SU1232680A1

SU1232680A1 - Способ удалени нуклеиновых кислот из ферментсодержащих клеточных экстрактов @ @

Info

Publication number: SU1232680A1
Application number: SU843825153A
Authority: SU
Inventors: Владимир Павлович Романов; Станислав Николаевич Загребельный; Валентина Федоровна Майстренко; Нина Михайловна Пустошилова
Original assignee: Научно-Исследовательский Конструкторско-Технологический Институт Биологически Активных Веществ
Priority date: 1984-12-17
Filing date: 1984-12-17
Publication date: 1986-05-23

Description

1

Изобретение относитс к биохимии, а именно к способам.получени ферментов из микробиологического сырь .

Источником ферментов часто служат клетки микроорганизмов. Очистка фермента включает в себ несколько стадий: получение клеточного экстракта, грубое фракционирование клеточного экстракта с целью удалени нуклеиновых кислот и очистка фермента хроматографией .

В св зи с этим важнейшей задачей на первых стади х очистки ферментов вл етс освобождение от нуклеиновых кислот с помощью различных фракционирующих реагентов.

Цель изобретени - увеличение содержани фермента в целевом.продукте

В предлагаемом способе используют в качестве фракционирующего реагента раствор триэтилентетрамингидрохлори- да в экспериментально подобранном оптимальном режиме. Интервалы рН 7,0- 7,5 обусловлены наиболее высокой стабильностью ферментов при данных значени х рН. Кроме того, используемый буферный раствор на основетрис -НС 6 и триэтилентетрамин в указанной области имеет максимальную буферную емкость. При добавлении триэтилен- тетрамингидрохлорида до концентрации ниже 0,5% снижаютс выходы ферментов , так как часть их осаждаетс с нуклеиновыми кислотами. Увеличение концентрации триэтилентетрамингидро- хлорида до концентрации вьше 1% вызывает увеличение расхода реактива без увеличени выхода ферментов, Кроме того, избыток реактива затрудн ет определение активности ферментов , концентрации белка, а также возникают трудности при дальнейшей очистке ферментов вследствие сорбции катиона триэтилентетрамина на хроматографических колонках.

Пример 1.100 г биомассы клеток Е. coli В, инфицированной фагом Т4 am № 82, суспендируют в 300 мл буферного раствора, мМ: ТРИС -НС-Е 50 (рН 8,0); ЭДТА 2; 2-мер- каптоэтанол 10 (буфер А). Суспензию перемешивают 30 мин и обрабатывают на ультразвуковом дезинтеграторе. Клеточные обломки осаждают на центрифуге .

Полученную надосадочную жид}сость (клеточный экстракт) разбавл ют два

326802

раза буфером, мМ: TPWC -НС 50 (рН 7,0-7,2); 2-меркаптоэтанол 10 (буфер Б). К смеси добавл ют фракционирующий реагент - 10%-ный раст5 вор триэтилентетрамингидрохлорида рН 7,0 до конечной концентрации последнего 0,5%. Суспензию перемешивают 30 м;ин и осадок удал ют центрифугированием . К надосадочной жидкости до10 бавл ют сульфат аммони (55-60% от насыщени ). Образовавшийс осадок собирают центрифугированием и раствор ют в буфере, мМ:трис -НС 10 (рН 7,5); ЭДТА 0,2; 2-меркаптоэта15 НОЛ 10 (буфер В). Дл обессоливани провод т диализ против этого же буфера .

Все процедуры провод т при 0-5°С, Результаты фракционировани клеIfO точного экстракта при выделении РНК-лигазы фага Т4 приведены в табл. 1.

Пример 2. 25г биомассы Е. coll В, инфицированной фагом

25 Т4 am № 82, суспендируют в 75 мл буфера А. Суспензию обрабатывают и центрифугируют аналогично примеру 1 . К разбавленной надосадочной. жидкости добавл ют 10%-ный раствор триэтилен30 тетрамингидрохлорида (рН 7,5) до конечной концентрации последнего 1%. . Суспензию перемешивают 30 мин и об- рабатьгоают аналогично примеру 1,

;jc Результаты анализов при выделении ДНК-полимеразы фага Т4 представлены в табл,. 2 .

Пример 3. Все процедуры провод т аналогично примеру 2, исполь- 40 зу 50 г биомассы.

Результаты анализов при вьщелении полинугшеотидкиназы фага Т4 приведены в табл. 3.

45 Пример 4. Все процедуры провод т аналогично примеру 1, использу 10 г биомассы, добавл триэтилен- тетрамингидрохлорид до конечной концентрации 0,4%.

Результаты анализов при выделении РНК-лигазы фага Т4 представлены в табл. 4.

Предлагаемый способ позвол ет расширить ассортимент фракционирующих реагентов дл удалени нуклеиновых кислот и повысить выход ферментов с 60 до 80-100%.

50

5

Получение клеточного экстракта

8950

6120 А96 81 93 6,5

3760 4А2 117 83 1,5

Получение клеточного экстракта

Фракционирование триэтилентетра- мингидрохлоРИДОМ

Осаждение сульфатом аммони и обессоливание

Активность вьппе 100% относительно клеточного экстракта объ сн етс наличием в клеточном экстракте нуклеаз, занижающих действительную активность ДНК-полимеразы при ее определении ,

Таблица I

530

59

100 20

Таблица 2

92 58 100 20

143 204 155 6,5

104 150 ИЗ 0,25

3113 43,2 13,9 100 20

1А50 47,0 32,4 107 6,5

1450 40,4 27,9 94 0,25

438 26,0 60,0 100 20

282 15,6 60,6 60 6,0

200 15,0 75,0 57 0,5

Редактор Н. Гунько

Составитель Т. Золотарева

Техред И.Попович Корректор А. Т ско

Заказ 2737/27Тираж 490

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предпри ти:е, г. Ужгород, ул. Проектна , i

Таблица 3

Таблица 4

Подписное

Claims

СПОСОБ УДАЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ ФЕРМЕНТСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТОВ ESCHERICHIA COLI, включающий воздействие на них фракционирующим реагенте»!, концентрирование недосадочной жидкости сульфатом аммония и обессоливание полученного ферментационного раствора диализом, отличающийся тем, что, с целью увеличения содержания фермента в целевом продукте, в качестве фракционирующего реагента используют раствор триэтилентетрамингидрохлорида pH 7,0-7,5 в количестве, необходимом для доведения концентрации последнего в смеси с клеточным фер- <g ментсодержащим экстрактом 0,5-1,0Z.

ND со ND <Х>

О