CN116063399A

CN116063399A - 一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液

Info

Publication number: CN116063399A
Application number: CN202211179596.7A
Authority: CN
Inventors: 刘一琳; 王培培; 孙亚萍; 马文君; 郑春阳
Original assignee: Zhongwei Lianchuang Biotechnology Tianjin Co ltd
Current assignee: Zhongwei Lianchuang Biotechnology Tianjin Co ltd
Priority date: 2022-09-27
Filing date: 2022-09-27
Publication date: 2023-05-05

Abstract

一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液，其特征在于本发明的酵母发酵滤液还有至少一种酚溶调制蛋白肽，本发明不仅含有酵母发酵产物滤液中丰富的小分子氨基酸、多肽、核苷酸、维生素等天然活性成分物质，可维持肌肤活力；还包含具有抑菌功效的酚溶调制肽，保持健康的皮肤微生态，同时避免了酚溶调制肽不易于表达与纯化的技术缺陷。同时，本发明的发酵过程省略了酚溶调制肽的纯化步骤，直接得到复合化妆品原料，工艺简单、成本低廉，适合规模化生产。

Description

一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液

技术领域

本发明属于化妆品原料技术领域，尤其涉及一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液。

背景技术

酵母发酵产物在护肤产品中，具有广泛的应用。酵母发酵产物富含维生素、氨基酸、矿物质、有机酸等多种小分子活性物，可以有效改善肌肤表皮层的代谢过程，维持肌肤透亮、柔嫩、细滑，保持肌肤活力。同时，皮肤表层存在天然益生菌群，一些短肽及其他小分子活性物质，可以部分抑制致病菌的生长，或促进益生菌的生长，进而维护皮肤微生态的良性发展。酿酒酵母是一种良性酵母，是公知的安全菌株之一，广泛应用于酿造、食品添加剂、护肤品等领域。酵母菌发酵产物滤液中富含小分子氨基酸、多肽、核苷酸、维生素等天然活性成分，是非常好的综合皮肤调理剂。酵母菌发酵产物滤液呈弱酸性，能抑制皮肤的有害细菌。很多皮肤的有害细菌更容易在碱性的环境下生存，保持酸性环境，可以抗感染，发挥角质层更好的屏障功能，保持健康的皮肤微生态。酵母菌发酵产物滤液还能平衡油脂、润白淡斑、抗氧化、修护肌肤；富含天然保湿因子促使角质层充盈的水分，有利于营养物质吸收与转化。

酚溶调制蛋白（PSM）是一系列具有调控炎症反应功效的多肽，在1999年由华盛顿大学 Mehlin在表皮葡萄球菌UW-3 株的培养上清液中发现。由于该蛋白在热酚萃取后溶解于酚，又因其具有调控炎症反应的功能，被命名为酚溶调制蛋白。酚溶调制蛋白有α、β、γ、δ等系列，其中β系列是目前研究较广的抑菌蛋白肽。PSMβ抑菌肽具抑制格兰仕阳性菌的潜质，对皮炎、红疹等有一定的功效。但是，由于化学合成法生产PSMβ抑菌肽的价格昂贵；生物合成法合成PSMβ系列抑菌肽的表达及纯化产率较低，不适合大规模生产，目前PSMβ抑菌肽并未在化妆品领域得到广泛应用。

现今，复合化妆品原料在护肤品领域应用广泛，多种活性原料复配在一起，实现“1+1＞2”的功效。由此，开发一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液，产品既具有酚溶调制肽抗菌益生的功效，又含有酵母发酵产物滤液中丰富的氨基酸、维生素等小分子活性物，可以有效改善肌肤表皮层的代谢过程，维持肌肤活力；获得一种富含酚溶调制肽的复合化妆品原料，成为现在亟需研究的课题。

发明内容

本发明目的在于提供一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液, 省略酚溶调制肽的纯化步骤，可直接得到具有功效的复合化妆品原料，以解决酚溶调制肽产量低、获取难度大、成本高的问题。

为解决上述技术问题，本发明的一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液的具体技术方案如下：

一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液，包括以下2个部分：（I）酵母发酵产物滤液；（II）酚溶调制蛋白肽。

所述的（I）为酿酒酵母菌株发酵产物滤液，其酿酒酵母菌株保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种编号为CICC1002；或经优化为其他酿酒酵母菌株，甚至是其他酵母菌株；

所述的（II）为酚溶调制蛋白肽；

进一步的，（II）为酚溶调制β系列蛋白肽；

进一步的，β系列蛋白肽分别为PSMβ1、PSMβ4和PSMβ6；

进一步的，氨基酸序列依次如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2、SEQ ID No：3所示，并分别整合至酿酒酵母染色体上。

更进一步的，所述PSMβ1、PSMβ4、PSMβ6的表达量的比例为任意比例，其中PSMβ1为高拷贝数表达，PSMβ4和PSMβ6为中拷贝数表达；

更进一步的，所述PSMβ1、PSMβ4、PSMβ6的表达量的比例为3:1:1。

本发明的第二发明目的在于提供一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液的制备方法，包括如下步骤：

步骤A、在质粒YCplac22上插入如SEQ ID No：4所示的核苷酸序列，获得酚溶调制肽PSMβ1目的片段和表达载体；

步骤B、提取步骤A中的构建质粒的DNA，并线性化，然后与酿酒酵母混合，转化完成后将其涂布于色氨酸缺陷型筛选培养基平板上，筛选阳性克隆，即获得含有酚溶调制肽PSMβ1基因的酿酒酵母底盘；

步骤C、将步骤B中得到的表达酚溶调制肽的酿酒酵母菌株，接种至YPDA培养基，并于200rpm、28℃摇床内发酵约60h，过滤除杂后补加少量多元醇，即获得含有酚溶调制肽PSMβ1的酵母发酵产物滤液。

本发明的一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液具有以下优点：

（1）本发明产品既具有酚溶调制肽抑菌的功效，又具有酵母发酵产物滤液中丰富的氨基酸、维生素等小分子活性物，可以有效改善肌肤表皮层的代谢过程，维持肌肤微生态。

本发明产品可以有效解决酚溶调制蛋白肽表达及纯化效率低的问题，省略酚溶调制肽的纯化步骤，直接得到复合化妆品原料，工艺简单、成本低廉，适合实验室生产。

附图说明

图1为本发明的思路设计示意图；

图2为构建PSMβ1的质粒图谱；

图3为多肽PSMβ1的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

下面将结合实施方式对本发明的实施方案进行详细描述。但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所述试剂或仪器未注明生产商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

酵母表达系统是真核表达蛋白的常用系统之一，具有真核表达系统的许多优点：如蛋白加工折叠、翻译后修饰等。

酵母底盘的蛋白表达与大肠杆菌具有很大不同，由于设计的质粒或载体均不带有酵母自身复制原点，直接将其导入到酵母宿主菌中，不能稳定存在，所以必须将质粒或载体线性化，以同源重组的方式与宿主菌的染色体进行整合，这样外源基因才能够稳定存在，而且同源重组一旦形成便能够稳定存在，不会因酵母的分裂或复制而消失。

这样一来，我们可以通过在酵母染色体上，插入外源基因的数量和位置，来调控外源基因在酵母分裂过程中的拷贝数，从而控制其蛋白表达量。而且，无需反复将外源基因整合至酵母底盘，只需构建好合适的表达底盘后，单次整合即可实现外源基因的表达量调控。

实施例1

本发明实施例1为获得酚溶调制肽PSMβ1目的片段和表达载体，图1是实施例提供的思路设计示意图，图2是所构建表达载体的质粒图谱，所构建质粒命名为YCplac22-PSMβ1。

具体实施步骤如下：

（1）使用商用载体YCplac22，根据相关序列位置设计酶切位点，并插入酚溶调制肽PSMβ1的基因序列。酚溶调制肽PSMβ1的氨基酸序列为SEQ ID No1：MTKLAEAIANTVKAGQDHDWAKLGTSIVGIAENGIGLLGKVFGF，其核苷酸序列为SEQ ID No4：ATGACCAAACTGGCTGAAGCTATCGCTAACACCGTTAAAGCTGGTCAGGACCACGACTGGGCTAAACTGGGTACCTCTATCGTTGGTATCGCTGAAAACGGTATCGGTCTGCTGGGTAAAGTTTTCGGTTTCTAA；

（2）通过PCR法扩增酚溶调制肽PSMβ1，引物为F1：5`-tgaccatgattacgccaATGACCAAACTGGCTGAAG-3`和R1：5`-acctgcaggcatgcaTTAGAAACCGAAAACTTTACCC-3`，使用普通DNA产物纯化试剂盒对目的片段进行纯化；

（3）构建的载体质粒为商用载体YCplac22，是一个具有色氨酸合成酶基因的高拷贝质粒，使用Hind III酶对YCplac22进行单酶切，酶切方法如产品说明书所述，酶切完成后使用普通DNA产物纯化试剂盒对线性载体进行纯化；

（4）上述纯化后的片段和线性载体，使用无缝克隆的方法进行连接，方法参照Gibson Method试剂盒说明书；

（5）连接后的质粒，转化至DH5α感受态细胞，孵育后涂布含有Amp抗性的LB培养皿中，筛选连接正确的阳性克隆，并提取质粒；

（6）对质粒进行外送测序并比对序列信息，比对无误的质粒即为本实施例所构建的表达载体。

实施例2

本发明实施例2为获得含有酚溶调制肽PSMβ1基因的酿酒酵母底盘。酿酒酵母底盘使用商业化的酿酒酵母菌株W303，具体实施步骤如下：

（1）将酿酒酵母W303菌株，划线至YPDA培养基的无菌培养平皿中，于28℃恒温培养箱内倒置培养60h以上，得到活化的酵母菌落；

（2）从平板上挑取新鲜菌落，转接至7ml的YPDA试管中，于28℃、200rpm摇床内培养12h以上，得到活化的高密度酵母菌株，并离心富悬液约5ml，富集菌株；

（3）使用酵母转化试剂盒，将线性化的质粒YCplac22-PSMβ1转化至酿酒酵母W303中，具体操作步骤参照试剂盒说明；

（4）将转化后的菌株，涂布色氨酸缺陷型筛选培养基，于28℃恒温培养箱内倒置培养约48h，直至平板上长出较大菌落；

（5）挑取上述平板上的阳性转化子，转接至YPDA试管中，于28℃、200rpm摇床内培养约24h，使用紫外分光光度计检测OD600数值为6以上；

取上述发酵液，添加终浓度为25%的甘油，保藏于-80℃冰箱内备用，即得到含有酚溶调制肽基因的酿酒酵母底盘细胞，并命名为W303-PSMβ1。

实施例3

本发明实施例3为获得含有酚溶调制肽PSMβ1的酵母发酵产物滤液。具体实施步骤如下：

（1）将W303-PSMβ1接种至100ml的YPDA摇瓶培养基内，于28℃、200rpm摇床培养24h，得到发酵种子液；

（2）种子液培养结束后，使用紫外分光光度计测试其OD600数值为7.2，满足种子液的发酵标准；

（3）取上述新鲜种子液，转接至含2L YPDA液体培养基的5L摇瓶，于28℃、200rpm摇床培养60h，得到含有酚溶调制肽的酵母发酵产物；

（4）上述发酵产物经过离心、浓缩等工艺，使酵母发酵产生的PSMβ1肽进一步富集，得到含有酚溶调制肽的酵母发酵产物粗产品；

（5）上述发酵产物粗产品，依次补加终浓度为5%的己二醇、0.3%的辛甘醇，并抽滤过0.2μm无菌滤膜，得到含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液，即为终产品。

实施例4

本发明实施例4为含有酚溶调制肽PSMβ1的酵母发酵产物滤液的指标检测。具体实施步骤如下：

（1）总蛋白质含量的测定：使用BCA法测定上述发酵产物滤液中的蛋白质含量为1.45mg/mL，即利用BCA试剂与CU1+结合产生的稳定蓝紫色复合物，在562nm下的光吸收与蛋白质含量成正比，在特定范围内计算蛋白质含量；

（2）干物质含量的测定：使用烘干法测定上述发酵产物滤液中的干物质含量为0.68%，即在蒸发皿中加入1ml产品，于105℃烘干1h，计算干物质含量=（皿加样拼烘干后重量-空皿重量）/(皿加样品烘干前重量-空皿重量)；

（3）保湿度的测定：仪器法测定上述发酵产物滤液的保湿度为15%，测试方法为手臂内侧分别涂抹0.5ml的生理盐水和上述产品，使用皮肤测试仪，测试使用前及液体挥发后的皮肤含水/失水情况；

（4）抑菌情况的测定：生长曲线法测试上述发酵产物滤液可在一定程度上抑制表皮葡萄球菌的生长，测试方法为表皮葡萄球菌分别与等体积的上述产品或生理盐水共培养，每隔2个小时监测使用紫外分光光度计检测一次OD₆₀₀值，测试含有上述产品的菌株生长情况是否受抑制；

（5）酚溶调制肽PSMβ1的表达情况：将含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液，经过蒸发、透析等方式浓缩，得到相关产品的3倍浓缩液，并进行SDS-PAGE检测，电泳结束后，使用银染的方式，查看小分子蛋白肽的条带大小，并与纯化样品对照，拍照记录（见图3）。

对比例

本对比例为不含有任何一种酚溶调制蛋白的酵母发酵产物滤液的制备和测试情况，制备工艺如以下步骤所示：

（1）将酿酒酵母W303菌株接种至100ml的YPDA摇瓶培养基内，于28℃、200rpm摇床培养24h，得到发酵种子液；

（2）种子液培养结束后，使用紫外分光光度计测试其OD₆₀₀数值为6.8，满足种子液的发酵标准；

（3）取上述新鲜种子液，转接至含2L YPDA液体培养基的5L摇瓶，于28℃、200rpm摇床培养60h，得到酵母发酵产物；

（4）上述发酵产物经过离心、浓缩等工艺，得到酵母发酵产物粗产品；

（5）上述发酵产物粗产品，依次补加终浓度为5%的己二醇、0.3%的辛甘醇，并抽滤过0.2μm无菌滤膜，得到酵母发酵产物滤液，即为终产品。

本对比例的指标测试情况如表1所示。

实施例5

本发明实施例5为测试含有1种或几种不同酚溶调制β系列蛋白肽的酵母发酵产物滤液的情况，并与不含任何一种酚溶调制蛋白的酵母发酵产物滤液进行对比，测试的几种产品及相关指标如表1所示。

下列所测试的5个产品，对比例中不含任何酚溶调制蛋白；实施例相关的4个产品，其总酚溶调制β系列蛋白肽的含量保持一致。实验结果表明，含有3种酚溶调制β系列蛋白肽，且当PSMβ1：PSMβ4：PSMβ6含量配比约为3:1:1时，各项测试指标较好。

表1 4种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液的参数比对

可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims

1.一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液，其特征在于，所述酵母滤液中含有酚溶调制蛋白肽。

2.根据权利要求1所述的一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液，其特征在于，所述酚溶调制蛋白肽为β系列蛋白肽，且滤液中包含一种或一种以上的β系列蛋白肽，其氨基酸序列如SEQ ID No1所示；或者经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸。

3.根据权利要求2所述的一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液，其特征在于，所述β系列蛋白肽分别为PSMβ1、PSMβ4和PSMβ6，其表达量为任意比例。

4.根据权利要求3所述的一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液，其特征在于，PSMβ1、PSMβ4、PSMβ6的表达量的比例为3:1:1。

5.根据权利要求1-3任意所述的一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，其制备方法如下：

构建目的基因片段和表达载体；

获得含有酚溶调制肽PSMβ基因的酵母底盘；

通过发酵培养获得含有酚溶调制肽PSMβ的酵母发酵产物滤液。

6.根据权利要求5所述的一种含有酚溶调制肽的酵母发酵产物滤液的制备方法，其特征在于，所述酵母菌株为酿酒酵母或是其他酵母菌株。