KR20070104735A

KR20070104735A - 중간엽 줄기세포 배양 배지 및 이를 이용한 중간엽줄기세포의 배양 방법

Info

Publication number: KR20070104735A
Application number: KR1020060036754A
Authority: KR
Inventors: 정재준; 김경숙; 김승현; 김희태; 채영규; 최미란
Original assignee: 코아스템(주)
Priority date: 2006-04-24
Filing date: 2006-04-24
Publication date: 2007-10-29
Also published as: WO2007123363A1; KR100908481B1

Abstract

본 발명은 기본 배지 및 제대혈 혈청을 포함하는 중간엽 줄기세포의 배양 배지에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 배양 배지를 이용하여 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법 및 중간엽 줄기세포를 획득하는 방법에 관한 것이다. 이에 의하여 중간엽 줄기세포를 대량으로 배양하여 획득할 수 있다.

중간엽 줄기세포, 제대혈 혈청, 배양 배지

Description

중간엽 줄기세포 배양 배지 및 이를 이용한 중간엽 줄기세포의 배양 방법{Culture media and methods for culturing mesenchymal stem cell}

도 1은 골수에서 분리된 단핵구 세포(MNCs; mononuclear cells)를 CG (CellGro™, CellGenix사) 및 MSCGM™ (Cambrex사) 배지가 들어있는 T25 플라스크에 5.28 x 10⁶ 세포의 농도로 분주하여 15일간 배양한 후, FACs(fibroblast-like adherent cells) 의 성장을 나타낸 그래프이다.

도 2는 MSCGM™ (Cambrex사)를 대조군으로 하여, MSCBM™ (Mesenchymal stem cell basal medium, Cambrex사)에 10% CS(제대혈 혈청; cord serum)를 첨가한 배지, MSCBM™ (Cambrex사)에 20% CS를 첨가한 배지, CellGro™ (CellGenix사)에 10% CS 를 첨가한 배지, CellGro™ (CellGenix사)에 20% CS (cord serum)를 첨가한 배지에서의 MSC의 증식률을 나타낸 그래프이다.

도 3은 MSCGM™ 배지를 대조군으로 하여, 10% Cord serum이 첨가된 MSCBM™ 배지 및 10% CS(제대혈 혈청; Cord serum)이 첨가된 CellGro™ 배지에서 증식된 MSC를 FACSCalibur (BD사)를 이용하여 유세포 분석(flow cytometry)을 시행하여 세포의 크기 및 표현형의 변화를 나타낸 그래프이다(SSC-H; granular content within cell, FSC-H; cell size).

도 4는 MSCGM™ 배지에서 증식된 MSC의 표면 마커에 대한 히스토그램을 나타낸 그래프이다.

도 5는 10% CS(cord serum)가 첨가된 MSCBM™ 배지에서 증식된 MSC의 표면 마커에 대한 히스토그램을 나타낸 그래프이다.

도 6은 10% CS가 첨가된 CellGro™ 배지에서 증식된 MSC의 표면 마커에 대한 히스토그램을 나타낸 그래프이다.

도 7은 MSCGM™배지를 대조군으로 하고, DMEM/F12 배지에 CS(제대혈혈청)과, 인슐린, 하이드로코르티존, EGF 및 LIF의 성장인자를 혼합한 배지에서 증식된 MSC의 성장 및 증식률을 그래프로 나타낸 그래프이다.

도 8은 MSCGM™ 배지를 대조군으로 하고, DMEM/F12 배지에 5% 또는10% CS(제대혈 혈청)과, 인슐린, 하이드로코르티존, EGF 및 LIF를 혼합한 배지에서 증식된 중간엽 줄기세포(MSC)의 크기 및 표현형의 변화를 나타낸 그래프이다(SSC-H; granular content within cell, FSC-H; cell size).

도 9 는 DMEM/F12 배지에 5% 제대혈 혈청과, 인슐린, 하이드로코르티존, EGF, LIF의 성장인자를 혼합한 배지에서 증식된 MSC의 표면 마커에 대한 히스토그램을 나타낸 그래프이다.

도 10은 DMEM/F12 배지에 10% 제대혈 혈청과, 인슐린, 하이드로코르티존, EGF, LIF의 성장인자를 혼합한 배지에서 증식된 MSC의 표면 마커에 대한 히스토그램을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 기본배지 및 제대혈 혈청을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 배지 및 이를 이용하여 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법, 및 이를 이용하여 중간엽 줄기세포를 획득하는 방법에 관한 것이다.

줄기세포는 미분화 상태에서 일정기간 동안 자신과 동일한 세포를 지속적으로 만들어 낼 수 있는 성질과 적당한 조건하에서는 특정한 세포로 분화하는 성질을 가지고 있다. 줄기세포는 그 기원에 따라 배아 줄기세포(embryonic stem cell)와 성체 줄기세포(adult stem cell)로 구분될 수 있다. 사람 배아 줄기세포는 인간 생명체로 발생할 수 있는 배아로부터 만들어지기 때문에 많은 윤리적인 문제점을 가지고 있으나 성체 줄기세포에 비하여 세포증식 및 분화 능력이 우수한 것으로 알려져 있다. 성체 줄기세포는 골수, 혈액, 뇌, 피부 등에서 얻을 수 있어 윤리적인 문제가 적으나 배아 줄기세포에 비하여 한정된 분화능력(multipotency)을 가지고 있다. 성체 줄기세포 중 가장 연구가 많이 진행된 것은 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cell)이며, 최근 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)에 대한 연구들도 활기를 띠고 있다.

한편, 생체에서와는 달리 체외에서 인위적으로 동물 세포를 배양하기 위하여 배양 배지를 공급하려면, 혈장이나 림프액과 같은 체액을 근거로 한 생체의 조건에 가까운 영양분과 pH, 온도, 삼투압 등의 환경 조건을 충분히 만족시켜 주어야 한다. 따라서, 체액을 근거로 배양 배지 조성을 결정하고 이 결정된 배양 배지를 선택하여 혈청을 적정 비율로 세포에 맞게 첨가한 뒤 세포 배양에 이용하여 왔다. 이에 인간줄기세포를 배양하기 위한 다양한 배지 조성물이 개시되고 있는데, 예를 들면, 동물혈청(우태아혈청)을 함유하는 배지를 이용하여 인간 줄기세포를 배양하는 방법이 있다. 그러나, 이 방법은 우태아혈청으로 배양한 세포를 태아혈청이 없는 용액으로 세척하더라도 상당량의 우태아혈청이 세포내 잔류하여 강력한 이종항원으로 작용하고, 또한 광우병 등 소의 질환의 인체감염 가능성 등의 문제점을 가지고 있다. 즉, 줄기세포를 임상에 적용하기 위해서는 배양과정에 사용되는 물질들이 안정성 측면에서 사람에서 유래된 물질이거나 그 안정성이 입증된 물질들을 사용해야만 한다.

이를 위하여 종래 세포배양에서 사용된 동물 유래의 혈청 대신 인간혈청을 사용한 배지에 대하여 대한민국 공개특허 제2005-0099724호에서 개시하고 있다. 그러나 상기 공개특허에 개시된 배지에서 배양한 줄기세포는 중간엽 줄기세포임을 나타내는 마커인 CD105의 발현율이 낮다. 또한 미국 공개특허 제2003/0232432호에서는 인간 제대혈 혈청을 포함하는 배지에 대하여 개시하고 있으나, 제대혈 혈청을 만드는 방법에 대해서만 기술하고 있을 뿐이다.

이에 본 발명자들은 중간엽 줄기세포의 체외증식 배양의 효율을 높이고, 연구 목적 및 임상 적용에 따른 안정성 측면에서 문제없는 배양 배지를 개발하고자 노력하였는바, 제대혈 혈청이 포함된 배양 배지가 중간엽 줄기세포의 배양에 효과 및 선별력이 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 기본배지 및 제대혈 혈청을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 배지를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기의 배지를 이용하여 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기의 배지를 이용하여 배양된 중간엽 줄기세포를 획득하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 기본배지 및 제대혈 혈청을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 배지에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어 "배지"는 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 말한다. 특히, 본 발명의 배지는 중간엽 줄기세포의 배양을 위한 배지이다. 상기의 "중간엽 줄기세포"는 인간을 포함한 포유동물 유래의 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포에 서 분리한 세포로서, 무한정으로 증식할 수 있는 능력 및 여러 가지 세포형태(예를 들면, 지방세포, 연골세포, 근육세포, 뼈세포 등)로 분화가 가능한 세포이다. 상기의 "배양"은 중간엽 줄기세포의 성장 및 증식을 포함하는 의미이다.

본 발명의 "기본배지"는 세포가 살아가기 위해 필요한 필수적인 당, 아미노산, 물 등이 포함되어 있는 혼합물로서, 혈청, 영양 물질 및 각종 중간엽 줄기세포 성장인자를 제외한 혼합물이다. 본 발명의 기본배지는 인위적으로 합성하여 제조하여 사용하거나 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 배지는 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

혈청은 동물 또는 사람의 혈액으로부터 원심분리하여 얻을 수 있는 상층액이다. 상기 혈청은 세포의 성장 시 필요한 필수 영양소 이외에 성장에 필수적이나 명확히 규명되지 않은 각종 무기염, 폴리펩타이드성 성장인자, 및 폴리펩타이드성 호르몬 등의 각종 인자를 포함하는 미량원소가 포함되어 있다.

본 발명의 "제대혈 혈청"은 태아의 탯줄에서 분리한 혈청을 말한다. 본 발명의 제대혈 혈청은 바람직하게는 태아의 출산 또는 사산 시 버려진 탯줄에서 얻을 수 있다. 제대혈은 탯줄 정맥으로부터 혈액 백(blood bag)에 연결된 주사바늘을 삽입시켜 수집할 수 있다. 이 혈액 수집은 실온에서 시행되며, 한 탯줄당 최대 100 cc까지 얻을 수 있다. 이 모든 과정은 오염이 없는 크린룸에서 시행될 수 있 으며, 이렇게 수집된 탯줄혈액은 혈액의 응고를 통해 혈장성분만을 수집할 수 있다. 혈액의 응고는 항-응고제가 포함되지 혈액백을 사용하여 수행되거나 또는 응고를 돕기 위해 응고제를 추가적으로 첨가할 수 있으나, 바람직하게는 첨가하지 않고 자연적인 응고를 유도한다. 응고에 필요한 시간은 5분, 30분, 1시간, 5시간, 8시간 또는 그 이상 이루어 질 수 있으며, 원심분리를 통하여 혈구와 혈장성분으로 분리할 수 있다. 이 모든 과정에서 쓰이는 용기는 멸균된 것을 이용하며, 미생물에 대한 오염 등의 생물학적인 안정성을 시험하여야 한다. 또한, 우태아혈청 등의 혈청성분과 마찬가지로 56℃에서 30분 동안 반응시켜 혈장성분을 불활성화시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 제대혈 혈청이 포함된 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양한 결과, 사람혈청 보다는 우태아혈청이, 우태아혈청보다는 재대혈 혈청이 보다 우수한 배지임을 상대적인 비율로 알 수 있었고, 또한 종래에 공지된 중간엽 줄기세포의 배양배지에 비하여 우수한 배양 효과를 나타내고 있음을 알 수 있었다(표1, 도 1 및 도 2 참조).

본 발명의 제대혈 혈청의 기원으로는, 사람, 소, 염소, 돼지, 말 등의 탯줄이 있는 동물이면 어떠한 기원도 가능할 것이며, 바람직하게는 사람, 소에서 기인한 것이며, 보다 바람직하게는 사람에서 기인한 것이다.

본 발명의 배지에 사용하는 제대혈 혈청의 농도는 전체 배지 조성물의 1 내지 30%, 바람직하게는 3 내지 25%, 보다 바람직하게는 3 내지 20 %, 가장 바람직하게는 5 내지 10% 이다.

구체적 양태로서, 본 발명의 배양 배지는 영양혼합물(Nutrient Mixture)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 영양혼합물은 세포배양에 일반적으로 사용되는 각종 아미노산, 비타민, 무기염 등을 포함하는 혼합물로서, 상기 아미노산, 비타민, 무기염 등을 혼합하여 제조하거나 상업적으로 제조된 영양혼합물을 사용할 수 있다. 상업적으로 제조된 영양혼합물은 예를 들면, F-12, M199,, MCDB110, MCDB202, MCDB302, 등이 있으며, 바람직하게는 F-12 영양혼합물(F-12 Nutrient Mixture), M199, MCDB media등을 사용할 수 있다. 상기 영양혼합물은 기본배지에 1 내지 10: 1로 희석하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 5: 1로 희석하여 사용할 수 있다.

구체적 양태로서, 본 발명의 배양 배지는 중간엽 줄기세포의 성장에 영향을 주는 중간엽 줄기세포 성장인자를 추가로 포함할 수 있다. 중간엽 줄기세포의 성장인자는 예를 들면, 인슐린(Insulin), 하이드로코르티존(Hydrocortisone), EGF(Epidermal Growth Factor), LIF(Leukemia Inhibitory Factor), GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor), EPO(Erythropoietin), FGF(Fibroblast Growth Factor), IGF(Insulin-like growth factor), PDGF( Platelet-derived growth factor), SCF(Stem cell factor), TGF (Transforming growth factor) 등이 있다. 본 발명의 구체적 실시에서는, 인슐린, 하이드로코르티존, EGF, LIF 등을 사용하였다. 상기 중간엽 줄기세포 성장인자 중 예를 들면, 인슐린은 본 발명의 기본배지에 0.1 내지 500 ng/ml 농도로, 바람직하게는 0.5 내지 100 ng/ml 농도로, 보다 바람직하게는 0.5 내지 50 ng/ml 농도로, 가장 바람직 하게는 1 내지 30 ng/ml 농도로 포함할 수 있고, 하이드로코르티존은 0.1 내지 500 nM 농도로, 바람직하게는 0.5 내지 100 nM 농도로, 보다 바람직하게는 0.5 내지 50 nM 농도로, 가장 바람직하게는 1 내지 30 nM 농도로 포함할 수 있고, EGF는 0.1 내지 500 ng/ml 농도로, 바람직하게는 0.5 내지 100 ng/ml 농도로, 보다 바람직하게는 0.5 내지 50 ng/ml 농도로, 가장 바람직하게는 1 내지 30 ng/ml 농도로 포함할 수 있고, LIF는 0.01 내지 500 ng/ml 농도로, 바람직하게는 0.05 내지 100 ng/ml 농도로, 보다 바람직하게는 0.1 내지 50 ng/ml 농도로, 가장 바람직하게는 0.5 내지 30 ng/ml 농도로 포함할 수 있다. 본 발명자는 다양한 기본배지 및 제대혈 혈청을 기본으로 하여, 상기 인슐린, 하이드로코르티존, EGF, LIF를 각각 10ng/ml, 10nM, 10ng/ml 및 10ng/ml 농도로 배지에 혼합하여 줄기세포의 성장을 관찰하였을 때, 첨가하지 않은 배지에서의 성장에 비해 상대적인 성장률이 높음을 알 수 있다(도2 및 도 7).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 중간엽 줄기세포 배양 배지를 이용하여 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계 및 분리된 중간엽 줄기세포를 본 발명의 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 배양 방법에 관한 것이다.

본 발명의 배양방법에서, 상기 중간엽 줄기세포는 인간 또는 동물의 배아줄기세포 또는 성체줄기세포에서 유래한 전분화능을 가진 세포이며, 바람직하게는 인 간 배아줄기세포 또는 성체줄기세포에서 유래한 세포이다.

본 발명의 중간엽 줄기세포의 분리 방법은 당해 기술 분야의 공지된 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 공여받은 조직에서 얻은 세포를 중간엽 줄기세포 기본배지로 희석하고, 원심분리하여 세포만을 모으고, 상기 세포를 1 내지 500,000 단핵세포수/cm²로, 바람직하게는 1,000 내지 50,000 단핵 세포수/cm² 농도로 세포배양용 플라스크에 배양하여 1 내지 30일 동안, 바람직하게는 5 내지 15일 동안 배양하고, 1 내지 10일에, 바람직하게는 2 내지 4일에 배지를 교체배양하여 부착 세포 및 증식하는 중간엽 줄기세포를 획득할 수 있다. 상기 공여받은 조직은, 골수, 혈액, 뇌, 피부, 제대혈, 배아 및 각종 조직 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 세포 증식 및 분화능력이 우수한 제대혈, 골수 또는 혈액을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 획득이 용이하고, 많은 양을 쓸 수 있으며, 자신의 조직으로부터 분리하여 면역반응을 최소화하게 할 수 있는 골수로부터 분리한다. 상기 중간엽 줄기세포는 각종 조직 및 세포로 분화하기 용이하며, 세포 자체로서 세포치료제로 사용할 수 있다.

상기 분리된 중간엽 줄기세포는 본 발명의 배양 배지에서 배양한다. 분리 및 배양한 중간엽 줄기세포는 CD105(SH2), CD29, CD44, CD73, CD166 등의 양성 표면 마커를 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상 발현하며, 특히 CD44 및 CD105(SH2) 양성 표면마커를 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상 발현한다. 또한, 분리 및 배양한 중간엽 줄기세포는 CD34, CD45, HLA-DR, CD1a, CD14, CD31, CD80 등의 음성 표면 마커를 50% 이하, 바람직하게는 10% 이하 발현하며, 특히 CD34 음성 표면 마커를 50% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 5% 이하 발현한다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 중간엽 줄기세포를 본 발명의 배지에서 배양하는 단계 및 배양 배지를 원심분리기에서 분리하여 중간엽 줄기세포를 획득하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 획득하는 방법에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포를 획득하는 방법은 본 발명의 배양 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하고, 이 배양 배지에서 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계를 포함한다. 중간엽 줄기세포의 분리는 당해 분야에서 공지된 방법에 의하여 수행할 수 있다. 하나의 예로서, 중간엽 줄기세포를 1 내지 10,000 세포수/cm²로, 바람직하게는 50 내지 6000 세포수/cm² 농도로 본 발명의 배양 배지가 포함된 세포배양용 플라스크에서 3 내지 40일 동안, 바람직하게는 6 내지 20일 동안 배양하고, 1 내지 10 일, 바람직하게는 2 내지 4일에 배지를 교체배양하여 부착 세포 및 증식하는 중간엽 줄기세포를 획득할 수 있다. 상기 방법으로 얻은 부착세포는 계속 계대배양하거나, 또는 배양 배지에 혼탁하여 초저온냉동 보존법 등을 이용하여 보관할 수 있다. 상기 초저온 냉동 보존법은 당업자라면 알 수 있는 일반적인 방법을 변형하여 수행할 수 있으며, 예를 들면 줄기세포 기본 배지에 10 내지 20%의 혈청 및 5 내지 10 % DMSO 가 포함된 동결보존액에 혼탁하여 보관할 수 있으며, 보다 바람직하게는 MSCGM™을 기본배지로하여 10% 우태아혈청(FBS) 및 5% DMSO가 함유된 동결보존액에 혼탁하여 -176℃ 액체질소에 보관할 수 있다. 획득한 중간엽 줄기세포는 필요에 따라 다양한 조직과 신경세포로 분화할 수 있으며, 손상된 골, 연골, 지방, 신경세포, 간, 및 각종 장기의 재생 및 치료제로 쓸 수 있다.

본 발명의 세포배양법은 중간엽 줄기세포를 대량으로 배양하고, 중간엽 중기세포를 보관하여 세포치료제로 사용될 때 유용하게 응용될 수 있으며, 인간의 질병을 치료하는 세포치료제로서 사용될 때 안정성이 확보되는 배양 배지를 제공할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : MSC 의 분리 및 배양

정상 건강인의 공여 혹은 환자 자신으로부터 공여받은 11㎖의 골수를 DMEM 배지로 1:2의 비율로 희석한 후, 미리 준비한 10㎖의 히스토파크(Histopaque; Sigma, density 1.077g/㎖) 층 위에 점적하고, 400×g에서 30분간 실온에서 원심분 리하였다. 단핵구 세포층을 분리하고, DMEM 배지를 첨가한 후 400×g에서 5분간 실온에서 원심분리하고, 얻어진 단핵구 세포를 DMEM 배지로 2회 세척한 후 MSCGM™배지에서 37℃와 5% C0₂를 유지하며 배양하였다. 배양 48시간 후, 플라스크 바닥에 붙지 않은 세포를 새로운 배지로 교환하여 제거시키고, 플라스크 바닥에 붙은 세포를 3 내지 4일에 한 번씩 배지를 갈아주며 배양하였다. 배양된 세포가 80%정도 자랐을 때 새 플라스크로 계대하여 배양하고, 배양한 세포는 일부는 계속 계대배양하고, 일부는 MSCGM™, 10% 우태아 혈청(FBS) 및 5% DMSO이 함유된 동결보존액에 혼탁하여 -176℃ 액체질소에 보관하였다.

실시예 2 : CG ( Cell Genix 사) 배지에서의 MSCs 증식력 검증실험

CG(Cell Genix 사)의 MSCs 증식력을 검증실험하기 위한 실험으로, Cell Genix사로부터 직접 공급받은 배지 CG ①, ②, ③ 과, 캠브렉스(Cambrex)사로부터 구입한 MSCGM™, 10% 우태아혈청 (FBS, Hyclone)를 함유하고 있는 DMEM (Gibco) 배지를 이용하여 실시예 1에서 분리하여 세척된 단핵구 세포를 5종류의 배지가 각각 들어있는 T25 플라스크에 5.28 x 10⁶ 개의 세포를 접종하고, 37℃와 5% C0₂를 유지하며 배양하였다. 배양 48시간 후, 플라스크 바닥에 붙지 않은 세포를 새로운 배지로 교환하여 제거시키고, 플라스크 바닥에 붙은 세포를 3 내지 4일에 한 번씩 배지를 갈아주며 배양하였다.

그 결과, CG ①, ② 및 ③의 배지 모두에서 단핵구 세포를 분주 후, 24시간 내에 부유띠를 형성하였으며, 첫 번째 배지 교환 후 플라스크 바닥에 붙어 있는 세포들이 거의 없었으며, 22일간 배지를 교환하며 유지하였으나, 자라는 세포가 없어서 배양 22일째에 중지하였다. MSCGM™배지로 배양한 플라스크에서는 세포 콜로니가 10개 이상 관찰되었으며, 배양 15일째에 3×10⁵ 개의 섬유아세포-부착세포(fibroblast-like adherent cells (FACs))를 수확했다. 10% 우태아혈청(FBS)를 함유하고 있는 DMEM배지에서 배양한 플라스크에서는 세포 콜로니가 5개 이상 관찰되었으며, 배양 15일째에 1.5×10⁵ 개의 FACs를 수확했다(도 1). 이로써, 간엽줄기세포의 배양에서 혈청을 포함한 CG사의 기본배지는 캠브렉스(Cambrex사)로부터 구입한 MSCGM™에 비해 그다지 효과가 없음을 알 수 있었다.

실시예 3 : MSCGM ™을 대조군으로 해서, DMEM 배지에 사람혈청( HS )과 SSS 의 효과분석

DMEM 배지 및 사람혈청(human serum; HS)과 SSS에 의한 MSC 증식력을 조사하기 위하여, MSCGM™(Cambrex사) 배지를 대조군으로 하여, DMEM(Gibco사)를 다양한 조건으로 용해하고 각종 혈청을 첨가한 DMEM 배지(Gibco사)에서 배양하여 MSC의 증식을 관찰하였다. A-C군은 대조군으로서 MSCGM™ (Cambrex사)배지, B-D군은 증류수에 녹인 DMEM(Gibco사)배지에 10% HS (Cambrex사) 단독 혹은 5% SSS (Irvine scientific사)를 동시에 함유하도록 한 것이고, C-L군은 DMEM (Gibco사)을 로비스사의 증류수(LOVIS water, 경원엔터프라이즈사)로 녹인 후 10% HS (Cambrex사) 단독 혹은 5% SSS (Irvine scientific사)를 동시에 함유하도록 제조하여 실험을 수행하였다.

실시예 1의 MSCGM™, 10% 우태아 혈청(FBS) 및 5% DMSO이 함유된 동결보존액에 보관 되었던 2.0 × 10⁶개의 중간엽줄기세포( mesenchymal stem cells; MSC)를 37℃ 중탕기에서 재빨리 녹인 후, MSCGM™ 배지로 2회 세척한 후 5ml의 MSCGM™ 배지로 혼합한 후 상기 대조군 배지A-C 및 10% HS를 함유하는 DMEM 배지 B-D C-L군이 든 T25 플라스크에 6.6 × 10⁵씩 분주하여, 37℃와 5% C0₂를 유지하며 배양하였다. 처음 배양 후 4일째에 배지를 교체하고 세포를 관찰한 결과, B-D와 C-L군의 MSCs는 A-L군에 비해 현미경 상으로 확인이 어려웠다. 다시 배양 7일째에, 0.125% 트립신-이디티에이(trypsin-EDTA)를 처리하여 떼어낸 후, T75 플라스크에 배양하던 세포의 1/2만 계대하여 배양하였다. 이때 B-D와 C-L군은 10% HS 단독 혹은 5% SSS를 동시에 함유하도록 한 DMEM에 나누어 접종하였다.

그 결과로서, 10% HS만을 첨가한 배지인 B-D와 C-L, 그리고 10% HS 및 5% SSS를 동시에 첨가한 배지 모두 MSCs를 분주 후 48시간 이내에 세포가 플라스크 바닥에서 떨어지며 사멸하는 것이 관찰되었으며, 대조군인 A-L 배지에서 배양한 간엽줄기세포(MSCs)만 잘 자라는 것이 관찰되었다(표 1). 이로써, 10% HS 및 10% SSS는 그다지 중간엽줄기세포의 성장에 기여하지 못함을 알 수 있었다.

배양배지 및 계대회수에 따른 세포 수

	A-C	B-D	C-L	B-D + 5% SSS	C-L + 5% SSS
1^st세포접종	6.6 × 10⁵	6.6 × 10⁵	6.6 × 10⁵	-	-
1^st 수확	20 × 10⁵	6.6 × 10⁵	7.2 × 10⁵	-	-
2^nd세포접종	20 × 10⁵	3.3 × 10⁵	3.6 × 10⁵	3.3 × 10⁵	3.6 × 10⁵
2^nd 수확	82 × 10⁵	폐기	폐기	폐기	폐기

실시예 4 : MSCGM ™을 대조군으로 해서, CG 배지에 우태아혈청 ( FBS ), 사람혈청과 SSS의 효과분석

CG배지를 기본으로하여 우태아혈청, 사람혈청(human serum) 과 및 SSS에 의한 MSC 증식력을 조사하기 위하여, MSCGM™ (Cambrex사)배지를 대조군으로 하여, CG(CellGro™; CellGenix사)에 하기와 같은 첨가하여 배양하고 MSC의 증식을 관찰하였다. 각종 CG 배지의 조건으로, 10% 우태아혈청(FBS)를 함유한 CG 배지, 10% 사람혈청(human serum, HS; Cambrex사)를 첨가한 CG 배지, 10% HS와 5% SSS(serum substitute supplement; Irvine scientific사)가 동시에 첨가된 CG 배지, 그리고 아무것도 넣지 않은 CG 배지 단독으로 사용하여 실험을 진행하였다.

실시예 1의 동결 보존되었던 MSCs를 실시예 3과 동일한 방법으로 해동하여, 각각의 배지가 들어있는 T25 플라스크에 3×10⁵씩 분주하여, 37℃와 5% C0₂를 유지하며 배양하고, 3 내지 4일에 한 번씩 배지를 교체배양하였다.

그 결과, 배양 6일째 캠브렉스(Cambrex)사의 MSCGM™과 10% 우태아혈청(FBS) 를 함유한 CG 배지에서만 MSC의 증식이 관찰되었고, 그 외의 조건에서는 MSC의 증식이 없었다.

실시예 5 : MSC 기본배지에 제대혈 첨가에 의한 증식력 및 표면마커 분석

5-1. 인간 제대혈( human cord serum ) 첨가에 의한 MSC 증식력 조사

인간 제대혈(human cord serum, CS) 첨가에 의한 MSCs 증식력을 조사하기 위하여, Cambrex사의 MSCBM™ (Mesenchymal stem cell basal medium, Cambrex사) 및 CellGro™ (CellGenix사)를 기본 배지로 하여 CS를 다양한 농도로 첨가하여 배양배지로 사용하였으며, 대조군으로 MSCGM™,를 사용하였다. 실험에 사용한 배지 조건으로, 10% CS를 함유한 MSCBM 배지, 20% CS를 함유한 MSCBM 배지, 10% CS 를 첨가한 CG 배지, 20% CS를 첨가한 CG 배지군을 사용하였고, 상기 CS는 태아의 분만시 반출되는 탯줄에서 제대혈을 채취하여 멸균 처리된 튜브에 담아 상온에서 20분간 두어 응고시킨 후, 700 ×g 에서 10분간 원심분리하여 상층의 혈청만 분리해서 사용했다.

실시예 1에 동결 보존되었던 MSCs를 실시예 3과 동일한 방법으로 해동하여, 각각의 배지가 들어있는 T25 플라스크에 2.4×10⁵씩 분주하여, 37℃와 5% C0₂를 유지하며 배양하고, 3 내지 4일에 한 번씩 배지를 교체배양하고, 세포가 바닥 면적의 80% 이상 자라면 계대 배양을 수행하였다.

그 결과로서, 2차 및 3차 계대배양에서 MSCGM™배지에서 배양한 대조군에 비해 CS가 첨가된 다른 4종류의 배지군에서 MSCs의 성장율이 높았고, 특히 CS가 첨가된 MSCBM™ 배지군에서 MSCs의 성장율이 2배 이상 높음을 관찰할 수 있었다. 이 결과들을 바탕으로 MSCs의 배양 증식을 위한 배지에 CS의 첨가가 매우 유용함을 확인하였다(도 2).

5-2. 인간 제대혈청 ( human cord serum ) 첨가에 의한 MSC 배양에서 세포표면마커 분석

실시예 5-1의 실시예의 배양배지에서 세포를 3차 계대 배양한 후, 배양된 MSCs를 0.125% 트립신(trypsin-EDTA)를 처리하여 떼어내고, 400xg에서 5분간 원심 분리하여 세포를 획득한 다음, 2% FBS를 함유한 Mg² ⁺ & Ca² ⁺ -free PBS (Gibco)로 2회 세척하고, 9개의 FACS용 튜브 (BD사)에 세척한 MSCs를 100ul씩 동일하게 분주 후 9종류의 항체를 10ul씩 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시킨 후 2% FBS를 함유하고, Mg² ⁺, Ca² ⁺ 함유하지 않은 PBS(Gibco)로 MSCs를 세척하여 400 ×g에서 5 분간 실온에서 원심분리하는 과정을 2회 반복 실시하였다. 세척 후 상기 2% FBS-PBS(Gibco)를 50ul씩을 첨가하여 유세포분석기를 이용하여 분석하였으며, MSCs의 세포표면(surface maker)를 분석하여 줄기세포로서의 표현형의 변화를 관찰하였다. 이때 항체들은 프로레신 아이소티오사이네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)가 결합된 IgG1 음성 대조구 (Serotec), CD29 (Serotec), CD44 (Dako), CD105 (Serotec) 및 HLA-DR (Serotec)과 피코에리틴(phycoerythrin, PE)이 결합된 IgG1 음성대조구 (Serotec), CD34 (Serotec), CD45 (Dako) 및 D73 (BD Biosciences)을 사용하였다.

그 결과, 대조군 MSCGM™과 10% CS를 함유한 MSCBM™ 배지군에서 배양한 MSCs는 세포 크기와 부피가 비슷하였으나, 10% CS 함유된 CellGro™ 배지에서 배양된 MSCs는 세포 크기가 작으면서, SSC-H의 분포가 넓은 것을 관찰하였고(도 3), 그 핵형에서는 대조군 MSCGM™과 10% CS가 첨가된 MSCBM™ 배지에서 배양된 MSCs는 95% 이상의 세포에서 CD105가 발현되나, CellGro™ 배지(10% CS 함유 )의 경우에는 30% 가량의 세포에서만 CD105가 발현되었다(도 4, 5, 6). 또한 일반적으로 MSCs 세포 표면 마커로 사용되는 CD29⁺, CD44⁺, CD73⁺, CD105⁺, CD34^-, CD45^-, HLA-DR^-발현을 표 2에 나타내었다.

배양배지에 따른 MSC 표면 마커의 발현률

	CD29⁺ MSCs	CD44⁺ MSCs	CD73⁺ MSCs	CD105 ⁺ MSCs	CD34^- MSCs	CD45^- MSCs	HLA-DR^- MSCs
MSCGM™	98.87%	99.75%	100%	98.96%	99.85%	99.67%	99.45%
MSCBM™+10%CS	99.99%	99.95%	100%	99.65%	99.97%	99.65%	99.75%
CellGro™+10%CS	98.46%	99.33%	99.84%	30.58%	96.68%	96.17%	98.94%

실시예 6 : 개발 배지에서의 MSC 증식력 및 표면마커 분석

6-1. 개발 배지에서의 MSC 증식력 조사

자체 개발된 배지에서 MSC의 증식력을 조사하기 위하여, Cambrex사의 MSCGM™를 대조군으로 하고, 인슐린(insulin; 10ng/ml), 하이드로 코르티존(hydrocortisone;10nM), EGF (10ng/ml), 그리고 5% CS(cord serum)가 첨가된 DMEM /F12 (Gibco) 배지①, 인슐린(insulin; 10ng/ml), 하이드로 코르티존(hydrocortisone;10nM), EGF (10ng/ml), 그리고 10% CS가 첨가된 DMEM/F12 배지②에서 실험을 수행하였다.

실시예 1에 동결 보존되었던 MSCs를 실시예 3과 동일한 방법으로 해동하여, 각각의 배지가 들어있는 T25 플라스크에 2×10⁵씩 분주하여, 37℃와 5% C0₂를 유지하며 배양하고, 3 내지 4일에 한 번씩 배지를 교체배양하고, 세포가 바닥 면적의 80% 이상 자라면 계대 배양을 수행하였다.

그 결과, 1차 계대배양에서는 배양된 MSCs는 대조군 MSCGM™ 에 배해서 세포증식율과 큰 차이가 없었으나, 5% CS 배지가 함유된 DMEM/F12 ①배지서의 MSC의 증식율에서는 대조군 MSCGM™ 보다 2배 이상 높게 관찰되었다. 또한 2차 계대배양에서도 MSCs의 증식율은 5% CS 배지가 함유된 DMEM/F12 ①배지, 10% CS 배지가 함유된 DMEM/F12 ②배지가 대조군 MSCGM™배지에서 보다 월등히 높은 것을 관찰하였다(도 7).

6-2. 개발 배지에서 배양된 MSC 세포표면마커 분석

실시예 6-1에서 배양한 MSCs 세포를 세포표면 마커를 분석하기 위하여, 실시예 5-2와 동일한 방법으로 세포를 처리하여 FACSCalibur (BD사)의 유세포분석기를 이용하여 표현형의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 대조군 MSCGM™에서 배양한 MSCs는 세포의 크기와 부피가 다양하였으나, 사람 제대혈 및 인슐린(insulin), EGF, 하이드로코르티존(hydrocortisone), LIF 등을 함유하는 DMEM/F12 배지군에서 배양한 MSC 세포는 일정한 크기와 부피가 가진 결과를 얻었다(도 8). 그 결과를 바탕으로 하여 각 5% 및 10%의 제대혈을 함유하는 배지에서 성장한 MSC의 표현형을 분석하여 본 결과, 5%의 제대혈혈청 및 각종 성장인자를 함유하는 DMEM/F12배지 및 10%의 제대혈혈청 및 각종 성장인자를 함유하는 DMEM/F12배지에서 배양된 MSC의 경우, CD45의 발현 그래프가 음성 대조군(negative control)에 비해 오른쪽으로 이동한 양상을 보였으나, 발현의 해석상 음성으로 모두 판독되었고, 중간엽줄기세포 표면 마커로 알려져 있는 CD29, CD44, CD105, CD73에서 98% 이상의 양성세포를 얻었다(도 9 및 10). 또한 MSC의 세포표면마커를 분석하여 표현형의 변화를 관찰한 결과, 배지에 따라 증식된 MSC의 표현형 분석결과는 CD34, CD45, HLA-DR 표지자 분석에서 얼마간의 분포 차이가 관찰되었으나 유의한 변화는 없었다(표 2).

본 발명의 제대혈 혈청을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 배지는 종래의 줄기세포 배양 배지에 비하여 중간엽 줄기세포의 전분화능을 유지하면서 성장 및 증식에 우수한 효과가 있어, 이를 이용하여 중간엽 줄기세포를 대량으로 배양하여 순수한 중간엽 줄기세포를 획득할 수 있다.

Claims

기본배지 및 제대혈 혈청을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 배지.
제1항에 있어서, 제대혈 혈청이 전체 배지 조성물의 1 내지 30% 포함하는 배지.
제2항에 있어서, 제대혈 혈청이 전체 배지 조성물의 3 내지 20% 포함하는 배지.
제1항에 있어서, 중간엽 줄기세포 성장 인자를 추가로 포함하는 배지.
제4항에 있어서, 중간엽 줄기세포 성장 인자가 인슐린, 하이드로코르티존 (hydrocortisone), EGF 또는 FGF 중 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 배지.
제5항에 있어서, 전체 배지 조성물에서 인슐린이 1 내지 500ng/㎖, 하이드로코르티존이 0.1 내지 500 nM, EGF가 0.1 내지 500 ng/ml 또는 LIF가 0.01 내지 500 ng/ml 농도인 배지.
제1항에 있어서, 중간엽 줄기세포가 인간에서 유래한 것인 방법.
배양된 중간엽 줄기세포가 CD105 및 CD44 양성 표면마커를 95% 이상 발현하는, 기본 배지 및 제대혈 혈청을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 배지.
배양된 중간엽 줄기세포가 CD34 음성 표면마커를 10% 이하로 발현하는, 기본 배지 및 제대혈 혈청을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 배지.
배양된 중간엽 줄기세포가 CD105 및 CD44 양성 표면마커를 95% 이상 발현하고, CD34 음성 표면마커를 10% 이하로 발현하는, 기본 배지 및 제대혈 혈청을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 배지.
제10항에 있어서, 배양된 중간엽 줄기세포가 CD105 및 CD44 양성 표면 마커를 98% 이상 발현하고, CD34 음성 표면 마커를 5% 이하로 발현하는, 기본 배지 및 제대혈 혈청을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 배지.
제10항에 있어서, 배양된 중간엽 줄기세포가 CD105, CD29, CD44, CD73 및 CD166 양성 표면 마커를 95% 이상 발현하고, CD34, CD45, HLA-DR, CD1a, CD14, CD31 및 CD80 음성 표면 마커를 5% 이하로 발현하는, 기본 배지 및 제대혈 혈청을 포함하는 중간엽 줄기세포 배양 배지.
제10항에 있어서, 제대혈 혈청이 전체 배지 조성물의 1 내지 30% 포함하는 배지.
제10항에 있어서, 중간엽 줄기세포 성장 인자를 추가로 포함하는 배지.
제14항에 있어서, 중간엽 줄기세포 성장 인자가 인슐린, 하이드로코르티존 (hydrocortisone), EGF 또는 FGF 중 어느 하나 이상을 추가로 포함하는 배지.
제15항에 있어서, 전체 배지 조성물에서 인슐린이 1 내지 500ng/㎖, 하이드로코르티존이 0.1 내지 500 nM, EGF가 0.1 내지 500 ng/ml 또는 LIF가 0.01 내지 500 ng/ml 농도인 배지.
제1항의 배양 배지를 이용하여 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법.
제17항에 있어서, 배양 배지가 제대혈 혈청을 1 내지 30%, 인슐린을 1 내지 500ng/㎖, 하이드로코르티존을 0.1 내지 500 nM, EGF를 0.1 내지 500 ng/ml 및 LIF를 0.01 내지 500 ng/ml 농도로 포함하는 것인 방법.
제17항에 있어서, 중간엽 줄기세포가 인간에서 유래한 것인 방법.
(a) 제1항의 배양 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계; (b) 상기 배 양된 중간엽 줄기세포를 원심분리하는 단계; (c) 중간엽 줄기세포를 획득하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 획득하는 방법.
제20항에 있어서, 배양 배지가 제대혈 혈청을 1 내지 30%, 인슐린을 1 내지 500ng/㎖, 하이드로코르티존을 0.1 내지 500 nM, EGF를 0.1 내지 500 ng/ml 및 LIF를 0.01 내지 500 ng/ml 농도로 포함하는 것인 방법.
제21항에 있어서, 중간엽 줄기세포가 인간에서 유래한 것인 방법.