KR20130043520A - 폐암세포의 분리 및 증식 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 환자의 폐암조직으로부터 효과적인 폐암세포의 분리 및 증식을 위한 배양 조건 및 상기의 방법으로 배양된 폐암세포를 이용한 환자 특이적 암치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 1) 환자로부터 분리한 폐암 조직을 지름 40 내지 100 μm의 크기로 절개하는 단계, 2) 상기 1)단계의 절개된 조직을 배양하는 단계, 3) 상기 2)단계의 배양된 세포에 디스파아제를 사용하여 폐암세포를 분리하는 단계, 4) 상기 3)단계의 폐암세포를 코팅물질이 코팅된 배양접시에서 무혈청 N2 배지로 배양하여 폐암세포만을 분리하여 배양하는 단계, 및 5) 상기 4)단계의 분리 배양된 폐암세포를 혈청 및 성장인자를 첨가한 배지에서 배양하여 증식시키는 단계를 포함하는 폐암조직으로부터 폐암세포를 분리 및 증식시키는 방법 및 상기 방법으로 제조된 폐암세포를 이용하여 환자 맞춤형 암치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

폐암세포의 분리 및 증식 방법{Method for the Isolation and Proliferation of Primary Lung Cancer Cells}
본 발명은 환자의 폐암조직으로부터 효과적인 폐암세포의 분리 및 증식을 위한 배양 조건 및 상기의 방법으로 배양된 폐암세포를 이용한 환자 특이적 암치료제의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 1) 환자로부터 분리한 폐암 조직을 지름 40 내지 100 μm의 크기로 절개하는 단계, 2) 상기 1)단계의 절개된 조직을 배양하는 단계, 3) 상기 2)단계의 배양된 세포에 디스파아제를 사용하여 폐암세포를 분리하는 단계, 4) 상기 3)단계의 폐암세포를 코팅물질이 코팅된 배양접시에서 무혈청 N2 배지로 배양하여 폐암세포만을 분리하여 배양하는 단계, 및 5) 상기 4)단계의 분리 배양된 폐암세포를 혈청 및 성장인자를 첨가한 배지에서 배양하여 증식시키는 단계를 포함하는 폐암조직으로부터 폐암세포를 분리 및 증식시키는 방법 및 상기 방법으로 제조된 폐암세포를 이용하여 환자 맞춤형 암치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
폐암은 폐에 생긴 악성 종양을 통틀어 말하는 것이며, 암세포가 기관지나 폐포에서 처음 발생한 원발성 폐암과 암세포가 다른 기관에서 생겨나 혈관이나 림프관을 타고 폐로 이동해 증식하여 발생한 전이성 폐암으로 나눌 수 있다. 일반적으로 폐암이라고 하는 원발성 폐암은 현미경학적으로 암세포의 형태에 따라 비소세포 폐암과 소세포 폐암으로 구분된다. 이와 같이 비소세포 폐암과 소세포 폐암을 구분하는 것은 임상적 경과와 치료 방법의 차이가 크기 때문이다. 비소세포 폐암은 조기에 진단되면 수술적 치료만으로도 완치를 기대할 수 있는 반면, 소세포 폐암은 대부분 진단 당시에 수술적 절제가 어려울 정도로 진행되어 있는 상태로 발견되는 경우가 많고 급속히 성장하며 전신 전이율이 높아서 수술보다는 항암 화학요법이나 방사선치료가 선택된다. 통상적으로 폐암이라고 하면 폐암의 약 80 내지 85%를 차지하는 비소세포 폐암을 의미하며, 이러한 비소세포 폐암은 편평상피암종, 선암종, 대세포암종 및 기타 폐암으로 세분된다.
특히 폐암은 19세기까지만 해도 드문 질환이었으나, 20세기 들어 흡연이 보편화되면서 급격히 증가하기 시작하여, 서양에서는 남성과 여성 모두에서 가장 많이 발생하는 악성 종양이 되었고 우리나라에서도 폐암 발생이 가파르게 상승하여 위암에 이어 발병률 2위의 암질환이다. 이러한 발생빈도의 증가는 흡연뿐 아니라 대기오염 및 산업공해의 증가 등에 기인한다. 또한 폐암은 다른 암에 비해 치료가 어려워 발병률은 1위가 아니나, 사망자는 암환자 중 가장 많은 것으로 알려져 있다. 완치의 기준인 5년 생존률이 15%에 지나지 않는다.
이러한 폐암의 치료방법은 병기에 따라 다르며 기본적으로 수술적 제거, 방사선치료, 항암화학요법의 세 가지 방법이 있다. 수술적 제거는 폐암치료에서 유일하게 완치를 기대할 수 있는 방법으로 수술 후 재발이나 전이를 줄이기 위해 방사선 치료와 화학 약물요법 등의 보조요법이 병행되고 있다. 폐암의 종류에 따라서도 적용가능한 치료 방법이 상이하다. 비소세포 폐암의 경우 조기 발견되면 수술로 완치 가능성이 높으므로 무엇보다 조기 발견이 중요하다. 그렇지 못한 경우 수술적 치료와 항암화학요법 및 방사선 치료법을 병행한다. 한편 소세포 폐암의 경우, 비교적 빨리 자라고 전신으로 원격전이가 용이하므로 대부분의 경우 수술적 치료를 시행하지 않는다. 그러나 항암화학요법 및 방사선 치료에 대한 감응성이 높아 제한성 병기의 경우 항암화학 및 방사선 병용요법을, 확장성 병기의 경우 항암화학요법을 시행하게 된다.
항암화학요법은 효과적인 암치료 방법 중 하나이지만 항암제의 지속적인 투여는 항암화학요법의 실패를 초래하는 원인으로 지적되고 있다. 이는 세포가 항암제에 내성을 획득하게 되기 때문이며, 한 항암제에 내성을 획득하면 구조가 다른 항암제에 대해서도 내성을 갖게 되는 교차내성을 가진다. 이와 같이 암세포가 항암제 구조에 상관없이 비 특이적인 내성을 획득하는 것을 다중약물내성(multidrug resistance; MDR)이라 한다[Gottesman et al., Nat . Rev . Cancer, 2: 48-58, 2002; Ambudkar et al., Oncogene, 22: 7468-85, 2003). 이러한 암세포의 MDR 획득은 항암화학요법 실패의 가장 큰 원인 중 하나로 잘 알려져 있다. 항암제 내성은 크게 2가지로 분류될 수 있는데 하나는 약물이 세포 내로 유입되지 못해 생기는 것이고, 또 다른 하나는 암세포 자체가 유전적 또는 후생유전적 변화에 의해 항암제에 대한 감수성이 떨어져 나타날 수 있는 것이다. 또한 항암제는 특유의 부작용도 가진다. 가장 중요한 것이 골수 기능 억제에 의한 백혈구 및 혈소판의 감소로 이는 면역기능과 관련되어 감염으로 연결될 수 있는 환자에게 치명적인 부작용이다. 이 외에도 소화기계 또는 생식기계에서의 이상을 초래하거나 탈모증을 유발하는 등의 부작용이 항암제의 적용을 제한한다.
폐암의 치료가 어려운 가장 중요한 이유는 다양성이다. 종양마다 다양한 유전적 특성을 가지고 있을 뿐만 아니라, 동일한 환자의 동일한 종양내에도 다양한 종류의 유전적 특성을 가진 암세포들이 다양한 정상세포들과 섞여있기 때문에 한가지 약물이 특정 암세포를 죽이는 효과가 있어서 종양의 크기가 줄어드는 효과가 나타나더라도 다른 특성을 가진 암세포들까지 모두 죽이지 못하기 때문에 소수의 세포들이 다시 분열해서 종양이 성장을 하면, 항암치료 이후에는 항암제에 내성이 있는 세포들로 바뀌는 결과가 발생한다. 현재 이러한 다양한 암세포의 성장기전을 차단하는 200여종의 항암제들이 개발되고 있으나, 어떤 종양에 어떤 약제를 사용해야 하는지를 결정하는데 필요한 시험방법은 전무한 상태여서, 환자당 약 6종의 약제밖에 사용하지 못하는 실정이다. 따라서, 폐암 환자별로 적합한 항암제를 처치하는 것이 매우 중요한 문제로 대두되고 있으며, 미리 환자 맞춤형의 항암제를 스크리닝하기 위한 환자의 세포 확보가 필요한 실정이다. 그러나, 폐암 환자로부터 폐암세포의 분리 및 증식에 효과적인 방법이 아직까지 보고가 미미한 실정이다.
이에 본 발명자들은 환자에 대한 약효가 검증되지 않은 항암물질의 무분별한 사용으로 인한 부작용을 방지하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 환자의 폐암조직으로부터 폐암세포를 분리, 배양, 증식할 수 있는 최적의 배양조건을 확립하였고, 상기 방법으로 배양된 세포를 이용하여 환자 맞춤형 암치료제를 스크리닝하는 방법을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 1) 환자로부터 분리한 폐암 조직을 지름 40 내지 100 μm의 크기로 절개하는 단계, 2) 상기 1)단계의 절개된 조직을 배양하는 단계, 3) 상기 2)단계의 배양된 세포에 디스파아제를 사용하여 폐암세포를 분리하는 단계, 4) 상기 3)단계의 폐암세포를 코팅물질이 코팅된 배양접시에서 무혈청 N2 배지로 배양하여 폐암세포만을 분리하여 배양하는 단계, 및 5) 상기 4)단계의 분리 배양된 폐암세포를 혈청 및 성장인자를 첨가한 배지에서 배양하여 증식시키는 단계를 포함하는 폐암조직으로부터 폐암세포를 분리 및 증식시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 폐암세포를 배양하는 단계 및 상기 폐암세포에 암치료 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는, 환자 맞춤형 암치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은 1) 환자로부터 분리한 폐암 조직을 지름 40 내지 100 μm의 크기로 절개하는 단계; 2) 상기 1)단계의 절개된 조직을 배양하는 단계; 3) 상기 2)단계의 배양된 세포에 디스파아제를 사용하여 폐암세포를 분리하는 단계; 4) 상기 3)단계의 폐암세포를 코팅물질이 코팅된 배양접시에서 무혈청 N2 배지로 배양하여 폐암세포만을 분리하여 배양하는 단계; 및 5) 상기 4)단계의 분리 배양된 폐암세포를 혈청 및 성장인자를 첨가한 배지에서 배양하여 증식시키는 단계를 포함하는 폐암조직으로부터 폐암세포의 분리 및 증식시키는 방법을 제공한다.
상기 단계 1)은, 환자로부터 분리한 조직에서 폐암세포를 효과적으로 증식시키기 위해 조직을 절개하는 단계로서, 가장 최적의 증식률을 얻을 수 있는 조직 절개 크기는 제한 없이 포함되나, 바람직하게는 40 내지 70 μm, 40 내지 100 μm, 70 내지 100 μm이며, 가장 바람직하게는 40 내지 100 μm일 수 있다. 절개된 조직이 높은 비율로 배양접시에 부착될 수 있도록 조직을 자르고 다공성 막을 이용하여 최적 크기 즉 40 내지 100 μm 크기의 조각을 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 조직응괴 비율이 40 내지 100 μm에서 가장 높은 것을 확인하였다(도 1).
상기 단계 2)는, 단계 1)에서 절개되고 여과된 일정 범위의 크기를 갖는 조직을 배양접시에 부착 배양하는 단계이다. 본 단계의 배양에서 배양접시에 부착된 증식응괴(outgrowth clump)로부터 폐암세포의 증식이 시작된다. 보다 나은 부착을 위해 코팅된 배양접시를 사용할 수 있다. 바람직하게 코팅 물질은 폐암세포의 부착에 이용될 수 있는 물질은 제한없이 이용가능하나, 그 예로 콜라겐, 젤라틴 또는 마트리겔일 수 있으며, 보다 바람직하게는 마트리겔일 수 있다.
본 발명의 용어 "증식응괴(outgrowth clump)"란 적절한 크기로 절개하여 배양접시에 도포한 조직 덩어리로부터 세포가 증식하여 뻗어나가는 형태의 덩어리를 의미한다. 배양접시에 도포된 모든 조직 조각이 부착하여 세포를 증식시키지는 않는다. 따라서 본 발명에서는 도포된 조직 조각의 수에 대한 증식응괴의 비율을 계산하여 최적의 조직 절개 크기를 찾는데 응용하였다.
본 발명의 용어 "마트리겔"이란 EHS(Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스 육종세포에서 분비되는 젤라틴성 추출물로, 특정 단백질로 구성된 세포 외 기질 (extracellular matricex; ECMs)이 포함되어 있다. 본 발명에서 폐암세포는 마트리겔을 지지체(scaffold)로 삼아서 부착된 후에 증식시킬 수 있다.
상기 단계 3)은, 단계 2)에서 증식응괴로부터 뻗어나온 폐암세포를 분리해 내는 단계로, 혼재되어있는 섬유아세포를 제거하고 순수한 폐암세포를 정제하기 위하여 디스파아제로 효소처리하여 분리할 수 있다.
본 발명의 용어 "디스파아제(Dispase)"란 피브로넥틴, 콜라겐 IV 및 적지만 콜라겐 I을 절단하는 단백질 분해효소이다. 디스파아제는 몇몇 박테리아에서 발견되고, 바실러스 폴리믹사의 배양 여과액으로부터 분리될 수 있다. 또한 연구의 목적으로 추출, 정제되어 사용될 수 있다. 세포에 손상을 최소화하면서 다양한 조직의 가벼운 분리 및 배양 세포의 회수에 적절하다. 본 발명의 실시예에 의하면 디스파아제를 이용할 경우 암세포괴(cancer colony)가 순수하게 분리되며, 콜라겐 분해효소의 경우 처리 시간이 오래 걸릴뿐 아니라, 효과적으로 암세포가 분리되지 않으며, 트립신-EDTA는 주변세포인 공급자세포(feeder cell)도 함께 떨어지는 것을 확인하여 기존의 세포분리물질이 부적합함을 확인하였다.
상기 단계 4)는, 단계 3)에서 정제된 폐암세포의 배양을 시작하는 단계로서, 폐암세포만을 정제하여 배양하는 단계이다. 특히 배양 초기 약 5 내지 7일간 무혈청 N2 배지를 사용하여 남아있는 섬유아세포의 증식을 억제하고 사멸시켜 순수한 폐암세포를 얻는 단계이다. 본 단계는 코팅물질이 코팅된 배양접시를 사용하여 수행될 수 있다. 이때, 사용되는 코팅물질은 콜라겐, 젤라틴 또는 마트리겔로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 마트리겔일 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면 콜라겐, 마트리겔, 젤라틴 코팅 배양접시에 대한 부착력과 증식력을 비교한 결과, 마트리겔 코팅 배양접시에 대한 부착력(도 3A) 및 증식율(도 3B)이 높은 것을 확인하였다.
본 발명의 용어 "무혈청 N2 배지"란 혈청이 배제되어있는 기본 배양배지에 N2 보충물을 첨가한 배지이다. 상기 "N2 보충물"은 보텐스타인의 N-1 제형을 기초로한 화학적으로 합성된 무혈청 보충물이다. 인간 홀로 트랜스페린 및 재조합 인슐린의 단백질과 프로게스테론, 푸트레신 및 셀레나이트를 유효성분으로 포함한다. 일반적으로 Neurobasal 배지 또는 DMEM에 성장인자와 함께 첨가되어 신경세포로의 분화를 유도하기 위하여 사용된다. 기본 배양배지는 폐암세포 증식배양에 사용할 수 있는 배지는 제한없이 사용할 수 있으며, 그 예로 RPMI1640, DMEM, DMEM/F12일 수 있다. 그러나 본 발명에서는 폐암세포의 초기배양에, 섬유아세포로부터 폐암세포를 정제하기 위하여, 바람직하게 L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신, 비필수 아미노산 및 머캅토에탄올을 포함하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배지를 기본 배양배지로 사용할 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면 정제된 폐암세포의 배양조건으로 기본배지에 (1) N2, (2) FBS, (3) FBS 및 성장인자, (4) ACL4 각각을 추가한 배지에서 배양시 N2 배양액 조건에서 과도한 섬유아세포의 증식 없이 폐암세포만이 정제됨을 확인하였다(도 4A).
상기 단계 5)는, 단계 4)에서 분리 배양된 폐암세포를 증식시키는 단계이다. 본 단계에서는 폐암세포의 효과적인 증식을 위하여 혈청 및 성장인자를 포함하는 배지를 사용할 수 있다. 바람직하게 혈청은 소태아혈청이 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 이때, 혈청의 농도는 10%일 수 있다.
본 발명의 용어 "성장인자"란 세포의 분화 및 성장에 관여하는 단백질로 정상 세포주기에 필수적인 요소로서 동물의 생명 유지에 중대한 요소이다. 나아가 태아의 발육을 조정하고 조직의 유지 및 보수에 중대한 역할을 하며, 혈구의 생성을 자극한다. 또한 암의 진행과정에도 관여한다. 본 발명에서는 정제된 폐암세포의 배양 및 증식과정에 첨가되어 증식된 폐암세포가 체내에 이식되어 또는 시험관내 환경에서 여전히 폐암세포의 특성을 유지하도록 한다. 상기 성장인자는 이에 제한되지 않으나, 그 예로 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), EGF(Epidermal Growth Factor) 또는 IGF(Insulin-like Growth Factor)일 수 있다. 본 발명의 실시예에 의하면 정제된 폐암세포의 배양조건으로 기본배지에 (1) N2, (2) FBS, (3) FBS 및 성장인자(bFBF, EGF 및 IGF), (4) ACL4 각각을 추가한 배지에서 배양시 FBS 및 성장인자(bFBF, EGF 및 IGF)를 추가한 배양액 조건에서 정제된 폐암세포가 가장 효과적으로 증식함을 확인하였다(도 4B).
상기 단계 4) 및 5)의 배양은 폐암세포를 배양접시에 단독으로 단층 부착배양(monolayer adherent culture) 또는 공급자세포(feeder cells)와 함께 동시배양(co-culture)할 수 있다. 이때, 공급자세포로는 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryo fibroblast; MEF)가 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 단층 부착배양할 수 있다.
본 발명의 용어 "부착배양"이란 세포가 어떠한 표면에 붙어서 배양되는 것을 의미하는 것으로 척추동물의 조혈세포를 제외한 대부분의 세포주는 부착배양을 선호하는 경향이 있다. 생체 외 배양시에는 부착능력을 높이기 위해 부착을 향상시킬 수 있는 물질로 미리 코팅된 배양 접시를 사용하기도 한다. 상기 부착을 향상시키기 위한 코팅물질로는 콜라겐, 젤라틴, 마트리겔 등의 물질이 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "공급자세포"란 줄기세포를 포함한 다양한 까다로운 배양을 요구하는 세포의 성장을 돕기 위해 사용되는 세포로, 비장세포, 대식세포, 가슴샘세포 또는 섬유아세포로부터 제조되며, 성장인자를 분비하여 배양하고자 하는 세포의 성장을 돕는다. 공급자세포는 미리 감마선 조사 또는 효소처리 등을 통하여 사용전에 비활성화된다. 배양시 공급자세포는 배양하고자 하는 세포의 기저층으로 작용하여 스스로는 성장이나 분열하지 않고 중요한 대사산물을 제공한다. 바람직하게는 마우스 배아 섬유아세포가 공급자세포로서 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "동시배양"이란 배양하고자 하는 세포를 하나의 배양 접시에서 다른 세포와 함께 섞여 배양되도록 하는 것이다. 일반적으로 공급자 세포와 함께 배양하는 경우가 많은데 이는 감마선이나 효소 처리를 통하여 공급자세포가 자신은 성장 또는 분열하지 않으면서 성장인자 또는 대사산물을 제공할 수 있어 배양하고자 하는 목적 세포가 이를 이용하여 성장속도를 향상시킬 수 있기 때문이다. 그러나 배양 후 목적 세포를 이들 공급자세포로부터 분리해야 하는 단점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면 단층 부착배양(2D) 및 동시배양 기법을 사용하여 배양한 경우 세포의 배양 및 증식이 가능함을 확인하였다(도 5). 다만, 동시배양의 경우 목적세포를 공급자세포로부터 분리하는 과정을 거쳐야 한다는 단점이 있다. 그러나 부유배양(3D) 기법을 이용하여 배양한 경우 세포의 성장을 관찰할 수 없었으므로, 본 발명의 폐암세포를 증식시키기 위한 배양 방법으로는 바람직하게는 단층 부착배양 기법 또는 동시배양 기법이 사용될 수 있으나, 보다 바람직하게는 단층 부착배양 기법이 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 폐암은 비소세포암일 수 있으며, 비소세포암은 편평세포암종, 대세포암종 또는 선암종일 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 폐암조직으로부터 폐암세포의 분리 및 증식시키는 방법으로 제조한 폐암세포를 배양하는 단계; 및 상기 폐암세포에 암치료 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는, 환자 맞춤형 암치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 세포 분리 및 배양 조건으로 제조한 폐암세포는 환자의 폐암조직과 동일한 세포이다. 구체적으로 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 제조된 폐암세포는 암세포 특이적인 세포분열 및 비정상적인 염색체 수의 증가를 보였으며(도 6), 마우스 이식 실험에서는 이식된 폐암세포가 마우스 체내에서 생존하고 종양과 유사한 형태의 조직으로 존재함을 관찰하였다(도 7). 또 마우스 이식 후 형성된 종양 조직을 분석한 결과 비정상적인 세포증식 및 세포의 크기, 모양, 세포핵의 다양성이 관찰되었고 이는 이식된 폐암세포로부터 형성된 종양이 전형적인 종양의 특성을 지님을 나타낸다. 즉, 본 발명의 방법으로 제조된 폐암세포는 환자 생체 내의 폐암세포와 동일한 특성을 나타내어 환자 맞춤형 암치료제의 스크리닝에 사용될 수 있음을 확인하였다.
따라서, 이와 같은 방법으로 얻어진 환자의 폐암세포에 일련의 암치료 후보물질을 처리하여 이들의 환자특이적 항암활성을 확인하여 효과적인 치료를 위한 환자에 적합한 암치료제를 찾을 수 있다. 즉, 본 발명의 분리 및 배양 조건을 이용하여 제조된 환자의 폐암세포에 치료물질을 처리하여 암세포가 사멸하면 해당 암치료물질이 폐암세포를 분리한 환자에게 맞춤형 항암제이고, 암세포가 사멸하지 않는 경우 해당 암치료물질은 본 환자에게 부적절한 항암제라 판단할 수 있다.
본 발명의 용어 "암치료 후보물질"이란 암환자에 적용하여 암에 의한 환자의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 항암제, 항종양 항생제 등 상기 특성을 나타내는 물질은 제한없이 포함될 수 있다.
바람직하게 상기 암치료 후보물질은 원발 비소세포암 및 소세포암 외에도 전이성 폐암, 폐전이 대장암, 유방암, 임파절 전이, 및 육종 등 폐에서 성장하는 모든 원발암과 전이암의 치료에 선택되는 암치료제 일 수 있다. 현재 폐암 치료에 사용되는 카보플라틴(파라플라틴)[Carboplatin(paraplatin)], 시스플라틴(Cisplatin), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 이포스파미드(Ifosfamide), 니드란(Nidran), 질소머스타드(메클로에타민 염산염)[Nitrogen mustar(Mechlorethamine HCL)], 블레오마이신(Bleomycin), 독소루비신(Doxorubicin), 미토마이신 C(Mitomycin C), 시타라빈(Cytarabine), 플루로우라실(Flurouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 트리메트렉세이트(Trimetrexate), 메토크렉세이트(Methotrexate), 에토포시드(Etoposide), 빈블라스틴(Vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 알림타(Alimta), 알트레타민(Altretamine), 프로카바진(Procarbazine), 탁솔(Taxol), 탁소텔(Taxotere), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 베바시주맙(Bevacizumab), 게피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 피시바닐 바이알(Picibanil Vial), 아크라루비신(Aclarubicin), 테가푸르(Tegafur), 에피루비신(Epirubicin), 베로테칸(Belotecan), 안트라싸이클린(anthracycline), 이다루비신(idarubicin), 또는 닥티노마이신(dactinomycin) 뿐만 아니라, 다른 암종에서 선택되는 암치료제일 수 있다.
본 발명의 방법은 폐암 환자로부터 효과적으로 폐암세포만을 분리 및 증식시킬 수 있는 방법으로, 환자 특유의 폐암세포주 확립에 효과적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 분리된 폐암세포는 암 특유의 특성을 잃지 않고 있다. 따라서, 이와 같은 폐암세포주는 환자 맞춤형 치료제의 선택에 유용하게 사용될 수 있다. 이에 따라 항암제 내성이 있는 환자에게 최적의 항암제를 제공할 수 있는 환자 맞춤형 치료에 효과가 있을 것이다.
도 1은 증식응괴(outgrowth clump)의 형태 및 조직의 절개 크기에 따른 돌출응괴의 비율을 그래프로 나타낸 도이다.
도 2는 디스파아제(dispase) 사용시 세포군의 효과적인 분리를 나타낸 도이다.
도 3은 배양접시 코팅물질에 따른 세포군의 부착율 및 세포 증식을 나타내는 도이다.
도 4는 배지조건에 따른 세포배양 형태를 나타내는 도이다.
도 5는 배양접시 부착배양(2D) 및 MEF와의 동시배양(co-culture)에 따른 세포의 형태를 나타내는 도이다.
도 6은 배양된 폐암세포의 염색체 분석 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 본 발명의 방법으로 배양된 폐암세포의 마우스 모델에 이식된 후의 생체 내 종양형성 능력 및 형성된 종양을 나타내는 도이다.
도 8은 마우스에 이식한 후 6주 후 세포에 의해 형성된 조직의 조직학적 분석 결과를 나타내는 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 조직 절개 크기에 따른 분리 결과 비교
환자로부터 최적의 조건으로 조직을 분리하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.
환자의 폐암조직을 수술용 가위를 이용하여 0.5 내지 1 cm 크기로 약 5 내지 10분간 절개한 후, 절개된 조직을 40, 70, 및 100 μm의 다양한 구멍크기의 다공성 막(Strainer, BD Bioscience)을 이용하여, 절개된 조직의 크기가 40 μm 미만, 40 내지 70 μm, 40 내지 100 μm, 70 내지 100 μm, 및 100 μm 초과인 다섯 개의 군으로 분류하였다.
배양시 절개된 조직으로부터 세포가 뻗어나오는 조직을 증식응괴(outgrowth clump)라 구분하였다(도 1A). 상기 조직응괴의 비율을 조직절개 크기에 따라 구분한 결과, 상기 절개된 조직의 크기에 따라 구분한 다섯 개의 실험군 중 40 내지 100 μm로 분리된 군에서 증식응괴의 비율이 가장 높았다(도 1B). 따라서, 폐암조직을 40 내지 100 μm로 절개하는 것이 가장 효과가 좋은 것을 알 수 있었다.
실시예 2: 폐암세포의 정제를 위한 최적의 효소 선별
폐암조직으로부터 폐암세포를 분리하기 위한 가장 최적의 효소를 찾기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
상기 실시예 1의 증식응괴로부터 유래한 세포는 폐암세포군과 섬유아세포가 혼재되어 있다(도 2 좌측 패널). 따라서 초기 배양된 조직에서 유래된 세포 중, 폐암세포군 만을 효과적으로 분리하기 위해, 다양한 효소을 이용한 화학적 방법 및 이전에 보고된 물리적 분리 방법[S. K. Oh et al., Stem Cells, 2005; 23: 605-609]을 이용하였다. 상기 사용된 효소는 디스파아제(Gibco), 트립신-EDTA(Gibco), 제4형 콜라게나아제(collagenase type IV, Gibco) 및 히알루노니다제(Sigma)이다. 각각 시판되는 효소를 디스파아제와 제4형 콜라게나아제는 1%로 희석하여 사용하였고, 트립신-EDTA와 히알루노니다제는 각각 0.25%와 100 unit/ml의 농도로 사용하였다.
그 결과, 디스파아제를 처리한 실험군에서만 폐암세포군이 효과적으로 분리되는 것이 확인되었다(도 2 우측 패널). 반면, 콜라게나아제는 처리시간이 길고, 효과적인 암세포괴의 분리도 이루어지지 않았으며, 트립신-EDTA의 경우는 주변의 공급자세포와 함께 떨어지는 현상이 관찰되어 세포 정제에는 적합지 못한 것으로 확인되었다.
실시예 3: 최적의 배양접시 코팅 물질 선별
초기 절개된 조직 및 분리된 폐암세포군의 효과적인 부착을 위해 각각 마트리겔, 젤라틴 또는 콜라겐이 코팅된 배양접시를 사용하여 배양하였다. 사용된 코팅 물질의 농도는 각각 1% 마트리겔(BD Bioscience), 0.1% 젤라틴(Sigma) 및 1% 콜라겐(Bioland)이다. 각각의 코팅 물질을 배양접시에 도포 후 실온에서 약 10 내지 15분간 코팅시키고, 마트리겔은 24시간 동안, 젤라틴은 30분 내지 1시간 동안, 그리고 콜라겐 역시 30분 내지 1시간 동안 건조시켜 사용하였다.
그 결과, 마트리겔을 코팅한 배양접시를 사용한 경우 증식응괴의 탁월한 부착률(도 3A), 및 동일 수의 세포를 같은 조건으로 7일간 배양에 따른 증식률(도 3B 및 C)도 높게 나타났다.
실시예 4: 최적의 배양액 선별
초기 절개된 조직의 배양으로부터 폐암세포의 정제 및 정제된 폐암세포의 배양 및 증식을 위한 적절한 배양액을 찾기 위하여 하기 4가지 조성의 배양액을 사용하여 실험하였다. 기본 배지로는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco-BRL)에 1 mM의 L-글루타민(Gibco-BRL), 1% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco-BRL), 1% 비필수 아미노산(Gibco-BRL), 및 0.1 mM 머캅토에탄올(Gibco-BRL)을 포함하는 배지를 사용하였다. 실험군으로는 상기 기본 배지에 각각 N2(Gibco-BRL), 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS, Hyclone), 10% FBS + BEI (10% FBS, 10 ng/ml bFGF(R&D system), 10 ng/ml EGF(R&D) 및 10 ng/ml IGF(R&D)), 및 ACL4[N. Masuda et al., CHEST, 1991; 100: 429-438]를 첨가하여 사용하였다.
도 4에 나타낸 결과에서 보듯이, 배양 초기 즉 폐암세포 정제시에는 혈청 및 성장인자가 포함된 10% FBS + BEI를 첨가한 배지의 사용은 섬유아세포의 과도한 증식을 유발하여 폐암세포주의 정제 배양을 위한 조건으로 적합하지 않았다(도 4A 상부 패널). 반면 무혈청 조건의 N2 첨가 배지 조건하에서는 불필요한 섬유아세포의 성장이 억제되어 순수한 폐암세포군 만이 정제되는 것을 확인할 수 있었다(도 4A 하부 패널). 그러나, 무혈청 N2 첨가 배지 조건하에서 정제된 폐암세포의 증식을 위한 실험에서는 혈청 및 성장인자를 포함한 10% FBS + BEI 첨가 배지에서 효과적인 증식이 관찰된 반면(도 4B 상부 패널), 무혈청 N2 첨가 배지에서는 시간이 지남에 따라 폐암세포의 사멸이 관찰되었다(도 4B 하부 패널). 따라서, 폐암세포 정제를 위하여 배양 초기 5 내지 7일간은 무혈청 N2 첨가 배지에서 배양하여 섬유아세포를 제거하고 순수한 폐암세포만이 증식되도록 하고, 이 후에는 상기 방법으로 정제된 폐암세포의 증식을 위해 혈청 및 성장인자를 포함하는 10% FBS + BEI 첨가 배지를 이용한 배양이 적합함을 확인하였다.
실시예 5: 최적의 배양 기법 선별
초기 정제된 폐암세포의 배양 및 증식에 대한 배양 기법의 영향을 확인하기 위하여 일반적인 세포배양법인 단층 부착배양법(2D), 부유응집체 배양법(3D) 및 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryo fibroblast; MEF)와의 동시배양법을 이용하여 배양하였다.
그 결과, 부유응집체 배양법(3D)으로 배양한 경우에는 세포의 성장을 관찰할 수 없었으나, 단층 부착배양법(도 5 좌측 패널) 및 MEF와의 동시배양법(도 5 우측패널)을 이용한 경우 모두 세포의 배양 및 증식이 가능함을 확인하였다. 그러나 동시배양의 경우 이후 공급자 세포(feeder cells)를 제거해야 하는 번거로움이 있다는 단점이 있다.
실시예 6: 배양된 폐암세포의 염색체 분석
상기 실시예 1 내지 5를 통해 확립한 최적의 배양 조건으로 분리되고 증식된 즉 마트리겔이 코팅된 배양접시에서 40 내지 100 μm 크기의 절개된 조직을 배양하여 얻어진 폐암세포를 디스파아제를 이용하여 혼재된 섬유아세포로부터 정제하고 이와 같이 정제된 폐암세포를 초기에는 무혈청 N2 첨가 배지로 일정기간 배양하여 여분의 섬유아세포를 제거하고 이후 FBS 및 성장인자를 포함하는 10% FBS + BEI 첨가 배지를 사용하여 증식시킨 폐암세포주가 여전히 암의 특성을 갖는지 확인하기 위하여 면역염색기법으로 염색체 분열을 조사하였다.
그 결과, 도 6에서 보듯이, 암세포의 특징인 비정상적인 세포분열(도 6A) 및 비정상적인 염색체 수의 증가(도 6B)가 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 방법에 의해 분리 및 배양된 폐암세포가 환자 생체 내의 세포와 동일한 특성을 갖는다는 것을 확인하였다.
실시예 7: 생체 내 종양형성 능력 분석
실시예 6에 사용된 본 발명의 최적화된 분리, 배양 및 증식을 위한 배양 방법으로 배양된 폐암세포가 암세포의 특성을 갖는지 확인하기 위하여, 상기 폐암세포주에 Cy5.5 형광물질을 표지하여 면역결핍 생쥐의 등에 이식하고 제노겐(xenogen) 장비로 세포 생존여부 및 종양형성 여부를 확인하였다.
그 결과, 이식된 폐암세포는 6주 경과 후에도 생존하고 있었으며, 적출하여 확인한 결과 종양과 유사한 형태의 조직으로 존재함이 관찰되었다(도 7).
실시예 8: 형성된 조직의 조직학적 분석
실시예 7에서 얻어진, 본 발명의 최적화된 분리, 배양 및 증식을 위한 배양 방법으로 배양된 폐암세포를 마우스에 이식하고 6주간 형성된, 종양조직을 냉동절단(cryo-section)하여, 헤마톡실린 및 에오신과 마송 삼색(Masson's trichrome)으로 염색하여 분석하고 그 결과를 도 8에 나타내었다.
그 결과, 비정상적인 세포증식 및 세포의 크기, 모양, 세포핵의 다양성으로 보아 상기 이식된 폐암세포로부터 형성된 종양조직은 전형적인 종양의 특성을 지니고 있음을 확인할 수 있었다.
상기와 같은 결과들은, 본 발명의 방법에 의해 분리 및 배양된 폐암세포가 환자 생체 내의 암세포와 동일한 특성을 갖는다는 것을 시사하는 것이며, 이는 환자 맞춤형 항암제의 스크리닝에 적절히 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.

Claims (9)

  1. 하기 단계를 포함하는 폐암조직으로부터 폐암세포의 분리 및 증식시키는 방법:
    1) 환자로부터 분리한 폐암 조직을 지름 40 내지 100 μm의 크기로 절개하는 단계;
    2) 상기 1)단계의 절개된 조직을 배양하는 단계;
    3) 상기 2)단계의 배양된 조직에 디스파아제(Dispase)를 사용하여 폐암세포를 분리하는 단계;
    4) 상기 3)단계의 폐암세포를 코팅물질이 코팅된 배양접시에서 무혈청 N2 배지로 배양하여 폐암세포만을 분리하여 배양하는 단계; 및
    5) 상기 4)단계의 분리 배양된 폐암세포를 혈청 및 성장인자를 첨가한 배지에서 배양하여 증식시키는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 폐암세포를 배양접시에 단독으로 단층 부착배양 또는 공급자세포(feeder cell)와 함께 동시배양하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    공급자세포는 마우스 배아 섬유아세포인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 폐암은 비소세포암인 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 비소세포암은 편평세포암종, 대세포암종 및 선암종으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 코팅물질은 마트리겔인 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 성장인자는 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor), EGF(Epidermal Growth Factor) 또는 IGF(Insulin-like Growth Factor)인 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 폐암세포를 배양하는 단계; 및
    상기 폐암세포에 암치료 후보물질을 처리하는 단계를 포함하는, 환자 맞춤형 암치료제를 스크리닝하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 암치료 후보물질은 카보플라틴(파라플라틴)[Carboplatin(paraplatin)], 시스플라틴(Cisplatin), 시클로포스파미드(Cyclophosphamide), 이포스파미드(Ifosfamide), 니드란(Nidran), 질소머스타드(메클로에타민 염산염)[Nitrogen mustar(Mechlorethamine HCL)], 블레오마이신(Bleomycin), 독소루비신(Doxorubicin), 미토마이신 C(Mitomycin C), 시타라빈(Cytarabine), 플루로우라실(Flurouracil), 젬시타빈(Gemcitabine), 트리메트렉세이트(Trimetrexate), 메토크렉세이트(Methotrexate), 에토포시드(Etoposide), 빈블라스틴(Vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 알림타(Alimta), 알트레타민(Altretamine), 프로카바진(Procarbazine), 탁솔(Taxol), 탁소텔(Taxotere), 토포테칸(Topotecan), 이리노테칸(Irinotecan), 베바시주맙(Bevacizumab), 게피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 피시바닐 바이알(Picibanil Vial), 아크라루비신(Aclarubicin), 테가푸르(Tegafur), 에피루비신(Epirubicin), 베로테칸(Belotecan), 안트라싸이클린(anthracycline), 이다루비신(idarubicin), 및 닥티노마이신(dactinomycin)으로 이루어진 군에서 선택되는 암치료제인 것인 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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AU2001249393A1 (en) * 2000-03-22 2001-10-03 Glaxo Group Limited Pharmaceutical comprising an agent that blocks the cell cycle and an antibody
DE102005015953A1 (de) 2005-04-07 2006-10-12 Medizinische Hochschule Hannover Verfahren zur Anreicherung und ex vivo Kultivierung von Brustprimärzellen

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110452875A (zh) * 2018-05-07 2019-11-15 北京吉尚立德生物科技有限公司 一种用于培养肺癌实体瘤原代细胞的培养基
CN111733135A (zh) * 2020-06-16 2020-10-02 华东医院 一种中国人肺鳞癌细胞系及其应用
CN111733135B (zh) * 2020-06-16 2023-03-10 华东医院 一种中国人肺鳞癌细胞系及其应用

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