SU1232679A1 - Способ получени аденозинтрифосфатазы - Google Patents

Способ получени аденозинтрифосфатазы Download PDF

Info

Publication number
SU1232679A1
SU1232679A1 SU833658486A SU3658486A SU1232679A1 SU 1232679 A1 SU1232679 A1 SU 1232679A1 SU 833658486 A SU833658486 A SU 833658486A SU 3658486 A SU3658486 A SU 3658486A SU 1232679 A1 SU1232679 A1 SU 1232679A1
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
atp
gel
centrifugation
enzyme
culture
Prior art date
Application number
SU833658486A
Other languages
English (en)
Inventor
Алексей Константинович Адамов
Николай Гаврилович Тихонов
Николай Викторович Майоров
Original Assignee
Всесоюзный Ордена Трудового Красного Знамени Научно-Исследовательский Противочумный Институт "Микроб"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Всесоюзный Ордена Трудового Красного Знамени Научно-Исследовательский Противочумный Институт "Микроб" filed Critical Всесоюзный Ордена Трудового Красного Знамени Научно-Исследовательский Противочумный Институт "Микроб"
Priority to SU833658486A priority Critical patent/SU1232679A1/ru
Application granted granted Critical
Publication of SU1232679A1 publication Critical patent/SU1232679A1/ru

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Изобретение относитс  к медицине, именно к микробиологии.
Цель изобретени  - упрощение способа за счет использовани  клеточного аутолиза.
Способ осуществл ют следующим бразом.
Дл  получени  аденозинтрифосфата- зы (АТФ-азы) используют холерный вибрион классического биовара, серовара наба, штамм 569 В.
Выращивают холерные вибрионы в реакторе-ферментере, затем инактиви- руют культуру 0,1%-ным мертиолатом. В присутствии мертиолата происходит аутолиз (разрушение клеток вибрионов ) , в результате чего АТФ-аза выходит из клеточных мембран в культу- ральную жидкость, котора  в дальнейшем служит источником фермента.
После аутолиза реакторную культуру центрифугируют дл  отделени  ферментов разрущенньпс клеток при 4000-6000 g в течение 25-30 мин и из надосадка.
Через 16-18 ч сформировавшийс  при высаливании осадок отдел ют центрифугированием при 4000-6000 g в течение 15-20 мин, раствор ют дистиллированной водой и обессоливают на колонке с акрилексом Р-60, элюиру  ферментсодержащий белок 0,005 М грис -НСг буфером рН 7,6-7,8.
Обессоленный препарат, содержащий АТФ-азу, гель-хроматографируют на колонке с биогелем А-150 М. Элю- цИю провод т 0,005 М грис -HCI. буфером рН 7,5-8,0.
Все операции по выделению и очистке фермента провод т под контролем определени  удельной активности. Степень очистки АТФ-азы составл ет . 41,83 крат. Выход препарата фермента 1,5-2%.
Пример. Культуру vibrio cho- terae 569 В выращивают в течение 8- 10 ч в 250 л реакторе-ферментере в услови х аэрации при 34-36 С глубинным методом на бульоне из ферментированного гидролизата казеина рН8,0, содержащего, %: пептон 2; NaCf 0,5; 0,05; аминного азота 200мг.%.
Культивирование вибрионов продолжают до концентрации 55-65 млрд. микробных клеток в 1 мл, перенос т реакторную культуру в бутыль емкостью 5 л и добавл ют мертиолат (5 г сухого мертиолата раствор ют в 20мл дистиллированной воды) таким образом.
5
чтобы его конечна  концентраци  составл ла 0,1%.
Через ч реакторную культуру с внесенным мертиолатсм высевают на питательные среды дл  контрол  специфической стерильности. Результат вы:сева учитывают в соответствии с режимом работы с особо опасными инфекци ми через 8 сут. За это врем  при аутолизе АТФ-аза переходит из мембран вибрионов в культуральную жидкость , из которой в дальнейшем получают фермент.
После учета контрол , подтверждающего стерильность реакторной культуры , ее центрифугируют дл  отделени  разрушенных аутолизом клеток при 4000-6000 g в течение 25-30 мин. Осадок, содержащий разрушенные клетки ,, отбрасывают, надосадок, содержащий АТФ-азу, перенос т в 10-л емкость и добавл ют к нему сульфат аммони  до 90% насыщени , раствор ют перемешиванием и оставл ют дл  формировани  осадка при комнатной температуре на 16-18 ч.
Через 16-18 ч насыщенную сульфатом аммони  культуральную жидкость центрифугируют дл  получени  осадка 0 белка при 4000-6000 g в течение 15- 20 мин. Надосадок отбрасывают, а осадок, содержащий АТФ-азу, в объеме 0,25-0,3 л раствор ют дистиллирован-- ной водой из расчета; 1 ч. осадка + 1 ч. воды. Растворенный осадок 0,5- 0,6 л фильтруют через бумажный фильтр и обессоливают на колонке с акрилексом Р-60. Дл  этого колонку размерами 45x500 мм наполн ют гелем акрилек0
5
5
са Р-60 в объеме 1 л, уравновешенным
0,005 М трис -НС буфером рН 7,5-8,0. На гель нанос т 0,5-0,6 л растворенного дистиллированной водой осадка и элюируют со скоростью 350-400 мл/ч.
Сбор элюата провод т под контролем оптической плотности при 380 нм с помощью проточной спектрофотометри- ческой кюветы.
Полученный препарат изучают на
содержание белка, полисахаридов, нуклеиновых кислот.
На заключительном этапе получени  АТФ--азы примен ют гель-хроматографию на колонке с биогелем А-150 М.
Дл  этого колонку размерами 15x300 мм наполн ют биогелем А-150 в объеме 45 мл. уравновешенным 0,005 Мтрис - НСf. буфером рН 7,5-8,0, и наслаивают
на него 25-30 мл обессоленного ферментного раствора. Элюцию провод т со скоростью 40-50 мл/ч. Фракции по 3-4 мл собирают на автоматическом коллекторе. Каждую фракцию изучают на содержание белка (по поглощению длины волны при 280 нм и более объективно по методу Лоури) и на активность АТФ-азы. Об активности АТФ-азы суд т по нарастанию концентрации не- органического фосфора PJ в инкубационной смеси, содержащей, М: NaC КСЕ 2-10, МпСЕ 5-10 ; АТФ-динатрие- вой соли (Р.еапа) IPHC-НСГ буфера 5 7,6.
Нар ду с опытной пробой одновременно став т две контрольные, одна из которых содержит все компоненты инкубационной смеси, но вместо раствора белка в нее внос т равный объем воды, друга  содержит исследуемый белок, но вместо инкубационной смеси внос т воду.
Концентрацию неорганического фосфора определ ют фотометрически по известному методу. Расчет увеличени  содержани  неорганического фосфора провод т вычитанием из концентрации Р/ опытной пробы суммы концентраций PJ двух контрольных проб. За едини- цу активности АТФ-азы принимают количество белка-фермента, которое споНасадок культуральной жидкости после отделени  фрагментов клеток вибрионов 3
Обессоленный ферменсодержа- щий препарат
после элюции
на колонке с
биогелем
Р-60 4
после хроматографии на колонке с бирге- лем А-150 М 4
13,2+1,2 161,6+6,5 154,7+12,7
5,55+0,15412jf35,0 746j+76,34,82
0,308+0,08
283+154,3 6472+1311
41,83
собно за I ч инкубации при 37 С высвободить из АТФ I мкг неорганичет:ког фосфора. Путем отношени  АТФ-азной активности к I/JO концентрации белка (так как в опытную пробу внос т 0,1 мл) рассчитывают удельную активность фермента. Результаты определени  удельной активности АТФ-азы холерного вибриона на различных стади х получени  представлены в табл. 1
Из табл. 1 видно, что по сравнению с исходным материалом (надосад- ком культуральной жидкости после отделени  фрагментов клеток вибрионов ) при обессоливании на колонке с акрилексом Р-60 достигаетс  4,82-кратна  очистка, при гельхрома- тографии на колонке с биогелем А-150 М - 41,83-кратна  степень чистоты препарата.
Химический состав нативного и очищенного препаратов АТФ-азы представлен в табл. 2.
Из представленных в табл. 2 данных видно, что по сравнению с натив- ным препаратом конечный продукт - фермент АТФ-аза, содержит в 3,9 раза меньше нуклеиновых кислот и в 62,8 раза меньше полисахаридов в расчете на 1 мг белка. Вьгход фермента составл ет 1,5-2%.
Таблица 1
283+154,3 6472+1311
41,83
13 ,,2 38,,4
рконов
(п-3)
(п-6)
Очищенный препарат фермента АТФ-азы холерного вибриона 0,308+0,08 0,23+0,009
(п-4)
(п«8)
Примечание. Содержание нуклеиновых кислот и полисахаридов в
надосадке культуральной жидкости после отделени  фрагментов клеток вибриоиов принимают за 100%.
Редактор Н. Гунько
Составитель М. Позн к
Техред И.Попович Корректор М. Максимишинец
Заказ 2737/27Тираж 490Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР
по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5
Производственно-полиграфическое предпри тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4
Таблица 2
2,9371,7+35,7 28,2
(100%)() (100%)
0,740,,009 0,45
(25,4%)() (1,59%)

Claims (1)

  1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТАЗЫ с помощью высаливания сульфатом аммония, центрифугирования и гель-фильтрации, о т л и ч а - ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, аденозинтрифосфатазу выделяют из холерного вибриона классического биовара, серовара Инаба, штамм 569 В с инактивированием О,1%-ным мертнолатом, центрифугированием культуры при 4000-6000 g в течение 25-30 мин, высаливанием сульфатом аммония при 90Z насыщения, отделением осадка через 16-18 ч центрифугированием при 4000-6000 g в течение 15-20 мин, гель-фракцией растворенного в дистиллированной воде осадка на акрилексе Р-60 и гель-хроматографией на биогеле А-150 М с последующей элюцией трис -буфером pH 7,5-8,0.
    (Л ьэ 00 ко Ci •м со
    1)
SU833658486A 1983-10-31 1983-10-31 Способ получени аденозинтрифосфатазы SU1232679A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU833658486A SU1232679A1 (ru) 1983-10-31 1983-10-31 Способ получени аденозинтрифосфатазы

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU833658486A SU1232679A1 (ru) 1983-10-31 1983-10-31 Способ получени аденозинтрифосфатазы

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1232679A1 true SU1232679A1 (ru) 1986-05-23

Family

ID=21087638

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU833658486A SU1232679A1 (ru) 1983-10-31 1983-10-31 Способ получени аденозинтрифосфатазы

Country Status (1)

Country Link
SU (1) SU1232679A1 (ru)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Способ получени АТФ-азы из митохондрий сердца быка. - Биохими , 1972, т. 37, № 2, с. 348-353. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Surzycki Genetic functions of the chloroplast of Chlamydomonas reinhardi: effect of rifampin on chloroplast DNA-dependent RNA polymerase
Cox et al. Alkaline phosphatase: I. Comparison of the physical and chemical properties of enzyme preparations from mammalian cell cultures, various animal tissues, and Escherichia coli
Gmeiner The isolation of two different lipopolysaccharide fractions from various Proteus mirabilis strains
US4283494A (en) Microbial lipase, process for its preparation and microbiologically pure culture therefor
Tomoda et al. Acid Protease Produced by Trametes sanguinea, a Wood-destroying Fungus: Part I. Purification and Crystallization of the Enzyme Part II. Physical and Enzymological Properties of the Enzyme
Higerd et al. New method for obtaining IgA-specific protease
SU1232679A1 (ru) Способ получени аденозинтрифосфатазы
Walker et al. The Language of Biotechnology: A Dictionary of Terms.
RU2230325C2 (ru) Способ приготовления очищенного препарата ботулинического токсина типа а
Goebel The chromatographic fractionation of colicine K
CA1341079C (en) Large scale method for purification of high purity heparinase
Gollub et al. Thromboplastinase, a new enzyme which destroys thromboplastin
Campbell et al. Formation of D-1-amino-2-propanol from L-threonine by enzymes from Escherichia coli K-12
Pardoe The inducible neuraminidase (N-acyl-neuraminyl hydrolase EC 3.2. 1.18) of Klebsiella aerogenes NCIB 9479
SU659611A1 (ru) Способ получени -аспарагиновой кислоты
Ruelius et al. Poricin, an acidic protein with antitumor activity from a Basidiomycete: I. Production, isolation, and purification
Guntermann et al. Induction of alpha-glucosidase and synthesis during the cell cycle of Myxobacter AL-1
Muñoz et al. Production and properties of a bacteriocin from Myxococcus coralloides D
JPH04228074A (ja) 酵素およびその製剤
JPS6342686A (ja) プロテア−ゼの製造法
SU1564190A1 (ru) Способ получени препарата фотосинтетических реакционных центров, содержащих фотоактивные цитохромы
RU2088663C1 (ru) Способ получения экзопротеаз возбудителя мелиоидоза
McDaniel Studies of some factors affecting growth of certain butyl alcohol-producing bacteria
GB1571877A (en) Microbial lipase and its preparation
SU1573025A1 (ru) Способ получени @ -амилазы