CN115612692A - 一种调控甜菊糖苷合成的转录因子SrMYB1及其表达蛋白和应用 - Google Patents

一种调控甜菊糖苷合成的转录因子SrMYB1及其表达蛋白和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种调控甜菊糖苷合成的转录因子SrMYB1及其表达蛋白和应用，属于植物基因工程技术领域。所述的转录因子SrMYB1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。在烟草表皮细胞中的亚细胞定位表明，该基因编码的蛋白主要定位在细胞核；酵母活性实验显示该蛋白具有转录激活活性。酵母单杂交实验表明SrMYB1可以结合在甜菊糖苷合成关键基因SrUGT76G1的启动子上。启动子活性及转基因实验均显示SrMYB1显著抑制SrUGT76G1的转录。基于这一特性，可为甜菊糖苷品质调控、甜菊新品种培育提供一定的参考借鉴。

Description

一种调控甜菊糖苷合成的转录因子SrMYB1及其表达蛋白和 应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种调控甜菊糖苷合成的转录因子SrMYB1及其表达蛋白和应用。
背景技术
甜菊是菊科多年生草本植物，其叶片中富含的甜菊糖苷具有高甜度（约为蔗糖的300-400倍）、低热量（约为蔗糖的1/300）、预防和辅助治疗高血压、糖尿病和肿瘤等疾病功效，被广泛用于食品、饮料和医药等领域，甜菊也被誉为继甘蔗和甜菜之后最具发展前景的糖料作物。
作为甜菊中最为重要的一类次生代谢化合物，甜菊糖苷的合成代谢途径及其调控基因一直是该领域的研究热点。经过几十年的研究，目前已知甜菊糖苷的合成前体物质甜菊醇是经MEP途径生成，然后再通过一系列糖苷转移酶基因在其C-13和C-19位添加不同种类和数量的糖基生成各类甜菊糖苷。目前已发现30多种甜菊糖苷，其中ST和RA苷含量最高，可占总糖苷含量的75-90%，相比于ST苷，RA苷口感更好，也是目前市场上主要使用的糖苷类型。随着糖苷研究的不断深入，近些年人们发现了一种口感最接近蔗糖的糖苷RM，然而其在甜菊叶片中的含量很很低（约占总糖苷的0.4-0.5%），因此如何提高甜菊中优质糖苷含量成为了一个亟待解决的问题。在通过对糖苷路径糖基转移酶基因的研究，已经发现SrUGT76G1基因不但可以促进ST苷向RA苷的转变，还可以促进RD苷向RM苷的转变，因此SrUGT76G1基因成为糖苷品质改良的一个十分重要基因。寻找其上游调控因子也将影响甜菊叶片中优质糖苷含量。
MYB类转录因子是植物中数量最大，功能最多的转录因子家族之一。该家族蛋白均含有一个或多个由50-53个保守氨基酸组成的保守结构域-MYB结构域。根据MYB结构域的数量，可将MYB转录因子家族分为1R (R1/2，R3 MYB)，2R (R2R3 MYB)，3R (R1R2R3 MYB)和4R(4个R1/R2 like)四种类型。其中2R类型的MYB蛋白占植物MYB蛋白的绝大多数。MYB转录因子可激活或者抑制下游基因的表达，参与植物的生长发育、胁迫应答和次生代谢等多种生命进程， 但其在调控甜菊糖苷生物合成方面未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种调控甜菊糖苷生物合成的转录因子基因SrMYB1及其表达蛋白和应用。本发明为调控甜菊糖苷合成提供了可选择的候选基因，以后可通过在甜菊体内抑制表达该基因达到促进优质糖苷合成，具有较好的应用前景。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
一种甜菊SrMYB1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述的甜菊SrMYB1基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
用于克隆获取SrMYB1基因的引物对，该引物对的引物序列为：
SrMYB1-F: CTTAGCTTCCAGTCTGCCCC；
SrMYB1-R: CCCTCTAGAAGGTTCACACCAG。
含有所述甜菊SrMYB1基因的载体或宿主菌。
本发明还提供了一种转录因子SrMYB1在调控甜菊糖苷生物合成中的应用。
进一步改进在于，所述调控甜菊糖苷生物合成指的是调控甜菊RA和RM苷合成关键SrUGT76G1基因表达。
进一步改进在于，所述转录因子SrMYB1通过抑制SrUGT76G1转录减少SrUGT76G1的表达。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明提供了一个新的SrUGT76G1的调控基因SrMYB1，该基因全长1074 bp, 编码357个氨基酸残基。亚细胞定位研究表明，该蛋白主要定位在细胞核中；酵母激活实验显示该蛋白具有转录激活活性；酵母单杂交实验表明SrMYB1可以结合SrUGT76G1基因启动子序列；启动子活性及转基因实验表明SrMYB1显著抑制SrUGT76G1的表达，表明SrMYB1能抑制甜菊RA和RM苷合成关键基因SrUGT76G1的转录。因此甜菊SrMYB1基因及其编码蛋白可以应用于甜菊糖苷含量及品质的遗传改良。
附图说明
图1为SrMYB1蛋白氨基酸序列分析（A）及系统进化树图（B）；
图2为SrMYB1蛋白在烟草表皮细胞中的定位图；
图3为SrMYB1的转录活性分析图；
图4为SrMYB1结合SrUGT76G1启动子的分析图；
图5为SrMYB1调控SrUGT76G1表达的分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下实施例中，未详细叙述的操作均为常规生物学实验操作，可参照分子生物学实验手册以及现有公开的期刊文献等进行。
植物材料：
基因克隆所用材料为本实验室自主选育的甜菊品种‘中山6号’叶片，采集于江苏省中国科学院植物研究所甜菊种质资源圃。亚细胞定位和启动子LUC实验所采用的烟草为本氏烟草，培养条件为光周期16 h光照/8 h黑暗，昼夜温度为23℃/18℃。
菌株和载体：
大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105感受态菌株均购自维地（上海）公司。酵母AH109和EGY48菌株和pGBKT7及pGADT7载体均购自宝日医生物技术（北京）有限公司（TaKaRa，Dalian）。亚细胞定位载体pCAMBIA1305-GFP、酵母单杂交载体pB42AD、pLacZi以及启动子活性验证载体pGreenII 0800-LUC载体均保存于实验室。
实施例1：
（1）甜菊SrMYB1基因克隆
采用TaKaRa公司的Trizol试剂并依据相关说明书提取甜菊叶片的总RNA，然后利用该公司的PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录成cDNA。根据甜菊转录组及基因组数据库进行比对，筛选得到SrMYB1的基因全长序列，利用基因全长引物进行PCR扩增，克隆SrMYB1所用引物如下：
SrMYB1-F: CTTAGCTTCCAGTCTGCCCC；
SrMYB1-R: CCCTCTAGAAGGTTCACACCAG。
扩增产物利用TaKaRa公司的凝胶回收试剂盒回收纯化，再利用添加接头的引物对回收片段进行扩增，扩增引物如下（小写字母为载体同源臂）：
SrMYB1-GFP-F: cggagctagctctagaATGGGAAGACACTCTTGT；
SrMYB1-GFP-R: tcgagacgtctctagaTGAATATTGCCCATAGCT。
扩增得到的产物经琼脂糖凝胶电泳后继续利用TaKaRa公司的凝胶回收试剂盒回收纯化。另外利用TaKaRa公司的XbaI快切酶对pCAMBIA1305空载进行单酶切，单酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后也利用TaKaRa公司的凝胶回收试剂盒回收纯化。片段和载体纯化的产物利用诺唯赞生物科技有限公司（南京）的重组酶进行重组反应。重组产物转化大肠杆菌DH5α菌株，挑菌后委托测序公司（通用）进行测序。测序获得了SrMYB1基因的开放阅读框1074bp, 编码357个氨基酸残基。同时获得构建好的SrMYB1亚细胞定位载体pCAMBIA1305-SrMYB1-GFP。
将SrMYB1蛋白序列提交NCBI进行结构域预测并利用DNAMAN软件进行多重序列比对发现其具有两个MYB结构域属于R2R3类型的MYB转录因子（图1A）。利用MEGA 5.0软件构建其与其他物种同源基因的系统进化树（N-J邻接法），结果显示其与菊科的莴苣、向日葵的MYB61及青蒿的MYB1亲缘关系较近（图1B）。
（2）SrMYB1蛋白亚细胞定位分析
将构建好的pCAMBIA1305-SrMYB1-GFP载体转化农杆菌感受态EHA105细胞，然后注射本式烟草表皮细胞，正常培养2-3天后，切下注射部位在激光共聚焦显微镜（Leica TCSSP5）下观察荧光发生情况。结果显示GFP空载在细胞核和细胞质都有定位，而SrMYB1-GFP发出的荧光信号主要集中在细胞核（图2），表明SrMYB1蛋白主要定位在细胞核，这与其作为转录因子的功能相符。
（3）SrMYB1转录激活活性分析
利用加接头的引物，对SrMYB1的全长序列进行克隆，另外利用TaKaRa公司的EorRI和PSTI快切酶对pGBKT7空载进行双酶切，基因扩增产物和酶切产物均进行琼脂糖凝胶电泳后利用TaKaRa公司的胶回收试剂盒进行回收纯化，回收后的片段及载体利用诺唯赞的重组酶进行重组反应。重组产物转化大肠杆菌DH5α菌株，挑菌后委托测序公司（通用）进行测序得到正确构建。
构建好的pGBKT7-SrMYB1及pGBKT7空载体分别和pGADT7空载利用Clontech公司的酵母转化试剂盒共同转化酵母感受态细胞AH109，然后涂布于SD/-Trp-Leu酵母缺陷培养基上，30℃倒置培养3天左右后，挑取单克隆溶于0.9 % NaCl溶液中，分不同浓度梯度点在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-His-Ade酵母缺陷培养基上，30℃倒置培养。结果显示转化进SrMYB1-BD的酵母能够在SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上生长而转化BD空载体的酵母则不能（图3），以上结果表明SrMYB1具有转录激活活性。
以上加接头的引物序列具体如下（小写字母为载体同源臂）：
SrMYB1-BD-F: catggaggccgaattcATGGGAAGACACTCTTGT；
SrMYB1-BD-R: tagttatgcggccgctgcagCTATGAATATTGCCCATA。
（4）SrMYB1与SrUGT76G1启动子序列结合分析
利用加接头的引物对SrUGT76G1启动子序列和SrMYB1全长片段进行扩增，然后分别利用TaKaRa公司的EorRI和XhoI快切酶对pB42AD和pLacZi空载进行单酶切，基因扩增产物和酶切产物均进行琼脂糖凝胶电泳后利用TaKaRa公司的胶回收试剂盒进行回收纯化，回收后的片段及载体利用诺唯赞的重组酶进行重组反应。重组产物转化大肠杆菌DH5α菌株，挑菌后委托测序公司（通用）进行测序得到正确构建。构建成功的pB42AD-SrMYB1质粒和pLacZi-proSrUGT76G1质粒组合按照Clontech酵母转化试剂盒，共同转化进酵母感受态细胞EGY48，然后涂布于SD/-Trp-Ura缺陷培养基上30℃倒置培养3天左右，然后转移到含X-gal 80 mg/L的SD/-Trp-Ura缺陷培养基上直至有蓝色显现。实验结果显示转化进SrMYB1和SrUGT76G1启动子的酵母能够在含X-gal的缺陷培养基上显蓝（图4），表明SrMYB1能够和SrUGT76G1启动子结合。
以上接头引物序列具体如下（小写字母为载体同源臂）：
SrMYB1-42AD-F: tgcctctcccgaattcATGGGAAGACACTCTTGT；
SrMYB1-42AD-R: cgagtcggccgaattcCTATGAATATTGCCCATA；
SrUGT76G1-Laczi-F: atctgtcgacctcgagAGTCTCCTTCTGTATTGA；
SrUGT76G1-LacZi-R: gagcacatgcctcgagAATATTATTCTCCGGCGT。
（5）SrMYB1调控SrUGT76G1表达分析
利用加接头引物对SrUGT76G1启动子序列进行扩增，另外利用TaKaRa公司的NcoI快切酶对pGreenII 0800-LUC空载进行单酶切，基因扩增产物和酶切产物均进行琼脂糖凝胶电泳后利用TaKaRa公司的胶回收试剂盒进行回收纯化，回收后的片段及载体利用诺唯赞的重组酶进行重组反应。重组产物转化大肠杆菌DH5α菌株，挑菌后委托测序公司（通用）进行测序得到正确构建。构建好的pGreenII 0800-proSrUGT76G1-LUC载体和做亚细胞定位的pCAMBIA1305-SrMYB1和pCAMBIA1305空载体分别瞬时转化本氏烟草表皮细胞，正常培养3天左右后，取下注射叶片喷施LUC荧光显色物质然后在Tanon 5200仪器上观察荧光显色情况。结果显示转化进SrUGT76G1启动子和SrMYB1质粒的烟草组织荧光强度要远弱于转化进SrUGT76G1启动子序列和pCAMBIA1305空载的（图5A-B）。另外根据已报道的甜菊转基因方法（Wu et al., 2020），将构建好的pCAMBIA1305-SrMYB1-GFP及GFP空载转化甜菊愈伤，发现相比于对照，转化进SrMYB1基因的抗性愈伤中SrMYB1表达量显著提高，而SrUGT76G1表达量则显著降低，以上LUC及转基因实验结果均表明SrMYB1可以显著抑制SrUGT76G1的表达。这为以后构建SrMYB1表达抑制载体转化甜菊从而促进SrUGT76G1表达，进而提高甜菊优质糖苷含量奠定基础。
以上接头引物序列具体如下（小写字母为载体同源臂）：
SrUGT76G1-LUC-F: agatcgaattccatggAGTCTCCTTCTGTATTGA；
SrUGT76G1-LUC-R: ttggcgtcttccatggAATATTATTCTCCGGCGT。
序列表
<110> 江苏省中国科学院植物研究所
<120> 一种调控甜菊糖苷合成的转录因子SrMYB1及其表达蛋白和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1074
<212> DNA
<213> 甜叶菊(Stevia rebaudiana)
<400> 1
atgggaagac actcttgttg ttacaaacaa aagctaagaa aaggtctttg gtcccctgaa 60
gaagatgaaa aactcatcag acacatcacc aaattcgggc atggttgctg gagctccgtt 120
cctaaacttg ccggactcga aagatgcggt aaaagttgca ggctcagatg gatcaattac 180
ctccggcccg atttgaaacg aggcacattc tctcctcaag aagagaaatt aatcatcgaa 240
ttacacgcgg ttcttggaaa caagtggtct caaattgcag ctcagttgcc tggaagaact 300
gataacgaga taaaaaactt atggaattca acaatcaaga agaagttaag acaaagaggg 360
attgatccca acactcataa accgctatcc gaggtacacg atgatcataa agccccatcc 420
gggagtaacg agaaaaactc acaagactcg tataacctcg acgacaaacc taaaccgaat 480
gctgccgcat catcttactc gctcatcgac agttcaccac ccgcaacaca cgaattcttt 540
ctcaaccgat ttgtaacatc tcacgagaac gcgatcaaac ccgattccca ccaccaactc 600
gccggattcc ttcctttcgg ttacaaccaa caacaacaac cacaaccaga acccaatgat 660
cttttctata ataaccattc caaatcgcca tccgagctga ttccggagtt taacaattct 720
atttctaact cattactctc tgctcctccg accaaccata ataataactg ggggagtaat 780
aatagtaata ataattgcaa caacagtggc ttttattcaa caaatagtgg atatcattca 840
tgggggttga gtgatggaat aaaaactcaa aaccaaattc aaggtgttga agaacaagat 900
tacatgaaat ggaacgatca atatcttcca tttttgatgg ggaaatcaac gattgaaagt 960
aaacctgaag tcaacttcgg ggtcaaccat gaactgtatc atggacaaca aagtgtggaa 1020
acttataata agaattttca gaggattgca acaagctatg ggcaatattc atag 1074
<210> 2
<211> 357
<212> PRT
<213> 甜叶菊(Stevia rebaudiana)
<400> 2
Met Gly Arg His Ser Cys Cys Tyr Lys Gln Lys Leu Arg Lys Gly Leu
1 5 10 15
Trp Ser Pro Glu Glu Asp Glu Lys Leu Ile Arg His Ile Thr Lys Phe
20 25 30
Gly His Gly Cys Trp Ser Ser Val Pro Lys Leu Ala Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp
50 55 60
Leu Lys Arg Gly Thr Phe Ser Pro Gln Glu Glu Lys Leu Ile Ile Glu
65 70 75 80
Leu His Ala Val Leu Gly Asn Lys Trp Ser Gln Ile Ala Ala Gln Leu
85 90 95
Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Leu Trp Asn Ser Thr Ile
100 105 110
Lys Lys Lys Leu Arg Gln Arg Gly Ile Asp Pro Asn Thr His Lys Pro
115 120 125
Leu Ser Glu Val His Asp Asp His Lys Ala Pro Ser Gly Ser Asn Glu
130 135 140
Lys Asn Ser Gln Asp Ser Tyr Asn Leu Asp Asp Lys Pro Lys Pro Asn
145 150 155 160
Ala Ala Ala Ser Ser Tyr Ser Leu Ile Asp Ser Ser Pro Pro Ala Thr
165 170 175
His Glu Phe Phe Leu Asn Arg Phe Val Thr Ser His Glu Asn Ala Ile
180 185 190
Lys Pro Asp Ser His His Gln Leu Ala Gly Phe Leu Pro Phe Gly Tyr
195 200 205
Asn Gln Gln Gln Gln Pro Gln Pro Glu Pro Asn Asp Leu Phe Tyr Asn
210 215 220
Asn His Ser Lys Ser Pro Ser Glu Leu Ile Pro Glu Phe Asn Asn Ser
225 230 235 240
Ile Ser Asn Ser Leu Leu Ser Ala Pro Pro Thr Asn His Asn Asn Asn
245 250 255
Trp Gly Ser Asn Asn Ser Asn Asn Asn Cys Asn Asn Ser Gly Phe Tyr
260 265 270
Ser Thr Asn Ser Gly Tyr His Ser Trp Gly Leu Ser Asp Gly Ile Lys
275 280 285
Thr Gln Asn Gln Ile Gln Gly Val Glu Glu Gln Asp Tyr Met Lys Trp
290 295 300
Asn Asp Gln Tyr Leu Pro Phe Leu Met Gly Lys Ser Thr Ile Glu Ser
305 310 315 320
Lys Pro Glu Val Asn Phe Gly Val Asn His Glu Leu Tyr His Gly Gln
325 330 335
Gln Ser Val Glu Thr Tyr Asn Lys Asn Phe Gln Arg Ile Ala Thr Ser
340 345 350
Tyr Gly Gln Tyr Ser
355

Claims (7)

1.一种甜菊SrMYB1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。
2.权利要求1所述的甜菊SrMYB1基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
3.用于克隆获取如权利要求1所述转录因子基因SrMYB1的引物对，该引物对的序列为：
SrMYB1-F: CTTAGCTTCCAGTCTGCCCC；
SrMYB1-R: CCCTCTAGAAGGTTCACACCAG。
4.含有权利要求1所述甜菊SrMYB1基因的载体或宿主菌。
5.一种如权利要求1所述转录因子SrMYB1在调控甜菊糖苷生物合成中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述调控甜菊糖苷生物合成指的是调控糖苷生物合成过程中SrUGT76G1基因表达。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述转录因子SrMYB1通过抑制SrUGT76G1基因转录从而抑制其表达。
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