JPH04228074A - 酵素およびその製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素ホスホエノールピ
ルベートカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）およびその製剤
に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ＰＥ
ＰＣは、生物学的試料中の重炭酸塩の測定に有用である
。この酵素がマレエートデヒドロゲナーゼと結合すると
、重炭酸塩の濃度は、以下のとおり、シュウ酸塩および
ＮＡＤＨの消費量に正比例する（ＭＤＨ＝マレエートデ
ヒドロゲナーゼ；ＰＥＰ＝ホスホエノールピルビン酸塩
）：

【０００３】

【数１】

【０００４】ＰＥＰＣの最も普及している市販の原料は
、トウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｉｚｅ）および小麦胚で
ある。両原料由来のＰＥＰＣは、本質的な安定性が乏し
く（すなわち、安定剤の非存在下で）、原料に不一致が
あり、バッチによる最終生成物の質に変動が生じる。ま
た、ＰＥＰＣは、検査キットの安定性に影響を及ぼし得
るＰＥＰ−劣化酵素と一緒に得られる。

【０００５】ＰＥＰ−がより一致した原料から得られる
場合、および原料の季節による制限がないことが望まし
い。さらに、精製が簡単であること、汚染酵素があまり
有意量ではないこと、より液体安定性であること、およ
び活性が増大することが望ましい。市販の入手可能なＰ
ＥＰＣは、通常、約５ユニット／ｍｇの特異活性である
が、２０〜２２ユニット／ｍｇ蛋白の特異活性が提案さ
れた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】ＰＥＰＣの過剰産生体で
あるセリン経路メチロトローフの菌株が同定された。単
離された酵素は、本質的に増強された液体安定性、広範
なｐＨプロフィルおよび高純度を示す。したがって、生
物学的液体中の重炭酸塩測定用の優れた診断試薬を製造
するのに適している。

【０００７】本発明の新規ＰＥＰＣは、精製された蛋白
に関して少なくとも４０、例えば５０〜１００ユニット
／ｍｇ蛋白の比較的高い特異活性を有する。

【０００８】新規ＰＥＰＣは、微生物起源によるもので
あり、植物起源に関する欠点を被らない。比較的高いＫ
ｍを有しており、したがって、速度方法論によって動力
学的検査に使用することができ；現在まで、終点検査法
がより一般的であった。

【０００９】新規ＰＥＰＣは、比較的高い安定性を有し
ており、例えば、２５℃で、１００ｍＭトリス（Ｔｒｉ
ｓ）−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）および１５ｍＭ　Ｍ
ｇＣｌ２中で１０日後の活性の消失が５０％以下であり
、好ましくは２５％以下である。いわゆるトウモロコシ
（Ｚｅａ　ｍａｌｉｚｅ）由来のＰＥＰＣによって必要
とされるグルタチオンのようなＳＨ含有安定剤が必要で
ない。

【００１０】新規なＰＥＰＣは、特に価値ある特徴とし
て、ｐＨ６．５（好ましい使用条件）で、その活性が、
最適なｐＨでの活性に比較して少なくとも４０％、好ま
しくは少なくとも５０％、例えば７５％、９０％または
それ以上までであるというｐＨプロフィルを有する。

【００１１】本発明の長所は、明らかに、セリン経路メ
チロトローフ菌から得られる酵素に関係する。ＰＥＰＣ
含有メチロトローフの好適な属は、ヒフォミクロビウム
（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、シュードモナス・
エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）およびメ
チロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）である。

【００１２】例えば、微生物属ヒフォミクロビウム（Ｈ
ｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）の菌株は、炭素および窒
素供給源としてメタノールおよびメチルアミンまたはト
リメチルアミンを用い、発酵法で単離および増殖させる
。このような菌株由来の酵素は、精製される。

【００１３】ＥＮＺＡ−３０として同定されたヒフォミ
クロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）の菌株は
、１９９０年５月４日に、ナショナル・コレクション・
オブ・インダストリアル・バクテリア（Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ
ｌ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）にブダペスト条約の規定に従っ
て寄託された。受託番号はＮＣＩＭＢ　４０２８０であ
る。

【００１４】収率および特異活性および他の特徴は、選
択処理によって、例えば突然変異誘発の後に改良され得
る。本発明は、寄託されたおよび野生型セリン経路メチ
ロトローフの突然変異体を含む。ＮＴＧ、ＥＭＧまたは
ＵＶ光のような慣用の突然変異原を使用し得る。

【００１５】微生物からのその産生方法は開示されてい
るが、本発明のＰＥＰＣはクローニングによって産生さ
れ得る。これは、慣用技術によって行われ得る。

【００１６】本発明のＰＥＰＣは、好都合に凍結乾燥さ
せることができ、その形態が良好な活性を保持する。例
えばトレハロースおよび／または緩衝剤塩と一緒に粉末
状態に製剤化され得る。他方、上記のように、ｐＨ６．
５〜８、例えばｐＨ７で、液体中で、例えばトリシン緩
衝液中で良好な活性を保持する。

【００１７】生物学的試料中の重炭酸塩を検査する際の
使用に関して、ＰＥＰＣは、基質ＰＥＰ、ＭＤＨ、ＮＡ
ＤＨ、Ｍｇ２＋イオンおよび緩衝液（ｐＨ５〜１０、例
えば６．５〜８）と一緒に製剤形態で供給されてもよい
。このような製剤は、新しく蒸留したＣＯ２不含沸騰水
または緩衝液によって再構成する前に凍結乾燥させてよ
い。酵素および基質も検査キットの分離容器中に供給さ
れることもできる。

【００１８】該検査において、血清を与えられた成分に
添加し、ＮＡＤＨが転換されると、３４０ｎｍでの吸光
度の減少が測定される。この減少は、血清中の重炭酸塩
の濃度に正比例する。

【００１９】以下の実施例は、本発明のＰＥＰＣ産生菌
株の発酵方法を説明する。

【００２０】

【実施例１】ヒフォミクロビウム・エスピー（Ｈｙｐｈ
ｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ　ｓｐ．）　ＮＣＩＭＢ　４０２
８０の細胞を寒天平板から培地５００ｍｌを含んでいる
２リットルのフラスコに移す。３６時間振盪させた後、
内容物を種発酵槽中の培地１２．５リットルに移す。次
いで、これを、１４時間、有酸素下で増殖させ、その後
、内容物を、培地３７５リットルを含有する生産発酵槽
に移す。炭素供給源が消耗されるまで、約１６時間、該
発酵を続け、その後、供給を開始する。供給を開始する
ための時間は、発酵槽における酸素要求量の低下によっ
て定義される。この時、供給のパルスが自動的に印加さ
れ、メチルアミン濃度を約９０ミリモルまでにする。こ
の炭素が使用されると、さらなるパルスが印加される。 このパルスの印加は、全ての供給（１００リットル）が
添加されるまで維持される。この方法における供給によ
って、発酵槽中のメチルアミン濃度が増加せず、有毒に
なる。

【００２１】生産発酵槽における種増殖および初期バッ
チ増殖のための培地は、さらに１５ｇ／リットル寒天を
添加して接種平板を作成する以外は、同一である。全て
の発酵は３０℃で行われる。

【００２２】 　　培地： リン酸モノメチルアミン　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　８７ミリモル硫酸アンモ
ニウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　２ｇ／リットルリン酸水素二
カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１．５リン酸二水素ナトリウム・２
Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．５
硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１．０酵母抽出物　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１．０細菌学的ペプタン　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１．０微量元素溶液　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　０．５ｍｌ／リットル脱イオン水　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　バランス

【００２３】 　　流加培地： リン酸モノメチルアミン　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２．５モル酵母抽出物　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２．０ｇ／リットルリン
酸水素二カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　１．５ｇ／リットルリン酸
二水素ナトリウム・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．５ｇ／リットル微量元素溶液　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　４ｍｌ／リットル脱イオン水　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　バランス

【００２４】 　　微量元素溶液： ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｇ／リットル
ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５．３ＭｎＳ
Ｏ４・Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　０．２ＺｎＳＯ４・
７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　０．２ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　０．０４ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．０４Ｎａ２Ｍｏ３Ｏ４　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．０４Ｈ３ＢＯ３　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　０．０３

【００２５】滅菌の前に、所
望により４Ｎ水酸化ナトリウムおよび２０％リン酸の添
加によって、培地のｐＨを７．０に調節し、発酵の間、
維持する。リン酸モノメチルアミンを、他の成分から分
離した濃縮水溶液として、濾過滅菌する。供給物は、発
酵槽中に直接、濾過滅菌する。

【００２６】増殖の後、連続ディスクスタック遠心器中
で細胞を掻き集める。

【００２７】例として、ＰＥＰＣの精製は、洗剤溶解に
よって開始され、次いで、カラムクロマトグラフィー、
濃縮および透析し、次いで、簡単な糖形成および凍結乾
燥する。以下の実施例において説明する。

【００２８】

【実施例２】（ａ）　　溶解は、トリトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）Ｘ−１００の溶液、ノニオン性洗剤を用いて行われ
る。１％ｖ／ｖで細胞（１０％ｗ／ｖ）を添加して再懸
濁させる。溶解は、通常、１５〜２０℃で約１〜１．５
時間行う。溶解が完了した後、硫酸ストレプトマイシン
を用いて、遠心分離によって細胞デブリスを除去する。

【００２９】（ｂ）　　カラムクロマトグラフィーは、
フラクトゲル−ＴＭＡＥ、ＤＥＡＥセファロース、Ｑセ
ファロース、ＤＥ　５２またはＱＡ５２のような強い陰
イオン交換樹脂の使用を含む。

【００３０】多量の酵素溶液に関して、吸収は、バッチ
摂取として行うことができる。ゲルは、勾配液溶離に関
してカラム中に充填する前にバッチ洗浄を有する。

【００３１】勾配液は、塩の濃度が増大するものである
。活性画分を集め、＞３０Ｕ／ｍｇの特異活性が得られ
るが、６０Ｕ／ｍｇ蛋白の酵素を含む画分もある。

【００３２】該酵素は、一晩ゲルに保持される；活性の
消失は見られない。長く貯蔵する場合、再生が減少し始
める。代表的な結果を下記表１に示す。

【００３３】

【表１】 　　　　　　　　　　貯蔵日数　　　　　　　　合計再
生率（％）　　　　　　　　プールＳ／Ａ（μ／ｍｇ）
　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　
　　　　　　９１　　　　　　　　　　　　　　　　３
７．４　　　　　　　　　　　　　　　２　　　　　　
　　　　　　　　　８５　　　　　　　　　　　　　　
　　３３．０　　　　　　　　　　　　　　　４　　　
　　　　　　　　　　　　７６　　　　　　　　　　　
　　　　　２８．１　　　　　　　　　　　　　　　８
　　　　　　　　　　　　　　　６０　　　　　　　　
　　　　　　　　２６．９

【００３４】（ｃ）　　濃縮
は、接線方向流システムの使用を含む。約３００Ｕ／ｍ
ｌまで濃縮すると、通常、１０リットルカラムプールか
ら約１．０リットルである。蛋白濃度は、不利な影響な
しで、１２ｍｇ／ｍｌほどの高さをとり得る。

【００３５】（ｄ）　　透析は、塩濃度を減少させる。 代表的には、溶液１．０リットルを緩衝液１００リット
ルに対して透析し、酵素溶液を遠心分離によって透明に
する。次いで、該透明溶液を濾過する。この段階で若干
量の沈殿物を見ることができる。この沈殿物は、酵素活
性に影響せず、透析による再生は、通常、９５〜９８％
である。

【００３６】（ｅ）　　発酵法は、単に、トレハロース
（１ｍｇ／ｍｌ）の添加を含む。これは、酵素の清澄度
および安定性の見地から再懸濁によって良好な結果を得
る。０．１５Ｍの塩の存在が、溶解性およびその後の安
定性を援助することも分かる。

【００３７】以下の特徴を有する凍結乾燥ＰＥＰＣ粉末
が得られる。

【００３８】 　　粉末活性　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　＞１０Ｕ／ｍｇ　　特異活性　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　＞２５Ｕ／ｍｇ蛋白　　Ａｓｓ．活
性　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＡＤＨ　
−　ｏｘ　　　　　　＜０．０２％　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＬＤＨ　
　　　　　　　　　　　　　　　＜０．０５％　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ＰＫ　　　　　　　　　　　　　　　　　　＜０．５
％

【００３９】安定性試験は、４℃、２５℃および３７
℃で、凍結乾燥酵素によって行った。結果を表２に示す
（ＮＴ＝試験されなかった）。

【００４０】

【表２】

【００４１】全ての再生は、軽量誤差を除外するために
特異活性に基づく。粉末は、４℃で非常に安定であり、
時間経過に伴って、２５℃および３７℃での活性が僅か
に減少するだけである。

【００４２】３７℃、２５℃および４℃でのアジドによ
る再構成酵素の結果を表３に示す。

【００４３】

【表３】

【００４４】検査緩衝液（１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を有す
る１６７ｍＭトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）／ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．０））中に酵素を貯蔵した。

【００４５】ＰＥＰＣには多くのｐＨ効果があり、ほと
んどが使用した緩衝液に依存する。様々な試験を介して
、ビス−トリス緩衝液は、通常使用するトリシン（Ｔｒ
ｉｃｉｎｅ）緩衝液よりも良い安定性および活性を与え
る。ｐＨ７．０で再生した場合の酵素の安定性を表４に
示す。

【００４６】

【表４】

【００４７】ｐＨ６．０、８．０および９．０に関して
、１５０ｍＭトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）＋１ｍＭＭｇ
Ｃｌ２を使用した。ｐＨ７．０に関しては、１５０ｍＭ
ビス−トリス＋１ｍＭ　ＭｇＣｌ２を選択した。溶液を
２５℃で貯蔵した。ｐＨ安定性に関する結果を表５に示
す。

【００４８】

【表５】 　　　　　　　　時間　　　　　　　　　　　　活　　
性　　の　　再　　生　　率　　（％）　　　　　　　
　　　（日）　　　　　　　　　　　ｐＨ６　　　　　
　　ｐＨ７　　　　　　　　　ｐＨ８　　　　　　　ｐ
Ｈ９　　　　　　　　　　　７　　　　　　　　　　６
９　　　　　　　　９９　　　　　　　　　　８１．８
　　　　　　　７８．２　　　　　　　　１２　　　　
　　　　　　４５．５　　　　　７８．２　　　　　　
　６７．３　　　　　５６．４

【００４９】酵素活性へ
のｐＨの影響は、緩衝液を変化させることおよびｐＨ値
によってチェックされた。再度、ビス−トリス（ｐＨ７
）を使用した。結果を表６に示す。

【００５０】

【表６】

【００５１】重炭酸塩検査において通常使用する緩衝液
は、１５０ｍＭトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）および１ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０である。活性結果は、ｐＨ
７．０の１５０ｍＭ　ビス−トリス緩衝液がより良いこ
とを示唆している。

【００５２】低い濃度のカルシウムは、ＰＥＰＣ活性に
抑制効果を有する。Ｍｇ２＋は、酵素の唯一の効果的活
性因子であると思われ、硫酸塩としてよりも塩化物化合
物としてより良く働く。

【００５３】ヒフォミクロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒ
ｏｂｉｕｍ）ＰＥＰＣのＫｍは、基質として重炭酸ナト
リウムおよびホスホエノールピルビン酸塩の両方によっ
てチェックされた。様々なｐＨ値および温度の影響を研
究した。

【００５４】ＰＥＰＣの活性への重炭酸塩の影響は、１
６７ｍＭトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）緩衝液＋１ｍＭ　
ＭｇＣｌ２中、ｐＨ８．０で評価した。これは、周囲か
ら溶け出した二酸化炭素の影響のために高い。おそらく
、この緩衝液中１ｍＭ以下である。

【００５５】ｐＨ７．０および２５℃でのモノシクロヘ
キシルアンモニウム塩およびトリシクロヘキシルアンモ
ニウムＰＥＰ塩のＫｍ値は、非常に類似していることが
分かった。結果は、トリシクロヘキシルアンモニウム塩
に関して０．９１ｍＭである。

【００５６】ＰＥＰＣの活性への温度の影響を評価した
。凍結乾燥酵素を３００Ｕ／リットルの濃度で、１ｍＭ
　ＭｇＣｌ２を含む１６７ｍＭトリシン（Ｔｒｉｃｉｎ
ｅ）緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁させた。次いで、該
酵素を推奨された試薬を使用して所望の温度で検査した
。

【００５７】相対活性は、２０℃で約１０％から５０℃
で１００％まで上昇し、次いで、５５℃で約１０％に迅
速に落ちる。

【００５８】ＰＥＰＣの活性へのｐＨの影響を評価した
。凍結乾燥した酵素を１６７ｍＭトリシン（Ｔｒｉｃｉ
ｎｅ）（ｐＨ８．０）（＋１ｍＭ　ＭｇＣｌ２）に再懸
濁させ（１０ｍｇ／ｍｌ）、濃度１Ｕ／ｍｌに希釈した
。次いで、該酵素を以下の緩衝液システム中で検査した
。ｐＨ６．０、８．０および９．０で、トリシン（Ｔｒ
ｉｃｉｎｅ）（１５０ｍＭ）を使用した。 ｐＨ６．５および７．０で、ビス−トリス（１５０ｍＭ
）を使用した。

【００５９】比活性は、ｐＨ６．０、６．５、７．０、
８．０および９．０で、各々、約７０％、８５％、１１
５％、１００％および９０％であった。

【００６０】以下の実施例は、ホスホエノールピルベー
トカルボキシラーゼ検査を説明する。

【００６１】

【実施例３】試薬： Ａ　　　　１６．７ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含有する１６７
ｍＭ　トリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）−ＨＣｌ緩衝液、ｐ
Ｈ８．０Ｂ　　　　試薬Ａ中２０．７ｍＭ　重炭酸ナト
リウムＣ　　　　試薬Ａ中２１７ｍＭホスホエノールピ
ルビン酸塩Ｄ　　　　１０ｍＭ　ＮＡＤＨ溶液、その濃
度は以下の方法でチェックした。 （１）　　キュベット中に試薬Ａ　０．９８ｍｌを入れ
、このキュベットを用いて３４０ｎｍで分光光度計を０
に合わせる。 （２）　　このキュベットに試薬Ｄ　０．０２ｍｌを加
え、全体的に混合する。 （３）　　この溶液のＡ３４０は、１．１８５に対して
１．１４でなければなら ない。 Ｅ　　　　７００Ｕ／ｍｌ　マレエートデヒドロゲナー
ゼ

【００６２】方法：

【００６３】１．分光光度計を３４０ｎｍおよび２５℃
に調節する。

【００６４】２．以下のように試薬カクテルを調製する
：５０ｍｌのビーカーに試薬Ｂ　４６．０ｍｌ、試薬Ｃ
　１．０ｍｌを入れる。このカクテルは、４℃で貯蔵す
ると８時間安定である。

【００６５】３．試薬Ｄ　０．０２ｍｌおよび試薬Ｅ　
０．０２ｍｌと一緒に、キュベット中に試薬カクテル０
．９４ｍｌを入れる。２５℃で、分光光度計中でキュベ
ットをインキュベートして、温度を平衡にし、次いで、
バックグラウンド速度を、いくらかでもあれば、確立す
る。

【００６６】４．試薬Ａにおいて酵素を約１．５Ｕ／ｍ
ｌまで希釈し、キュベットにこの溶液０．０２ｍｌを加
えることによって反応を開始させる。

【００６７】５．反応の直線部分上で吸光度の変化（△
Ａ／分）を計算する。

【００６８】６．活性（Ｕ／ｍｌ）＝

【数２】 （ＥｍＭ　ＮＡＤＨ＝６．２２）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ｐＨ６．５における活性が、最適ｐＨ
   での活性と比較して少なくとも４０％の活性であること
   を特徴とするホスホエノールピルベートカルボキシラー
   ゼ（ＰＥＰＣ）。
2. 【請求項２】　　相対活性が少なくとも５０％である請
   求項１記載のＰＥＰＣ。
3. 【請求項３】　　少なくとも４０Ｕ／ｍｇ蛋白の特異活
   性であることを特徴とするＰＥＰＣ。
4. 【請求項４】　　安定剤の非存在下、２５℃で、１６７
   ｍＭトリシン／ＨＣｌ水性緩衝液（ｐＨ８．０）および
   １５ｍＭ　ＭｇＣｌ２中、６０日後の活性の消失が５０
   ％以下であることを特徴とするＰＥＰＣ。
5. 【請求項５】　　請求項１〜４に挙げられた特徴の２、
   ３またはそれ以上を有することを特徴とするＰＥＰＣ。
6. 【請求項６】　　微生物起源である請求項１〜５のいず
   れか１項記載のＰＥＰＣ。
7. 【請求項７】　　請求項１〜５のいずれか１項記載のＰ
   ＥＰＣを提供する能力を有することを特徴とするセリン
   経路メチロトローフ菌の菌株。
8. 【請求項８】　　請求項７記載のヒフォミクロビウム（
   Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）の菌株。
9. 【請求項９】　　ＮＣＩＭＢ　４０２８０として入手可
   能であるものの特徴を有する請求項８記載のヒフォミク
   ロビウム（Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）の菌株また
   はその突然変異体。
10. 【請求項１０】　　請求項１〜６のいずれか１項記載の
    ＰＥＰＣ、マレエートデヒドロゲナーゼ、ＰＥＰ、緩衝
    液（ｐＨ５〜１０）およびＮＡＤＨからなることを特徴
    とする生物試料中の重炭酸塩測定用組成物または検査キ
    ット。