KR102172970B1 - 감마선 조사 혈청을 이용한 중간엽 줄기세포의 배양방법 - Google Patents

감마선 조사 혈청을 이용한 중간엽 줄기세포의 배양방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102172970B1
KR102172970B1 KR1020190060757A KR20190060757A KR102172970B1 KR 102172970 B1 KR102172970 B1 KR 102172970B1 KR 1020190060757 A KR1020190060757 A KR 1020190060757A KR 20190060757 A KR20190060757 A KR 20190060757A KR 102172970 B1 KR102172970 B1 KR 102172970B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
vitamin
fbs
gamma
stem cells
cells
Prior art date
Application number
KR1020190060757A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190134522A (ko
Inventor
라정찬
강성근
김은영
Original Assignee
주식회사 알바이오
주식회사 네이처셀
라정찬
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 알바이오, 주식회사 네이처셀, 라정찬 filed Critical 주식회사 알바이오
Priority to US16/422,525 priority Critical patent/US11932874B2/en
Priority to JP2019098293A priority patent/JP6920369B2/ja
Publication of KR20190134522A publication Critical patent/KR20190134522A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102172970B1 publication Critical patent/KR102172970B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2529/00—Culture process characterised by the use of electromagnetic stimulation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 감마선 조사 혈청을 이용한 중간엽 줄기세포의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 감마선 조사 혈청 및 항산화제가 포함된 배양배지를 이용하여 줄기세포의 부착력 및 증식율을 향상시킬 수 있는 중간엽 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명의 중간엽 줄기세포의 배양방법은 오염원으로부터 안전하지만 세포의 부착 및 증식효율을 떨어뜨리는 감마멸균 FBS를 이용하여 줄기세포를 배양시 줄기세포의 부착율 및 증식율을 회복시킬 수 있으므로, 세포치료용 줄기세포의 제조에 유용하다.

Description

감마선 조사 혈청을 이용한 중간엽 줄기세포의 배양방법 {Method for Culturing Mesenchymal Stem Cells Using Gamma Irradiated Serum}
본 발명은 감마선 조사 혈청을 이용한 중간엽 줄기세포의 배양방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 감마선 조사 혈청 및 항산화제가 포함된 배양배지를 이용하여 줄기세포의 부착력 및 증식율을 향상시킬 수 있는 중간엽 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다.
줄기세포 (stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포 (totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포 (multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.
만능 줄기세포 (totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며, 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell)는 외배엽, 중배엽, 내배엽 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4~5일 후 나타나는 배반포 (blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴 (inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다분화능(또는 다능성) 줄기세포 (multipotent stem cell)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 중간엽 줄기세포라 한다.
중간엽 줄기세포 (Rebecca S. Y. Wong, et al., J Biomed Biotechnol 24:2011, 2011)는 심장 질환, 골형성 부전증 및 척수 손상과 같은 다양한 질병 상태에서 세포 기반 치료에 사용되어 왔으며, 그 결과가 주목되고 있다. 이러한 중간엽 줄기세포를 줄기세포의 성능을 유지하면서 대량으로 얻기 위해서는 그 배양방법이 중요하다.
지방줄기세포 (ADSC; adipose-derived stem cells)의 배양과 유지에는 대부분 동물의 혈청, 특히 우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum)이 포함된 배지가 이용된다. FBS는 다양한 종류의 성장인자 (growth factors), 단백질, 비타민류, 호르몬을 포함하고 있어서 (Wassman S. J et al., Dev Biol Stand 99:3-8, 1999), 줄기세포배양에 사용하는 것이 비교적 적합하지만, 동물유래 원료는 세포 배양용으로 사용하기에 위험 요소들을 완전히 배제할 수는 없다.
이러한 위험요소를 제거하기 위해, 최근에는 FBS를 첨가하지 않는 무혈청 배지 (serum-free media)가 다양하게 개발되어 판매되고 있으며 세포의 종류에 따라 적당한 무혈청 배지를 선정하여 사용할 수 있다. 그러나, 무혈청 배지를 이용한 배양 효율은 혈청을 첨가하여 배양했을 때보다 매우 낮은 경우가 대부분 (Mannello F. et al., Stem Cells. 25(7):1603-9, 2007)이며, 이를 보완하기 위하여 추가로 각종 첨가제를 처리하여야 한다. 이렇듯 무혈청 배지에서의 세포는 증식율이 상대적으로 낮고 무혈청 배지에 첨가되는 여러가지 성장인자와 첨가제들로 인해 비용이 상당한 부담이다.
생산과정에서의 비용 부담 및 세포 증식 저하 문제를 해결할 수 있는 방법 중 하나로 감마선 조사 멸균 FBS를 사용할 수 있다. 감마선, 전자선 및 X-선을 활용한 방사선 조사 기술은 제품의 완전한 포장 상태에서 온도의 상승 없이 유해성분이 남지 않는 냉온살균, 살충 기술이다. 이러한 효과는 방사선의 직접 및 간접작용을 통하여 세포의 DNA, 단백질 또는 지질과 같은 세포 구성성분에 손상을 줌으로써 일어난다. 감마선 조사는 멸균여과 후에도 존재할 수 있는 바이러스 및 마이코플라스마의 범위를 더 줄이거나 없앨 수 있다. 따라서, 전세계 의약품 공정에 사용되고, 동물유래 원자재에 대해서 감마선 조사 멸균을 권장하는 추세이다.
하지만, 감마선에 노출된 단백질은 가역적 또는 비가역적으로 변화하며 (조용식, 충남대학교 학위논문, 1999), 감마선 조사 후 생성되는 자유라디탈은 여러가지 성장인자를 손상시킨다. 즉, 감마선 조사에 의해 FBS 내의 성장인자가 파괴될 수 있는 가능성이 존재한다.
이에, 본 발명자들은 감염 등의 위험요소가 배제되어 세포치료제로 사용하기에 안전한 줄기세포를 제조하고자 예의 노력한 결과, 감마선 조사 혈청 및 항산화제가 포함된 배지에서 줄기세포를 배양하면 부착력 및 증식율이 향상되어 세포치료제로 사용하기에 우수한 줄기세포를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 감마선을 조사한 혈청 및 항산화제가 포함된 배양배지를 이용하여 줄기세포의 부착력 및 증식율을 향상시킬 수 있는 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum)에 감마선을 조사하는 단계; (b) 상기 감마선 조사 우태아혈청을 줄기세포 배양배지에 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 배양배지를 이용하여 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 배양방법을 제공한다.
본 발명의 중간엽 줄기세포의 배양방법은 오염원으로부터 안전하지만 세포의 부착 및 증식효율을 떨어뜨리는 감마멸균 FBS를 이용하여 줄기세포를 배양시 줄기세포의 부착율 및 증식율을 회복시킬 수 있으므로, 세포치료용 줄기세포의 제조에 유용하다.
도 1은 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 후처리군)를 보여주는 것이다.
도 2는 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 4일간 배양 (비타민 C 후처리군)후, 세포수 및 세포 doubling time을 조사한 것이다.
도 3은 비타민 C 전처리 후 감마선 조사로 멸균한 FBS를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 전처리군)와 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 후처리군)를 비교한 것이다.
도 4는 비타민 C 전처리 후 감마선 조사로 멸균한 FBS를 첨가한 배지 (비타민 C 전처리군) 또는 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지 (비타민 C 후처리군)에서 4일간 배양 후, 세포수 및 세포 doubling time을 조사한 것이다.
도 5는 비타민 C 전처리 후 감마선 조사로 멸균한 FBS를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 전처리군)와 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 후처리군)의 계대배양에 도달하는 기간을 확인한 것이다.
도 6은 비타민 C 전처리 후 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 전처리군), 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 후처리군) 및 비타민 C 전처리 후 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 4일간 배양한 줄기세포 (비타민 C 전+후처리군)를 비교한 것이다.
도 7은 비타민 C 전처리 후 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 전처리군), 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 후처리군) 및 비타민 C 전처리 후 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 4일간 배양한 줄기세포 (비타민 C 전+후처리군)의 세포수을 비교한 것이다.
도 8은 비타민 C 전처리 후 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 전처리군), 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 후처리군) 및 비타민 C 전처리 후 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 4일간 배양한 줄기세포 (비타민 C 전+후처리군)의 세포 크기를 비교한 것이다.
도 9는 비타민 C 전처리 후 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 전처리군), 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 후처리군) 및 비타민 C 전처리 후 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 4일간 배양한 줄기세포 (비타민 C 전+후처리군)의 세포 생존율을 비교한 것이다.
도 10은 비타민 C 전처리 후 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 전처리군), 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 후처리군) 및 비타민 C 전처리 후 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 4일간 배양한 줄기세포 (비타민 C 전+후처리군)의 세포 doubling time을 비교한 것이다.
도 11은 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 후처리군)의 세포 부착력을 확인한 것으로, 도 11a는 passage 1, 도 11b는 passage 2, 도 11c는 passage 3의 세포이다.
도 12는 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 후처리군)의 줄기세포 CD 마커 발현을 FACS로 분석한 것이다.
도 13은 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 후처리군)의 지방세포 분화 유도를 보여주는 것이다.
도 14는 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 후처리군)의 골세포 분화 유도를 보여주는 것이다.
도 15는 30kGy 감마선 조사로 멸균한 FBS 및 비타민 C를 첨가한 배지에서 배양한 줄기세포 (비타민 C 후처리군)의 연골세포 분화 유도를 보여주는 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 열 불활성화 (heat inactivation)나 여과로는 해결할 수 없는 동물 유래 FBS의 위험요소를 완전히 배제할 수 있는 감마멸균 우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum)를 이용하여 세포치료용 줄기세포를 제조하기 위하여, 감마선 조사로 인해 생성된 자유라디칼을 항산화제를 이용하여 해결할 수 있었다. 즉, FBS의 감마선 조사로 인해 발생한 줄기세포의 부착 및 증식에 대한 악영향을 항산화제를 이용함으로써 회복할 수 있었다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a) 우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum)에 감마선을 조사하는 단계; (b) 상기 감마선 조사 우태아혈청을 줄기세포 배양배지에 첨가하는 단계; 및 (c) 상기 배양배지를 이용하여 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 우태아혈청은 항산화제가 포함되거나 또는 포함되지 않는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 항산화제는 0.025% 내지 2%로 첨가되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 1%인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
혈청 단백질은 지질, 효소류 등의 영양소를 세포내로 운반하는 carrier 역할을 하기도 한다 (Stein A et al., Biotechniques 43:228-229,2007; Sterodimas A et al., J Plast Reconstr Aesthet Surg 63:1886-1892, 2010). 일반적으로 세포배양용 배지는 비타민류, 무기염류, 호르몬류, 성장인자를 포함하며 세포에 따라 미량으로 요구되는 영양소의 공급을 위해 FBS가 첨가된다.
감마선 조사 혈청 (Gamma Irradiated Fetal Bovine Serum)은 바이러스 및 백신 생산, 생물 약제 생산 공정 및 진단 제품 생산과 같이 업계에서 설정된 가장 엄격한 무균 요구 사항에 적합하다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 줄기세포 배양배지는 항산화제가 포함된 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 항산화제는 0.025% 내지 2%로 첨가되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 1%인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
배양의 효율을 증가시키기 위한 첨가제는 기본배지에 포함되어 있는 비타민류, 무기염류, 호르몬류 등을 보다 다양한 종류로 보충하거나 고농도로 보충하여 기본배지의 영양성분을 강화하게 되며 세포에 따라서는 특정한 성장인자를 첨가하기도 한다 (Maurer HR et al., Send to Cytotechnology. 5(1):1, 1991).
본 발명에 있어서, 상기 항산화제는 비타민 C (ascorbic acid), 셀레늄, 코엔자임 Q10, 비타민 E, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DHA(docosahexanoic acid)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
Krumahar 등은 감마선 조사된 락탈부민 (lactabumin)의 용해도에 미치는ascorbic acid의 효과에 대하여 보고한 바 있다 (Krumhar et al., J. Food Sci . 55:1127-1132, 1990). 방사선 조사에 의한 단백질 손상과 관련하여 산소의 효과는 잘 알려진 사실이며 (Singh, A et al., Methods in E nzymology, 186:686-696, 1990 ), 산소는 방사선 조사가 일으키는 생물학적 손상을 촉진하기 때문에 항산화제는 방사선으로 인한 손상을 억제하는 물질이 될 수 있다 (Bienvenu, P et al., Adv. Exp . Med . Biol. 264:291-300, 1990). 실제로 방사선에 의한 생물학적 손상을 억제하는 물질의 대부분이 항산화제이다 (Bienvenu, P et al., Adv . Exp . Med . Biol. 264:291-300, 1990). Ascorbic acid는 필수 비타민이며 항산화제로서, 토코페롤 (tozcopherol)과 함께 동물실험을 통한 방사선 손상 억제 연구에서 많이 사용되어져 왔다 (El-Nahas S. M et al., Mutat . Res. 301:143-147, 1993; O 'Connor M. K et al., Br. J. Radiol . 50:587-591, 1977; Niki, E et al., Ann. N. Y. Acad. Sci . 498:186-199, 1987; Niki, E et al., J. Biol. Chem. 259:4177-4182, 1984; Rana, K et al., Indian J. Exp . Biol. 31:847-849, 1993). Ascorbic acid는 자유라디탈과 반응하며 방사선 조사에 의하여 쉽게 산화되고 (Woods, R. J et al., Applied radiation chemistry pp443-447, 1994), dehydroa scorbic acid로 산화될 때 반응성이 강해지는 것으로 알려졌으며 (Kacem, B et al., J. Food Sci. 52:1665-1672, 1987), 라디칼 형성에 대한 ascorbic acid의 효과적인 방사선 손상억제는 ascorbic acid가 단백질 라디칼을 소거한 관점에서 이해된다 (조용식, 충남대학교 학위논문, 1999).
본 발명의 용어 "비타민 C 전처리" 또는 "AA2P 전처리"란 항산화제를 FBS에 처리한 다음 감마멸균하는 것을 의미한다. 즉, 항산화제가 포함된 FBS를 배양배지에 추가하는 것이다.
본 발명의 용어 "비타민 C 후처리" 또는 "AA2P 후처리"란 항산화제가 포함되지 않은 FBS를 감마멸균 한 다음, 배양 배지에 처리할 때 항산화제를 함께 배지에 추가하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는 감마멸균한 FBS가 포함된 배지로 배양한 줄기세포는 부착력 및 증식율이 현저히 감소하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 미국 FDA 가이드라인에 제시되어 있는 최소 요구량인 25 kGy로 연구를 진행하였다.
본 발명에 있어서, 상기 감마선 조사는 흡수선량이 20~35 kGy인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
방사선 조사된 단백질에 관한 연구는 단백질 또는 단백질을 구성하는 아미노산을 대상으로 많은 연구들이 진행되어 왔는데 (Garrison, W.M et al. Chem Rev. 87:381-398, 1987) 조사에 의해 생성된 일차적 라디칼이온 또는 단백질과 결합하고 있는 물분자로부터 생성된 이차적 라디칼이온의 연쇄반응에 의하여 단백질은 고분자화 또는 저분자화 된다 (Davies, K.J.A et al., J. Biol . Chem. 262:9895-9901, 1987). 또한, 단백질에 방사선이 조사되면 분자구조가 변하여 효수활성과 면역학적 성질이 변화한다는 연구결과도 보고되었다 (Yook, H.S et al. J. Kor . Soc . Food Sci. Nutr . 26:1116-1121, 1997). 즉, 감마선 조사 후 생성되는 자유라디칼은 여러가지 성장인자를 손상시킬 수 있다.
상기 결과는, 오염원으로부터 안전한 감마멸균 FBS를 이용한 줄기세포 배양에서 해결해야할 문제이다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 우태아혈청은 2% 내지 10%로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 5%인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
세포치료제로 사용하기 위한 줄기세포의 배양에서 열불활성화 또는 여과 등으로는 해결할 수 없는 감염 등의 위험요소를 제거할 수 있는 방법으로, 무혈청 배양 또는 감마멸균 FBS를 사용할 수 있다.
그러나, 무혈청 배양은 증식율이 상대적으로 낮아서 그 효율을 증가시키기 위해 기본배지에 포함되어 있는 비타민류, 무기염류, 호르몬류 등의 첨가제를 고농도로 보충하여 기본배지의 영양성분을 강화하게 되며 세포에 따라서는 특정한 성장인자를 첨가하기도 한다 (Maurer HR et al., Send to Cytotechnology . 5(1):1, 1991).
감마멸균 FBS는 멸균여과 후에도 존재할 수 있는 바이러스 및 마이코플라스마의 범위를 더 줄이거나 없앨 수 있다. 미생물의 방사선 민감성은 온도, 산소조 건, 수분활성도에 따라 달라지는데 온도가 높을수록, 산소가 많을수록, 수분활성도가 높을수록 생물에 미치는 방사선의 영향은 커지게 되어 상대적으로 낮은 방사선량으로 미생물을 제어할 수 있다.
현재 방사선 멸균기술을 활용하여 농산물의 발아/발근 억제, 숙도 지연, 해충 및 기생충 방제 및 부패미생물의 살균 등 식량자원의 장기 저장에 사용되고 있으며 우주식품, 구호식품 및 환자식 개발에도 이용되고 있다. 또한, 의료용품을 비롯한 공중보건 제품의 멸균처리와 국가간 농산물 검역 및 방역 처리시에도 화학적 보존제 및 훈증제를 대체할 수 있는 가장 효과적인 기술로서 활용되고 있다. 재생의학분야에서 동종 및 이종조직의 병원성 미생물을 제거하기 위하여 국제 표준기술로 방사선 처리를 권고하고 있으며, 향후 방사선 멸균기술을 활용하여 이종 생체재료의 면역거부반응 저감화 및 안전성 확보에 대한 많은 연구개발이 이루어질 것으로 예측된다 (김재경 외, 대한골.연골조직이식학회지 13(2):49-57, 2013).
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 줄기세포 배양배지는 Defined Keratinocyte-SFM에 0.05~1 mM의 L-ascorbic acid 2-phosphate, 0.1~100μg/ml의 인슐린, 0.2~20mM의 N-아세틸-L-시스테인(N-acetyl-L-cysteine), 0.01~1mM의 칼슘클로라이드, 5ng/ml~1μg/ml의 하이드로코티손 및 5% FBS가 포함된 KSFM-P 배지와 DMEM배지가 1:1로 혼합된 배지인 것을 특징으로 할 수 있다. 더욱 바람직하게는 0.2mM L-ascorbic acid 2-phosphate, 5μg/ml의 인슐린, 2mM의 N-아세틸-L-시스테인, 0.09mM의 칼슘클로라이드, 74ng/ml의 하이드로코티손인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 지방 조직 유래인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서는 25~30 kGy로 감마선 조사된 FBS를 포함하는 배지에 비타민 C를 1% 처리한 후, 줄기세포를 부착 및 배양하여 감마선이 조사되지 않은 일반 FBS를 시용한 양성 대조군과 비슷한 수준의 증식률 및 부착력을 확인할 수 있었다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기세포 분리
지방흡입술(Liposuction)에 의해 복부지방으로부터 얻어진 인간 지방조직을 분리하여 PBS로 세척하였다. 조직을 잘게 자른 후 collagenase type1 (1mg/ml)을 첨가한 DMEM media를 이용해 37℃에서 2시간 동안 조직을 분해시켰다. 콜라게나아제 처리된 조직을 PBS로 세척 후 1000rpm에서 5분간 원심분리 하여, 상층액을 제거하고, 펠렛을 PBS로 세척한 후 1000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 100㎛ mesh에 필터링하여 부유물을 제거한 후 PBS로 세척하고, 10% FBS, 2mM NAC(N-acetyl-Lcysteine), 0.2mM ascorbic acid가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 하룻밤 지난 후 부착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 5% FBS, 2mM NAC, 02mM ascorbic acid, 0.09mM calcium, 5ng/ml rEGF, 5㎍/ml 인슐린, 10ng/ml bFGF 및 74ng/ml Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM media을 2일마다 교체하면서 계대배양하여 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 분리하였다.
실시예 2: 감마선 조사 FBS를 이용한 줄기세포의 배양
우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum)에 감마선 25 kGy를 조사 ((주) 소야 그린텍)하여 감마 멸균된 FBS를 준비하였다.
그 다음, 실시예 1에서 분리한 인간 지방조직 유래 줄기세포 passage 3을 해동하여 0.5 x 106 세포/T75 플라스크 농도로 T75 플라스크에 접종하고, 상기 준비한 감마 멸균된 FBS가 5%로 포함된 AMSC+ 배양배지 ((주)알바이오)로 37℃, CO2 인큐베이터에서 2일 동안 배양하였다. 2일 배양 후, 배지를 제거하고 5% 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지 (음성 대조군) 또는 5% 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지에 비타민 C (ascorbic acid; L-Ascorbic Acid 2-phosphate)가 첨가된 배지 (비타민 C 후처리 실험군)로 교체하였다. 비타민 C는 배양배지에 대하여 0.025, 0.05, 0.1 및 1%로 첨가하였다. 상기 AMSC+ 배양배지 ((주)알바이오)는 Defined Keratinocyte-SFM에 0.2mM L-ascorbic acid 2-phosphate, 5μg/ml의 인슐린, 2mM의 N-아세틸-L-시스테인, 0.09mM의 칼슘클로라이드, 74ng/ml의 하이드로코티손 및 5% FBS가 포함된 KSFM-P 배지와 DMEM 배지가 1:1의 비로 혼합된 혼합배지이다.
4일 동안 배양한 다음, 세포 증식률 및 doubling time을 조사하였다. 세포 생존율은 현미경 및 Hemocytometer로 확인하였으며, doubling time은 하기 식으로 계산하였다.
[수학식 1]
Doubling Time = duration x log(2) / log(Final Concentration)-log(Initial Concentration)
양성 대조군은 감마선을 조사하지 않은 5% normal FBS 및 AMSC+ 배양배지를 이용하여 상기 음성 대조군 및 실험군과 동일하게 배양하였다.
그 결과, 표 1 및 도 2에 나타난 것과 같이, 감마 멸균된 FBS가 포함된 배지 (음성 대조군)에서 배양한 줄기세포는 세포수가 감소하고 doubling time이 증가하였으나, 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지에 비타민 C (ascorbic acid; L-Ascorbic Acid 2-phosphate)가 첨가된 배지 (비타민 C 후처리 실험군)에서 4일 동안 배양한 줄기세포의 세포수 및 doubling time은 양성 대조군 수준으로 향상되었다.
Figure 112019053098010-pat00001
또한, 각각의 배지에서 0, 1 및 4일째 줄기세포를 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과 역시 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지에 비타민 C (ascorbic acid; L-Ascorbic Acid 2-phosphate)가 첨가된 배지 (비타민 C 후처리 실험군)에서 배양한 줄기세포는 양성 대조군과 유사한 수준을 나타냈다 (도 1).
실시예 3: 항산화제가 포함된 감마선 조사 FBS를 이용한 줄기세포의 배양
우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum)에 감마선 25 kGy를 조사하여 감마 멸균 FBS를 준비하였으며, FBS에 비타민 C (ascorbic acid; L-Ascorbic Acid 2-phosphate)를 첨가한 다음 감마선 25 kGy를 조사하여 비타민 C가 전처리된 감마 멸균 FBS를 준비하였다. 비타민 C는 FBS에 대하여 0.1% 또는 1%로 첨가하였다.
그 다음, 실시예 1에서 분리한 인간 지방조직 유래 줄기세포 passage 3을 해동하여 0.5 x 106 세포/T75 플라스크 농도로 T75 플라스크에 접종하고, 상기 준비한 감마 멸균 FBS 또는 비타민 C가 전처리된 감마 멸균 FBS가 각각 5%로 포함된 AMSC+ 배양배지 ((주)알바이오)로 37℃, CO2 인큐베이터에서 2일 동안 배양하였다. 2일 배양 후, 배지를 제거하고 5% 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지 (음성 대조군), 5% 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지에 비타민 C가 첨가된 배지 (비타민 C 후처리 실험군), 비타민 C가 전처리된 5% 감마 멸균 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지 (비타민 C 전처리 실험군)로 교체하였다. 비타민 C는 배양배지 또는 FBS에 대하여 0.1% 또는 1%로 첨가하였다. 4일 동안 배양한 다음, 세포 증식률 및 doubling time을 실시예 2와 동일한 방법으로 조사하였다. 양성 대조군도 실시예 2와 같이 준비하였다.
그 결과, 표 2 및 도 4에 나타난 것과 같이, 감마 멸균된 FBS가 포함된 배지 (음성 대조군)에서 배양한 줄기세포는 세포수가 감소하고 doubling time이 증가하였으나, 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지에 비타민 C가 첨가된 배지 (비타민 C 후처리 실험군) 및 비타민 C가 전처리된 감마 멸균 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지 (비타민 C 전처리 실험군)에서 4일 동안 배양한 줄기세포의 세포수 및 doubling time은 양성 대조군 수준으로 향상되었다.
Figure 112019053098010-pat00002
또한, 각각의 배지에서 4일째 줄기세포를 현미경으로 관찰한 결과, 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지에 비타민 C가 첨가된 배지 (비타민 C 후처리 실험군) 및 비타민 C가 전처리된 감마 멸균 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지 (비타민 C 전처리 실험군)에서 배양한 줄기세포는 양성 대조군과 유사한 수준을 나타냈다 (도 3).
실시예 4: 25kGy 감마선 조사 FBS에서 배양한 줄기세포의 부착력
실시예 3과 동일하게 우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum)에 감마선 25 kGy를 조사하여 감마 멸균 FBS를 준비하였으며, FBS에 비타민 C (ascorbic acid; L-Ascorbic Acid 2-phosphate)를 첨가한 다음 감마선 25 kGy를 조사하여 비타민 C가 전처리된 감마 멸균 FBS를 준비하였다. 비타민 C는 FBS에 대하여 1%로 첨가하였다.
그 다음, 실시예 1에서 분리한 인간 지방조직 유래 줄기세포 passage 0을 1.7 x 105 세포/T25 플라스크 농도로 T25 플라스크에 접종하고, 상기 준비한 감마 멸균 FBS 또는 비타민 C가 전처리된 감마 멸균 FBS가 각각 5%로 포함된 AMSC+ 배양배지 ((주)알바이오)로 37℃, CO2 인큐베이터에서 2일 동안 배양하였다. 2일 배양 후, 배지를 제거하고 5% 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지 (음성 대조군), 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지에 비타민 C가 첨가된 배지 (비타민 C 후처리 실험군), 비타민 C가 전처리된 5% 감마 멸균 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지 (비타민 C 전처리 실험군)로 교체하였다. 비타민 C는 배양배지 또는 FBS에 대하여 1%로 첨가하였다. 양성 대조군도 실시예 2 및 3과 같이 준비하였다.
각각의 대조군 및 실험군에서 줄기세포 밀도가 90%가 되어 계대배양 할 수 있는 기간을 조사하였다.
그 결과, 표 3 및 도 5에 나타난 것과 같이, 감마선을 조사하지 않은 5% normal FBS 및 AMSC+ 배양배지의 양성 대조군은 배양 10일차에 줄기세포 밀도가 90%가 되었으며, 감마 멸균된 FBS가 포함된 배지 (음성 대조군)에서 배양한 줄기세포는 배양 8일차 및 배양 13일차 모두 부착된 세포가 거의 없었다. 하지만, 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지에 비타민 C가 첨가된 배지 (비타민 C 후처리 실험군) 및 비타민 C가 전처리된 감마 멸균 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지 (비타민 C 전처리 실험군)에서 배양한 줄기세포는 양성 대조군과 유사하게 각각 13일차 및 10일차에 줄기세포 밀도가 90%가 되었다.
Group Density (90%)
Positive control 10일
Negative control
Vit.C 전처리 13일
Vit.C 후처리 10일
실시예 5: 30kGy 감마선 조사 FBS에서 배양한 줄기세포의 생존율
우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum)에 감마선 30 kGy를 조사하여 감마 멸균 FBS를 준비하고, FBS에 비타민 C (ascorbic acid; L-Ascorbic Acid 2-phosphate)를 첨가한 다음 감마선 30 kGy를 조사하여 비타민 C가 전처리된 감마 멸균 FBS를 준비하였다. 비타민 C는 FBS에 대하여 1%로 첨가하였다.
그 다음, 실시예 1에서 분리한 인간 지방조직 유래 줄기세포 passage 3을 해동하여 0.5 x 106 세포/T75 플라스크 농도로 T75 플라스크에 접종하고, 상기 준비한 감마 멸균 FBS 또는 비타민 C가 전처리된 감마 멸균 FBS가 각각 5%로 포함된 AMSC+ 배양배지 ((주)알바이오)로 37℃, CO2 인큐베이터에서 2일 동안 배양하였다. 2일 배양 후, 배지를 제거하고 5% 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지 (음성 대조군), 5% 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지에 비타민 C가 첨가된 배지 (비타민 C 후처리 실험군), 비타민 C가 전처리된 5% 감마 멸균 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지 (비타민 C 전처리 실험군), 비타민 C가 전처리된 5% 감마 멸균 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지에 비타민 C가 첨가된 배지 (비타민 C 전+후처리 실험군)로 교체하였다 (표 4). 비타민 C는 배양배지 또는 FBS에 대하여 1%로 첨가하였다. 4일 동안 배양한 다음 (도 6), 세포 증식률, 세포수, 생존율 및 doubling time을 조사하였다. 양성 대조군도 실시예 2와 같이 준비하였다.
양성 대조군 FBS(normal)가 포함된 AMSC+배지에 배양
음성 대조군 30kGy 감마선 조사 FBS가 포함된 AMSC+배지
1% Vit.C 전처리군 Vit.C를 첨가한 30kGy 감마선 조사 FBS가 포함된 AMSC+배지
1% Vit.C후처리군 30kGy 감마선 조사 FBS가 포함된 AMSC+배지에 Vit.C 후 첨가
1% Vit.C 전+후 처리군 Vit.C를 첨가한 30kGy 감마선 조사 FBS가 포함된 AMSC+배지에 Vit.C 후 첨가
그 결과, 표 5 및 도 7 내지 10에 나타난 것과 같이, 감마 멸균된 FBS가 포함된 배지 (음성 대조군)에서 배양한 줄기세포는 세포수 및 세포 생존율이 감소하고 doubling time이 증가하였으나, 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지에 비타민 C가 첨가된 배지 (비타민 C 후처리 실험군)에서 4일 동안 배양한 줄기세포의 세포수, 생존율 및 doubling time은 양성 대조군 수준으로 향상되었다.
Figure 112019053098010-pat00003
실시예 6: 30kGy 감마선 조사 FBS에서 배양한 줄기세포의 부착 및 증식율
우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum)에 감마선 30 kGy를 조사하여 감마 멸균 FBS를 준비하였으며, 상기 감마 멸균 FBS가 5%로 포함된 AMSC+ 배양배지 ((주)알바이오)에 1% 비타민 C가 첨가된 배지 (비타민 C 후처리 실험군)를 준비하였다.
그 다음, 실시예 1에서 분리한 인간 지방조직 유래 줄기세포 passage 1을 1.7 x 105 세포/T25 플라스크 농도로 T25 플라스크에 접종하고, 상기 준비한 감마 멸균 FBS가 5%로 포함된 AMSC+ 배양배지 ((주)알바이오)로 37℃, CO2 인큐베이터에서 2일 동안 배양하였다. 2일 배양 후, 배지를 제거하고 5% normal FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지 (양성 대조군) 또는 감마 멸균된 FBS가 포함된 AMSC+ 배양배지에 비타민 C가 첨가된 배지 (비타민 C 후처리 실험군)로 교체하였다. 비타민 C는 배양배지에 대하여 1%로 첨가하였다.
양성 대조군 및 비타민 C 후처리 실험군의 passage 2 내지 4에서 줄기세포의 부착력 (도 11a 내지 11c) 및 세포수, 세포크기, 생존율을 조사하였다 (표 6 내지 9). 도 11의 줄기세포 부착력은 Leica 현미경으로 조사하였으며, 표 6 내지 9의 세포수, 세포크기, 생존율은 LunaTM Automated cell counter L10001 (Logos biosystems)로 조사하였다.
그 결과, passage 2 내지 4에서 줄기세포의 부착력 및 세포수, 세포크기, 생존율은 양성 대조군과 차이가 없었다.
줄기세포 세포수(x107cells) 세포크기(㎛) 생존율(%)
#1 P1 P.C 2.7 x107cells 20 ㎛ 83.2 %
비타민 C 후처리 2.4x107cells 19.1㎛ 84.4%
#2 P1 P.C 1.9 x107cells 20 ㎛ 80.2 %
비타민 C 후처리 1.8x107cells 20㎛ 89.6%
#3 P1 P.C 2.8 x107cells 20 ㎛ 85%
비타민 C 후처리 2.3x107cells 19.6㎛ 87.1%
줄기세포 세포수(x107cells) 세포크기(㎛) 생존율(%)
#1 P2 P.C 1.6 x107cells 19.8㎛ 88.3 %
비타민 C 후처리 1.6x107cells 19.5㎛ 83%
#2 P2 P.C 1.5x107cells 20 ㎛ 82.8 %
비타민 C 후처리 1.8x107cells 19.3㎛ 95.5%
#3 P2 P.C 1.3 x107cells 19 ㎛ 84.2 %
비타민 C 후처리 1.4x107cells 18 ㎛ 82%
줄기세포 세포수(x107cells) 세포크기(㎛) 생존율(%)
#1 P3 P.C 1.6 x107cells 19 ㎛ 90.8 %
비타민 C 후처리 2.0 x107cells 19.2 ㎛ 88.7 %
#2 P3 P.C 1.3 x107cells 20 ㎛ 98.3 %
비타민 C 후처리 1.2 x107cells 19.7 ㎛ 88.9 %
#3 P3 P.C 1.3 x107cells 20 ㎛ 96.6 %
비타민 C 후처리 1.4 x107cells 19.3 ㎛ 88.2 %
줄기세포 세포수(x108cells) 세포크기(㎛) 생존율(%)
#1 P4 P.C 2.8x108cells 19.8 ㎛ 97.6 %
비타민 C 후처리 3.3x108cells 20 ㎛ 87.5 %
#2 P4 P.C 2.4x108cells 18.8 ㎛ 83.0 %
비타민 C 후처리 1.5x108cells 18.8 ㎛ 95.6 %
#3 P4 P.C 2.4x108cells 18.5 ㎛ 84.0 %
비타민 C 후처리 2.1x108cells 17.8 ㎛ 88.0 %
실시예 7: 감마선 조사 FBS 및 비타민 C 후처리 배지에서 배양된 줄기세포의 특성
실시예 6의 양성 대조군 및 비타민 C 후처리 실험군에서 passage 4 줄기세포의 순도 및 특성을 조사하였다.
줄기세포의 순도는 FACS를 이용하여 CD 마커 발현을 확인하였으며(도 12 및 표 10), 줄기세포의 특성은 지방, 골 및 연골로의 분화를 확인하였다 (도 13 내지 15). 지방세포로의 분화는 sigmaaldrich 프로토콜에 따라 oil red O 염색으로 확인하였으며, 골세포로의 분화는 lifelinecelltech의 프로토콜에 따라 alizarin red S 염색으로 확인하였고, 연골세포로의 분화는 TSP2 ELISA로 확인하였다.
줄기세포 CD73 CD90 CD31 CD34 CD45 CD73
#1 P4 P.C 82.47 100 0.27 0.31 0.17 82.47
비타민 C 후처리 94.30 99.98 0.52 0.31 0.49 94.30
#2 P4 P.C 95.73 99.97 0.24 0.10 0.09 95.73
비타민 C 후처리 93.42 99.99 0.16 0.14 0.11 93.42
#3 P4 P.C 92.75 99.99 0.02 0.00 0.02 92.75
비타민 C 후처리 91.45 99.99 0.47 0.70 0.78 91.45
그 결과, 30KGy 감마선 조사 및 1% 비타민 C 후처리 실험군의 CD 마커 발현은 양성 대조군과 차이가 없었으며, 지방세포, 골세포, 연골세포로의 분화 특성도 양성 대조군과 차이가 없었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 다음 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 배양방법:
    (a) 우태아혈청 (FBS; fetal bovine serum)에 감마선을 조사하는 단계;
    (b) 상기 감마선 조사 우태아혈청에 비타민 C를 처리한 후, 줄기세포 배양배지인 KSFM-P와 DMEM의 혼합배지에 첨가하는 단계; 및
    (c) 상기 배양배지를 이용하여 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 비타민 C는 0.025% 내지 1%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 배양방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 (b) 단계의 우태아혈청은 2% 내지 10%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 배양방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 KSFM-P는 L-아스코르브산 2-인산 (L-ascorbic acid 2-phosphate), 인슐린, N-아세틸-L-시스테인(N-acetyl-L-cysteine), 칼슘클로라이드, 하이드로코티손 및 FBS가 포함된 Defined Keratinocyte-SFM인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 배양방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 감마선 조사는 흡수선량이 20~35 kGy인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 배양방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 지방 조직 유래인 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포의 배양방법.
KR1020190060757A 2018-05-25 2019-05-23 감마선 조사 혈청을 이용한 중간엽 줄기세포의 배양방법 KR102172970B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/422,525 US11932874B2 (en) 2018-05-25 2019-05-24 Method for culturing mesenchymal stem cells using gamma-irradiated serum
JP2019098293A JP6920369B2 (ja) 2018-05-25 2019-05-27 ガンマ線照射血清を用いた間葉系幹細胞の培養方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180059594 2018-05-25
KR20180059594 2018-05-25

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190134522A KR20190134522A (ko) 2019-12-04
KR102172970B1 true KR102172970B1 (ko) 2020-11-02

Family

ID=69004916

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190060757A KR102172970B1 (ko) 2018-05-25 2019-05-23 감마선 조사 혈청을 이용한 중간엽 줄기세포의 배양방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102172970B1 (ko)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160050412A (ko) * 2014-10-29 2016-05-11 주식회사 알바이오 줄기세포 배양을 위한 배지조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190134522A (ko) 2019-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112322580B (zh) 一种间充质干细胞无血清培养基的应用
KR100908481B1 (ko) 중간엽 줄기세포 배양 배지 및 이를 이용한 중간엽줄기세포의 배양 방법
Tekkatte et al. “Humanized” stem cell culture techniques: the animal serum controversy
CN106754668B (zh) 一种干细胞培养液及注射液
US20150118748A1 (en) High-concentration stem cell production method
RU2756561C2 (ru) Среда для формирования колоний и её применение
US11932874B2 (en) Method for culturing mesenchymal stem cells using gamma-irradiated serum
CN102985534A (zh) 用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法
JP2020191861A (ja) 臍帯間葉系幹細胞ＭＳＣｓ及びその培養法と応用
KR20120126284A (ko) 고농도의 세포성장인자를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조방법 및 이로부터 얻어진 조성물
CN111621476B (zh) 一种用于间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法
CN103484432A (zh) 一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途
CN112481202B (zh) 血小板裂解物无血清分离培养脐带间充质干细胞的方法
CN104758923A (zh) 一种治疗神经损伤的干细胞制剂及其制备方法
CN113564111A (zh) 一种低氧培养脐带来源间充质干细胞的方法
CN106701670A (zh) 一种增强间充质干细胞分泌生物活性因子能力及培养液中活性因子的提取方法
CN113151165B (zh) 一种人脐带间充质干细胞扩增用培养基及培养方法
KR101753557B1 (ko) 줄기세포 증식 향상 배지 조성물 및 줄기세포의 배양방법
KR101597604B1 (ko) 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물
KR102172970B1 (ko) 감마선 조사 혈청을 이용한 중간엽 줄기세포의 배양방법
RU2012107674A (ru) Биотрансплантат для восстановления объема костной ткани при дегенеративных заболеваниях и травматических повреждениях костей и способ его получения
CN113373108A (zh) 一种表皮干细胞扩增培养基及其制备方法和应用
CN112608892A (zh) 血小板裂解物用于无血清分离和传代培养脐带间充质干细胞的方法
CN108517313B (zh) 一种用于培养扩增牙髓干细胞的血清/血浆替代物
US20210115403A1 (en) Method for preparing an irradiated platelet lysate

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant