KR100373151B1 - 입체선택성 리파제와 이를 생산하는 악시네토박터 균주 - Google Patents

입체선택성 리파제와 이를 생산하는 악시네토박터 균주 Download PDF

Info

Publication number
KR100373151B1
KR100373151B1 KR10-2000-0029739A KR20000029739A KR100373151B1 KR 100373151 B1 KR100373151 B1 KR 100373151B1 KR 20000029739 A KR20000029739 A KR 20000029739A KR 100373151 B1 KR100373151 B1 KR 100373151B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lipase
acinetobacter
strain
cis
bromomethyl
Prior art date
Application number
KR10-2000-0029739A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20010109632A (ko
Inventor
신평균
윤문영
박호일
배희경
정찬성
한예선
박정극
이병석
김순일
Original Assignee
경동제약 주식회사
한올제약주식회사
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경동제약 주식회사, 한올제약주식회사, 한국과학기술연구원 filed Critical 경동제약 주식회사
Priority to KR10-2000-0029739A priority Critical patent/KR100373151B1/ko
Publication of KR20010109632A publication Critical patent/KR20010109632A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100373151B1 publication Critical patent/KR100373151B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본발명은 신균주 악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01 (상기 균주는 벌콜데리아 코코베네난스(Burkholderia cocovenenans) SY-01로 기탁되었으나, 2002년 5월 1일자로 제출한 과학적 성질 및 분류학상의 위치 표시 등의 기록서를 통하여 분류학상의 위치가Acinetobacter sp.SY-01로 수정되었음)과 이로부터 생산되는 입체선택적 기질특이성을 갖는 리파제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항진균제의 원료로 사용되는 이트라코나졸의 중간체로서 라세믹 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트의 에스테르결합을 입체선택적으로 분해할 수 있는 리파제에 관한 것이다.

Description

입체선택성 리파제와 이를 생산하는 악시네토박터 균주{ENANTIOSELECTIVE LIPASE AND ACINETOBACTER SP. SY-01 STRAIN PRODUCING THE SAME}
본 발명은 입체선택적 기질특이성을 갖는 리파제를 생산하는 악시네토박터(Acinetobacter sp.)와 상기 균주가 생산하는 리파제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항진균제의 원료로 사용되는 이트라코나졸의 중간체로서 라세믹 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트를 입체 선택적으로 가수분해하는 신규한 리파제에 관한 것이다.
정밀 유기화합물의 선택적 유기합성법중 화학적 방법을 이용한 것은 전세계적으로 많은 연구가 진행되고 있고 국내에서도 많은 연구가 진행되어 국내외의 기술격차를 좁혀가고 있다. 한편 선택적 유기합성법의 한 분야로 생체촉매를 이용하는 연구가 활발히 진행되고 있는데 이러한 연구는 주로 선진국에서 진행되고 있고 국내연구는 미미한 상태이다. 이러한 생체촉매중 히드롤라제(Hydrolase)에 대해서 생화학적 연구가 많이 진행되었고 히드롤라제의 반응특이성을 이용하여 정밀화합물을 제조하는 연구가 지속적으로 보고되고 있다.
특히, 히드롤라제중에서 리파제는 생화학적으로 많이 연구되었고 넓은 스펙트럼의 반응특이성을 가지고 있기에 대표적으로 많이 사용되고 있다. 지금까지 알려진 리파제의 종류는 70여종에 이르고, 이들의 반응특이성은 각각에 따라 조금씩 다르게 나타나므로, 적절한 리파제를 선택하여 필요한 기질에 적용할 수 있다면 순수한 이성체를 얻을 수 있다(Jackson,M.A. et al., 1995., Enz. Microb. Technol. 17:175-179.).
일반적으로, 라세믹 의약품에 비해 단일이성질체 의약품은 생체내 약리활성을 증가시키고 라세믹화합물의 생체내에서 부작용을 감소시키는 효과가 있다. 특히 항균제 또는 소염제등으로 사용되는 이트라코나졸(Itraconazole)은 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트를 중간체로 사용하여 화학적으로 제조되나 이 중간체가 라세믹형태로 제조되므로 이후의 단계가 복잡하고 또한 최종적으로 얻어지는 산물이 라세믹형태로 제공되므로 여러 가지 부작용의 우려 및 생물학적 활성이 낮은 등의 문제가 있을 수 있어 단일 이성질체 형태로 제공하려는 시도가 있었다. 그러나 화학적으로 합성된 경우에는 라세믹형태의 분리에 별도의 추가비용이 발생하는 등 상용화에는 여러 가지 어려운 점이 많다. 따라서, 중간체를 단일의 이성질체로 분리하여 이후의 반응을 수행함으로써 제조공정의 간편화, 제조원가의 감소, 생물학적 활성의 증가 및 부작용의 최소화를 도모할 수 있을 것이다.
이트라코나졸(intraconazole)은 잘 알려진 항진균제(antifungal agent)로서 시스 형태의 이성질체를 상업적으로 이용할 수 있으나, 라세믹 혼합물 형태로 판매되고 있다. 그러나 이러한 라세믹 형태의 이트라코나졸은 간에 독성이 있고, 부정맥, 메스꺼움, 구토, 과민증, 두드러기, 복통, 두통, 현기증 등의 부작용을 유발할 수 있으므로 현재 화학적 합성기법을 사용하여 광학적으로 순수한 이성질체를 제조하려는 연구가 시도되고 있는 실정이지만 생체촉매를 이용하는 방법은 전무한 실정이다(미국특허 제 5,952,502호 및 미국특허 제 5,474,997호)이다.
본발명은 화학적 유기합성법이 갖는 상기 문제점을 해결하고자, 기질에 대한 입체선택적 특이성을 갖는 리파제를 생산하는 악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01 (상기 균주는 벌콜데리아 코코베네난스(Burkholderia cocovenenans) SY-01로 기탁되었으나, 2002년 5월 1일자로 제출한 과학적 성질 및 분류학상의 위치 표시 등의 기록서를 통하여 분류학상의 위치가Acinetobacter sp.SY-01로 수정되었음)을 제공하는 것이다.
또한, 본발명의 목적은 악시네토박터 (Acinetobacter sp.) SY-01이 생산하는 기질에 대한 입체선택적 특이성을 갖는 리파제를 제공하는 것이다.
본발명의 또다른 목적은 악시네토박터 (Acinetobacter sp.) SY-01가 생산하는 리파제를 이용하여 소염진통제 및 항진균제등으로 사용되는 이트라코나졸의 중간체인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트의 라세믹 혼합물로부터 단일 이성질체로 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
도1a 및 1b는 악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01이 생산하는 입체선택적 리파제에 의해 가수분해되기 전과 후의 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트와 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 알콜을 분석한 결과이다.
도2는 악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01이 생산하는 입체선택적 리파제를 사용하여 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트를 가수분해 시켰을 때, 시간별로 기질의 두 개 이성질체의 감소 비율과 두가지 이성질체에 대한 생성물의 증가비율을 나타낸 것이다.
도3은 악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01의 배양과정에서 균의 증식과 리파제 효소의 생성 관계를 나타낸 것이다.
도4는 조효소액으로부터 Sephadex G-100을 사용하여 정제한 결과 리파제 효소활성 피크와 단백질 피크가 일치하는 결과를 나타낸 것이다.
도5는 정제한 리파제 효소액을 SDS-PAGE 전기영동한 결과와 분자량측정 결과를 나타낸 것이다.
도6은 본 발명의 리파제의 활성과 안정성에 미치는 pH의 영향을 나타낸 것이다.
도7는 본 발명의 리파제의 활성과 안정성에 미치는 온도의 영향을 나타낸 것이다.
본 발명은 악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01 (상기 균주는 벌콜데리아 코코베네난스(Burkholderia cocovenenans) SY-01로 기탁되었으나, 2002년 5월 1일자로 제출한 과학적 성질 및 분류학상의 위치 표시 등의 기록서를 통하여 분류학상의 위치가 Acinetobacter sp. SY-01로 수정되었음) 균주와 이 균주가 생산하는 입체선택적 기질특이성을 갖는 리파제를 제공한다. 더욱 자세하게는, 상기 균주가 생산하는 리파제를 이용하여 다양한 기질의 라세믹 혼합물로부터 단일이성체만을 선택적으로 분리하는데 이용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 이트라코나졸의 중간체인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트의 라세믹 혼합물에서 단일 이성체만을 선택적으로 분리하는데 이용할수 있고, 이 단일 이성질체를 중간체로 사용하는 단일 입체이성질체 의약품을 합성하는데도 이용할 수 있다. 이트라코나졸(intraconazole)은 잘 알려진 항진균제(antifungal agent)로서 시스 형태의 이성질체를 상업적으로 이용할 수 있고, 라세믹 혼합물 형태로 판매되고 있으나, 이러한 라세믹 형태의 이트라코나졸은 간에 독성이 있고, 부정맥, 메스꺼움, 구토, 과민증, 두드러기, 복통, 두통, 현기증 등의 부작용을 유발할 수 있는 문제점이 있다. 그러므로, 중간체인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트를 라세믹 혼합물로부터 단일 이성질체로 분리하여 단일 이성질체로 이트라코나졸을 생산하기 위한 단일중간체로서 제공될 수 있다.
시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트의 화학식은 다음과 같다.
본 발명자들은 라세믹 혼합물을 단일이성질체로 분리하기 위한 리파제 생산균주를 얻기 위해서 전국각지의 토양, 폐수, 하천슬러지 샘플로부터 라세믹 기질, 예컨대 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트에 높은 입체선택성을 나타내는 리파제 생산 미생물을 탐색하기위해, 공단주변의 하천 슬러지에서 상기 기질에 활성이 높고 입체선택성이 우수한 리파제 효소를 생산하는 균주를 다음절차에 의해 분리해 내었다. 즉, 트윈 80을 함유한 분리용 배지에서 콜로니 주위에 불투명한 할로(halo)를 형성하는 균주를 순수분리하였다. 여기에서 할로를 형성하는 콜로니는 트윈 80에 함유된 에스테르(ester) 결합을 분해하는 미생물이므로 리파제 또는 에스테라제를 생산하는 미생물로 판단할 수 있다. 이렇게 분리된 각각의 균주를 올리브유와 로다민 B (rhodamine B)를 함유하는 배지에 접종하여 배양 후 자외선에 조사하였을 때 콜로니 주위에 오렌지색 형광을 나타내는 균주를 순수 분리하였다. 로다민 B 함유배지에서 오렌지색 형광을 나타내려면 배지에 함유되어있는 올리브유의 에스테르 결합을 분해하여 생성된 글리세롤(glycerol)과 지방산(fatty acid)과 로다민 B가 복합체를 형성하여야 하므로 여기에서 분리된 콜로니는 리파제 생산미생물로 판단할 수 있다.
올리브유함유 액체 배지에 상기 분리된 각각의 균주를 배양후 원심분리하여 상등액을 회수하여 조효소액을 분리하고, 이를 올리브 유(olive oil)를 50% 포함한 유화액을 기질로 하여 40℃에서 3시간 반응시킨 후 효소반응에 의해 생성되는 지방산을 0.05M NaOH용액으로 적정하여 효소활성을 측정함으로써 효소 반응이 수행된 것으로 확인된 균주를 최종적으로 분리하여 총 200개의 리파제 생산균주를 확보하였다. (Hou,C.T. et al., 1992., JAOCS. 69(11): 1088-1097.: Watanabe, N. et al., 1977., Agric. Biol. Chem. 41(8): 1353-1358).
리파제 생산균주로 확인된 200종 중에서 입체선택성이 우수한 리파제 생산균주를 선별하기 위하여, 상기에서 분리한 200종의 리파제 생산 미생물중 1차로 60종을 배양하여 각각의 배양액에서 분리된 조효소액와 트리즈마(TRIZMA) 완충용액에 노르말 헥산에 녹인 라세믹 기질(10g/l 농도)을 100㎕ 투입하여 효소반응을 수행하여 노르말 헥산층만을 회수하여 HPLC분석기를 이용하여 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸아세테이트의 입체선택적 가수분해능을 확인하였다.
이와 같이 분리된 60종의 균주가 생산하는 리파제의 상기 라세믹 기질에 대한 입체선택적 가수분해능 측정을 통하여 입체선택성을 나타내는 균주 4종이 분리되었으며, 이중에서 가장 높은 입체선택성을 나타내는 미생물을 선택하여 그 특성을 조사하였다. 최종 분리된 균은 그램음성균이고, 현미경하에서 원형(coccus)모양을 가진 미생물이며, 옥시다제 활성 시험결과 양성반응을 나타내어 본균주는 호기성 미생물임을 알 수 있었다. 대사지문법(Biolog)을 사용하여 동정하기 위해서, Biolog사 의 95가지 탄소원을 입힌 그램 음성용 96웰 마이크로 플레이트 (상표명 : GN2 Microplate)를 사용하였다. 대사지문법은 96웰 마이크로 플레이트에 함유된 탄소원을 접종된 세포가 호흡하므로서 산화시키고, 웰에 함유된 테트라졸리움(tetrazolium)염료는 환원이 되면서 보라색을 형성하는 원리를 이용한 방법이다. 상기 96웰 마이크로 플레이트에 미리 배양한 분리균 현탁액을 접종하여 배양시켜 분리균의 95가지 탄소원에 대한 기질이용능과 산화능을 측정한 결과를 바이오로그(Biolog)회사의 동정용 프로그램(상표명 : Biolog MicroLog3 4.01A)에 입력하여 동정해 본 결과 본 발명의 미생물은 악시네토박터 (Acinetobacter sp.)로 동정되었다. 이를 악시네토박터 (Acinetobacter sp.) SY-01로 명명하였다. 표 1은 96웰 마이크로 플레이트(GN2 Microplate)의 95가지 탄소원 조성을 나타내면, 표 2는 상기 마이크로 플레이트에서 본발명의 분리균주에 대한 대사지문법의 동정결과를 나타낸다.
상기 표 1 및 2의 결과로부터, 본발명의 분리된 미생물은 트윈 40(Tween 40), 트윈 80(Tween80), 메틸피루베이트(methyl pyruvate), 모노메틸숙시네이트(mono-methyl succinate), 아세트산, 시스-숙신산(cis-succinic acid), 포름산(formic acid), α-케토부틸산, α-케토 글루타르산, 프로피온산,숙신산, 브로모숙신산, 알라닌아미드(alanineamide), L-알라닌(L-alanine), L-아스파라긴(L-asparagine), L-글루탐산(L-glutamic acid), L-히스티딘(L-histidine), L-프로린(L-proline), L-세린(L-serine)을 산화할 수 있는 것으로 나타났다.
상기 균주는 버르콜데리아 코코베네난스(Burkholderia Cocovenenans) SY-01로 한국 미생물 보존센터에 1999년 11월 15일자 수탁번호 KFCC-11111호로 기탁되었으며, 2002년 5월 1일자로 제출된 과학적 성질 및 분류학상의 위치표시 등의 기록서를 통하여 분류학상의 위치가 악시네토박터 (Acinetobacter sp.)로 수정되었다.
악시네토박터 (Acinetobacter sp.) SY-01이 생산하는 입체선택적 리파제는 올리브 유(olive oil)를 함유한 트립톤-글루코스-효모추출물 액체배지에서 3일정도 플라스크 배양후 원심분리하여 상등액을 회수함으로써 조효소액을 얻을 수 있다. 상기 조효소액을 사용하여 라세믹 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트를 기질로 하여 효소 가수분해반응을 수행한 후, 가수분해에 의해 생성되는 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸아세테이트와 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 알콜을 분석한 결과, 악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01이 생산하는 효소가 입체선택적 기질특이성을 지닌다. 악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01이 생산하는 발효액 또는 조효소액을 이용하여 라세믹화합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트로부터 단일 이성체로 분리하는데 이용할 수 있고, 이 단일 이성체를 중간체로 이용하여 단일 입체이성질체 의약품을 합성하는데 이용할 수 있다.
본발명의 리파제의 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트의 분해결과를 나타내는 HPLC 분석 결과인 도 1a, 1b에서, 리파제에 의한 가수분해반응 전의 두가지 에스테르 형태 이성질체들 피크가 가수분해한 후에 1개의 에스테르형태 이성체와 두 가지의 알콜형태 이성질체 피크로 나타나므로 본 발명에 의해 생산된 리파제는 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트에 선택적으로 작용하는 입체 선택적 리파제이며, 도 2에서 나타내는 바와 같이, 가수분해 반응이 진행됨에 따라 두가지 라세믹 기질의 잔존양의 비율과 두가지 생성물 이성질체의 증가양의 비율을 나타내는 것으로 기질 75%가 전환되었을 때 기질중 한 가지 이성질체가 모두 없어진 반면, 나머지 한가지 이성질체는 25% 남아있으므로 단일 이성체가 존재하여, 두가지 이성질체의 라세믹 혼합물로부터 하나의 이성질체만을 선택적으로 분리가능하다.
본 발명의 리파제의 분자량은 순수분리된 효소를 표준단백질과 함께 SDS-PAGE를 행한 결과 분자량이 39KD정도이며, 최적 pH 범위는 7.0 - 9.0이고(도 6a), pH 6에서 9까지 안정하였다(도 6b). 또한, 리파제의 최적 활성온도는 45에서 50℃범위이고(도 7a ), 40℃ 내지 60℃까지는 안정하다 (도 7b). 본발명의 리파제은 수은, 구리, 니켈, 칼슘이온등에 의해 저해를 받으며(표 6), 소디움 도데실설페이트에 의해서는 본 효소의 활성이 강한 저해를 받았으나, 트윈 80이나 트리톤 X-100,담즙산염(Gall Powder), 소디움 데옥시콜레이트를 첨가하였을 경우 활성이 크게 증가하였다.(표 7).
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명이 이들만으로 한정된 것은 아니다
실시예
실시예 1: 리파제 생산균주의 분리
전국 각지의 공단주변 하천, 폐수, 토양시료 1ml을 생리식염수에 희석하여 트윈 80(Tween 80)을 함유한 분리용배지(Tween 80 1.0%, Peptone 0.5% Beef extract 0.3%, CaCl2·2H2O 0.001%, Agar 2.0%, pH 7.0) 에 직접 도말하거나 올리브유를 함유한 최소배지(올리브유 2.0%, NH4Cl 0.1% K2HPO40.44%, NaH2PO4·2H2O 0.39%, MgSO4·7H2O 0.05%, CaCl2·2H2O 0.0003% FeSO4·7H2O 0.0001%, MnCl2·4H2O 0.0001% CoCl2·6H2O 0.00001% Na2MoO4·2H2O 0.00001% 시트르산 모노하이드레이트 0.0004%, pH 7.0)에서 수회 반복 집적배양한 후 희석하여 트윈 80(Tween 80)을 함유한 분리용배지에 도말하였고, 30℃에서 4-5일 배양한 후 콜로니 주위에 불투명한 할로(halo)를 형성하는 균주를 1차 분리하였다. 분리된 균주 각각을 로다민 B(Rhodamine B)를 함유한 분리용배지(올리브유 1.0%, 펩톤 0.5%, Beef extract 0.3%, Rhodamine B 0.0001%, 아가 2.0%, pH 7.0)에 접종하여 30℃에서 3일 배양한 후 UV를 조사하였을 때 콜로니 주위에 오렌지색 형광을 나타내는 균주를 2차 분리하였다. 최종적으로 분리된 각각의 균주를 리파제 생산용 배지(올리브유 1.0%, 트립톤 0.5%, 덱스트로스 0.1%, 효모추출물 0.5%, K2HPO40.1%, pH 7.0.)5 ml를 함유한 시험관(20ml용량)에 각각 접종하여 30℃, 150rpm에서 3일 배양한 후 원심분리하여 배양상등액 1ml, 올리브 유 50%함유한 유화액(시그마 카타로그 번호 800-1)3ml, 200mM 트리즈마 완충용액(pH 8.0) 1ml, 증류수 2.5ml을 혼합한 후 40℃에서 6시간 반응시켰다. 반응후 95% 에탄올 3ml과 에탄올에 녹인 0.9% 티몰프탈레인(thymolphthalein) 지시약을 소량 투입하고 0.05M NaOH 용액으로 적정하여 리파제(Lipase) 활성을 측정하여 리파제(Lipase) 생성균주를 최종적으로 분리하였고 총 200개의 리파제 생산균주를 확보하였다.
분리한 200종의 리파제 생산균주 중 1차로 60종을 리파제(Lipase) 생산용 배지(올리브유 1.0%, 트립톤 0.5%, 덱스트로스 0.1%, 효모추출물 0.5%, K2HPO40.1%, pH 7.0.)5ml를 함유한 시험관(20ml용량)에 각각 접종하여 30℃, 150rpm에서 3일 배양한후 원심분리하여 배양상등액 1 ml와 노르말 헥산에 10g/ℓ 농도로 용해한 라세믹 기질 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트10㎕, 200mM 트리즈마 완충용액(pH8.0) 1 ml, 증류수 4 ml을 혼합한후 40℃에서 250rpm으로 6시간 반응시킨 후 노르말 헥산 1 ml를 투입하고 혼합한 후 노르말 헥산층만을 회수하여 HPLC를 이용하여 분석하여 상기의 기질에 대한 입체선택성을 확인하였다. 이와 같이 상기의 기질에 입체선택성이 우수한 균주 4종이 분리되었으며, 이중에서 가장 높은 입체선택성을 나타내는 균주 1종을 선택하였다.
상기 HPLC 분석결과를 도 1a 와 도 1b에 나타냈으며, 악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01이 생산하는 입체 선택적 리파제에 의해 가수분해된 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트를 분석한 결과로서, 가수분해반응 전의 두 개의 에스테르 형태 이성질체들 피크가 가수분해한 후 1개의 에스테르 형태 이성질체와 두 개의 알콜형태 이성체 피크로 나타나므로 본 발명에의해 생산된 리파제는 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트에 선택적으로 작용하는 입체 선택적 리파제임이 입증되었다.
또한, 상기와 동일한 방법으로 라세믹 기질에 대한 효소 가수분해반응에서 시간별로 입체선택성을 측정하였다.
도 2는 본 발명에 의해 생산된 리파제를 사용하여 가수분해반응을 실시하였을 때, 가수분해 반응이 진행됨에 따라 두가지 라세믹 기질의 잔존양의 비율과 두가지 생성물 이성질체의 증가양의 비율을 나타내는 것으로 기질 75%가 전환되었을 때 기질중 한 가지 이성체가 모두 없어진 반면, 나머지 한가지 이성질체는 25% 남아있으므로 단일 이성체가 존재함이 입증되었다.
따라서 본 발명의 분리된 균주는 입체선택적 기질특이성을 갖는 리파제를 생산하며, 본균주의 배양물을 이용하여 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트를 기질로 하여 효소반응에 의하여 단일 이성체를 분리할 수 있고, 이 단일 이성체를 이용하여 여러 가지 단일 이성질체 의약품을 합성할 수 있다.
실시예 2: 분리균주의 동정
실시예 1에서 분리된 균주의 특성을 조사하기 위해서, 그람 염색을 한 결과 그램음성을 나타냈으며, 현미경하에서 관찰한 결과 원형모양을 지닌 미생물임을 알 수 있었다. 또한 옥시다제 활성시험결과 양성반응을 나타내어 호기성 미생물임이 확인되었다.
또한 Biolog사의 95가지 탄소원을 입힌 그램음성용 96웰 마이크로 플레이트(상표명: GN2 Microplate)에 미리 실시예 1의 방법으로 배양한 분리균 현탁액을 각 웰당 200㎕씩 접종하여 30℃ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 95가지 탄소원에 대한 기질이용능을 측정한 결과를 Biolog사의 동정용 프로그램(상표명: Biolog MicroLog34.01A)에 입력하여 동정한 결과를 표 1내지 표 2에 나타냈다. 그 결과 본발명의 분리균은 악시네토박터(Acinetobacter sp.)로 동정되었다.
실시예 3: 리파제의 생산
리파제를 생산하기 위하여 0.5% 올리브유, 0.5% 트립톤, 0.1% 글루코스, 0.5% 효모추출물, 0.1% K2HPO4를 녹인 배지 3ℓ를 pH 7.5로 맞춘후 121℃에서 15분간 가압살균한 하여 냉각한 후에, 여기에 동일 배지조성으로 미리 24시간 배양한 본 발명의 악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01균주(KFCC-11111)를 배양한 종배양액 100ml을 접종하고, 배양온도 30℃, 회전수 600rpm의 5ℓ 발효기(Fermenter, 한국발효기)에서 10시간 배양한 결과 364 units/liter의 리파제 활성결과를 얻었다. 도 3 은 배양시간에 따른 균체의 성장과 리파제 생산, pH의 변화를 나타낸 것이다.
실시예 4: 리파제의 정제
악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01균주(KFCC-11111)의 배양액을 원심분리(12000rpm, 10분)한 후 배양상등액 500ml을 분자량 10000 달턴 포어(Pore) 크기의 막(membrane)이 장착된 한외여과 시스템(아미콘 8200 모델)을 이용하여 부피로 약 10배정도 농축하였다. 농축액을 다시 원심분리(12000rpm, 10분)하여 남아있는 균체를 완전히 제거하였다. 이 농축액을 Tris-HCl 완충액(pH 8.0)으로 평형화시킨 세파덱스 G-100 컬럼(150mm x 30mm))에 넣고 동일완충액으로 20ml/hr의 유속으로 용출시켰다. 분획별로 5ml씩 회수하여 리파제 활성과 파장 280nm에서 흡광도를 측정한 결과 5 - 9번 분획에서 효소활성 피크와 단백질 피크가 일치하는 결과(도 4 )을 얻을 수 있었다. 이러한 정제과정을 표 3 에 정리하였다. 본발명의 리파제의 비활성도는 2.44 unit/mg이었으며 수율은 34.86%, 정제도(purity)는 39.2배까지 증가되었다. 이 정제 효소액을 SDS-PAGE 전기영동한 결과 본 효소는 전기영동상에서 단일밴드로서 나타나므로 정제되었음이 확인되었다(도 5 ).
실시예 5: 본발명의 리파제의 특성
실시예 4에서 순수분리된 효소를 사용하여 다음 실험예에 따라서 리파제의 특성을 조사하였다.
A. 효소의 분자량 및 N-말단 아미노산 서열 결정
순수분리된 효소를 표준단백질과 함께 SDS-PAGE를 행한 결과 분자량이 39KD정도로 나타났다(도 5). 겔상의 단백질을 추출해서 N-말단의 아미노산 서열을 분석한 결과 표 4와 같이 나타났다. 분리된 효소는 같은 그램음성균인 슈도모나스속의 균이 생산하는 리파제와 N-말단이 상당히 다른 신규 효소임을 알 수 있다.
B. 리파제에 대한 PH영향
실시예 5에서 순수 분리된 리파제에 대한 pH 및 온도의 영향을 조사하였다. pH를 다양하게 하면서 효소활성을 측정한 결과, 최적 pH 범위는 7.0에서 9.0사이였다(도 6a).
pH는 브리튼-로빈슨 완충액을 사용하여 상기 표 5에 표시한 과 같이 변화 시켰다.
활성측정은 브리튼-로빈슨 완충액 1ml과 올리브유 50%를 함유한 유화액 기질(시그마 카타로그 번호 800-1)3ml, 증류수 2.5ml, 효소용액 1ml을 혼합한후 50℃에서 6시간 반응시켰다. 반응 완료후 에탄올(95%)3ml과 티몰프탈레인 지시약 6방울을 혼합한후 0.05M NaOH용액으로 적정하였다.비교시험(blank)은 효소용액을 제외하고 동일한 방법으로 수행하였다.
리파제의 pH에 대한 안정성을 측정하기 위하여 다양한 pH에서 30℃를 유지하면서 24시간 방치한 후 50℃에서 잔존 효소활성을 측정한 결과 pH 6에서 9까지 안정하였다. (도 6b).
C. 리파제에 대한 온도영향
온도변화는 온도 조정이 가능한 항온조에서 30, 40, 45, 50, 60, 70℃ 각각의 온도에서 반응 시켰고, 활성측정은 200mM TRIZA 완충액(pH 8.0) 1ml과 올리브유 50%를 함유한 유화액 기질(시그마 카타로그 번호 800-1)3ml, 증류수 2.5ml, 효소용액 1ml을 혼합한후 상기 각각의 온도에서 6시간 반응시켰다. 반응 완료후 에탄올(95%)3ml과 티몰프탈레인(thymolphthalein) 지시약 6방울을 혼합한후 0.05M NaOH용액으로 적정하였다. 비교시험(blank)은 효소용액을 제외하고 동일한 방법으로 수행하였다.효소의 최적 활성온도는 45에서 50℃사이로 나타났고(도 7a ), 40℃이하와 50℃ 이상에서 효소활성이 급격히 감소하였다. 리파제의 열안정성을 측정하기 위하여, 각각의 온도에서 1시간 방치한 후 50℃에서 효소활성을 측정한 결과 60℃까지는 안정한 것으로 판명되어 본 효소는 어느정도 열 안정성이 있음을 알 수 있었다(도 7b).
D. 리파제에 대한 금속이온 및 각종시약의 영향
금속이온에대한 영향을 보기 위하여 200mM TRIZA 완충액(pH 8.0) 1ml과 올리브유 50%를 함유한 유화액 기질(시그마 카타로그 번호 800-1)3ml, 증류수 2.5ml, 효소용액 1ml을 혼합한후, 여기에 각각의 금속이온 농도가 5mM이 되도록 정량하여 혼합하고 50℃ 항온조에서 6시간 반응시켰다. 반응 완료후 에탄올(95%)3ml과 티몰프탈레인(thymolphthalein) 지시약 6방울을 혼합한후 0.05M NaOH용액으로 적정하였다. 비교시험(blank)은 효소용액을 제외하고 동일한 방법으로 수행하였다. 각종 시약에 대한 영향도 같은 방법으로 실험을 수행 하였다.
본발명의 리파제에 대한 여러 가지 금속이온의 영향을 살펴본 결과, 수은, 구리, 니켈, 칼슘이온등에 의해 저해를 받는 것으로 나타났다(표 6). 또한 각종 시약에의한 영향을 조사한 결과 소디움 도데실설페이트에 의해서는 본 효소의 활성이 강한 저해를 받았으나, 트윈 80이나 트리톤 X-100, 담즙산염(Gall Powder), 소디움 데옥시콜레이트를 첨가하였을 경우 활성이 크게 증가하였다(표 7 ).
E. 리파제의 용매에 대한 내성도
본발명의 리파제 활성이 956unit/ℓ로 만들어진 용액 1ml에 에탄올, DMSO, 다이옥산(Dioxane), 헥산(Hexane), 데칸(Decane)을 각각 10%, 20%, 50%용액을 만든 후 지방가수분해 역가를 측정한 결과 표 8 과 같이 용매에 대해 매우 안정성이 높아서 본발명의 효소를 생촉매로서 이용할 수 있음을 알았다.
악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01균주는 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트에 입체선택적으로 작용하여 에스테르 형태를 가수분해하는 리파제를 생산하며, 상기 균주로 부터 생산된 입체선택적 기질특이성을 갖는 리파제를 이용하여 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트를 기질로하는 효소반응에 의하여 단일 이성체를 분리할 수 있고, 이 단일 이성체를 이용하여 여러 가지 단일 이성질체 의약품을 합성하는데 이용할 수 있다.

Claims (5)

  1. 수탁번호 KFCC-11111의 악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01 균주에 의해서 생산되고,
    SDS-PAGE 결과 분자량이 약 39 KD이고,
    최적 활성 온도 범위가 45 내지 50 ℃ 이고,
    최적 활성 pH가 7.0 내지 9.0 이고,
    수은, 구리, 니켈 또는 칼슘 이온에 의하여 활성이 저해되고,
    다음과 같은 N-말단 아미노산 서열을 가지며, 입체선택적 기질특이성을 갖는 리파제
    N-말단-DGINIGI.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 리파제는 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트로부터 단일 이성체로 분리하는 것이 특징인 리파제.
  4. 입체선택성 리파제를 생산하는 수탁번호 KFCC-11111을 갖는 악시네토박터 (Acinetobacter sp.) SY-01 균주.
  5. 제 4 항의 악시네토박터(Acinetobacter sp.) SY-01 균주를 배양하여 그 배양물을 사용하여 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥소란-4-메틸 아세테이트로부터 단일이성질체를 분리하는 방법.
KR10-2000-0029739A 2000-05-31 2000-05-31 입체선택성 리파제와 이를 생산하는 악시네토박터 균주 KR100373151B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2000-0029739A KR100373151B1 (ko) 2000-05-31 2000-05-31 입체선택성 리파제와 이를 생산하는 악시네토박터 균주

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2000-0029739A KR100373151B1 (ko) 2000-05-31 2000-05-31 입체선택성 리파제와 이를 생산하는 악시네토박터 균주

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20010109632A KR20010109632A (ko) 2001-12-12
KR100373151B1 true KR100373151B1 (ko) 2003-02-25

Family

ID=45923937

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR10-2000-0029739A KR100373151B1 (ko) 2000-05-31 2000-05-31 입체선택성 리파제와 이를 생산하는 악시네토박터 균주

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100373151B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100446256B1 (ko) * 2002-07-11 2004-09-01 경동제약 주식회사 고 광학선택성을 가지는시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로페닐)-13-디옥소란-4-메틸알콜의 제조방법

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100446256B1 (ko) * 2002-07-11 2004-09-01 경동제약 주식회사 고 광학선택성을 가지는시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로페닐)-13-디옥소란-4-메틸알콜의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20010109632A (ko) 2001-12-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CS224624B2 (en) Method for producing 2,5-diketo-d-gluconic acid or its salts
CN103509728B (zh) 生产辅酶q10工程菌的构建方法、工程菌与应用方法
JP3694065B2 (ja) 環状Ｓ−α−アミノカルボン酸およびＲ−α−アミノカルボキサミドの生物工学的製造方法
KR100373151B1 (ko) 입체선택성 리파제와 이를 생산하는 악시네토박터 균주
US5496715A (en) Process for preparing indigo
KR100355496B1 (ko) 내열성 티로신 페놀리아제와 트립토파나아제를 생산하는신규한 고온성 공생 미생물 심비오박테리움 퇴비 ｓｃ-1및 그의 유사 미생물의 탐색방법
US5663329A (en) Preparation of enantiomerically pure lactams
KR100507559B1 (ko) 신규한 슈도모나스 속 균주들, 그로부터 생산되는 입체선택적 기질 특이성을 가진 리파아제, 및 그러한 리파아제를 이용한 광학이성질체의 분할 방법
RU2077577C1 (ru) Штамм бактерии delcya marina - продуцент щелочной фосфатазы и способ получения щелочной фосфатазы
US6242243B1 (en) Trichosporon sp RRLY-15 (DSM 11829) and its use to prepare S(+)-6-methoxy-methyl-2-naphthalene acetic acid
KR100229284B1 (ko) 신규 고온성 공생 심비오박테리움 속 미생물 및 그로부터 생산되는 내열성 티로신 페놀리아제 및 트립토파나아제
JP3642344B2 (ja) クレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法
KR0183447B1 (ko) 신균주 바실러스 엘케이-1
FI89077B (fi) Foerfarande foer erhaollande av termostabila -amylaser genom odling av superproduktiva mikroorganismer vid hoeg temperatur
JPS6248380A (ja) セフアロスポリンｃアシラ−ゼの製造法
KR100260837B1 (ko) 광학활성 카본산 및 그 거울상 이성체 에스테르의 제조방법
KR0184716B1 (ko) 내열성 디-알라닌 아미노기전이효소 활성을 갖는 신규의 고온성 균주 바실러스 종 엘케이-2
JPH0898683A (ja) ７−アミノセファロスポラン酸エステラーゼ
WO2000023608A1 (en) Preparation of amino alcohols
JPH0331195B2 (ko)
KR100306912B1 (ko) 슈도모나스 세파시아 ｂｙ21균주와 이로부터글루타릴세븐에이씨에이 아실레이즈 생산방법
JPH04141096A (ja) Ｒ（―）―１，３―ブタンジオールの製造法
JPH09247A (ja) Ｄ−乳酸脱水素酵素およびその製造法
JPS6248379A (ja) セフアロスポリンｃアシラ−ゼの製造法
JPS6279782A (ja) 耐熱性リパ−ゼ

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20101224

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20111228

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150106

Year of fee payment: 15

LAPS Lapse due to unpaid annual fee