JP6920369B2

JP6920369B2 - ガンマ線照射血清を用いた間葉系幹細胞の培養方法

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Publication number: JP6920369B2
Application number: JP2019098293A
Authority: JP
Inventors: ジョンチャンラ; サンクンカン; ウンヨンキム
Original assignee: Naturecell Co Ltd; R Bio Co Ltd
Current assignee: Naturecell Co Ltd; R Bio Co Ltd
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2021-08-18
Anticipated expiration: 2039-05-27
Also published as: US20190359942A1; US11932874B2; JP2019201640A

Description

本発明は、ガンマ線照射血清を用いた間葉系幹細胞の培養方法に関し、より詳細には、ガンマ線を照射した血清および抗酸化剤が含まれた培養培地を用いて幹細胞の付着力および増殖率を向上させることができる間葉系幹細胞の培養方法に関する。

幹細胞（ｓｔｅｍｃｅｌｌ）とは、自己複製能力を有すると共に、二つ以上の細胞に分化する能力を有する細胞をいい、万能幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）、分化万能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）、多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）に分類できる。

万能幹細胞（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）は、一つの完全な個体に発生していくことができる万能性を有する細胞で、卵子と精子の受精以後８細胞期までの細胞がこのような性質を有し、この細胞を分離して子宮に移植すると一つの完全な個体に発生していくことができる。分化万能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）は、外胚葉、中胚葉、内胚葉層由来の多様な細胞と組織から発生できる細胞であり、受精４〜５日後現れる胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）の内側に位置した内部細胞塊（ｉｎｎｅｒｃｅｌｌｍａｓｓ）から由来し、これを胚芽幹細胞といい、多様な他の組織細胞に分化するが新しい生命体を形成することはできない。多能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ）は、この細胞が含まれた組織及び器官に特異的な細胞だけに分化できる幹細胞で、胎児期、新生児期及び成体期の各組織及び臓器の成長と発達のみならず成体組織の恒常性維持と組織損傷時再生を誘導する機能に関与しており、組織特異的多能性細胞を総称して間葉系幹細胞という。

間葉系幹細胞(Rebecca S. Y. Wong, et al., J Biomed Biotechnol 24:2011, 2011)は、心臓疾患、骨形成不全症、および脊髄損傷などのような種々の疾病状態で細胞ベースの治療に用いられており、その結果が注目されている。かかる間葉系幹細胞を、幹細胞の性能を保持しながらも大量で得るためには、その培養方法が重要である。

脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ；ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）の培養および維持には、殆ど、動物の血清、特に、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）が含まれた培地が用いられる。ＦＢＳは、種々の成長因子（ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ）、タンパク質、ビタミン類、ホルモンを含んでいるため(Wassman S. J et al., Dev Biol Stand 99:3-8, 1999)、幹細胞の培養において比較的好適に使用可能であるが、動物由来の原料は、細胞培養用に用いるには、その危険要素を完全に排除することはできない。

かかる危険要素を除去するために、近年、ＦＢＳを添加していない無血清培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅｍｅｄｉａ）が多様に開発されて販売されており、細胞の種類に応じて、適した無血清培地を選定して使用することができる。しかし、無血清培地を用いた培養の効率は、殆どの場合、血清を添加して培養する際に比べて非常に低く(Mannello F. et al., Stem Cells. 25(7):1603-9, 2007)、それを補完するために、各種添加剤をさらに処理しなければならない。このように無血清培地における細胞の増殖率は相対的に低く、無血清培地に添加される様々な成長因子および添加剤により、コストが相当な負担となる。

生産過程におけるコスト負担および細胞増殖低下の問題を解決できる方法の１つとして、ガンマ線照射滅菌ＦＢＳが使用可能である。ガンマ線、電子線、およびＸ−線を活用した放射線の照射技術は、製品の完全な包装状態で、温度の上昇がなく、且つ有害成分が残らない低温滅菌、殺虫技術である。このような効果は、放射線の直接および間接作用により、細胞のＤＮＡ、タンパク質、または脂質などのような細胞構成成分に損傷を与えることで起こる。ガンマ線の照射は、滅菌濾過後にも存在し得るウイルスやマイコプラズマの範囲をより減少または除去することができる。したがって、全世界の医薬品工程で用いられており、動物由来の原資材に対してガンマ線照射滅菌を勧奨する傾向にある。

しかしながら、ガンマ線に曝されたタンパク質は、可逆的または不可逆的に変化し（チョヨンシク、忠南大学校学位論文、１９９９）、ガンマ線照射後に生成されるフリーラジカルは、種々の成長因子を損傷させる。すなわち、ガンマ線の照射により、ＦＢＳ中の成長因子が破壊される可能性が存在する。

そこで、本発明者らは、感染などの危険要素が排除され、細胞治療剤として安全に使用可能な幹細胞を製造するために鋭意努力した結果、ガンマ線照射血清および抗酸化剤が含まれた培地で幹細胞を培養すると、付着力および増殖率が向上し、細胞治療剤として使用するにおいて優れた幹細胞を製造することができることを確認し、本発明を成すに至った。

本発明の目的は、ガンマ線を照射した血清および抗酸化剤が含まれた培養培地を用いて幹細胞の付着力および増殖率を向上させることができる間葉系幹細胞の培養方法を提供するところにある。

前記目的を達成するために、本発明は、（ａ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）にガンマ線を照射するステップと、（ｂ）前記ガンマ線照射ウシ胎仔血清を幹細胞培養培地に添加するステップと、（ｃ）前記培養培地を用いて間葉系幹細胞を培養するステップと、を含む、間葉系幹細胞の培養方法を提供する。

本発明の間葉系幹細胞の培養方法は、汚染源から安全であるが、細胞の付着および増殖効率を低下させるガンマ線滅菌ＦＢＳを用いて、幹細胞の培養時における幹細胞の付着率および増殖率を回復させることができるため、細胞治療用幹細胞の製造において有用である。

ガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）を示す図である。ガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で４日間培養（ビタミンＣ後処理群）した後、細胞数および細胞倍増時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇｔｉｍｅ）を調査した図である。ビタミンＣ前処理後にガンマ線照射により滅菌したＦＢＳを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ前処理群）と、ガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）とを比較した図である。ビタミンＣ前処理後にガンマ線照射により滅菌したＦＢＳを添加した培地（ビタミンＣ前処理群）、またはガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地（ビタミンＣ後処理群）で４日間培養した後、細胞数および細胞倍増時間を調査した図である。ビタミンＣ前処理後にガンマ線照射により滅菌したＦＢＳを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ前処理群）と、ガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）の、継代培養に達する期間を確認した図である。ビタミンＣ前処理後に３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ前処理群）、３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）、ならびにビタミンＣ前処理後に３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で４日間培養した幹細胞（ビタミンＣ前＋後処理群）を比較した図である。ビタミンＣ前処理後に３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ前処理群）、３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）、ならびにビタミンＣ前処理後に３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で４日間培養した幹細胞（ビタミンＣ前＋後処理群）の細胞数を比較した図である。ビタミンＣ前処理後に３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ前処理群）、３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）、ならびにビタミンＣ前処理後に３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で４日間培養した幹細胞（ビタミンＣ前＋後処理群）の細胞サイズを比較した図である。ビタミンＣ前処理後に３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ前処理群）、３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）、ならびにビタミンＣ前処理後に３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で４日間培養した幹細胞（ビタミンＣ前＋後処理群）の細胞生存率を比較した図である。ビタミンＣ前処理後に３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ前処理群）、３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）、ならびにビタミンＣ前処理後に３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で４日間培養した幹細胞（ビタミンＣ前＋後処理群）の細胞倍増時間を比較した図である。３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）の細胞付着力を確認した図であって、１継代(ｐａｓｓａｇｅ１)の細胞を示す。３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）の細胞付着力を確認した図であって、２継代(ｐａｓｓａｇｅ２)の細胞を示す。３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）の細胞付着力を確認した図であって、３継代(ｐａｓｓａｇｅ３)の細胞を示す。３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）の幹細胞ＣＤマーカーの発現を分析するために行われたＦＡＣＳの結果を示す図である。３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）の、脂肪細胞への分化誘導を示す図である。３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）の、骨細胞への分化誘導を示す図である。３０ｋＧｙのガンマ線照射により滅菌したＦＢＳおよびビタミンＣを添加した培地で培養した幹細胞（ビタミンＣ後処理群）の、軟骨細胞への分化誘導を示す図である。

他の方式で定義されない限り、本明細書において使用されたあらゆる技術的・科学的用語は、本発明が属する技術分野に熟練した専門家によって通常理解されるものと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用された命名法及び以下で詳述する實驗方法は、本技術分野において周知であり、しかも汎用されるものである。

本発明では、熱不活性化（ｈｅａｔｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）や濾過では解決できない動物由来ＦＢＳの危険要素を完全に排除することができるガンマ線滅菌ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）を用いて細胞治療用幹細胞を製造するために、ガンマ線の照射により生成されたフリーラジカルを、抗酸化剤を用いて解決することができた。すなわち、ＦＢＳのガンマ線照射により発生した幹細胞の付着および増殖への悪影響を、抗酸化剤を用いることで除去することができた。

したがって、本発明は、一観点において、（ａ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）にガンマ線を照射するステップと、（ｂ）前記ガンマ線照射ウシ胎仔血清を幹細胞培養培地に添加するステップと、（ｃ）前記培養培地を用いて間葉系幹細胞を培養するステップと、を含む、間葉系幹細胞の培養方法に関する。

本発明において、前記ステップ（ａ）のウシ胎仔血清には、抗酸化剤を含んでも含まなくでもよく、前記抗酸化剤は０．０２５％〜２％で添加されることが好ましく、１％で添加されることが最も好ましいが、これに限定されない。

血清タンパク質は、脂質、酵素類などの栄養素を細胞内に運ぶキャリアの役割を果たすこともある(Stein A et al., Biotechniques43:228-229,2007; Sterodimas A et al., J Plast Reconstr Aesthet Surg 63:1886-1892, 2010)。一般に、細胞培養用培地は、ビタミン類、無機塩類、ホルモン類、成長因子を含み、細胞の類型によって、微量で要求される栄養素の供給のためにＦＢＳが添加される。

ガンマ線照射血清（ＧａｍｍａＩｒｒａｄｉａｔｅｄＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ）は、ウイルスおよびワクチンの生産、生物薬剤の生産工程、および診断製品の生産のような、業界で設定された最も厳格な無菌要求事項に適する。

本発明において、前記ステップ（ｂ）の幹細胞培養培地は、抗酸化剤を含んでもよく、前記抗酸化剤は０．０２５％〜２％で添加されることが好ましく、１％で添加されることが最も好ましいが、これに限定されない。

培養の効率を増加させるための添加剤は、基本培地に含まれたビタミン類、無機塩類、ホルモン類などを、より多様な種類で補充したり高濃度で補充したりして基本培地の栄養成分を強化することとなり、細胞の類型によっては、特定の成長因子を添加することがある(Maurer HR et al., Send to Cytotechnology. 5(1):1, 1991)。

本発明において、前記抗酸化剤は、ビタミンＣ（ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）、セレン、コエンザイムＱ１０、ビタミンＥ、カテキン、リコペン、ベータカロテン、ＥＰＡ（ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃａｃｉｄ），およびＤＨＡ（ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｎｏｉｃａｃｉｄ）で構成された群から選択されてもよい。

Ｋｒｕｍａｈａｒ等は、ガンマ線が照射されたラクトアルブミン（ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ）の溶解度に与えるアスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）の効果について報告している(Krumhar et al., J. Food Sci.55:1127-1132, 1990)。放射線の照射によるタンパク質の損傷に関連して、酸素の効果は公知の事実であって(Singh, A et al., Methods in E nzymology, 186:686-696, 1990)、酸素は、放射線照射により引き起こされる生物学的損傷を促進するため、抗酸化剤は、放射線による損傷を抑える物質となることができる(Bienvenu, P et al., Adv. Exp. Med. Biol. 264:291-300, 1990)。実際に、放射線による生物学的損傷を抑える物質の殆どが抗酸化剤である(Bienvenu, P et al., Adv. Exp. Med. Biol. 264:291-300, 1990)。アスコルビン酸は、必須ビタミンで、且つ抗酸化剤であって、トコフェロール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）とともに、動物実験による放射線損傷抑制の研究で多く使用されてきた(El-Nahas S. M et al., Mutat. Res. 301:143-147, 1993; O 'Connor M. K et al., Br. J. Radiol. 50:587-591, 1977; Niki, E et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 498:186-199, 1987; Niki, E et al., J. Biol. Chem. 259:4177-4182, 1984; Rana, K et al., Indian J. Exp. Biol. 31:847-849, 1993)。アスコルビン酸は、フリーラジカルと反応し、放射線の照射によって酸化されやすく(Woods, R. J et al., Applied radiation chemistry pp443-447, 1994)、デヒドロアスコルビン酸（ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）に酸化される際に反応性が強くなると知られている(Kacem, B et al., J. Food Sci. 52:1665-1672, 1987)。ラジカルの形成に対するアスコルビン酸の効果的な放射線損傷抑制は、アスコルビン酸がタンパク質ラジカルを消去した観点から理解される（チョヨンシク、忠南大学校学位論文、１９９９）。
本発明の用語「ビタミンC前処理」または「AA2P前処理」とは、抗酸化剤をＦＢＳに処理し、ガンマ滅菌することを意味する。つまり、抗酸化剤が含まれているＦＢＳを培養培地に追加することである。
本発明の用語「ビタミンCの後処理」または「AA2P後処理」とは、抗酸化剤が含まれていないＦＢＳをガンマ滅菌し、培養培地に処理するとき、抗酸化剤を一緒に培地に追加することを意味する。

本発明の一実施例では、ガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれた培地で培養した幹細胞は、付着率および増殖率が著しく減少した。

本発明の一実施例では、米国のＦＤＡガイドラインに提示されている最小要求量である２５ｋＧｙで研究を行った。

本発明において、前記ガンマ線照射は、２０〜３５ｋＧｙの吸収線量で行われることが好ましが、これに限定されない。

放射線照射されたタンパク質に関する研究においては、タンパク質またはタンパク質を構成するアミノ酸を対象として多くの研究が行われてきたが(Garrison, W.M et al. Chem Rev. 87:381-398, 1987)、照射により生成された一次的なラジカルイオン、またはタンパク質と結合している水分子から生成された二次的なラジカルイオンの連鎖反応により、タンパク質が高分子化または低分子化される(Davies, K.J.A et al., J.Biol.Chem. 262:9895-9901, 1987)。また、タンパク質に放射線が照射されると、その分子構造が変わり、酵素活性と免疫学的性質が変わるという研究結果も報告されている(Yook, H.S et al. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 26:1116-1121, 1997)。すなわち、ガンマ線照射後に生成されるフリーラジカルは、種々の成長因子を損傷させ得る。

上記の結果は、汚染源から安全なガンマ線滅菌ＦＢＳを用いた幹細胞の培養において解決すべき問題である。

本発明において、前記ステップ（ｂ）のウシ胎仔血清は、２％〜１０％で添加されてもよく、５％で添加されることが好ましいが、これに限定されない。
細胞治療剤として用いるための幹細胞の培養において、熱不活性化または濾過などでは解決できない感染などの危険要素を除去することができる方法として、無血清培養またはガンマ線滅菌ＦＢＳを用いることができる。

しかし、無血清培養は増殖率が相対的に低いため、その効率を増加させるために、基本培地にビタミン類、無機塩類、ホルモン類などの添加剤を高濃度で添加して基本培地の栄養成分を強化することとなり、細胞の類型によって特定の成長因子を添加することもある(Maurer HR et al., Send to Cytotechnology. 5(1):1, 1991)。

ガンマ線滅菌ＦＢＳは、滅菌濾過後にも存在し得るウイルスやマイコプラズマの範囲をより減少または除去することができる。微生物の放射線敏感性は、温度、酸素条件、水分活性度によって変わるが、温度が高いほど、酸素が多いほど、水分活性度が高いほど、生物に与える放射線の影響が大きくなり、相対的に低い放射線量で微生物を制御することができる。

現在、放射線滅菌技術を活用し、農産物の発芽／発根の抑制、熟度の遅延、害虫および寄生虫の防除、ならびに腐敗微生物の殺菌など、食糧資源の長期貯蔵に用いられており、宇宙食、救護食品、および患者食の開発にも用いられている。また、医療用品を始めとする公衆保健製品の滅菌処理や、国間における農産物検疫および防疫処理時にも、化学的保存剤およびくん蒸剤に代替可能な最も効果的な技術として活用されている。再生医学分野では、同種および異種組織の病原性微生物を除去するために、国際標準技術の放射線処理を勧告しており、これから、放射線滅菌技術を活用して異種生体材料の免疫拒否反応の低減化および安全性の確保に関する研究開発が多く行われると予測される（キムゼキョンの他、大韓骨・軟骨組織移植学会誌１３（２）：４９−５７、２０１３）。

本発明において、前記ステップ（ｂ）の幹細胞培養培地は、ＤｅｆｉｎｅｄＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭに、０．０５〜１ｍＭのＬ−ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．１〜１００μｇ／ｍｌのインスリン、０．２〜２０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、０．０１〜１ｍＭの塩化カルシウム、５ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、および５％のＦＢＳが含まれたＫＳＦＭ−Ｐ培地とＤＭＥＭ培地が１：１の比で混合された混合培地であることを特徴とする。さらに好ましくは、０．２ｍＭのＬ−ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５μｇ／ｍｌのインスリン、２ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、０．０９ｍＭの塩化カルシウム、および７４ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンを含むことができるが、これに限定されない。

本発明において、前記間葉系幹細胞は、脂肪組織由来であることが好ましいが、これに限定されない。

本発明では、２５〜３０ｋＧｙでガンマ線が照射されたＦＢＳを含む培地にビタミンＣ１％を処理した後、幹細胞を付着および培養したところ、ガンマ線が照射されていない一般のＦＢＳを用いて培養した陽性対照群と類似のレベルの増殖率および付着力を確認することができた。

以下、本発明を実施例に挙げて詳述する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に制限されないことは当業者において通常の知識を有する者にとって自明である。

実施例１：ヒト脂肪組織由来の間葉系幹細胞の分離
脂肪吸引（Ｌｉｐｏｓｕｃｔｉｏｎ）により腹部脂肪から得られたヒト脂肪組織を分離し、ＰＢＳで洗浄した。組織を細切した後、コラゲナーゼタイプ１（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｔｙｐｅ１）（１ｍｇ／ｍｌ）を添加したＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃で２時間組織を分解させた。コラゲナーゼ処理された組織をＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を除去し、ペレットをＰＢＳで洗浄した後、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１００μｍメッシュで濾過して浮遊物を除去した後、ＰＢＳで洗浄し、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＮＡＣ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌｃｙｓｔｅｉｎｅ）、０．２ｍＭのアスコルビン酸が添加されたＤＭＥＭ培地で培養した。一晩経過後、付着されていない細胞をＰＢＳで洗浄し、付着された細胞は、５％のＦＢＳ、２ｍＭのＮＡＣ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、０．０９ｍＭのカルシウム、５ｎｇ／ｍｌのｒＥＧＦ、５μｇ／ｍｌのインスリン、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、および７４ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾンを含有するＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ培地を２日おきに交換しながら継代培養して、脂肪組織由来の間葉系幹細胞を分離した。

実施例２：ガンマ線照射ＦＢＳを用いた幹細胞の培養
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）に２５ｋＧｙのガンマ線を照射（（株）ＳＯＹＡＧＲＥＥＮＴＥＣ）することで、ガンマ線滅菌されたＦＢＳを準備した。

次に、実施例１で分離した３継代(ｐａｓｓａｇｅ３)のヒト脂肪組織由来の幹細胞を解凍し、０．５ｘ１０^６細胞／Ｔ７５フラスコの濃度でＴ７５フラスコに接種し、接種された幹細胞を前記準備したガンマ線滅菌ＦＢＳが５％で含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（（株）ＲＢｉｏ）で、３７℃、ＣＯ_２インキュベーターにて２日間培養した。２日培養後、培地を除去し、５％のガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（陰性対照群）、または５％のガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地にビタミンＣ（アスコルビン酸；Ｌ−ＡｓｃｏｒｂｉｃＡｃｉｄ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が添加された培地（ビタミンＣ後処理実験群）に交換した。ビタミンＣは、培養培地に対して０．０２５、０．０５、０．１、および１％の濃度で添加した。前記ＡＭＳＣ＋培養培地（（株）ＲＢｉｏ）は、ＤｅｆｉｎｅｄＫｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ−ＳＦＭ、０．２ｍＭのＬ−ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５μｇ／ｍｌのインスリン、２ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン、０．０９ｍＭの塩化カルシウム、７４ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、および５％のＦＢＳが含まれたＫＳＦＭ−Ｐ培地とＤＭＥＭ培地が１：１の比で混合された混合培地である。

４日間培養した後、細胞増殖率および倍増時間を調査した。細胞生存率は、顕微鏡および血球計（Ｈｅｍｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）で確認し、倍増時間は下記式により計算した。

［数学式１］
倍増時間（ＤｏｕｂｌｉｎｇＴｉｍｅ）＝デュレイション（ｄｕｒａｔｉｏｎ）ｘｌｏｇ（２）／ｌｏｇ（最終濃度）−ｌｏｇ（初期濃度）

陽性対照群は、ガンマ線を照射していない５％のｎｏｒｍａｌＦＢＳおよびＡＭＳＣ＋培養培地を用いて、前記陰性対照群および実験群と同様に培養した。

その結果、表１および図２に示されたように、ガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれた培地（陰性対照群）で培養した幹細胞は、細胞数が減少し、倍増時間が増加したが、ガンマ線照射ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地にビタミンＣ（アスコルビン酸；Ｌ−ＡｓｃｏｒｂｉｃＡｃｉｄ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が添加された培地（ビタミンＣ後処理実験群）で４日間培養した幹細胞の細胞数および倍増時間は、陽性対照群のレベルに向上した。

また、それぞれの培地で、０、１、および４日目に幹細胞を顕微鏡で観察したところ、その結果も、ガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地にビタミンＣ（アスコルビン酸；Ｌ−ＡｓｃｏｒｂｉｃＡｃｉｄ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が添加された培地（ビタミンＣ後処理実験群）で培養した幹細胞は、陽性対照群と類似のレベルを示した（図１）。

実施例３：抗酸化剤が含まれたガンマ線照射ＦＢＳを用いた幹細胞の培養
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）に２５ｋＧｙのガンマ線を照射してガンマ線滅菌ＦＢＳを準備し、ＦＢＳにビタミンＣ（アスコルビン酸；Ｌ−ＡｓｃｏｒｂｉｃＡｃｉｄ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を添加した後、２５ｋＧｙのガンマ線を照射することで、ビタミンＣが前処理されたガンマ線滅菌ＦＢＳを準備した。ビタミンＣは、ＦＢＳに対して０．１％または１％の濃度で添加した。

次に、実施例１で分離した３継代（ｐａｓｓａｇｅ３）のヒト脂肪組織由来の幹細胞を解凍し、０．５ｘ１０^６細胞／Ｔ７５フラスコの濃度でＴ７５フラスコに接種し、接種された幹細胞を前記準備したガンマ線照射ＦＢＳまたはビタミンＣが前処理されたガンマ線滅菌ＦＢＳがそれぞれ５％で含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（（株）ＲＢｉｏ）で、３７℃、ＣＯ_２インキュベーターにて２日間培養した。２日培養後、培地を除去し、５％のガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（陰性対照群）、５％のガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地にビタミンＣが添加された培地（ビタミンＣ後処理実験群）またはビタミンＣが前処理された５％のガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（ビタミンＣ前処理実験群）に交換した。ビタミンＣは、培養培地またはＦＢＳに対して０．１または１％の濃度で添加した。４日間培養した後、細胞増殖率および倍増時間を実施例２と同様の方法で調査した。陽性対照群も実施例２と同様に準備した。

その結果、表２および図４に示されたように、ガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれた培地（陰性対照群）で培養した幹細胞は、細胞数が減少し、倍増時間が増加したが、ガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地にビタミンＣが添加された培地（ビタミンＣ後処理実験群）およびビタミンＣが前処理されたガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（ビタミンＣ前処理実験群）で４日間培養した幹細胞の細胞数および倍増時間は、陽性対照群のレベルに向上した。

また、それぞれの培地で、４日目に幹細胞を顕微鏡で観察した結果、ガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地にビタミンＣが添加された培地（ビタミンＣ後処理実験群）およびビタミンＣが前処理されたガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（ビタミンＣ前処理実験群）で培養した幹細胞は、陽性対照群と類似のレベルを示した（図３）。

実施例４：２５ｋＧｙのガンマ線照射ＦＢＳで培養した幹細胞の付着力
実施例３と同様に、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）に２５ｋＧｙのガンマ線を照射してガンマ線滅菌ＦＢＳを準備し、ＦＢＳにビタミンＣ（アスコルビン酸；Ｌ−ＡｓｃｏｒｂｉｃＡｃｉｄ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を添加した後、２５ｋＧｙのガンマ線を照射することで、ビタミンＣが前処理されたガンマ線滅菌ＦＢＳを準備した。ビタミンＣは、ＦＢＳに対して１％の濃度で添加した。

次に、実施例１で分離した０継代(ｐａｓｓａｇｅ０)のヒト脂肪組織由来の幹細胞を解凍し、１．７ｘ１０^５細胞／Ｔ２５フラスコの濃度でＴ２５フラスコに接種し、接種された幹細胞を前記準備したガンマ線照射ＦＢＳまたはビタミンＣが前処理されたガンマ線滅菌ＦＢＳがそれぞれ５％で含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（（株）ＲＢｉｏ）で、３７℃、ＣＯ_２インキュベーターにて２日間培養した。２日培養後、培地を除去し、５％のガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（陰性対照群）、５％のガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地にビタミンＣが添加された培地（ビタミンＣ後処理実験群）またはビタミンＣが前処理された５％のガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（ビタミンＣ前処理実験群）に交換した。ビタミンＣは、培養培地またはＦＢＳに対して１％の濃度で添加した。陽性対照群も実施例２および３と同様に準備した。

それぞれの対照群および実験群で、幹細胞の密度が９０％となって継代培養可能な期間を調査した。

その結果、表３および図５に示されたように、ガンマ線を照射していない５％のｎｏｒｍａｌＦＢＳおよびＡＭＳＣ＋培養培地の陽性対照群は、培養１０日目に幹細胞の密度が９０％となり、ガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれた培地（陰性対照群）で培養した幹細胞は、培養８日目および培養１３日目に、何れも付着された細胞が殆どなかった。しかし、ガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地にビタミンＣが添加された培地（ビタミンＣ後処理実験群）、およびビタミンＣが前処理されたガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（ビタミンＣ前処理実験群）で培養した幹細胞は、陽性対照群と類似に、それぞれ１３日目および１０日目に幹細胞の密度が９０％となった。

実施例５：３０ｋＧｙのガンマ線照射ＦＢＳで培養した幹細胞の生存率
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）に３０ｋＧｙのガンマ線を照射してガンマ線滅菌ＦＢＳを準備し、ＦＢＳにビタミンＣ（アスコルビン酸；Ｌ−ＡｓｃｏｒｂｉｃＡｃｉｄ２−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を添加した後、３０ｋＧｙのガンマ線を照射することで、ビタミンＣが前処理されたガンマ線滅菌ＦＢＳを準備した。ビタミンＣは、ＦＢＳに対して１％の濃度で添加した。

次に、実施例１で分離した３継代(ｐａｓｓａｇｅ３)のヒト脂肪組織由来の幹細胞を解凍し、０．５ｘ１０^６細胞／Ｔ７５フラスコの濃度でＴ７５フラスコに接種し、接種された幹細胞を前記準備したガンマ線照射ＦＢＳまたはビタミンＣが前処理されたガンマ線滅菌ＦＢＳがそれぞれ５％で含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（（株）ＲＢｉｏ）で、３７℃、ＣＯ_２インキュベーターにて２日間培養した。２日培養後、培地を除去し、５％のガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（陰性対照群）、５％のガンマ滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地にビタミンＣが添加された培地（ビタミンＣ後処理実験群）、ビタミンＣが前処理された５％のガンマ線照射ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（ビタミンＣ前処理実験群）、またはビタミンＣが前処理された５％のガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地にビタミンＣが添加された培地（ビタミンＣ前＋後処理実験群）に交換した(表４)。ビタミンＣは、培養培地またはＦＢＳに対して０．１または１％の濃度で添加した。４日間培養した後(図６)、細胞増殖率、細胞数、生存率および倍増時間を調査した。陽性対照群も実施例２と同様に準備した。

その結果、表５および図１０に示されたように、ガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれた培地（陰性対照群）で培養した幹細胞は、細胞数および細胞生存率が減少し、倍増時間が増加したが、ガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地にビタミンＣが添加された培地（ビタミンＣ後処理実験群）で４日間培養した幹細胞の細胞数、生存率および倍増時間は、陽性対照群のレベルに向上した。

実施例６：３０ｋＧｙのガンマ線照射ＦＢＳで培養した幹細胞の付着および増殖率
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）に３０ｋＧｙのガンマ線を照射してガンマ線滅菌ＦＢＳを準備し、前記ガンマ線滅菌ＦＢＳが５％で含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（（株）ＲＢｉｏ）に１％ビタミンＣが添加された培地（ビタミンＣ後処理実験群）を準備した。

次に、実施例１で分離した１継代（ｐａｓｓａｇｅ１）のヒト脂肪組織由来の幹細胞を解凍し、１．７ｘ１０^５細胞／Ｔ２５フラスコの濃度でＴ２５フラスコに接種し、接種された幹細胞を前記準備したガンマ線照射ＦＢＳが５％で含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（（株）ＲＢｉｏ）で、３７℃、ＣＯ_２インキュベーターにて２日間培養した。２日培養後、培地を除去し、５％のｎｏｒｍａｌＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地（陽性対照群）、またはガンマ線滅菌ＦＢＳが含まれたＡＭＳＣ＋培養培地にビタミンＣが添加された培地（ビタミンＣ後処理実験群）に交換した。ビタミンＣは、培養培地に対して１％の濃度で添加した。

陽性対照群およびビタミンＣ後処理実験群の場合、２〜４継代（ｐａｓｓａｇｅ２〜４) の幹細胞の付着力（図１１ａ〜１１ｃ）、細胞数、細胞サイズ、および生存率を調査した（表６〜９）。図１１中の幹細胞の付着力はＬｅｉｃａ顕微鏡で調査し、表６〜９中の細胞数、細胞サイズ、および生存率はＬｕｎａ^ＴＭＡｕｔｏｍａｔｅｄｃｅｌｌｃｏｕｎｔｅｒＬ１０００１（Ｌｏｇｏｓｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で調査した。

その結果、２〜４継代(ｐａｓｓａｇｅ２〜４) の幹細胞の付着力、細胞数、細胞サイズ、および生存率は、陽性対照群と差がなかった。

実施例７：ガンマ線照射ＦＢＳおよびビタミンＣ後処理培地で培養された幹細胞の特性
実施例６の陽性対照群およびビタミンＣ後処理実験群で、４継代（ｐａｓｓａｇｅ４）の幹細胞の純度および特性を調査した。

幹細胞の純度は、ＦＡＣＳを用いてＣＤマーカー発現を確認し（図１２および表１０）、幹細胞の特性は、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞への分化を確認した（図１３〜１５）。脂肪細胞への分化はｓｉｇｍａ-ａｌｄｒｉｃｈプロトコルに従ってオイルレッドＯ染色により確認し、骨細胞への分化はｌｉｆｅｌｉｎｅｃｅｌｌｔｅｃｈのプロトコルに従ってアリザリンレッドＳ(alizarin red S)染色で確認し、軟骨細胞への分化はＴＳＰ２ＥＬＩＳＡで確認した。

その結果、３０ｋＧｙのガンマ線照射および１％ビタミンＣ後処理実験群のＣＤマーカー発現は、陽性対照群と差がなく、実験群の脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞への分化特性も陽性対照群と差がなかった。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳述したが、当業界における通常の知識を持った者にとって、このような具体的な記述は単なる好適な実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることはないという点は明らかである。よって、本発明の実質的な範囲は特許請求の範囲とこれらの等価物により定義されると言える。

Claims

（ａ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ）にガンマ線を照射するステップと、
（ｂ）前記ガンマ線照射ウシ胎仔血清にビタミンＣ（ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄ）を
添加した後、幹細胞培養培地であるＫＳＦＭ−Ｐ培地とＤＭＥＭ培地の混合培地に添加するステップと、
（ｃ）前記培養培地を用いて間葉系幹細胞を培養するステップと、を含む、間葉系幹細胞の培養方法。
前記ビタミンＣは、前記前記ガンマ線照射ウシ胎仔血清に対して０．０２５％〜１％の濃度で添加されることを特徴とする請求項１に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
前記ステップ（ｂ）のウシ胎仔血清は、２〜１０％の濃度で添加されることを特徴とする請求項１又は２に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
前記ＫＳＦＭ−Ｐ培地は、 L-アスコルビン酸2-リン酸、インスリン、Ｎ−アセチル
−Ｌ−システイン、塩化カルシウム、ヒドロコルチゾンおよびＦＢＳを含むＤｅｆｉｎｅｄケラチノサイト−ＳＦＭであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
前記ガンマ線照射は、吸収線量が２０〜３５ｋＧｙであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞の培養方法。
前記間葉系幹細胞は、脂肪組織由来であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の間葉系幹細胞の培養方法。