HU189268B

HU189268B - Process for the semisynthetic preparation of humane insuline

Info

Publication number: HU189268B
Application number: HU831392A
Authority: HU
Inventors: Dedem Gijsbert W K Van; Houdenhoven Francois E A Van
Original assignee: Akzo Nv,Nl
Priority date: 1982-04-21
Filing date: 1983-04-21
Publication date: 1986-06-30
Also published as: ES8405760A1; DK161683A; DE3379640D1; JPH05339290A; JPS58189149A; ATE42203T1; PL241575A1; IL68397A; EP0092280B1; DK173007B1; JPH0533993B2; US4840897A; ES521674A0; PL143571B1; NL8201650A; JPH0735399B2; AU1355483A; DK161683D0; IL68397A0; CA1202587A

Description

A találmány tárgya új eljárás humán inzulin szemiszintetikus előállítására. A találmány szerint új, módosított humán inzulint állítunk elő, majd ebből a módosító csoportot eltávolítva nyerjük a humán inzulint.

A vérben jelentkező inzulinhiány (diabetes mellitus) következtében fellépő hipoglikémia inzulin adagolással, például injekció formájában vagy adagoló pumpa segítségével, kezelhető. Erre a célra különösen elterjedten használják az állati pankreászból, például sertés vagy marha pankreászból izolált inzulint.

Az ilyen inzulinkészítmények egyes esetekben antigén vagy allergén aktivitással bírnak. Ezt részben a készítményben jelenlévő szennyezések (például pro-inzulin, ennek részleges bomlástermékei, arginin-inzulin, inzulin-etil-észter, monodezaminoinzulin vagy inzulin aggregátumok) okozhatják. Ezen felül az allergén aktivitás az állati és a humán inzulin szerkezete közötti különbség következménye is lehet annak eredményeképpen, hogy az emberi szervezet nem fogadja be az állati eredetű fehérjét. A sertés és a humán inzulin például egy aminosavban, az úgynevezett B-lánc karboxiterminális aminosavában különbözik egymástól. Ez az úgynevezett B 30 aminosav a sertés inzulinban alanin, a humán inzulinban pedig treonin. Ezért a sertés inzulin a B 30 aminosav treoninra való cserélésével alakítható humán inzulinná. E feladat megoldására számos eljárás ismeretes.

Természetes módon szinte minden eljárás a B 30 aminosav eltávolításával kezdődik; a sertés inzulin esetében így az alanint távolítják el. Az így előállított dez(B 30) inzulint gyakran nevezik dez(Ala) inzulinnak, röviden DAI-nak. Az eljárás folytatásaként számos, a humán inzulin keletkezéséhez vezető eljárás ismeretes. Ezek védett - például észterrel védett - karboxilcsoporttal bíró treoninnak enzimes vagy nem enzimes eljárással dez(B 30) inzulinhoz való kötésén alapulnak. A treonin kötődése után a védőcsoportot el kell távolítani. Egy szokásosan alkalmazott védőcsoport, a terc-butoxicsoport esetében a védőcsoport eltávolításához igen drasztikus körülmények szükségesek, főként szélsőséges pH, amely a visszamaradó inzulinmolekulára is hat. E hatás eredményeként az inzulin részleges lebomlásának termékei jönnek létre, melyek gyakorlatilag elválaszthatatlanok a célterméktől, a humán inzulintól. Ennek folytán a kapott termék tisztasága nem megfelelő. A tisztítás már az eljárás korábbi szakaszában a treonin kötését követően reagált és a reakcióban részt nem vett dez(B 30) inzulin elválasztása során is jelentős problémát okoz. Az elválasztással, különösen nagy léptékű gyártásnál, nem lehet megfelelően tiszta terméket nyerni, kivéve, ha igen nagy veszteségek fellépését vállaljuk.

Humán inzulin szemiszintetikus előállítására szolgáló eljárást ismertetnek a 4 320 196 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. Az ismert eljárásban a DAI-t Thr-O-alkillel reagáltatják. Ebben az eljárásban a reakcióban résztvett és a reagálatban DAI elválasztása - amely a kívánt termék tisztaságára is kihat - nem kielégítő. Ennek oka, hogy az elválasztandó termékek retenciós ideje közötti különbség nem elég nagy.

erre vonatkozó mérési adatainkat a találmány sz, rinti vegyületekkel való összehasonlításban a 2.

táblázatban ismertetjük.

Az ismert eljárásban az alkilcsoportot a Thr-Oalkillal kapcsolt DAI-ról meglehetősen agresszív módszerrel, trifluor-ecetsawal hasítják le.

A reakció hozama 43 %, a kapott termék tisztasága 77%.

Célul tűztük ki az ismertnél jobb hozamú, tisztább terméket biztosító eljárás kidolgozását.

Találmányunk olyan eljárást biztosít 99%-nál nagyobb tisztaságú humán inzulin előállítására, amely nem tartalmaz nagyszámú, a hozamot csökkentő elválasztási és tisztítási műveletet.

A DAI-Thr-R¹ vegyületről, amelyben R¹ a Thrhez peptidkötéssel kapcsolódik, az R¹ csoport a peptidkötés hasításával >99% hozammal távolítható el, ellentétben a fenti, ismert eljárásban alkalmazott észterkötés hasításának kisebb hozamával.

A találmány szerinti eljárásban az (I) általános képletű módosított humán inzulinról - a képletben R¹ jelentése aminosav vagy peptid vagy ezek észtere vagy amidja - enzimesen lehasítjuk az aminosavat vagy peptidet - majd az így kapott humán inzulint elkülönítjük a közegből.

Az (I) általános képlettel jellemzett módosított humán inzulin könnyen előállítható dez(B 30) inzulinnak (II) általános képletű vagy dez(B 29, B 30) inzulinnak (III) általános képletű vegyülettel való összekötésével. A (II) és (III) képletekben R¹ jelentése az előzőekben megadott.

A dez(B 30) inzulin a humán inzulinnal a B 30 aminosavtól eltekintve mindenben azonos állati inzulinból, azt megfelelő enzimmel, például karboxipeptidáz A enzimmel vagy Achromobacter lyticusból származó liziléndopeptidázzal kezelve elkülönítetten előállítható. A dez(B 30) inzulin-maradék előállítható in situ, de a B 30 aminosav eltávolítása és a (II) általános képletű vegyület kötése úgynevezett transzpeptidáz reakcióban egyetlen enzimmel, például tripszinnel elvégezhető.

A dez(B 29, B 30) inzulin ugyancsak előállítható a megfelelő állati inzulinból dipeptidáz enzim alkalmazásával vagy olyan peptidáz segítségével, amely specifikusan a prolin-lizin peptidkötést hasítja.

A (II) általános képletű vegyület az előzőek szerint készített dez(B 30) inzulin B 29-lizinjéhez például tripszinnel vagy bármely más tripszinhez hasonló hatású enzimmel, például liziléndopeptidázzal hozzáköthető. Hordozóhoz kötött enzim akkor használható, ha a reakció végeztével az enzim és a módosított inzulint tartalmazó oldat könnyen elválasztható egymástól.

Az R¹ csoport és a humán inzulin közötti kovalens kötésnek enzimesen hasíthatónak kell lennie.

Ez a feltétel jelentősen befolyásolja az R¹ csoportot alkotó aminosav(ak) megválasztását.

Ha R¹ aminosavból vagy aminosavakból áll, előnyösen egy aminosavból álló részt vagy di- vagy tripeptidet választunk. Ezek lehetnek például hidrofób aminosavak, mint a fenilalanin vagy a triptofán és/vagy töltéssel bíró aminosavak, mint az arginin vagy a lizin. Ha hidrofób aminosavakat használunk, a tisztítást jelentősen elősegítik a hidrofób

189 268 körülmények, míg a poláris vagy ionizáló körülmények mellett végzett tisztításnak például a töltéssel bíró aminosavak kötése kedvez.

A humán inzulin előállítására a maradék R¹ csoportokat enzimes eljárással el kell távolítani az (I) általános képletű vegyületről. Az R¹ csoport karboxipeptidázzal távolítható el. A karboxipeptidáz olyan exopeptidáz, amely a peptid karboxi-terminálisáról kiindulva egyenként, egymás után távolítja el az aminosavakat, egyes aminosavakkal szemben hatékonyabb.

A karboxipeptidáz A (CPA) a hidrofób aminosavakat hasítja le, különösen előnyösen az aromás aminosavakat, például a fenilalanint, tirozint és triptofánt. Másrészt viszont a karboxipeptidáz B (CPB) a bázikus aminosavakat hasítja le könynyen. Ha az R¹ csoport megfelelően megválasztott aminosavak kombinációja, a CPA és/vagy CPB a találmány szerinti eljárás megvalósítására igen alkalmas proteolitikus enzimek, de más karboxipeptidázok vagy dipeptil-karboxipeptidázok is alkalmazhatóak helyettük.

A találmányt a továbbiakban példákkal világítjuk meg. A következő példákban minden esetben a dez(B 30) inzulin szerepel alapul, melyet sertés inzulinból E. W. Schmitt és munkatársai módszerével [lásd: Hoppé Seyler’s Z. Physiol. Chemie 359, 799 (1978)] állítottunk elő, ez az úgynevezett dez(Ala) inzulin (DAI).

7-6. Példa

Di- és tripeptidek kötése DAl-hoz

A kötés különféle szubsztrátok - di- és tripeptidek és tripeptidek hidrogén-klorid sói - és különféle enzimrendszerek - tripszin és hordozóhoz kötött tripszin és liziléndopeptidáz-jelenlétében történik.

A kötéseket a következőképpen végezzük:

a) Puffért készítünk

- dimetil-formamid és etanol 1 : 1 arányú elegyéből (ez az úgynevezett szerves frakció) és

- 0,5 mól/1 tris-HCl puffer bizonyos mennyiségéből

b) Mért mennyiségű szubsztrátot és DAI-t oldunk fenti pufferben.

c) A kapott elegy pH-ját tömény, 1 mól/l-es nátrium-hidroxiddal a kívánt értékre emeljük.

d) Hozzáadjuk a kötést létrehozó enzimet, a kötési reakciót 37 °C-on hajtjuk végre.

ej A reakció befejeződése után a reakcióterméket kromatográfiás eljárással elválasztjuk, a kötési reakció termékének hozamát a kromatogramból meghatározzuk és az elméleti érték százalékában kifejezve adjuk meg.

Az 1-6. példákra vonatkozó reakciókörülményeket és a hozamokat az 1. táblázatban ismertetjük.

7. Példa

A kötési reakció termékének elválasztása kromatográfiás eljárással összehasonlítottuk a pepiiddel kötött DAI és az észterrel kötött DAI kromatográfiás viselkedését.

Erre a célra az 1-4. példákban ismertetett módon elvégeztük DAI és thr-O-metil, thr-O-terc-butil, thr-phe-O-metil, valamint DAI és thr-phe-phe-csoportok kötését.

A reakció körülményei: 14g/1 DAI, 0,06mól/1 szubsztrát, 2,5 g/1 tripszin és 67% szerves frakció pH 6,4-es közegben, a reakcióidő fél óra.

A kötési reakció termékeit analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással elválasztjuk és a retenciós idő értékeket (R_f) meghatározzuk. Az elválasztási művelet eredményeit a 2. táblá40

7. Táblázat

Példa száma Körülmények	1.	2.	3.	4.	5.	6.
DAI koncentráció (g/1)	67,1	66,6	13,6	25,2	32,2	32,2
Szubsztrát Koncentráció (mól/1)	Thr-Phe 0,176	Thr-Phe 0,175	Thr-Phe- -Phe 0,067	Thr-Phe- -Phe-HCl 0,037	Thr-Phe- -Phe-HCl 0,047	Thr-Phe- -Phe 0,025
Enzim (g/1) tripszin: tripszines szilíciumdioxid: liziléndopeptidázos szilíciumdioxid:	2,7	808	5	77	157	157
Közeg (% szerves frakció)	60	60	67	60	60	60
PH	6,2	6,5	6,5	6,3	6,5	6,5
Reakcióidő (óra)	1/3	1	7/12	48	3	3
Hozam (az elméleti %-a)	53	28	54	38	27	16

-3189 268 zatban ismertetjük a kötési reakció termékei retenciós idejének a DAI retenciós idejétől való eltéréseként (AR_f) megadva. A táblázatból látható, hogy a AR_f értékek az ismert termékekénél jóval nagyobbak.

teljes egészében humán inzulinná alakul. Az áL kulást nagynyomású folyadékkromatográfiás víz, gálattal igazoltuk. A hozam > 99%. A kapott termék tisztasága >99%.

DAI-hoz kapcsolt csoport	AR_f (s)
thr-O-metil	220
thr-O-terc-butil	1000
thr-phe-O-metil	1400
thr-phe-phe	1700

Ez a reagálatlan DAI és a módosított inzulin elválasztását megkönnyíti, tisztább termék előállítását teszi lehetővé.

<S’. Példa

A kötött phe-plie-csoport eltávolítása bAI-thr-phe-phe-röl

Az át nem alakult DAI és a kötési reakció termékeként nyert DAI-thr-phe-phe hidrofób oszlopon való elválasztása révén 23 ml térfogatú frakciót kapunk, amely 0,85 mg/ml kötött terméket tartalmaz. Ezt a terméket fagyasztva szárítjuk, majd közelítőleg 2,8 mg/ml koncentrációjúra oldjuk 0,2 mól/l-es pH 8,5 ammónium-hidrogén-karbonát pufferben. Ehhez az oldathoz 2 μΐ karboxipeptídázoldatot adunk (2,3 E). A reakciót 30 perc elteltével azonos térfogatú 0,5 mól/1 citromsav hozzáadásával leállítjuk. Ezután a kapott anyagot kristályosítjuk.

Az aminosavanalízissel végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a kötési reakció terméke teljes egészében humán inzulinná alakul. Kristályosítást követően a felülúszóban kizárólagos aminosavként fenilalanin mutatható ki. A hozam > 99%. A kapott inzulin tisztasága > 99%.

9. Példa

190 mg treonin-fenilalanin-metil-észtert Imi 1 : 1 arányú dimetil-formamid - etanol elegyben oldunk. A kapott oldatból 0,2 ml-t 19,4 mg DAIhoz adunk. Ezt követően 0,1 ml tripszin oldatot (6 mg tripszint 1 ml 0,5 mól/l-es, pH 6,5-ös trisz/ hidrogén-klorid pufferben oldunk) és 0,04 ml 1 mól/l-es nátrium-hidroxid-oldatot adunk a dipeptidoldathoz, majd az elegy pH-ját 6,8-re állítjuk. 18 órán át tartó inkubálást követően 25%-os hozammal nyerjük a DAI-thr-phe-O-metil vegyületet.

10. Példa

DAl-thr-phe-t a 8. példában a DAI-thr-phe-phe kezelésénél ismertetett módon karboxipeptidázzal (0,9 E) kezelünk. 1 óra elteltével a DAI-thr-phe

II. Példa

Az 1-6. példákban ismertetetthez hasonló módon DAI-thr-phe-phe-O-metil-t állítunk elő. A reakció körülményei: 40,7 g/1 DAI, l,0mól/I thrphe-phe-O-metil, 1,8 g/1 tripszin, 60% szerves frakció pH 6,6-os közegben, a reakcióidő 1 óra. A reakció hozama 86%.

12. Példa

DAI-thr-phe-phe-O-metilt a 7. példában ismertetett módon kezelünk. A DAI-hoz kapcsolt csoport retenciós ideje és a DAI retenciós ideje közötti különbség R,(s) = 2000.

13. Példa

DAI-thr-phe-phe-O-metilt és DAI-thr-phe-Ometilt a 8. példában a DAI-thr-phe-O-metíire megadott módon kezelünk. Az ott kapottal azonos eredményre jutunk, a humán inzulinná való átalakulás tökéletes, és fenilalaninon kívül más aminosav nem mutatható ki. Hozam: > 99%. A kapott inzulin tisztasága > 99%.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás humán inzulin szemiszintetikus előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely (II) általános képletű vegyületet - ahol R¹ jelentése valamely aminosav, peptid vagy ezek atnidja vagy észtere dez(B 30) inzulinnal vagy dez(B 30) inzulin maradékkal reagáltatunk, a kapott (I) általános képletű módosított humán inzulinról - ahol R¹ jelentése a (II) általános képletnél megadott - az R¹ csoportot karboxipeptidáz enzimmel lehasítjuk, majd a kapott humán inzulint elkülönítjük. Elsőbbsége: 1982. 04. 21.
2. Eljárás humán inzulin szemiszintetikus előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely (III) általános képletű vegyületet - ahol R¹ jelentése valamely aminosav vagy peptid vagy ezek amidja vagy észtere - dez(B 29, B 30) - inzulinnal reagáltatunk, és a kapott (I) általános képletű módosított humán inzulinról - ahol R^! jelentése a (III) általános képletnél megadott - az R* csoportot karboxipeptidáz enzimmel lehasítjuk, majd a kapott humán inzulint elkülönítjük. Elsőbbsége: 1983. 04. 21.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R¹ helyettesítőként aminosavat, dipeptidet vagy tripeptidet vagy ezek észterét vagy amidját tartalmazó (II) általános képletű vegyületet alkalmazunk. Elsőbbsége: 1982. 04. 21.
4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R¹ helyettesitőként aminosavat, dipeptidet

189 268 vagy tripeptidet vagy ezek észterét vagy amidját tartalmazó (III) általános képletű vegyületet alkalmazunk. Elsőbbsége: 1983. 04. 21.
5. AZ 1. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R¹ helyettesítőként a fenilalanín mono-, di vagy trimerjét tartalmazó (II) általános képletű vegyületet alkalmazunk. Elsőbbsége: 1982. 04. 21.
6. A 2. vagy 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy R* helyettesítőként a fenilalanín mono-, di vagy trimerjét tartalmazó (III) általános képletű vegyületet alkalmazunk. Elsőbbsége: 1983. 04. 21.
7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy karboxipeptidáz enzimként karboxipepti⁵ dáz A enzimet alkalmazunk. Elsőbbsége: 1982. 04.

21.
8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy karboxipeptidáz enzimként karboxipeptidáz A enzimet alkalmazunk. Elsőbbsége: 1983. 04.