을 통과하면서 폐에 도달할 수 있다. FDKP로부터 이 크기 범위의 입자를 용이하게 제조할 수 있다.
FDKP는 디케토피페라진 고리에서 2개의 비대칭 중심을 보유한다. FDKP를 디케토피페라진의 중심 "고리"에 측쇄의 배열에 따라 "시스-FDKP" 및 "트랜스-FDKP"로 확인된 기하 이성체의 혼합물로서 제조한다. R,R 및 S,S 거울상 이성체는 디케토피페라진 고리의 동일 평면 측으로부터 돌출되는 프로페닐(아미노부틸) "측면 암"을 갖고(하기 A 및 B), 따라서 시스 이성체라 칭하고, 반면 R,S 화합물은 디케토피페라진 고리의 반대 평면 측으로부터 돌출되는 "측면 암"을 갖고(하기 C), 트랜스 이성체라 칭한다.
Figure 112012002726374-pct00003
동일 내용과 관련하여 교시를 위해 참조문헌으로 본원에 포함된 발명의 명칭이 "Unit Dose Cartridge and Dry Powder Inhaler"인 미국 특허 제7,464,706호에 개시된 MEDTONE® 흡입기와 같은 적절히 효율적인 흡입기에 의해 RF/충전에 의해 측정할 때, 허용가능한 공기역학적 성능을 갖는 FDKP 마이크로입자 분말을 약 45 내지 약 65% 범위의 트랜스 이성체 함량을 갖는 FDKP로부터 제조한다. 이 범위에서 이성체 함량을 갖는 입자는 또한 개시내용이 동일 내용과 관련하여 교시를 위해 참조문헌으로 본원에 포함된, 2009년 6월 12일자에 출원된 발명의 명칭이 "A Dry Powder Inhaler and System for Drug Delivery"인 US 특허 출원 제12/484,125호 및 2010년 3월 4일자에 출원된 발명의 명칭이 "Improved Dry Powder Drug Delivery System"인 미국 특허 출원 제12/717,884호에 개시된 것과 같은 고효율 흡입기에 의해 훌륭히 수행한다. 65% 초과의 트랜스-FDKP를 포함하는 마이크로입자를 포함하는 분말은 다소 가변적인 RF/충전을 갖는 경향이 있다(도 1). FDKP의 트랜스 이성체 풍부 마이크로입자는 형태학을 변경시키고 또한 가공하기 어려운 점성의 현탁액을 생성시킨다.
도 1에 도시된 것과 비슷한 조건 하에 수행된 다른 실험에서, 약 95% 트랜스 풍부 FDKP 및 인슐린으로 제조된 마이크로입자는 약 24%의 RF/충전을 생성한 반면, 동일 인슐린 함량을 갖고 약 59%의 트랜스 이성체 함량을 갖는 대조군 샘플은 약 49∼52%의 RF/충전을 생성하였다(데이터 도시하지 않음). 따라서, 약 45% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 갖는 FDKP 마이크로입자 분말은 허용가능한 공기역학적 특성을 갖는 분말을 생성시킨다. 대안적인 실시양태에서, FDKP 트랜스 이성체 함량은 약 50% 내지 약 65%, 약 52% 내지 약 62% 또는 약 53% 내지 약 63% 범위이다(도 1 참조).
상기에 기초하여, 약 45% 내지 약 65% 범위 내에 트랜스 이성체 함량을 갖는 마이크로입자 분말을 제조하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 개시내용은 트랜스 이성체 함량이 FDKP 마이크로입자의 공기역학적 성능에 영향을 미친다는 것(이는 기대되지 않았었다)을 확신시켜 준다. 그러나, FDKP 마이크로입자를 제조하기 위해 사용되는 FDKP의 이성체 함량을 조심스럽게 제어함으로써 개선된 점조도를 얻을 수 있다는 것이 발견되었다. 도 1에서, 곡선 실선은 예상된 RF/충전을 나타내고 곡선 파선은 적합한 RF/충전 점수를 얻는 것의 단측 95% 신뢰 하한을 나타낸다. 수직 점선은 본원에 개시된 하나의 예시적인 실시양태에 대한 트랜스 이성체 함량에 대한 제한을 제공한다.
FDKP 시스/트랜스 이성체 비는 도 2에 도시된 제조 단계 동안 확립한다. 도 2는 약 45% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 갖는 FDKP를 제조하도록 제어될 수 있는 합성식에서의 단계를 도시한 것이다. 합성식에서, 표적화된 또는 원하는 이성체 비를 얻도록 조절될 수 있는 FDKP의 합성 동안 여러 매개변수 및/또는 비누화 및 재결정을 비롯한 반응 단계가 존재한다. 예를 들면, 원하는 또는 표적화된 트랜스 이성체 함량을 갖는 생성물을 생성하기 위해 온도, 반응 시간, 및 사용된 용매 또는 공용매의 유형을 비롯한 반응의 특정한 매개변수를 제어할 수 있다.
FDKP 트랜스 이성체 함량의 범위의 하한치의 제어
DKP 고리를 강한 염기에 노출함으로써 트랜스 이성체 함량의 하한치를 제어할 수 있다. 일 제조 단계에서, 수산화나트륨에 의한 비누화에 의해 에틸 보호기를 제거한다. 이 염기성 조건은 또한, 이성체가 과량인지에 대해 관계없이, 하기 기재된 바대로 이성체 사이의 고리 에피머화를 조장한다. 예를 들면, 95% 트랜스 이성체로 예를 들면 이루어지는 출발 화합물을 포함하는 반응물에 염기를 첨가하면 시스 및 트랜스 이성체 함량의 대략 50/50 혼합물로 이루어지는 FDKP 물질을 생성시킬 수 있다(도 3). 염기성 pH 이외에, 용매 및 공용매의 농도, 노출 시간 및 반응 온도를 비롯한 다른 인자가 또한 트랜스 이성체 함량 형성의 조절에 기여할 수 있다.
Figure 112012002726374-pct00004
FDKP 트랜스 이성체 함량의 범위의 상한치의 제어
이성체 사이의 용해도의 차이는 FDKP 이성체 함량에 영향을 미친다. 예를 들면, 트리플루오로아세트산(TFA) 및 빙초산(GAA)으로부터 FDKP를 재결정할 수 있다. 트랜스 FDKP는 시스 FDKP보다 이 용매 시스템에서 덜 가용성이다. 따라서, 덜 가용성인 트랜스 이성체의 선택적 침전을 선호하는 조건을 이용하여 최종 생성물의 트랜스 이성체 함량을 증가시킬 수 있다. 이 조건은 감소된 재결정 시간, 저온에서의 반용매 첨가 및/또는 트리플루오로아세트산-빙초산(TFA-GAA) 혼합물의 신속한 냉각을 포함한다(도 4). 또한, 이 방법에 의한 트랜스 이성체 함량을 증가시키는 것은 시스 이성체에서 풍부한 FDKP의 잔류 용액을 제공하는 것으로 이해된다.
[표 1] 예시적인 제조 범위
Figure 112012002726374-pct00005
약 45% 내지 약 65% 범위의 이성체 함량을 갖는 마이크로입자를 제공하는 것은 유리한 공기역학적 특징을 갖는 마이크로입자를 제공한다.
활성제의 선택 및 도입
본원에 기재된 마이크로입자가 필요한 이성체 함량을 보유하는 한, 이것은 폐로의 전달 및/또는 약물 흡착에 유리한 다른 추가의 특징을 채용할 수 있다. 발명의 명칭이 "Method for Drug Delivery to the Pulmonary System"인 미국 특허 제6,428,771호는 폐로의 DKP 입자 전달을 기재한 것이고 동일 내용과 관련하여 교시를 위해 참조문헌으로 본원에 포함된다. 발명의 명칭이 "Purification and Stabilization of Peptide and Protein Pharmaceutical Agents"인 미국 특허 제6,444,226호는 마이크로입자 표면에의 약물의 흡착을 위한 유리한 방법을 기재한 것이고 또한 동일 내용과 관련하여 교시를 위해 참조문헌으로 본원에 포함된다. 마이크로입자 표면 특성은 동일 내용과 관련하여 교시를 위해 참조문헌으로 본원에 포함된 발명의 명칭이 "Method of Drug Formulation based on Increasing the Affinity of Crystalline Microparticle Surfaces for Active Agents"인 미국 특허 출원 제11/532,063호에 기재된 바람직한 특징을 성취하기 위해 조작될 수 있다. 발명의 명칭이 "Method of Drug Formation based on Increasing the Affinity of Active Agents for Crystalline Microparticle Surfaces"인 미국 특허 출원 제11/532,065호는 마이크로입자에의 활성제의 흡착을 촉진하는 방법을 기재한 것이다. 미국 특허 출원 제11/532,065호는 또한 동일 내용과 관련하여 교시를 위해 참조문헌으로 본원에 포함된다.
본원에 기재된 마이크로입자는 1종 이상의 활성제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 "활성제"는, "약물"과 상호교환되어 사용되어, 소분자 의약, 생물제 및 바이오활성제를 비롯한 약학 물질을 의미한다. 활성제는 천연, 재조합 또는 합성 기원, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 유기 마크로분자, 합성 유기 화합물, 폴리사카라이드 및 다른 당, 지방산 및 지질 및 항체 및 이의 단편, 예컨대, 인간화 또는 키메라 항체, F(ab), F(ab)2, 단쇄 항체 단독 또는 다른 폴리펩티드 또는 암 항원에 대한 치료학적 또는 진단학적 단클론 항체와 융합된 것(이들로 제한되지는 않음)일 수 있다. 활성제는 다양한 생물학적 활성 및 분류, 예컨대 혈관작동성제, 신경활성제, 호르몬, 항응고제, 면역조정제, 세포독성제, 항생제, 항바이러스제, 항원, 감염원, 염증 매개체, 호르몬 및 세포 표면 항원 하에 해당할 수 있다. 더욱 특히, 활성제는, 비제한적인 방식으로, 사이토카인, 리포카인, 엔케펄린, 알킨, 시클로스포린, 항-IL-8 항체, ABX-IL-8을 포함하는 IL-8 길항제; PG-12를 포함하는 프로스타글란딘, LY29311, BIIL 284 및 CP105696을 포함하는 LTB 수용체 차단제; 트립탄, 예컨대 수마트립탄 및 팔미톨레이트, 인슐린 및 이의 유사체, 성장 호르몬 및 이의 유사체, 부갑상선 호르몬(PTH) 및 이의 유사체, 부갑상선 호르몬 관련 펩티드(PTHrP), 그렐린, 오베스타틴, 엔테로스타틴, 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 아밀린, 아밀린 유사체, 글루카곤 유사 펩티드 1(GLP-1), 텍사스 레드, 클로피도그렐, PPACK(D-페닐알라닐-L-프롤릴-L-아르기닌 클로로메틸 케톤), 옥신토모듈린(OXM), 펩티드 YY(3-36)(PYY), 아디포넥틴, 콜레시스토키닌(CCK), 세크레틴, 가스트린, 글루카곤, 모틸린, 소마토스타틴, 뇌성 나트륨이뇨 펩티드(BNP), 심방성 나트륨이뇨 펩티드(ANP), IGF-1, 성장 호르몬 방출 인자(GHRF), 인테그린 베타-4 전구체(ITB4) 수용체 길항제, 노시셉틴, 노시스타틴, 오파닌 FQ2, 칼시토닌, CGRP, 안지오텐신, P 물질, 뉴로키닌 A, 췌장 폴리펩티드, 신경펩티드 Y, 델타 수면 유도 펩티드 및 혈관작동성 장 펩티드를 포함할 수 있다.
45% 내지 65%의 트랜스 이성체 함량을 갖는 FDKP로부터 형성된 마이크로입자에 전달하고자 하는 약물 함량은 통상적으로 0.01% 초과이다. 일 실시양태에서, 상기 언급된 트랜스 이성체 함량을 갖는 마이크로입자에 의해 전달하고자 하는 약물 함량은 인슐린과 같은 펩티드에 통상적인 약 0.01% 내지 약 20% 범위일 수 있다. 예를 들면, 약물이 인슐린인 경우, 본 발명의 마이크로입자는 통상적으로 3∼4 U/㎎(대략 10 내지 15%)의 인슐린을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 입자의 약물 함량은 전달하고자 하는 약물의 형태 및 크기에 따라 달라질 수 있다.
마이크로입자의 제조
일 실시양태에서, 본원은 약 45% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량 및 인슐린을 포함하는 FDKP 마이크로입자를 제조하기 위해 사용할 수 있는 제조 방법을 개시한다.
도 5는 인슐린을 포함하는 본 발명의 FDKP 마이크로입자를 제조하는 제조 방법의 도식 표현을 도시한 것이다. 요약하면, 요약하면, 예를 들면 개시내용이 전문이 참조문헌으로 본원에 포함된 2009년 11월 2일자에 출원된 미국 가출원 제61/257,311호에 개시된 것과 같은 2중 공급 고전단 혼합기를 사용하여, 약 16℃±약 2℃에서 동량의 약 10.5 중량%의 아세트산 및 약 2.5 중량%의 FDKP 용액(표 2 및 3)을 0.001 in2 구멍을 통해 2000 psi로 공급할 수 있다. 침전물을 대략 동일한 질량 및 온도의 탈이온수(DI 수) 저장소에 수집할 수 있다. 생성된 현탁액은 약 0.8% 고체를 포함한다. 침전물을 농축하고 수평 흐름 여과에 의해 세척할 수 있다. 침전물을 우선 약 4% 고체로 농축하고 이후 탈이온수로 세척한다. 현탁액을 최종적으로 FDKP의 초기 질량에 기초하여 약 10% 고체로 농축할 수 있다. 오븐 건조 방법에 의해 고체 함량에 대해 농축된 현탁액을 평가할 수 있다.
1 부 인슐린 및 9 부 약 2 중량% 아세트산에 의해 농축된 인슐린 스톡 용액을 제조할 수 있다. 인슐린 스톡을 중량측정하여 현탁액에 첨가하여 약 11.4 중량%의 인슐린의 로드를 얻을 수 있다. 인슐린 함유 현탁액을 약 15 분 이상 혼합하고, 이후 약 14 내지 약 15 중량%의 암모니아 수용액에 의해 약 3.5의 초기 pH로부터 약 4.5의 pH로 적정할 수 있다. 개시내용이 전문이 참조문헌으로 본원에 포함된 2009년 11월 2일자에 출원된 미국 가출원 제61/257,385호에 공개된 것과 같은 입자제조기를 사용하여 현탁액을 액체 질소 중에 급속 냉동하여 펠렛을 형성하고, 동결건조하여 약 45% 내지 65%의 트랜스 이성체 함량(%)을 갖는 벌크 인슐린 로딩 FDKP 마이크로입자를 생성할 수 있다. 인슐린 로딩 및 pH 조정 단계가 없이 블랭크 FDKP 마이크로입자를 동일하게 제조할 수 있다.
[표 2] 10.5%의 아세트산 용액
Figure 112012002726374-pct00006
[표 3] 2.5%의 FDKP 용액
Figure 112012002726374-pct00007
본원에서 사용된 "용매"는 활성제 및 마이크로입자가 "욕조 내에" 있는 유체 매체를 의미한다. 모든 성분이 용액 중에 있을 것이 요구되는 것으로 이해되어서는 안 된다. 실제로, 많은 예에서, 이것은 마이크로입자가 현탁된 액체 매체를 의미하는 것으로 사용될 수 있다.
상기 개시내용으로부터 명확한 것처럼, 본원에 개시된 실시양태의 마이크로입자는 많은 상이한 형태를 취할 수 있고 많은 상이한 약물 또는 활성제를 도입한다. 그러나, 각각의 이러한 실시양태의 일반적 속성은 형성된 마이크로입자가 약 45% 내지 약 65%의 트랜스 이성체 함량을 갖는다는 것이다.
[실시예]
하기의 실시예는 개시된 마이크로입자의 실시양태를 설명하도록 포함된다. 하기의 실시예에 개시된 기술은 발명자가 본 개시내용의 실행시 잘 수행하는 것으로 개발된 기술을 나타내는 것으로 당업자가 이해해야 하고, 따라서 이의 실행을 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 생각될 수 있다. 그러나, 당업자는, 본 개시내용의 견지에서, 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 개시된 구체적인 실시양태에 많은 변화가 이루어질 수 있고 여전히 동일한 또는 유사한 결과를 얻을 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1
Ⅰ. 트랜스 이성체 함량과 RF /충전 사이의 관계식
FDKP 및 인슐린으로부터 마이크로입자를 제조하였다. FDKP를 수성 NH4OH 중에 용해시켜 용액을 형성하였다. 이 용액의 공급물 스트림을 고전단 혼합기에서 수성 HOAc 용액의 공급물 스트림과 합하여 마이크로입자의 수성 현탁액을 형성하였다.
약 2.5 중량%의 FDKP, 약 1.6 중량%의 농축 NH4OH(약 28 내지 약 30 중량%의 NH3) 및 약 0.05 중량%의 폴리소르베이트 80에 의해 FDKP 공급 용액을 제조하였다. 약 10.5 중량%의 GAA 및 약 0.05 중량%의 폴리소르베이트 80에 의해 아세트산 공급 용액을 제조하였다. 공급 용액 둘 다 약 0.2 ㎛ 막을 통해 여과한 후 사용하였다.
동량(질량 기준)의 각각의 공급 용액을 5호 구멍(0.0011 in2)을 갖는 Dual-feed Sonolator™을 통해 펌프질하였다. 소형 펌프를 동일한 유속의 각각의 공급물 스트림에 대해 50%로 설정하고 공급 압력은 약 2000 psi이었다. 탈이온수(DI 수)를 포함하는 수용 용기는 공급 용액의 질량과 동일하였다(예를 들면, FDKP 공급 용액 4 ㎏ 및 HOAc 공급 용액 4 ㎏을 DI 수 4 ㎏을 포함하는 수용 용기로 Sonolator™을 통해 펌프질하였다).
생성된 현탁액을 농축하고 0.2 ㎡ PES 막을 사용하여 수평 흐름 여과에 의해 세척하였다. 현탁액을 우선 약 4% 고체로 농축하고 이후 DI 수로 정용여과하고 마지막으로 약 16% 명목 고체로 농축하였다. 세척된 현탁액의 고체의 실제 백분율을 "건조 감량"에 의해 측정하였다.
DI 수 중의 약 2 중량% HOAc를 포함하는 용매 중에 (수취한 대로) 10 중량% 인슐린을 포함하는 인슐린 스톡 용액을 제조하고, 무균 여과하였다. 사용 전에 스톡 용액을 0.22 마이크로미터 필터를 통해 여과하였다. 현탁액의 고체 함량에 기초하여, 적절한 양의 스톡 용액을 혼합 현탁액에 첨가하였다. 이후, 수산화암모늄 용액을 사용하여 약 3.6의 pH로부터 약 4.5의 pH로 생성된 마이크로입자/인슐린 현탁액을 조정하였다.
이후, 마이크로입자/인슐린 현탁액을 액체 질소 중에 급속 냉동하여 펠렛화(냉동 과립화)하였다. 차가운 펠렛을 동결건조하여 건조 분말을 생성시켰다.
벌크 분말의 충전당 호흡성 분율(RF/충전)은 공기역학적 마이크로입자 크기 분포의 측정치이고, Andersen Cascade Impactor에 의한 실험에 의해 측정하였다. RF/충전 값을 얻기 위해, 카트리지에 벌크 분말을 충전하고 30 L/분에서 MEDTONE® 흡입기를 통해 배출시켰다. 각각의 흡입기 단에서 수집된 분말을 칭량하고 수집된 전체 분말을 카트리지에 충전된 전체 양으로 정규화하였다. 따라서, RF/충전은 카트리지에 로딩된 분말로 나눈 호흡성 분율을 나타내는 임팩터의 단에서 수집된 분말이었다.
도 1에 도시된 바대로, RF/충전으로서 측정된 허용가능한 공기역학적 성능을 갖는 FDKP 분말을 45%만큼 적은 트랜스 이성체 함량을 갖는 FDKP로부터 제조하였다(도 1). 65% 초과의 트랜스-FDKP를 포함하는 분말은 다소 가변적인 RF/충전을 갖는 경향이 있다.
본 연구는 유리한 공기역학적 특성을 갖는 트랜스 이성체 함량 범위를 측정한다. 다음 섹션은 특정한 이성체 함량을 생성시킬 수 있는 가공 조건을 평가하기 위해 수행되는 실험을 기재한다.
Ⅱ. 비누화 용매
FDKP 트랜스 이성체 함량에 대한 비누화 조건의 효과를, 존재한다면, 결정하기 위해 실험을 수행하였다(도 2). FDKP 디에틸 에스테르(화합물 004)와 590 ㎖의 반응 용매(표 5 참조)의 혼합물을 약 57℃로 가열하였다. 반응 온도가 안정화된 후, 약 50% NaOH 용액을 적하 깔때기를 통해 약 60 분 동안 적하하였다. NaOH 첨가가 완료된 후 반응을 약 30 분 동안 유지시키고 이후 여과하여 임의의 비반응된 고체를 제거하였다. 여액을 아세트산에 의해 약 5의 pH로 산성화하고, 생성된 고체를 여과로 분리하고, 물 및 아세톤으로 세척하고, 진공 오븐에서 건조하고, HPLC에 의해 분석하여 시스 및 트랜스 이성체 함량을 측정하였다.
따라서, 수성 용매 시스템(표 4, A)으로부터 유기 용매 시스템(표 4, E) 범위의 5개의 상이한 용매 시스템을 평가하였다. 일반적으로, 표 4에서의 데이터는 실험 A, B 및 C에서 사용된 용매 시스템이 허용가능한 트랜스 이성체 함량을 갖는 FDKP를 생성시킨다는 것을 보여준다.
[표 4] FDKP 이성체 함량에 미치는 단계 5에서의 물:메탄올 용매 비의 영향
Figure 112012002726374-pct00008
Ⅲ. 재결정 조건
TFA(용매)/GAA(반용매) 혼합물(도 2; 단계 6)로부터 FDKP를 재결정할 수 있다. 이 재결정 공정 및 FDKP 이성체 함량에 대한 이의 효과를 규명하기 위해 제어 공정 매개변수를 평가하였다. 일반적으로, 높은 수율을 갖는 재결정 반응은 또한 원하는 트랜스 이성체 함량을 갖는 FDKP를 생성시켰다. 저수율 재결정 반응은 높은 트랜스 이성체 함량을 생성시키는데, 왜냐하면 시스 이성체가 재결정 용매 시스템에서 더 높은 용해도를 갖기 때문이다.
반응기에 미정제 FDKP(약 75 g) 및 TFA(약 250 ㎖)를 충전하고 교반을 개시하였다. 현탁액을 환류(약 80℃ 내지 약 85℃)로 가열하고 약 10 분 동안 또는 모든 고체가 용해될 때까지 유지시켰다. 혼합물을 약 60℃ 이하로 냉각시켰다. 빙초산(약 375 ㎖)을 이 용액에 첨가하였다. 혼합물을 냉각시키고 약 10℃ 내지 약 20℃에서 최소 약 6 시간 동안 유지시켰다. 침전된 생성물을 여과하고 GAA(3×약 100 ㎖), 아세톤(3×약 100 ㎖) 및 물(1×약 100 ㎖)로 세척하였다. 생성물을 진공(Hg 중 약 22 내지 약 25) 하에 약 55℃에서 약 12 내지 약 18 시간 동안 건조시켰다.
초기에, 용매 분량, 반용매 분량, 결정 시간 및 결정 온도를 포함하는 4가지 인자를 시험하였다. 약 2.68 또는 약 3.34 ㎖/g의 FDKP의 용매 분량은 허용가능한 FDKP의 트랜스 이성체(%)를 제공하였다. 약 6.68 ㎖ 용매/g의 FDKP에서, 허용 가능하지 않게 높은 트랜스 이성체 함량이 생성되었다. 반용매의 양은 5.0 ㎖/g의 FDKP 이하에서 트랜스 FDKP 이성체 함량(%)에 현저히 영향을 미치지 않았다. 제어 분량으로부터 반용매 분량을 감소시키는 것은 실질적으로 원하는 범위를 초과하는 트랜스 FDKP(%)를 생성시켰다.
높은 생성물 수율을 갖는 실험에서, 결정 시간은 약 6 또는 24 시간 이하에서 트랜스 FDKP 이성체 함량(%)에 현저히 영향을 미치지 않았다. 이성체 함량(FDKP의 트랜스 이성체(%))은 시험된 높은(35℃) 및 낮은(0℃) 결정 온도에서 약 45 내지 약 65% 범위를 벗어났다.
후속 실험을 이러한 발견을 지지하였다. 도 6은 용매:반용매 비(TFA:GAA) 및 결정 온도의 함수로서 트랜스 FDKP(%)로서 측정되는 FDKP 이성체 함량을 도시하는 표면을 보여준다. 이 실험에서 시험된 범위에 걸쳐 트랜스 FDKP(%)에 대한 값은 59∼75% 변했다. 데이터는 트랜스 FDKP 이성체가 낮은 용매 비(0.43) 및 높은 결정 온도(25℃)에서 원하는 범위 내에 있다는 것을 제시한다. 반응 표면의 면적에서의 트랜스 FDKP 이성체(%)에 대한 예상 값은 58∼60%이었다. 이 관찰은 25℃의 결정 온도의 사용이 유리하다는 것을 제시한다.
실시예 2
FDKP 의 트랜스 이성체의 측정
HPLC를 사용하여 FDKP 시스/트랜스 이성체 비를 측정하였다. 1 M 포름산암모늄 완중액 중의 ∼0.15 ㎎/㎖의 농도로 FDKP 샘플을 제조하였다.　 샘플을 음파처리하고 분석을 위해 HPLC 바이알로 옮겼다.　 사용된 주입 용적은 20 ㎕이었다.　 하기 HPLC 매개변수를 이용하여 31.7 분 및 33.3 분의 보유 시간(각각 시스 및 트랜스 FDKP)이 관찰되었다:
칼럼:　 Phenomenex LUNA Phenyl-Hexyl
입자 크기:　 3 ㎜
칼럼 길이:　 15 ㎝
칼럼 내경:　 3.0 ㎜
이동상 A:　 물/트리플루오로아세트산, 1000:1(v:v)
이동상 B:　 메탄올/테트라하이드로푸란/트리플루오로아세트산, 900:100:1(v:v:v)
주입 용적:　 20 ㎕
유속:　 분당 0.3 ㎖
실행 시간:　 90 분
칼럼 온도: 30±3℃
샘플 온도:　 8±3℃
검출기: UV 254 ㎚
[표 5] FDKP 샘플의 용리 구배
Figure 112012002726374-pct00009
실시예 3
용적측정 중앙 기하 직경 ( VMGD ) 특징에 의한 배출 제제의 기하 입자 크기 분석
건조 분말 흡입기로부터 배출된 건조 분말 제제의 레이저 회절은 분말에 처리된 탈응집의 수준을 규명하기 위해 이용되는 통상의 방법론이다. 이 방법론은 산업 표준 임팩션 방법론에서 발생하는 공기역학적 크기보다는 기하 크기의 측정치를 나타낸다. 통상적으로, 배출된 분말의 기하 크기는 중앙 입자 크기, VMGD에 의해 특징지어지는 용적측정 분포를 포함한다. 중요하게는, 배출된 입자의 기하 크기는 임팩션 방법에 의해 제공되는 공기역학적 크기와 비교하여 고조된 해상도에 의해 파악된다. 더 작은 크기가 바람직하고 개별 입자가 폐 호흡기도로 전달되는 가능성을 증가시킨다. 따라서, 흡입기 탈응집의 차이 및 최적 성능은 회절에 의해 해결하기 더 쉬울 수 있다. 이 실험에서, 흡입기를 실제 환자 흡기 용량에 유사한 압력에서 레이저 회절에 의해 시험하여 분말 제제를 탈응집하는 흡입 시스템의 효과를 결정하였다. 구체적으로, 제제는 활성 인슐린 로딩된 성분을 갖거나 갖지 않는 응집성 디케토피페라진 분말을 포함하였다. 이 분말 제제는 특징적인 표면적, 이성체 비율 및 Carr 지수를 보유하였다. 표 4에서 시험 동안 VMGD 및 용기 엠프팅의 효율을 기록하였다. FDKP 분말은 50의 근사 Carr 지수를 갖고 TI 분말은 40의 근사 Carr 지수를 가졌다.
[표 6]
Figure 112012002726374-pct00010
표 6에서의 데이터는 MedTone® 흡입기 시스템에 비해 DPI 2로서 확인된 흡입기에서의 분말 탈응집의 개선을 보여준다. 표면적이 14∼56 m2/g 범위인 디케토피페라진 제제는 85% 초과의 엠프팅 효율 및 7 마이크론 미만의 VMGD를 나타냈다. 유사하게, 45∼66% 트랜스 범위의 이성체 비율을 보유하는 제제는 인정 장치에 비해 개선된 성능을 나타냈다. 그러나, 66% 트랜스 함량에서 더 효율적인 흡입기에 의하더라도　트랜스 이성체 함량이 본원에 개시된 범위를 벗어나면서 공기역학적 성능의 하락(감소)을 나타내는 카트리지 엠프팅의 감소가 존재한다는 것을 주목할 가치가 있다. 마지막으로, 40∼50의 Carr 지수를 갖는 것을 특징으로 하는 제제에 의한 흡입기 시스템의 성능은 또한 인정 장치에 비해 개선되는 것으로 보였다. 모든 경우에, 보고된 VMGD 값은 7 마이크론 미만이었다.
달리 기재되지 않은 한, 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 성분의 분량, 분자 중량과 같은 특성, 반응 조건 및 기타 등등을 포함하는 모든 숫자는 모든 경우에 "약"이란 용어에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 반대로 표시되지 않는 한, 명세서 및 특허청구범위에 기재된 숫자 매개변수는 본 발명에 의해 얻어지는 추구하고자 하는 바람직한 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 매우 최소한으로, 특허청구범위에 균등물의 원리의 적용을 제한하는 시도가 아니면서, 각각의 숫자 매개변수는 보고된 유의적인 숫자의 수에 견지에서 통상의 반올림 기술을 적용하여 적어도 해석되어야 한다. 본 발명의 넓은 범위를 기재하는 숫자 범위 및 매개변수가 근사치임에도 불구하고, 구체적인 예에 기재된 숫자 값은 가능한 한 정확히 기록되었다. 그러나, 임의의 숫자 값은 본래 필수적으로 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 생기는 특정한 오차를 포함한다.
본 발명을 설명하는 데 있어서 (특히 특허청구범위에 있어서) 사용되는 단수 용어 및 지시어는, 본원에서 달리 기재되지 않거나, 본원에 의해 달리 명확히 반대되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에서의 값의 범위의 언급은 단순히 그 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법을 제공하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 기재되지 않은 한, 각각의 개별 값은 본원에 개별적으로 인용되는 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에서 달리 기재되지 않거나, 본원에 의해 달리 명확히 반대되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 본원에 기재된 모든 방법을 수행할 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예 또는 예시적인 단어(예, "예컨대")의 사용은 단순히 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것이고 달리 청구되지 않은 한 본 발명의 범위에 제한을 부여하지 않는다. 명세서에서의 어떠한 언어도 본 발명의 실행에 필수적인 임의의 청구되지 않은 부재를 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
특허청구범위에서의 "또는"이라는 용어의 사용은, 개시내용이 유일한 대안 및 "및/또는"을 의미하는 정의를 지지하더라도, 명확히 유일한 대안을 의미하는 것으로 기재되지 않거나 대안이 상호 배제되지 않는 한, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.
대안적인 부재 또는 본원에 개시된 본 발명의 실시양태의 그룹화 제한으로서 해석되어서는 안 된다. 각각의 군 구성원은 개별적으로 또는 본원에 발견되는 군의 다른 구성원 또는 다른 부재와의 임의의 조합으로 언급되고 청구될 수 있다. 군의 1개 이상의 구성원이 편리성 및/또는 특허성의 이유로 군에 포함되거나 군으로부터 삭제될 수 있는 것으로 기대된다. 임의의 이러한 포함 또는 삭제가 일어나는 경우, 명세서는 본원에서 군을 변형된 바대로 포함하고 따라서 특허청구범위에서 사용되는 모든 Markush 군의 기재된 설명을 이행하는 것으로 생각된다.
본 발명을 실행하기 위해 발명자에게 공지된 최선의 방식을 비롯하여 본 발명의 바람직한 실시양태가 본원에 기재되어 있다. 물론, 바람직한 실시양태에 대한 변형이 명세서를 읽을 때 당업자에게 명확할 것이다. 본 발명자들은 당업자는 이 변형을 적절하게 이용할 것이라 예상하고, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기재된 것과 달리 실행되도록 의도한다. 따라서, 본 발명은 준거법에 의해 허용되는 바대로 본원에 첨부된 특허청구범위에 기재된 대상의 모든 변형 및 균등물을 포함한다. 더욱이, 본원에서 달리 기재되지 않거나, 본원에 의해 달리 명확히 반대되지 않는 한, 모든 가능한 변형에서의 상기 기재된 부재의 임의의 조합은 본 발명에 의해 포함된다.
본원에 개시된 구체적인 실시양태는 언어로 구성되거나 또는 실질적으로 구성되는 청구항에 의해 추가로 제한될 수 있다. 청구항에서 사용될 때, 제출되었든 또는 보정에 의해 추가되었든, "로 구성되는"이란 전환어는 청구항에 기재되지 않은 임의의 부재, 단계 또는 성분을 배제한다. "로 실질적으로 구성되는"이란 전환어는 특허청구범위를 기재된 물질 또는 단계 및 기본적이고 새로운 특징(들)에 영향을 중요하게 미치지 않는 것에 제한하지 않는다. 이렇게 청구된 본 발명의 실시양태는 본원에 본래 또는 명확히 기재되고 가능하게 된다.
또한, 본 명세서에 걸쳐 특허 및 인쇄 공보에 다양한 참조문헌이 이루어졌다. 각각의 상기 인용된 참조문헌 및 인쇄 공보는 본원에서 전문이 참조문헌으로 개별적으로 포함된다.
추가로, 본원에 개시된 본 발명의 실시양태는 본 발명의 원칙을 예시하는 것으로 이해되어야 한다. 이용할 수 있는 다른 변형은 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 제한이 아닌 예의 방식으로, 본원에서의 교시에 따라 본 발명의 대안적인 배치를 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 도시되고 기재된 바대로 정확하게 제한되지 않는다.

Claims (65)

  1. 45% 내지 65%의 트랜스 이성체 함량을 포함하는 푸마릴 디케토피페라진(FDKP) 마이크로입자로서, 상기 FDKP는 3,6-비스(N-푸마릴-4-아미노부틸)-2,5-디케토피페라진인 FDKP 마이크로 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 트랜스 이성체 함량은 50% 내지 65%인 FDKP 마이크로입자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 트랜스 이성체 함량은 53% 내지 63%인 FDKP 마이크로입자.
  4. 제1항에 있어서, 약물 또는 활성제를 추가로 포함하는 FDKP 마이크로입자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 약물 또는 활성제는 펩티드 또는 단백질인 FDKP 마이크로입자.
  6. 제5항에 있어서, 상기 펩티드는 내분비 호르몬인 FDKP 마이크로입자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 내분비 호르몬은 인슐린, 부갑상선 호르몬, 칼시토닌, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드 1 또는 옥신토모듈린인 FDKP 마이크로입자.
  8. 제4항에 있어서, 약물은 마이크로입자의 0.01 중량% 초과의 양으로 존재하는 것인 마이크로입자.
  9. 45% 내지 65%의 트랜스 이성체 함량을 포함하는 FDKP 마이크로입자를 포함하는 건조 분말로서, 상기 FDKP는 3,6-비스(N-푸마릴-4-아미노부틸)-2,5-디케토피페라진인 건조 분말.
  10. 제9항에 있어서, 상기 트랜스 이성체 함량은 50% 내지 65%인 건조 분말.
  11. 제9항에 있어서, 상기 트랜스 이성체 함량은 53% 내지 63%인 건조 분말.
  12. 제9항에 있어서, 약물 또는 활성제를 추가로 포함하는 건조 분말.
  13. 제12항에 있어서, 상기 약물 또는 활성제는 펩티드 또는 단백질인 건조 분말.
  14. 제13항에 있어서, 상기 펩티드는 내분비 호르몬인 건조 분말.
  15. 제14항에 있어서, 상기 내분비 호르몬은 인슐린, 부갑상선 호르몬, 칼시토닌, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드 1 또는 옥신토모듈린인 건조 분말.
  16. 제12항에 있어서, 약물은 마이크로입자의 0.01 중량% 초과의 양으로 존재하는 것인 건조 분말.
  17. 45% 내지 65%의 FDKP 트랜스 이성체 함량을 포함하는 FDKP 마이크로입자를 포함하는 건조 분말 제제를 포함하는, 내분비 관련 질환 또는 질병 치료용 약제로서, 상기 약제는 상기 질환 또는 질병을 치료하는 내분비 호르몬을 포함하고, 상기 FDKP는 3,6-비스(N-푸마릴-4-아미노부틸)-2,5-디케토피페라진인 약제.
  18. 제17항에 있어서, 상기 트랜스 이성체 함량은 50% 내지 65%인 약제.
  19. 제17항에 있어서, 상기 트랜스 이성체 함량은 53% 내지 63%인 약제.
  20. 제17항에 있어서, 상기 트랜스 이성체 함량은 50% 내지 59%인 약제.
  21. 제17항에 있어서, 상기 내분비 호르몬은 인슐린, 부갑상선 호르몬, 칼시토닌, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드 1 또는 옥신토모듈린인 약제.
  22. 제21항에 있어서, 상기 내분비 호르몬은 마이크로입자의 0.01 중량% 초과의 양으로 존재하는 것인 약제.
  23. 제17항에 있어서, 내분비 관련 질환은 당뇨병인 약제.
  24. 제23항에 있어서, 상기 당뇨병은 1형 당뇨병인 약제.
  25. 제23항에 있어서, 상기 당뇨병은 2형 당뇨병인 약제.
  26. 제23항에 있어서, 내분비 호르몬은 부갑상선 호르몬인 약제.
  27. 제23항에 있어서, 내분비 호르몬은 칼시토닌인 약제.
  28. 제23항에 있어서, 내분비 호르몬은 글루카곤인 약제.
  29. 제23항에 있어서, 내분비 호르몬은 글루카곤 유사 펩티드 1인 약제.
  30. 제23항에 있어서, 내분비 호르몬은 옥신토모듈린인 약제.
  31. 건조 분말로서 폐 투여를 하기 위한 마이크로입자를 제조하는 방법으로서,
    (a) 45% 내지 65%의 FDKP 트랜스 이성체 함량을 갖는 FDKP 화합물을 합성하는 단계로서, 상기 FDKP 화합물은 3,6-비스(N-푸마릴-4-아미노부틸)-2,5-디케토피페라진인 단계;
    (b) FDKP 화합물을 염기성 pH를 갖는 용액 중에 용해시켜 FDKP 용액을 형성하는 단계;
    (c) 휘발성 산의 용액을 제공하는 단계; 및
    (d) 고전단 혼합기 내에서 용액을 함께 혼합하여 상기 마이크로입자를 현탁액으로 생성하는 단계
    를 포함하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, FDKP의 트랜스 이성체 함량을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, FDKP의 트랜스 이성체 함량을 측정하는 단계는 고압 액체 크로마토그래피를 이용하여 수행되는 것인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 마이크로입자와 약물을 포함하는 용액을 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 약물은 내분비 호르몬인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 내분비 호르몬은 인슐린, 부갑상선 호르몬, 칼시토닌, 글루카곤, 글루카곤 유사 펩티드 1 또는 옥신토모듈린인 방법.
  37. 45% 내지 65%의 트랜스 이성체 함량을 갖는 디케토피페라진을 합성하는 방법으로서,
    (a) 염기성 pH에서 물과 수혼화성 용매의 혼합물 중에서 디케토피페라진의 에스테르를 비누화하는 단계; 및
    (b) 0.4 내지 0.7 범위의 최종적 비율로 트리플루오로아세트산 및 빙초산을 포함하는 반응 혼합물 중에서 디케토피페라진을 재결정화시키는 단계
    를 포함하고, 상기 디케토피페라진은 3,6-비스(N-푸마릴-4-아미노부틸)-2,5-디케토피페라진인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 수혼화성 용매는 알콜, 테트라하이드로푸란, 디옥산 또는 아세토니트릴인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 알콜은 메탄올, 에탄올, 또는 이소프로판올인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 메탄올은 1:1 내지 3:1 범위의 물:메탄올 비율로 존재하는 것인 방법.
  41. 제37항에 있어서, 디케토피페라진의 트랜스 이성체 함량을 측정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 제37항에 있어서, 재결정 단계의 반응 혼합물은 4시간 또는 4시간 초과의 기간 동안 유지되는 것인 방법.
  45. 3,6-비스(N-푸마릴-4-아미노부틸)-2,5-디케토피페라진 및 인슐린을 포함하는 마이크로입자를 포함하는 건조 분말로서, 상기 마이크로입자는 중량 기준으로 10% 내지 15%의 인슐린을 포함하고, 마이크로입자의 트랜스 FDKP 이성체 함량은 53% 내지 63%인 건조 분말.
  46. 3,6-비스(N-푸마릴-4-아미노부틸)-2,5-디케토피페라진 및 인슐린을 포함하는 마이크로입자를 포함하는 건조 분말 및 호흡 작동식(breath powered) 흡입기를 포함하는 흡입 시스템으로서, 상기 마이크로입자는 중량 기준으로 10% 내지 15%의 인슐린을 포함하고, 마이크로입자의 트랜스 FDKP 이성체 함량은 53% 내지 63%이고, 상기 건조 분말은 단위 용량 카트리지에 제공되는 것인 흡입 시스템.
  47. 제4항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약물은 인슐린인 FDKP 마이크로입자.
  48. 제12항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약물은 인슐린인 건조 분말.
  49. 제17항 내지 제25항 중 어느 하나의 항에 있어서, 내분비 호르몬은 인슐린인 약제.
  50. 제34항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약물은 인슐린인 방법.
  51. 제45항에 있어서, 인슐린은 인간 인슐린인 건조 분말.
  52. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 마이크로입자는 45% 내지 65%의 상기 트랜스 이성체 함량의 범위 밖의 트랜스 이성체 함량을 갖는 마이크로입자와 비교하였을 때 공기역학적 성능이 향상된 것인 FDKP 마이크로입자.
  53. 제9항 내지 제16항 및 제45항 중 어느 하나의 항에 있어서, FDKP 마이크로입자는 45% 내지 65%의 상기 트랜스 이성체 함량의 범위 밖의 트랜스 이성체 함량을 갖는 마이크로입자와 비교하였을 때 공기역학적 성능이 향상된 것인 건조 분말.
  54. 제17항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, FDKP 마이크로입자는 45% 내지 65%의 상기 트랜스 이성체 함량의 범위 밖의 트랜스 이성체 함량을 갖는 마이크로입자와 비교하였을 때 공기역학적 성능이 향상된 것인 약제.
  55. 제31항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 있어서, FDKP 마이크로입자는 45% 내지 65%의 상기 트랜스 이성체 함량의 범위 밖의 트랜스 이성체 함량을 갖는 마이크로입자와 비교하였을 때 공기역학적 성능이 향상된 것인 방법.
  56. 제46항에 있어서, FDKP 마이크로입자는 45% 내지 65%의 상기 트랜스 이성체 함량의 범위 밖의 트랜스 이성체 함량을 갖는 마이크로입자와 비교하였을 때 공기역학적 성능이 향상된 것인 흡입 시스템.
  57. 제46항에 있어서, 인슐린은 인간 인슐린인 흡입 시스템.
  58. 제47항에 있어서, 인슐린은 인간 인슐린인 FDKP 마이크로입자.
  59. 제48항에 있어서, 인슐린은 인간 인슐린인 건조 분말.
  60. 제49항에 있어서, 인슐린은 인간 인슐린인 약제.
  61. 제50항에 있어서, 인슐린은 인간 인슐린인 방법.
  62. 제47항에 있어서, 마이크로입자는 45% 내지 65%의 상기 트랜스 이성체 함량의 범위 밖의 트랜스 이성체 함량을 갖는 마이크로입자와 비교하였을 때 공기역학적 성능이 향상된 것인 FDKP 마이크로입자.
  63. 제48항에 있어서, FDKP 마이크로입자는 45% 내지 65%의 상기 트랜스 이성체 함량의 범위 밖의 트랜스 이성체 함량을 갖는 마이크로입자와 비교하였을 때 공기역학적 성능이 향상된 것인 건조 분말.
  64. 제49항에 있어서, FDKP 마이크로입자는 45% 내지 65%의 상기 트랜스 이성체 함량의 범위 밖의 트랜스 이성체 함량을 갖는 마이크로입자와 비교하였을 때 공기역학적 성능이 향상된 것인 약제.
  65. 제50항에 있어서, FDKP 마이크로입자는 45% 내지 65%의 상기 트랜스 이성체 함량의 범위 밖의 트랜스 이성체 함량을 갖는 마이크로입자와 비교하였을 때 공기역학적 성능이 향상된 것인 방법.
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