CN113215095B

CN113215095B - 组合物、培养基补充剂以及干细胞培养基及培养方法

Info

Publication number: CN113215095B
Application number: CN202110579910.XA
Authority: CN
Inventors: 陈东煌; 陈海佳; 戚康艺; 姜交华; 李学家
Original assignee: Guangdong Guoke Cell Technology Co ltd; Bioisland Laboratory
Current assignee: Guangdong Guoke Cell Technology Co ltd; Bioisland Laboratory
Priority date: 2021-05-26
Filing date: 2021-05-26
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2041-05-26
Also published as: CN113215095A

Abstract

本发明涉及一种组合物、培养基补充剂以及干细胞培养基及培养方法。所述组合物包含L‑抗坏血酸‑2‑磷酸三钠盐、过氧化氢酶、辅酶Q10、雷帕霉素以及罗布麻宁。本发明选择L‑抗坏血酸‑2‑磷酸三钠盐、过氧化氢酶、辅酶Q10、雷帕霉素以及罗布麻宁进行组合，形成特定配方的组合物，将该组合物与非必需氨基酸添加到无血清培养基中构成特定的无血清培养体系，采用该无血清培养体系对ADSCs进行传代培养时，细胞的增值速率能够高于含血清培养体系。同时，在传代培养中，细胞空泡化得到有效抑制，细胞衰老得到缓解，并且该效果能够达到与有血清培养基相当的水平。

Description

组合物、培养基补充剂以及干细胞培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及组合物、培养基补充剂以及干细胞培养基及培养方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)来源于发育早期的中胚层，是一类非造血干细胞，其广泛存在于骨髓、皮下脂肪、骨外膜、肌肉、滑膜、滑液、肝脏、外周组织、脂肪、脂肪血及胎盘等组织。MSCs具有高度自我更新能力、多向分化潜能，可在体外培养扩增，不仅能够支持造血干细胞的生长，还具有免疫调控的作用；不同的诱导条件下，在体外可分化为骨、软骨、肌肉、神经、心肌、内皮和脂肪等，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，MSCs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞，是移植领域和自身性免疫疾病治疗的研究热点。

脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived derived mesenchymal stemcell，ADSCs)从脂肪组织中分离提取出的一类成纤维细胞形细胞。与骨髓间充质干细胞一样，ADSCs在特定的诱导条件下，可以跨胚层向不同的组织类型的细胞分化，形成软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、骨豁肌细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、神经元细胞等。由于脂肪组织来源广泛，取材容易，不涉及伦理问题，便于自体移植，并且给患者带来的痛苦较小，因此目前被认为是比骨髓间充质干细胞更有优势的组织工程“种子细胞”的来源。

随着MSCs及其分泌物作为新型的美容抗衰、疑难杂症治疗等领域的高速发展，传统的MSCs培养采用无血清培养体系，目前市面上的无血清培养基大部分具有化学成分明确、无血清甚至无动物源原料添加等优点。无血清培养基虽然很好的避免了血清或动物成分带来的免疫反应、动物病毒等影响，但由于无血清培养基成分相对单一，营养不足，并且部分替代物对细胞可能存在刺激作用，会引起内质网应激或者细胞自噬。因此在MSCs体外连续传代培养的扩增能力上，仍然和有血清体系存在较大差距。

ADSCs在无血清培养体系培养时，面临的问题相对于其他种类的MSCs更加严峻，因为ADSCs属于成体干细胞，其体外扩增能力本身就比较有限，如果使用无血清培养基体外培养ADSCs，扩增能力更是会出现显著下降的现象，并且连续传代后细胞空泡化现象十分明显，胞质空泡随着传代次数越来越多，细胞迅速老化，随着空泡越来越大，最终细胞破裂死亡。

鉴于ADSCs的特殊性，其对无血清体系的要求更加严苛，传统用于MSCs的无血清培养体系根本无法满足ADSCs培养需求，传统的无血清培养体系例如：

一种无血清的脂肪间充质干细胞的培养基，所述培养基包括基础培养基和血清替代物，所述血清替代物的添加量为基础培养基质量的3.5％～4.5％，所述血清替代物包括以下组分：人血清蛋白、白蛋白、转铁蛋白、纤粘连蛋白、层粘连蛋白、雌二醇、维生素B2、辅酶A、维生素B12、牛磺酸、丙酮酸、西那卡塞、血管内皮生长因子、血管内皮生长因子2型受体、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、促红细胞生成素、胰岛素样生长因子、胰岛素、重组人生长激素、蛋白酶抑制剂、胰酶抑制剂、L-谷氨酰胺、转化生长因子-α、转化生长因子-β、白细胞介素21以及造血细胞生长因子。

一种干细胞培养基，所述干细胞培养基中不含血清，所述干细胞培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、细胞因子和蛋白多肽；其中，所述氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸及谷氨酰胺；所述细胞因子和蛋白多肽包括成纤维细胞生长因子1、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素、胰岛素样生长因子1、血管内皮细胞生长因子、胎盘生长因子、白血病抑制因子、干细胞因子、转铁蛋白和人血清白蛋白；所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸硫氨、辅酶Q10、维生素B12、腐胺二盐酸盐、维生素C和维生素E；所述脂类包括地塞米松、油酸、胆固醇、乙醇胺、亚油酸、硫辛酸和脂质混合物；所述盐类包括碳酸氢钠、氯化钙、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠、一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和丙酮酸钠；所述干细胞培养基还包括抗氧化剂、D-葡萄糖、牛磺酸、肝素钠。

一种细胞培养液，所述细胞培养液包含凋亡小体，基础培养基为α-MEM培养基，添加物包括人血白蛋白、转铁蛋白、氢化可的松、亚硒酸钠、维生素C、亚油酸、胰岛素、孕酮、丙酮酸钠、乙醇胺、非必需氨基酸、必需氨基酸、碱性成纤维生长因子和转化生长因子。

一种人脐带/脂肪间充质干细胞的无分化扩增抗衰老培养基，包含细胞因子、维生素、化学小分子，其中：细胞因子包括TGF-β、LIF、Activin A、EGF、FGF-2、IGF-1、HGF、PDGF-bb、VEGF、SCF、Epithalon，化学小分子包括硫辛酸、黄芪甲苷、人参皂甙、Rapamycin、二甲双弧、亚精胺、SRT1720、白藜芦醇以及奥普托拉。

因此，如何采用无血清体系在体外连续传代培养中提升ADSCs的细胞增殖速率，是ADSCs体外传代培养亟需解决的问题。

发明内容

基于此，本发明的主要目的是提供一种组合物、培养基补充剂以及干细胞培养基及培养方法。采用本发明的干细胞培养基对ADSCs进行传代培养时，细胞的增值速率能够高于含血清培养体系。

具体技术方案包括：

一种组合物，所述组合物包含L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、过氧化氢酶、辅酶Q10、雷帕霉素以及罗布麻宁。

在其中一个实施例中，所述组合物包含25mg/L～100mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、0.1mg/L～20mg/L过氧化氢酶、0.1μM～20μM辅酶Q10、0.1μM～20μM雷帕霉素以及0.1μM～20μM罗布麻宁。

在其中一个实施例中，所述组合物包含45mg/L～55mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、5mg/L～15mg/L过氧化氢酶、5μM～15μM辅酶Q10、5μM～15μM雷帕霉素以及5μM～15μM罗布麻宁。

一种培养基补充剂，所述培养基补充剂包含非必需氨基酸以及如上所述的组合物。

一种干细胞培养基，所述培养基包含基础培养基以及如上所述的组合物，或者所述培养基包含基础培养基以及如上所述的培养基补充剂。

在其中一个实施例中，所述基础培养基为无血清培养基。

在其中一个实施例中，所述无血清培养基为UltraCULTURE Serum-free Medium或/和

hMSC-SFM。

在其中一个实施例中，所述组合物或者培养基补充剂与所述基础培养基的体积比为(0.8～1.2):1000。

如上所述的组合物或者如上所述的培养基补充剂、如上所述的培养基补充剂或者如上所述的干细胞培养基在干细胞培养中的应用。

在其中一个实施例中，所述组合物、所述培养基补充剂以及所述干细胞培养基抑制干细胞衰老和/或提高干细胞增殖效率。

在其中一个实施例中，所述组合物、所述培养基补充剂以及所述干细胞培养基防止干细胞传代培养空泡化。

本发明实施例涉及如上所述的干细胞培养基的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：混合所述组合物或者所述培养基补充剂，以及所述基础培养基。

一种干细胞培养方法，所述培养方法包括如下步骤：

将干细胞接种至如上所述的干细胞培养基，培养。

在其中一个实施例中，所述干细胞为间充质干细胞。

在其中一个实施例中，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。

与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：

本发明将L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、过氧化氢酶、辅酶Q10、雷帕霉素以及罗布麻宁进行组合，形成特定配方的组合物，将该组合物与非必需氨基酸添加到无血清培养基中构成特定的无血清培养体系，采用该无血清培养体系对ADSCs进行传代培养时，细胞的增值速率能够高于含血清培养体系。同时，在传代培养中，细胞空泡化得到有效抑制，细胞衰老得到缓解，并且该效果能够达到与有血清培养基相当的水平。并且，本发明通过将上述组合物和非必需氨基酸添加至无血清培养基实现以上效果，相对于传统的无血清培养体系，本发明在对ADSCs进行传代培养时，所需的培养基添加原料种类少得多，简单，成本低。

附图说明

图1为用实施例1培养基培养ADSCs所采集的图像；

图2为用实施例2培养基培养ADSCs所采集的图像；

图3为用实施例3培养基培养ADSCs所采集的图像；

图4为用实施例4培养基培养ADSCs所采集的图像；

图5为用实施例5培养基培养ADSCs所采集的图像；

图6为用含10％FBS的DMEM/F12完全培养基培养ADSCs所采集的图像；

图7为用LONZA公司的UltraCULTURE Serum-free Medium培养ADSCs所采集的图像；

图8为用

hMSC-SFM培养ADSCs所采集的图像；/>

图9为各组ADSCsβ-半乳糖苷酶活性染色图(40×)；

图10为各组ADSCs生长曲线；

图11为各组ADSCs倍增时间比较图；

图12为实施例2和对照组1的ADSCs成脂诱导效果图(100×)；

图13为实施例2和对照组1的ADSCs成骨诱导效果图(100×)。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明实施例提供一种组合物，所述组合物包含L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、过氧化氢酶、辅酶Q10、雷帕霉素以及罗布麻宁。

在其中一个示例中，所述组合物包含25mg/L～100mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、0.1mg/L～20mg/L过氧化氢酶、0.1μM～20μM辅酶Q10、0.1μM～20μM雷帕霉素以及0.1μM～20μM罗布麻宁。

在其中一个示例中，所述组合物包含45mg/L～55mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、5mg/L～15mg/L过氧化氢酶、5μM～15μM辅酶Q10、5μM～15μM雷帕霉素以及5μM～15μM罗布麻宁。

本发明实施例提供一种培养基补充剂，所述培养基补充剂包含非必需氨基酸以及如上所述的组合物。

可以理解的是，本发明实施例所述的非必需氨基酸，可以以溶液的形式与所述组合物混合，例如将市购的非必需氨基酸溶液以合适的用量与所述组合物混合，进而形成所述培养基补充剂。本发明实施例所述的市购的非必需氨基酸溶液包括但不限于Gibco11140-050非必需氨基酸溶液。本发明实施例所述的合适的用量例如为占所述培养基补充剂的体积为1％。本发明实施例提供一种干细胞培养基，所述培养基包含基础培养基以及如上所述的组合物，或者所述培养基包含基础培养基以及如上所述的培养基补充剂。

在其中一个示例中，所述基础培养基为无血清培养基。

在其中一个示例中，所述无血清培养基为UltraCULTURE Serum-free Medium或/和

hMSC-SFM。

在其中一个示例中，所述组合物或者培养基补充剂与所述基础培养基的体积比为(0.8～1.2):1000，优选为1:1000，以下实施例以1:1000为例对本发明实施例的技术方案进行解释说明。

本发明实施例还提供如上所述干细胞培养基的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：混合所述组合物或者培养基补充剂，以及所述基础培养基。

本发明实施例涉及如上所述的组合物、所述的培养基补充剂或者所述的干细胞培养基在干细胞培养中的应用。

在其中一个示例中，所述组合物、所述培养基补充剂以及所述干细胞培养基抑制干细胞衰老和/或提高干细胞增殖效率。

在其中一个示例中，所述组合物、所述培养基补充剂以及所述干细胞培养基防止干细胞传代培养空泡化。

本发明实施例还提供一种干细胞培养方法，所述培养方法包括如下步骤：

将干细胞接种至如上所述的干细胞培养基，培养。

可以理解的是，本发明实施例所述的培养采用适宜干细胞的培养条件，例如：于5％CO₂培养箱37℃培养。

可以理解的是，培养细胞至合适量时可以对细胞进行传代培养，例如培养细胞汇合度达80％以上即可进行传代培养，传代的培养的次数包括3次以上。

在其中一个示例中，所述干细胞为间充质干细胞。

在其中一个示例中，所述间充质干细胞为脂肪间充质干细胞。

本发明中，所涉及的组分、试剂均为常规市售产品。如L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐(货号49752)，过氧化氢酶(货号C3556)，辅酶Q10(货号C9538)，雷帕霉素(货号V900930)，罗布麻宁Apocynin(货号PHL83252)购自sigma公司，非必须氨基酸溶液(货号11140-050)购自Gibco公司。本发明选择含10％FBS的DMEM/F12的有血清完全培养基，LONZA公司的UltraCULTURE Serum-free Medium，广东国科细胞公司

hMSC-SFM等开展验证实验。

实施例1：

本实施例提供一种脂肪间充质干细胞培养基及其制备方法。具体涉及如下步骤：

(1)取L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、过氧化氢酶、辅酶Q10、雷帕霉素、罗布麻宁以及非必需氨基酸溶液，制备成含25mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、1mg/L过氧化氢酶、1μM辅酶Q10、1μM雷帕霉素、1μM罗布麻宁Apocynin以及1％(v/v)非必需氨基酸溶液(Gibco11140-050非必需氨基酸溶液)的培养基补充剂，0.22μm滤膜过滤除菌。该培养基补充剂作为储存液(1000×)，-20℃～-80℃保存备用。

所述储存液的制备步骤包括：各组分按其各自特性溶解，再使用DPBS作为溶剂，混合配制成上述浓度的储存液(1000×)，0.22m滤膜过滤除菌。

(2)取上述培养基补充剂，按体积比1:1000加入到LONZA公司的无血清培养基UltraCULTURE Serum-free Medium和广东国科细胞公司

hMSC-SFM中，混合。

实施例2：

(1)取L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、过氧化氢酶、辅酶Q10、雷帕霉素、罗布麻宁以及非必需氨基酸溶液，制备成含50mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、10mg/L过氧化氢酶、10μM辅酶Q10、10μM雷帕霉素、10μM罗布麻宁Apocynin以及1％(v/v)非必需氨基酸溶液(Gibco11140-050非必需氨基酸溶液)的培养基补充剂，0.22μm滤膜过滤除菌。该培养基补充剂作为储存液(1000×)，-20℃～-80℃保存备用。储存液(1000×)的制备步骤参照实施例1。

hMSC-SFM中，混合。/>

实施例3：

(1)取L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、过氧化氢酶、辅酶Q10、雷帕霉素、罗布麻宁以及非必需氨基酸溶液，制备成含100mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、20mg/L过氧化氢酶、20μM辅酶Q10、20μM雷帕霉素、20μM罗布麻宁Apocynin以及1％(v/v)非必需氨基酸溶液(Gibco11140-050非必需氨基酸溶液)的培养基补充剂，0.22μm滤膜过滤除菌。该培养基补充剂作为储存液(1000×)，-20℃～-80℃保存备用。储存液(1000×)的制备步骤参照实施例1。

(2)取上述培养基补充剂，按体积比1:1000加入到LONZA公司的无血清培养基UltraCULTURE Serum-free Medium和广东国科细胞公司的血清培养基

hMSC-SFM中，混合。

实施例4

本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处主要包括培养基补充剂的配方，具体地，本发明实施例培养基补充剂包含45mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、5mg/L过氧化氢酶、5μM辅酶Q10、5μM雷帕霉素、5μM罗布麻宁Apocynin以及1％(v/v)非必需氨基酸溶液(Gibco 11140-050非必需氨基酸溶液)。

实施例5

本实施例是实施例1的变化例，相对于实施例1的变化之处主要包括培养基补充剂的配方，具体地，本发明实施例培养基补充剂包含55mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、15mg/L过氧化氢酶、15μM辅酶Q10、15μM雷帕霉素、15μM罗布麻宁Apocynin以及1％(v/v)非必需氨基酸(Gibco 11140-050非必需氨基酸溶液)。

表1、实施例1至实施例5培养基补充剂成分汇总

效果验证

选择P3代ADSCs开展实验，ADSCs按1×10⁴/cm²密度接种于6孔板中，每组设置3个重复。组别包括：实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、实施例5组。同时，还设有如下3个对照组：

对照组1：含10％FBS的DMEM/F12完全培养基；

对照组2：LONZA公司的UltraCULTURE Serum-free Medium；

对照组3：广东国科细胞公司

hMSC-SFM。

置于5％CO₂培养箱37℃培养。细胞汇合度达80％以上即可进行传代培养，连续进行至少3次传代。然后进行如下几个方面的检测：

一、连续传代培养形态对比

对各组每个培养代次的ADSCs进行图像采集，结果如图1至图8所示：图1为用实施例1培养基培养ADSCs所采集的图像，图2为用实施例2培养基培养ADSCs所采集的图像，图3为用实施例3培养基培养ADSCs所采集的图像，图4为用实施例4培养基培养ADSCs所采集的图像，图5为用实施例5培养基培养ADSCs所采集的图像，图6为用含10％FBS的DMEM/F12完全培养基培养ADSCs所采集的图像，图7为用LONZA公司的UltraCULTURE Serum-free Medium培养ADSCs所采集的图像，图8为用广东国科细胞公司

hMSC-SFM培养ADSCs所采集的图像；图1至图8中，自左向右的培养代次依次为P3、P4、P5、P6。

各组ADSCs均呈单层贴壁生长，大部分细胞呈长梭形，形态不规则。在连续传代培养过程中，对照组1没出现细胞空泡，对照组2在连续培养3代后出现空泡化现象，对照组3在连续培养2代开始出现细胞空泡，连续培养3代后空泡明显增加且变大；实施例1组与实施例3组的ADSCs有逐步出现少量细胞空泡，但空泡体积小，与对照组2和对照组3比明显减少；实施例2组、实施例4组和实施例5组的ADSCs各代次均未见空泡出现。

二、β-半乳糖苷酶活性染色

对各组培养3代后的ADSCs进行β-半乳糖苷酶活性染色，检测ADSCs的衰老程度。ADSCs按4.5×10⁴个/孔接种于12孔板中，放入5％CO₂培养箱37℃培养。48h后，使用β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒对各组ADSCs进行染色，结果见图9，图9为各组ADSCβ-半乳糖苷酶活性染色图(40×)。

结果显示，对照组1、实施例2、实施例4和实施例5的细胞未见β-半乳糖苷酶着色，实施例1和实施例3的细胞可见少量β-半乳糖苷酶着色，对照组2、对照组3的细胞可见大量β-半乳糖苷酶着色，细胞衰老明显。因此，本发明组合物能有效减缓ADSCs在连续传代过程中的衰老。

三、增殖速率检测

选择连续传代培养3次以上的ADSCs开展实验，ADSCs按1×10⁴个/孔接种于24孔板中，放入5％CO₂培养箱37℃培养。每天收集细胞进行细胞计数，每次随机收集计算3个孔，连续7天，绘制细胞生长曲线，结果如表2，图10。

由表2及图10结果可见，与对照组1(含血清组)、对照组2(LONZA组)和对照组3相比，各实施例组ADSCs扩增效率高于三个对照组。

根据倍增时间计算公式：DT＝t*[lg2/(lgNt-lgNo)]，其中t为培养时间；No为首次记下的细胞数；Nt为t时间后的细胞数。本实验以ADSC培养72h为计算时间点，结果如表3、图11。

表2、各组ADSCs7天细胞计数结果

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表3

实验组别	倍增时间
		实施例1	33.50±1.01*
实施例2	29.46±0.20**
		实施例3	32.58±1.37*
实施例4	32.04±0.74**
		实施例5	32.18±0.68**
对照组1	39.77±2.40
		对照组2	40.85±3.11
对照组3	38.99±2.05

*表示p<0.05,**表示p<0.01

结果表明，各实施例组ADSCs的倍增时间均低于各对照组，其中实施例2、实施例4、实施例5与三个对照组有极显著性差异(**，p<0.01)，实施例1、实施例3与三个对照组有显著性差异(*，p<0.05)，说明采用本发明所述组合物可以提高ADSCs的增殖速率。

四、ADSCs表面标志物检测

选择实施例组合对比例组培养基对ADSCs开展实验，ADSCs按1×10⁴/cm²密度接种于T25培养瓶中，置于5％CO₂培养箱37℃培养。3天后，0.25％胰蛋白酶溶液消化收集各组ADSCs，流式细胞仪检测其表面marker如CD105、CD73、CD90、CD34、CD45、HLA-DR等的表达情况。结果如表4。

表4、各组ADSCs表面marker检测结果

CD105

CD73

CD90

CD34

CD45

HLA-DR

实施例1

98.83％

100.0％

0.11％

0.08％

0.10％

实施例2

99.98％

100.0％

0.12％

0.04％

0.21％

实施例3

97.21％

100.0％

0.12％

0.03％

0.31％

实施例4

98.99％

100.0％

0.14％

0.03％

0.32％

实施例5

99.15％

100.0％

0.11％

0.02％

0.39％

对照组1

100.0％

99.98％

100.0％

0.09％

0.00％

0.06％

对照组2

96.55％

98.22％

96.41％

0.23％

0.35％

0.33％

对照组3

97.97％

100.0％

98.24％

0.09％

0.10％

0.21％

检测结果表明，实验组与对照组1的ADSCs表面markerCD105、CD73、CD90阳性表达，且符合MSC参考标准(≥95.0％)而CD34、CD45、HLA-DR阴性表达，且符合MSC参考标准(≤2.0％)各组之间无显著性差异。表明本发明的组合物的使用不影响ADSCs表面标记物的表达。

五、ADSCs多向分化潜能检测

选择连续传代培养3次以上的ADSCs开展实验，实施例2组和对照组1的ADSCs分别按1×10⁵/孔接种于6孔板中，放入5％CO₂培养箱37℃培养。待各组ADSCs融合度达80％以上，分别设置对照孔和诱导孔，对照孔使用常规有血清完全培养基培养，诱导孔分别使用成脂或成骨分化诱导液培养，每3天换液一次。

诱导ADSCs成骨和成脂分化。7天后对成脂分化实验组细胞进行油红O染色，21天后对成骨分化实验组细胞进行茜素红染色。实验结果表明本发明组合物不影响ADSCs成脂成骨分化潜能，见图12、图13。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种培养基补充剂，其特征在于，所述培养基补充剂由体积比为1%的非必需氨基酸以及组合物组成，所述组合物由L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、过氧化氢酶、辅酶Q10、雷帕霉素以及罗布麻宁组成；

所述组合物包含45mg/L～55mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐、5mg/L～15mg/L过氧化氢酶、5µM～15µM辅酶Q10、5µM～15µM雷帕霉素以及5µM～15µM罗布麻宁。

2.一种干细胞培养基，其特征在于，所述培养基包含基础培养基以及权利要求1所述的培养基补充剂；

所述基础培养基为无血清培养基；

所述无血清培养基为UltraCULTURE Serum-free Medium和hMSC-SFM；

所述培养基补充剂与所述基础培养基的体积比为1:1000。

3.权利要求1所述的培养基补充剂或者权利要求2所述的干细胞培养基在干细胞培养中的应用；

所述干细胞为脂肪间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养基补充剂以及所述干细胞培养基抑制所述脂肪间充质干细胞衰老和/或提高所述脂肪间充质干细胞增殖效率。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述培养基补充剂以及所述干细胞培养基防止所述脂肪间充质干细胞传代培养空泡化。

6.权利要求2所述的干细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：混合所述培养基补充剂，以及所述基础培养基。

7.一种干细胞培养方法，其特征在于，所述培养方法包括如下步骤：

将干细胞接种至权利要求2所述的干细胞培养基中培养；

所述干细胞为脂肪间充质干细胞。