CN116285383A - 一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料及制备方法，该材料由重组人胸腺肽多倍体蛋白、交联剂和基质组成；所述的重组人胸腺肽多倍体蛋白记作(Tβ₄)_n蛋白，其中n取3的整数倍。该方法具体包括如下过程：将交联剂和(Tβ₄)_n蛋白加入基质中，混匀后于4～37℃静置，静置期间观察交联状态，待成胶后即制得重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料。本发明首次提出采用(Tβ₄)_n蛋白和交联剂制备水凝胶材料，制得的重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料中的(Tβ₄)_n蛋白与细胞的相容性良好，在制备生物材料器械(例如生物材料支架)中具有应用价值。

Description

一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料及其制备方法

技术领域

本发明属于生物组织材料技术领域，涉及蛋白水凝胶材料，具体涉及一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料及其制备方法。

背景技术

胸腺肽β₄(Tβ₄)是胸腺肽β家族中的一员，由43个氨基酸组成，是一种具亲水性多肽，生物体中的天然Tβ₄含量很低，且与多种高度同源性的Tβ₄较难分离，导致难以获得髙纯度的胸腺肽β₄；进行人工表达蛋白时，由于Tβ₄的分子量过低，使得其在宿主细胞中过表达时稳定性较差，难以获得理想的浓度水平；目前用于科学和临床前实验研究的高纯度Tβ₄基本上是合成化学的，但是化学合成Tβ₄的工艺复杂、产量低，且价格昂贵。此外，已有研究表明，Tβ₄在生物的生理和病理过程中均发挥重要的调控作用，其应用前景有待进一步挖掘。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料及其制备方法，解决现有技术中人工表达蛋白时难以获得髙浓度的Tβ₄，而化学合成Tβ₄工艺复杂且产量低的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：

一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料，该材料由重组人胸腺肽多倍体蛋白、交联剂和基质组成；所述的重组人胸腺肽多倍体蛋白记作(Tβ₄)_n蛋白，其中n取3的整数倍；

所述的交联剂为戊二醛、京尼平、花青素或谷氨酰胺转移酶。

本发明还具有如下技术特征：

具体的，所述的(Tβ₄)_n蛋白为(Tβ₄)₆蛋白、(Tβ₄)₉蛋白或(Tβ₄)₁₂蛋白；

所述的(Tβ₄)₆蛋白的编码基因序列如核苷酸序列表中的sequence ID Number 1所示；

所述的(Tβ₄)₉蛋白的编码基因序列如核苷酸序列表中的sequence ID Number 2所示；

所述的(Tβ₄)₁₂蛋白的编码基因序列如核苷酸序列表中的sequence ID Number 3所示。

具体的且优选的，所述的基质为水或DMEM液体培养基。

具体的且可选的，该材料中，所述的(Tβ₄)_n蛋白和水的质量之比为0.04:0.98，且交联剂和水的体积之比为0.02:0.98。

具体的且可选的，该材料中，所述的(Tβ₄)_n蛋白、交联剂和水的质量之比为0.04:0.02:1。

具体的且可选的，该材料中，每0.5单位体积的DMEM液体培养基中含有0.02～0.04单位质量的(Tβ₄)_n蛋白和0.0005单位质量的交联剂。

本发明还保护一种如上所述的重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料的制备方法，该方法具体包括如下过程：将交联剂和(Tβ₄)_n蛋白加入基质中，混匀后于4～37℃静置，静置期间观察交联状态，待成胶后即制得重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料。

具体的，所述的(Tβ₄)_n蛋白的制备方法包括：采取定向递归技术构建(Tβ₄)_n蛋白表达载体，采取基因工程技术进行蛋白表达，获得(Tβ₄)_n蛋白。

本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：

(Ⅰ)由于Tβ₄在正常生理条件下无二级结构形成，以单链形式存在并发挥作用，因此多个Tβ₄编码基因串联后表达获得的蛋白仍然具有类似多肽的线性结构，这种线性结构与交联剂的反应活性良好。基于上述理论基础，本发明首次提出采用(Tβ₄)_n蛋白和交联剂制备水凝胶材料，制得的重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料中的(Tβ₄)_n蛋白与细胞的相容性良好，在制备生物材料器械(例如生物材料支架)中具有应用价值。

(Ⅱ)本发明的重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料的制备方法，采取定向递归技术构建(Tβ₄)_n蛋白表达载体，实现了将多个Tβ₄编码基因序列串联在一个编码框中，增加了基因拷贝数，大幅度提高表达量，同时由于表达产物相对分子质量增加，提高了产物表达稳定性。相较于现有的人工表达Tβ₄的方法，本发明的方法能够获得更髙浓度的蛋白；相较于现有的化学合成Tβ₄的方法，本发明的方法工艺简单且产量高。

附图说明

图1为采用BamHI和SacI以及BglII和SacI两对限制性内切酶分别酶切检测(Tβ₄)_n(n＝3，6，9，12)表达载体的核酸电泳图。图1中：M表示DNA Maker III；①-1、③-1、和④-1表示pUC18-(Tβ₄)_n质粒；①-2和①-3表示(Tβ₄)_n目的片段；②-1表示pUC18-(Tβ₄)₆质粒；②-2表示pUC18-(Tβ₄)₆质粒的酶切产物；②-3和②-4表示(Tβ₄)₆目的片段。

图2为初步验证(Tβ₄)_n蛋白(n＝3、6、9、12)是否表达的SDS-PAGE凝胶电泳图。图2中：M表示蛋白分子量Marker；1、3、5、7表示未诱导的总蛋白条带；2、4、6、8表示诱导后的总蛋白条带。

图3为(Tβ₄)_n蛋白(n＝3、6、9、12)粗纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳图。图3中：M表示蛋白分子量Marker；1、4、7、10表示未诱导的总蛋白条带；3、6、9、12表示诱导后的总蛋白条带。

图4为(Tβ₄)_n蛋白(n＝3、6、9、12)凝胶层析纯化后的SDS-PAGE凝胶电泳图。图4中：M表示蛋白分子量Marker；1和2表示纯化后的(Tβ₄)₆蛋白条带；3和4表示纯化后的(Tβ₄)₉蛋白条带；5和6表示纯化后的(Tβ₄)₁₂蛋白条带。

图5为实施例1中(Tβ₄)₁₂蛋白细胞相容性的试验结果。图5中：HUVECs表示人血管内皮细胞，HDF表示人成纤维细胞，MSCs表示间充质干细胞。

图6为实施例2至5中的重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料的宏观形貌图。图6中：Glutaraldehyde表示交联剂戊二醛，Genipin表示交联剂京尼平，Anthocyanin表示交联剂花青素，Transglutaminase表示交联剂谷氨酰胺转移酶。

图7为实施例6至8以及对比例1中，不同浓度的(Tβ₄)_n蛋白在不同时间点的交联状态图。

以下结合实施例对本发明的具体内容作进一步详细解释说明。

具体实施方式

需要说明的是，本发明中的所有用到的培养基、试剂和载体，在没有特殊说明的情况下，均采用本领域已知的培养基、试剂和载体，例如：

DMEM液体培养基采用现有技术中已知的常规的DMEM固体培养基粉末和水配制而成，配制时加入羟乙基哌嗪乙硫磺酸(Hepes)将pH值调节为7.0～7.2。

pUC18克隆载体为现有技术中已知的常规的克隆载体。

本发明中：Tβ₄指的是人胸腺肽β₄。

以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。

实施例1：

本实施例给出一种的重组人胸腺肽多倍体蛋白(Tβ₄)_n的制备方法，该方法具体包括如下步骤：

步骤一，(Tβ₄)₃蛋白的编码基因序列的设计与合成：

以NCBI中已公开的Tβ₄的mRNA序列(基因序列号NM-021109.3)为基础，设计并人工合成(Tβ₄)₃蛋白的编码基因序列，连接在pUC18克隆载体上，获得pUC18-(Tβ₄)₃重组载体。

步骤二，采取定向递归技术构建(Tβ₄)_n蛋白表达载体，采取基因工程技术进行蛋白表达，获得(Tβ₄)_n蛋白：

步骤2.1，采用限制性内切酶BamHI和SacI切割pUC18-(Tβ₄)₃重组载体，经电泳、切胶和纯化回收后，将(Tβ₄)₃蛋白的编码基因插入到pUC18-(Tβ₄)₃的线性化载体中，获得pUC18-(Tβ₄)₆重组载体；重复以上的步骤，获得pUC18-(Tβ₄)_n重组载体。

步骤2.2，采用限制性内切酶BamHI和SacI切割pUC18-(Tβ₄)_n重组载体，经电泳、切胶和纯化回收后，将目的片段(Tβ₄)_n的编码基因插入到线性化表达载体，经转化和筛选后，对单克隆菌落进行鉴定，结果如图1所示。由图1可知，多个(Tβ₄)_n表达载体成功构建。

步骤2.3，将(Tβ4)_n表达载体转化到表达感受态细胞中，挑取单克隆，摇菌至OD值达到0.5～0.6诱导，初步检测(Tβ₄)_n蛋白是否表达，由图2可知，经诱导后，(Tβ₄)₃、(Tβ₄)₆、(Tβ₄)₉和(Tβ₄)₁₂蛋白均在菌体中成功表达。

步骤2.4，确定(Tβ₄)_n蛋白能够表达后，采用发酵罐发酵并获得大量菌体。

步骤三，(Tβ₄)_n蛋白的纯化：

称取步骤2.4获得的菌体，每1g菌体中加入10mL的ddH₂O，充分搅拌，煮沸5min，快速冷却至室温，8000rpm离心15min，收集上清液。采用阴离子色谱柱对上清液进行纯化，纯化后跑胶鉴定，由图3和图4可知，纯化获得的产物为(Tβ₄)_n蛋白。

本实施例中，产物(Tβ₄)_n蛋白为(Tβ₄)₆蛋白、(Tβ₄)₉蛋白、(Tβ₄)₁₂蛋白和(Tβ₄)₃蛋白。(Tβ₄)₆蛋白的编码基因序列如核苷酸序列表中的sequence ID Number 1所示；(Tβ₄)₉蛋白的编码基因序列如核苷酸序列表中的sequence ID Number 2所示；(Tβ₄)₁₂蛋白的编码基因序列如核苷酸序列表中的sequence ID Number 3所示；(Tβ₄)₃蛋白的编码基因序列核苷酸序列表中的sequence ID Number 4所示。

效果验证：

本实施例中，对最终获得的(Tβ₄)₁₂蛋白的细胞相容性均进行了试验，试验方法采用现有技术中已知的细胞迁移率试验方法，试验结果如图5所示。由图5可知，(Tβ₄)₁₂蛋白能促进人的血管内皮细胞、成纤维细胞以及间充质干细胞增殖和迁移，有良好的细胞相容性，因此采用上述(Tβ₄)₁₂蛋白制备的重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料能够用于制备生物材料器械，例如制备生物材料支架。

实施例2：

本实施例给出一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料的制备方法，该方法采用实施例1制得的(Tβ₄)₁₂蛋白。该方法的具体过程包括：

将称量好的戊二醛加入水中，混合均匀后制得戊二醛溶液，该戊二醛溶液中戊二醛的体积分数为0.2％；然后称取0.04g的(Tβ₄)₁₂蛋白，溶于1mL的戊二醛溶液中，充分混匀后取200μL到0.5mL的离心管中，于4℃静置，静置期间观察交联状态，待成胶后即制得重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料。

本实施例中，该水凝胶材料由(Tβ₄)₁₂蛋白、戊二醛和水组成；(Tβ₄)₁₂蛋白和水的质量之比为0.04:0.98，戊二醛和水的体积之比0.02:0.98。该材料的宏观形貌由图6所示。

实施例3：

本实施例给出一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料的制备方法，该方法采用实施例1制得的(Tβ₄)₁₂蛋白。该方法的具体过程包括：

将称量好的京尼平加入水中，混合均匀后制得京尼平溶液，该京尼平溶液中京尼平的质量分数为0.2％；然后称取0.04g的(Tβ₄)₁₂蛋白，溶于1mL的京尼平溶液中，充分混匀后取200μL到0.5mL的离心管中，于4℃静置，静置期间观察交联状态，待成胶后即制得重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料。

本实施例中，该水凝胶材料由(Tβ₄)₁₂蛋白、京尼平和水组成；(Tβ₄)₁₂蛋白、京尼平和水的质量之比为0.04:0.02:1。该材料的宏观形貌由图6所示。

实施例4：

本实施例给出一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料的制备方法，该方法采用实施例1制得的(Tβ₄)₁₂蛋白。该方法的具体过程与实施例3基本相同，区别在于：交联剂为花青素。

本实施例中，该水凝胶材料由(Tβ₄)₁₂蛋白、花青素和水组成；(Tβ₄)₁₂蛋白、花青素和水的质量之比为0.04:0.02:1。该材料的宏观形貌由图6所示。

实施例5：

本实施例给出一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料的制备方法，该方法采用实施例1制得的(Tβ₄)₁₂蛋白。该方法的具体过程与实施例3基本相同，区别在于：交联剂为谷氨酰胺转移酶。

本实施例中，该水凝胶材料由(Tβ₄)₁₂蛋白、谷氨酰胺转移酶和水组成；(Tβ₄)₁₂蛋白、谷氨酰胺转移酶和水的质量之比为0.04:0.02:1。该材料的宏观形貌由图6所示。

实施例6：

本实施例给出一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料的制备方法，该方法采用实施例1制得的(Tβ₄)₆蛋白、(Tβ₄)₉蛋白和(Tβ₄)₁₂蛋白。该方法的具体过程包括：

分别称取0.02g的(Tβ₄)₆蛋白、(Tβ₄)₉蛋白和(Tβ₄)₁₂蛋白，再称取三份0.0005g谷氨酰胺转移酶，然后取三份0.5mL DMEM液体培养基中，将称取好的三种(Tβ₄)_n蛋白分别加入至三份DMEM液体培养基中，再在每份DMEM液体培养基中加入一份谷氨酰胺转移酶，充分混匀后取200μL到0.5mL的离心管中，于4℃静置，静置期间观察交联状态，待成胶后即制得重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料。

本实施例中，该水凝胶材料由(Tβ₄)_n蛋白、谷氨酰胺转移酶和水组成，其中n取6、9或12；该材料中，每0.5mL的DMEM液体培养基中含有0.02g的(Tβ₄)_n蛋白和0.0005g的谷氨酰胺转移酶。该材料的宏观形貌由图6所示。

实施例7：

本实施例给出一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料的制备方法，该方法采用实施例1制得的(Tβ₄)_n蛋白。该方法的具体过程与实施例6基本相同，区别在于：(Tβ₄)₆蛋白、(Tβ₄)₉蛋白和(Tβ₄)₁₂蛋白的质量均为0.03g。

本实施例中，该水凝胶材料由(Tβ₄)_n蛋白、谷氨酰胺转移酶和水组成，其中n取6、9或12；该材料中，每0.5mL的DMEM液体培养基中含有0.03g的(Tβ₄)_n蛋白和0.0005g的谷氨酰胺转移酶。该材料的宏观形貌由图7所示。

实施例8：

本实施例给出一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料的制备方法，该方法采用实施例1制得的(Tβ₄)₆蛋白、(Tβ₄)₉蛋白和(Tβ₄)₁₂蛋白。该方法的具体过程与实施例6基本相同，区别在于：(Tβ₄)₆蛋白、(Tβ₄)₉蛋白和(Tβ₄)₁₂蛋白的质量均为0.04g。

本实施例中，该水凝胶材料由(Tβ₄)_n蛋白、谷氨酰胺转移酶和水组成，其中n取6、9或12；该材料中，每0.5mL的DMEM液体培养基中含有0.04g的(Tβ₄)_n蛋白和0.0005g的谷氨酰胺转移酶。该材料的宏观形貌由图7所示。

对比例1：

本对比例给出一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料的制备方法，该方法采用实施例1制得的(Tβ₄)₆蛋白、(Tβ₄)₉蛋白和(Tβ₄)₁₂蛋白。该方法的具体过程与实施例6基本相同，区别在于：(Tβ₄)₆蛋白、(Tβ₄)₉蛋白和(Tβ₄)₁₂蛋白的质量均为0.01g。

本对比例中，如图7所示，由于(Tβ₄)_n蛋白的加入量不足，导致未能成胶，即最终未制得重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料。

本发明中，实施例6至8以及对比例1的试验结果表明，不同浓度的(Tβ₄)_n蛋白在谷氨酰胺转移酶的作用下，在4℃交联不同时间均能够获得水凝胶。其中随着(Tβ₄)_n蛋白倍数n的增加，交联时间在缩短；而且随着蛋白浓度的增大，交联时间在缩短。

Claims (8)

1.一种重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料，其特征在于，该材料由重组人胸腺肽多倍体蛋白、交联剂和基质组成；所述的重组人胸腺肽多倍体蛋白记作(Tβ₄)_n蛋白，其中n取3的整数倍；

所述的交联剂为戊二醛、京尼平、花青素或谷氨酰胺转移酶。

2.如权利要求1所述的重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料，其特征在于，所述的(Tβ₄)_n蛋白为(Tβ₄)₆蛋白、(Tβ₄)₉蛋白或(Tβ₄)₁₂蛋白；

所述的(Tβ₄)₆蛋白的编码基因序列如核苷酸序列表中的sequence ID Number 1所示；

所述的(Tβ₄)₉蛋白的编码基因序列如核苷酸序列表中的sequence ID Number 2所示；

所述的(Tβ₄)₁₂蛋白的编码基因序列如核苷酸序列表中的sequence ID Number 3所示。

3.如权利要求1所述的重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料，其特征在于，所述的基质为水或DMEM液体培养基。

4.如权利要求3所述的重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料，其特征在于，该材料中，所述的(Tβ₄)_n蛋白和水的质量之比为0.04:0.98，且交联剂和水的体积之比为0.02:0.98。

5.如权利要求3所述的重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料，其特征在于，该材料中，所述的(Tβ₄)_n蛋白、交联剂和水的质量之比为0.04:0.02:1。

6.如权利要求3所述的重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料，其特征在于，该材料中，每0.5单位体积的DMEM液体培养基中含有0.02～0.04单位质量的(Tβ₄)_n蛋白和0.0005单位质量的交联剂。

7.一种如权利要求1至6任一项所述的重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料的制备方法，其特征在于，该方法具体包括如下过程：将交联剂和(Tβ₄)_n蛋白加入基质中，混匀后于4～37℃静置，静置期间观察交联状态，待成胶后即制得重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料。

8.如权利要求7所述的重组人胸腺肽多倍体蛋白水凝胶材料的制备方法，其特征在于，所述的(Tβ₄)_n蛋白的制备方法包括：采取定向递归技术构建(Tβ₄)_n蛋白表达载体，采取基因工程技术进行蛋白表达，获得(Tβ₄)_n蛋白。

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