SU1232679A1 - Способ получени аденозинтрифосфатазы - Google Patents

Description

Изобретение относитс  к медицине, именно к микробиологии.

Цель изобретени  - упрощение способа за счет использовани  клеточного аутолиза.

Способ осуществл ют следующим бразом.

Дл  получени  аденозинтрифосфата- зы (АТФ-азы) используют холерный вибрион классического биовара, серовара наба, штамм 569 В.

Выращивают холерные вибрионы в реакторе-ферментере, затем инактиви- руют культуру 0,1%-ным мертиолатом. В присутствии мертиолата происходит аутолиз (разрушение клеток вибрионов ) , в результате чего АТФ-аза выходит из клеточных мембран в культу- ральную жидкость, котора  в дальнейшем служит источником фермента.

После аутолиза реакторную культуру центрифугируют дл  отделени  ферментов разрущенньпс клеток при 4000-6000 g в течение 25-30 мин и из надосадка.

Через 16-18 ч сформировавшийс  при высаливании осадок отдел ют центрифугированием при 4000-6000 g в течение 15-20 мин, раствор ют дистиллированной водой и обессоливают на колонке с акрилексом Р-60, элюиру  ферментсодержащий белок 0,005 М грис -НСг буфером рН 7,6-7,8.

Обессоленный препарат, содержащий АТФ-азу, гель-хроматографируют на колонке с биогелем А-150 М. Элю- цИю провод т 0,005 М грис -HCI. буфером рН 7,5-8,0.

Все операции по выделению и очистке фермента провод т под контролем определени  удельной активности. Степень очистки АТФ-азы составл ет . 41,83 крат. Выход препарата фермента 1,5-2%.

Пример. Культуру vibrio cho- terae 569 В выращивают в течение 8- 10 ч в 250 л реакторе-ферментере в услови х аэрации при 34-36 С глубинным методом на бульоне из ферментированного гидролизата казеина рН8,0, содержащего, %: пептон 2; NaCf 0,5; 0,05; аминного азота 200мг.%.

Культивирование вибрионов продолжают до концентрации 55-65 млрд. микробных клеток в 1 мл, перенос т реакторную культуру в бутыль емкостью 5 л и добавл ют мертиолат (5 г сухого мертиолата раствор ют в 20мл дистиллированной воды) таким образом.

5

чтобы его конечна  концентраци  составл ла 0,1%.

Через ч реакторную культуру с внесенным мертиолатсм высевают на питательные среды дл  контрол  специфической стерильности. Результат вы:сева учитывают в соответствии с режимом работы с особо опасными инфекци ми через 8 сут. За это врем  при аутолизе АТФ-аза переходит из мембран вибрионов в культуральную жидкость , из которой в дальнейшем получают фермент.

После учета контрол , подтверждающего стерильность реакторной культуры , ее центрифугируют дл  отделени  разрушенных аутолизом клеток при 4000-6000 g в течение 25-30 мин. Осадок, содержащий разрушенные клетки ,, отбрасывают, надосадок, содержащий АТФ-азу, перенос т в 10-л емкость и добавл ют к нему сульфат аммони  до 90% насыщени , раствор ют перемешиванием и оставл ют дл  формировани  осадка при комнатной температуре на 16-18 ч.

Через 16-18 ч насыщенную сульфатом аммони  культуральную жидкость центрифугируют дл  получени  осадка 0 белка при 4000-6000 g в течение 15- 20 мин. Надосадок отбрасывают, а осадок, содержащий АТФ-азу, в объеме 0,25-0,3 л раствор ют дистиллирован-- ной водой из расчета; 1 ч. осадка + 1 ч. воды. Растворенный осадок 0,5- 0,6 л фильтруют через бумажный фильтр и обессоливают на колонке с акрилексом Р-60. Дл  этого колонку размерами 45x500 мм наполн ют гелем акрилек0

5

5

са Р-60 в объеме 1 л, уравновешенным

0,005 М трис -НС буфером рН 7,5-8,0. На гель нанос т 0,5-0,6 л растворенного дистиллированной водой осадка и элюируют со скоростью 350-400 мл/ч.

Сбор элюата провод т под контролем оптической плотности при 380 нм с помощью проточной спектрофотометри- ческой кюветы.

Полученный препарат изучают на

содержание белка, полисахаридов, нуклеиновых кислот.

На заключительном этапе получени  АТФ--азы примен ют гель-хроматографию на колонке с биогелем А-150 М.

Дл  этого колонку размерами 15x300 мм наполн ют биогелем А-150 в объеме 45 мл. уравновешенным 0,005 Мтрис - НСf. буфером рН 7,5-8,0, и наслаивают

на него 25-30 мл обессоленного ферментного раствора. Элюцию провод т со скоростью 40-50 мл/ч. Фракции по 3-4 мл собирают на автоматическом коллекторе. Каждую фракцию изучают на содержание белка (по поглощению длины волны при 280 нм и более объективно по методу Лоури) и на активность АТФ-азы. Об активности АТФ-азы суд т по нарастанию концентрации не- органического фосфора PJ в инкубационной смеси, содержащей, М: NaC КСЕ 2-10, МпСЕ 5-10 ; АТФ-динатрие- вой соли (Р.еапа) IPHC-НСГ буфера 5 7,6.

Нар ду с опытной пробой одновременно став т две контрольные, одна из которых содержит все компоненты инкубационной смеси, но вместо раствора белка в нее внос т равный объем воды, друга  содержит исследуемый белок, но вместо инкубационной смеси внос т воду.

Концентрацию неорганического фосфора определ ют фотометрически по известному методу. Расчет увеличени  содержани  неорганического фосфора провод т вычитанием из концентрации Р/ опытной пробы суммы концентраций PJ двух контрольных проб. За едини- цу активности АТФ-азы принимают количество белка-фермента, которое споНасадок культуральной жидкости после отделени  фрагментов клеток вибрионов 3

Обессоленный ферменсодержа- щий препарат

после элюции

на колонке с

биогелем

Р-60 4

после хроматографии на колонке с бирге- лем А-150 М 4

13,2+1,2 161,6+6,5 154,7+12,7

5,55+0,15412jf35,0 746j+76,34,82

0,308+0,08

283+154,3 6472+1311

41,83

собно за I ч инкубации при 37 С высвободить из АТФ I мкг неорганичет:ког фосфора. Путем отношени  АТФ-азной активности к I/JO концентрации белка (так как в опытную пробу внос т 0,1 мл) рассчитывают удельную активность фермента. Результаты определени  удельной активности АТФ-азы холерного вибриона на различных стади х получени  представлены в табл. 1

Из табл. 1 видно, что по сравнению с исходным материалом (надосад- ком культуральной жидкости после отделени  фрагментов клеток вибрионов ) при обессоливании на колонке с акрилексом Р-60 достигаетс  4,82-кратна  очистка, при гельхрома- тографии на колонке с биогелем А-150 М - 41,83-кратна  степень чистоты препарата.

Химический состав нативного и очищенного препаратов АТФ-азы представлен в табл. 2.

Из представленных в табл. 2 данных видно, что по сравнению с натив- ным препаратом конечный продукт - фермент АТФ-аза, содержит в 3,9 раза меньше нуклеиновых кислот и в 62,8 раза меньше полисахаридов в расчете на 1 мг белка. Вьгход фермента составл ет 1,5-2%.

Таблица 1

283+154,3 6472+1311

41,83

13 ,,2 38,,4

рконов

(п-3)

(п-6)

Очищенный препарат фермента АТФ-азы холерного вибриона 0,308+0,08 0,23+0,009

(п-4)

(п«8)

Примечание. Содержание нуклеиновых кислот и полисахаридов в

надосадке культуральной жидкости после отделени  фрагментов клеток вибриоиов принимают за 100%.

Редактор Н. Гунько

Составитель М. Позн к

Техред И.Попович Корректор М. Максимишинец

Заказ 2737/27Тираж 490Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска  наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предпри тие, г. Ужгород, ул. Проектна , 4

Таблица 2

2,9371,7+35,7 28,2

(100%)() (100%)

0,740,,009 0,45

(25,4%)() (1,59%)

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗИНТРИФОСФАТАЗЫ с помощью высаливания сульфатом аммония, центрифугирования и гель-фильтрации, о т л и ч а - ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, аденозинтрифосфатазу выделяют из холерного вибриона классического биовара, серовара Инаба, штамм 569 В с инактивированием О,1%-ным мертнолатом, центрифугированием культуры при 4000-6000 g в течение 25-30 мин, высаливанием сульфатом аммония при 90Z насыщения, отделением осадка через 16-18 ч центрифугированием при 4000-6000 g в течение 15-20 мин, гель-фракцией растворенного в дистиллированной воде осадка на акрилексе Р-60 и гель-хроматографией на биогеле А-150 М с последующей элюцией трис -буфером pH 7,5-8,0.

   (Л ьэ 00 ко Ci •м со

   1)