CN117821382A

CN117821382A - 一种毛囊干细胞无血清培养基和培养方法

Info

Publication number: CN117821382A
Application number: CN202311870364.0A
Authority: CN
Inventors: 陈海佳; 姜交华; 戚康艺; 李学家; 陈东煌; 陈启意
Original assignee: Guangdong Guoke Cell Technology Co ltd; Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Current assignee: Guangdong Guoke Cell Technology Co ltd; Guangzhou Saliai StemCell Science and Technology Co Ltd
Priority date: 2023-12-29
Filing date: 2023-12-29
Publication date: 2024-04-05

Abstract

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种毛囊干细胞无血清培养基和培养方法。本发明提供的毛囊干细胞无血清培养基包括MEM非必需氨基酸溶液、MEM维生素溶液、L‑谷氨酰胺溶液、L‑谷胱甘肽、亚硒酸钠、重组人血白蛋白、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人血小板衍生生长因子‑AB、重组人上皮调节蛋白、重组人过氧化氢酶、L‑抗坏血酸、(+)‑α‑生育酚乙酸酯、茴香霉素、皮质脂酮、左旋肉碱、D‑半乳糖、乙醇胺、亚油酸、亚麻酸、孕酮、腐胺以及基础培养基，化学成分明确，无外源外泌体污染，能够实现HFSCs体外快速增殖，多次传代细胞无空泡化或老化。

Description

一种毛囊干细胞无血清培养基和培养方法

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种毛囊干细胞无血清培养基和培养方法。

背景技术

由于现代生活节奏快、压力大等原因，越来越多的人受到病理性脱发困扰。研究认为，很多因素如衰老、遗传(如雄激素性脱发)、激素紊乱(如甲状腺疾病)、自身免疫(如系统性红斑狼疮)、营养障碍和药物等长期影响毛发生长周期和降低毛囊内细胞的活性，导致毛囊受损或产生缺陷，是引起脱发的直接原因。其中雄激素性脱发是占比最大的脱发类型，且越来越低龄化的，从而催生出一个高增长且潜力无限的防脱市场。

目前治疗雄脱的药物有限，市场上只有非那雄胺和米诺地尔两种治疗药物获得美国FDA批准。口服药非那雄胺带来的性欲下降、性功能障碍、情绪障碍和可能的出生缺陷等副作用是患者谨慎选择使用的主要原因。而外用药米诺地尔的缺点则是只对部分患者有效，且起效周期长，至少持续用药两个月以上才能开始看到是否有效，需要试用6到12个月才能知道是否适合自己。如果有效则需要继续使用来保持结果，当患者停止时，脱发会再次出现。

当前比较流行的脱发治疗手段是毛囊移植技术，即将患者本人非脱发区域的毛囊单位移植体移植到脱发区域。尽管毛发移植术已经比较成熟，但存在成活率不高等劣势，最大的局限就是供区不足。对于大面积脱发，尤其是6级以上脱发的患者不适合进行该手术。

近年来随着再生医学和毛发组织工程领域的快速发展，干细胞治疗脱发成为目前最具前景的治疗方法。现阶段干细胞治疗脱发可以分为三类：干细胞移植、干细胞条件培养基和干细胞外泌体的使用。现有研究表明，在动物模型上移植各种来源的MSCs(脐带、骨髓、脂肪等)可有效防止毛囊退化，激活毛囊组织的各类细胞活力，重新恢复毛囊生长周期。干细胞衍生条件培养基最近也被广泛研究应用。干细胞衍生条件培养基富含各种细胞生长因子，无肿瘤发生风险，易收获，同时研究者发现其可诱导毛囊细胞群再激活、发育、毛发周期和毛囊再生。外泌体(exosome)是细胞分泌的囊泡状物质，直径约为30-100nm，内含多种生物活性物质，在细胞间信号交流中扮演着重要角色，目前在各个领域，外泌体治疗作用已被大量报道。在毛囊研究方向，已有研究证实外泌体能促进鼠背毛从休止期进入生长期。干细胞源性外泌体是细胞分泌的小囊泡，通过携带包括转录因子、细胞因子充当细胞间的信号传导，已被证明是旁分泌的重要调节因子，特别是毛囊干细胞衍生的外泌体可能对头发具有重要意义。

毛囊是一种复杂的微小器官，毛囊的形成和发生是毛囊上皮成分与真皮成分间相互作用的结果，毛囊的生长再生受到自身的干细胞调控。存在于毛囊当中的干细胞主要有：毛囊干细胞(hair follicle stem cells，HFSCs)，毛乳头细胞(dermal papilla cells，DPCs)和黑色素干细胞(melanocyte stemcells，McSCs)三种细胞，其中毛乳头细胞和毛囊干细胞在毛囊形态发生及毛发周期中起重要作用。毛囊干细胞是定植于毛囊外根鞘隆突区(bulge区)的一群成体干细胞，属于上皮成分，具有慢周期性、自我更新、未分化和体外增殖能力强等特点。HFSCs不仅表达MSCs的表面标记物，而且还展示出向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、造血细胞、平滑肌细胞和神经元细胞等细胞分化的能力，加上其本身具有易于获取自体干细胞来源的特性，使得HFSCs在干细胞为基础的再生医学中具有巨大的潜力。

现有的HFSCs体外培养大都使用胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)或人血小板裂解液(Human Platelet Lysate hPL)。FBS成分复杂且含有异种蛋白质，容易携带病毒或被支原体感染等。hPL作为血清替代物最有效的成分，营养丰富，含大量多种细胞增殖所需的生长因子与蛋白，但使用过程中仍不能避免人源蛋白的引入，所培养的细胞或收集的条件培养基在临床或医美领域应用时存在异体免疫排斥反应的可能。因此，无人源或动物源、无血清及其衍生物添加的无血清培养体系，能够完全避免上述现有HFSCs培养体系的缺点。

HFSCs属于成体干细胞，其体外扩增能力有限，使用无血清培养基体外培养HFSCs，连续传代后细胞空泡化现象十分明显，胞质空泡随着传代次数越来越多，细胞迅速老化，扩增能力显著下降；随着空泡越来越大，最终细胞破裂死亡。因此，抑制HFSCs在无血清培养体系中连续传代所出现的空泡化，是提高HFSCs活力，减缓衰老，提高扩增效率的关键所在。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种毛囊干细胞无血清培养基和培养方法。本发明提供的毛囊干细胞无血清培养基能够减缓毛囊干细胞在连续传代过程中的衰老和/或维持所述毛囊干细胞增殖活力与传代能力，有效提高毛囊干细胞体外扩增和/或传代能力，防止所述毛囊干细胞传代培养空泡化。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种毛囊干细胞无血清培养基，所述毛囊干细胞无血清培养基包括：体积比为0.1-2％的MEM非必需氨基酸溶液、体积比为0.1-2％的MEM维生素溶液、体积比为0.1-2％的L-谷氨酰胺溶液、1～8mg/L L-谷胱甘肽、0.1～1μg/L亚硒酸钠、0.5～5g/L重组人血白蛋白、1～20mg/L重组人胰岛素、1～10mg/L重组人转铁蛋白、10～50μg/L重组人表皮生长因子、10～50μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、1～20μg/L重组人血小板衍生生长因子-AB、1～50μg/L重组人上皮调节蛋白、12.5～500mg/L重组人过氧化氢酶、5～200mg/L L-抗坏血酸、5～200ug/L(+)-α-生育酚乙酸酯、0.05～5mg/L茴香霉素、0.1～10mg/L皮质脂酮、25～500mg/L左旋肉碱、0.05～5mg/L D-半乳糖、0.1～10mg/L乙醇胺、25～500ug/L亚油酸、25～500ug/L亚麻酸、0.05～5μg/L孕酮、50～500mg/L腐胺以及余量基础培养基；

所述MEM非必需氨基酸溶液、MEM维生素溶液和L-谷氨酰胺溶液的终浓度均为100×。

优选的，所述毛囊干细胞无血清培养基包含体积比为1％的MEM非必需氨基酸溶液、体积比为1％的MEM维生素溶液、体积比为1％的L-谷氨酰胺溶液、4mg/L L-谷胱甘肽、0.5μg/L亚硒酸钠、2g/L重组人血白蛋白、10mg/L重组人胰岛素、5mg/L重组人转铁蛋白、20μg/L重组人表皮生长因子、20μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、10μg/L重组人血小板衍生生长因子-AB、10μg/L重组人上皮调节蛋白、125mg/L重组人过氧化氢酶、50mg/L L-抗坏血酸、50ug/L(+)-α-生育酚乙酸酯、0.5mg/L茴香霉素、1mg/L皮质脂酮、100mg/L左旋肉碱、0.5mg/LD-半乳糖、2mg/L乙醇胺、100ug/L亚油酸、100ug/L亚麻酸、0.5μg/L孕酮、200mg/L腐胺以及余量基础培养基。

优选的，所述基础培养基为无血清培养基；所述无血清培养基为IMDM或高糖DMEM基础培养基。

本发明的第二个目的是提供一种如上述的毛囊干细胞无血清培养基在干细胞培养中的应用；所述干细胞为毛囊干细胞。

优选的，所述毛囊干细胞无血清培养基减缓毛囊干细胞在连续传代过程中的衰老和/或维持所述毛囊干细胞增殖活力与传代能力。

优选的，所述毛囊干细胞无血清培养基防止所述毛囊干细胞传代培养空泡化。

本发明的另一个目的是提供一种如上述毛囊干细胞无血清培养基的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：按上述毛囊干细胞无血清培养基各组分溶解特性溶解，混合均匀配制成1000×溶液，滤膜过滤除菌，-20～-80℃以下保存备用。

本发明的另一个目的是提供一种毛囊干细胞培养方法，所述培养方法包括如下步骤：

将干细胞接种至上述无血清培养基中培养；

所述干细胞为毛囊干细胞。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种针对毛囊干细胞的无血清培养基和培养方法，采用本发明提供的无血清培养基对毛囊干细胞HFSCs进行传代培养，能够实现毛囊干细胞HFSCs体外快速增殖，且细胞的增殖能力高于含血清组培养基。同时，本发明实现了毛囊干细胞HFSCs在传代培养中多次传代细胞无空泡化或老化，细胞空泡化得到了有效的抑制，细胞衰老得到缓解，并且该效果能达到与血清培养基相当的水平。

其次，本发明提供的毛囊干细胞HFSCs培养的无血清培养基，其化学成分明确，无人源或动物源，无血清及其衍生物，无外源外泌体污染，相比传统的无血清培养体系，本发明对毛囊干细胞HFSCs进行传代培养时，所需的培养基添加原料种类少，简单成本低。

同时，将本发明提供的无血清培养基应用于毛囊干细胞HFSCs的传代培养，能够满足毛发组织工程领域研究或治疗对HFSCs数量的需求，同时可收集不含外源外泌体的条件培养基或提取HFSCs外泌体，应用于脱发治疗。

附图说明

图1为采用实施例1无血清培养基培养至P3、P4和P5代HFSCs形态图；

图2为采用实施例2无血清培养基培养至P3、P4和P5代HFSCs形态图；

图3为采用实施例3无血清培养基培养至P3、P4和P5代HFSCs形态图；

图4为采用实施例4无血清培养基培养至P3、P4和P5代HFSCs形态图；

图5为采用实施例5无血清培养基培养至P3、P4和P5代HFSCs形态图；

图6为采用对照组1完全培养基培养至P3、P4和P5代HFSCs形态图；

图7为采用对照组2完全培养基培养至P3、P4和P5代HFSCs形态图；

图8为各组HFSCs衰老细胞β-半乳糖苷酶活性染色结果图(40×)；

图9为各组HFSCs各代次细胞扩增倍数曲线图；

图10为实验组1HFSCs表面marker流式检测结果图；

图11为实验组2HFSCs表面marker流式检测结果图；

图12为实验组3HFSCs表面marker流式检测结果图；

图13为实验组4HFSCs表面marker流式检测结果图；

图14为实验组5HFSCs表面marker流式检测结果图；

图15为对照组1HFSCs表面marker流式检测结果图；

图16为对照组2HFSCs表面marker流式检测结果图；

图17为200×倍镜下，实验组2、对照组1和对照组2HFSCs成脂分化效果图；

图18为40×倍镜下，实验组2、对照组1和对照组2HFSCs成骨分化效果图。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。

本发明中，所涉及的组分、试剂均为常规市售产品。如重组人血白蛋白(货号：HYC002C01)购自武汉禾元生物科技股份有限公司；MEM非必须氨基酸溶液和MEM维生素溶液购自Thermofisher公司；所述胎牛血清FBS购自corning，货号35-081-cv；所述IMDM完全培养基购自Gibco，货号C12440500BT；所述人血小板裂解液(hPL)购自BI，货号PLTGOLD0500R；L-谷氨酰胺溶液、亚油酸、亚麻酸、亚硒酸钠和L-谷胱甘肽购自sigma公司；各类重组蛋白均购自Peprotech公司。

本发明提供的毛囊干细胞无血清培养基含有多种生长因子和营养物质，这能促使毛囊干细胞在无血清培养条件下正常的生长和代谢：

重组人血白蛋白替代了血源人血白蛋白用于细胞培养，其可与维生素、脂类、激素、金属离子和生长因子的结合，起到稳定和调节上述物质在无血清体系中的活性作用，同时保护细胞免受机械损伤。

重组人胰岛素可以促进RNA、蛋白质和脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，是重要的细胞存活因子。

重组人转铁蛋白是一种结合蛋白，可携带铁离子；在细胞代谢过程中起重要作用。转铁蛋白也是重要的细胞外抗氧化剂，其在生理条件下紧密地结合铁，以至于几乎不存在游离铁来催化自由基的产生，维持体外培养的细胞年轻化。

重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人血小板衍生生长因子-AB和重组人上皮调节蛋白等生长因子，可以细胞内各自相应受体结合，激活MAPK-ERK、PI3K-AKT等多条信号通路，进而促进细胞增殖。

重组人过氧化氢酶、L-抗坏血酸、(+)-α-生育酚乙酸酯和左旋肉碱为抗氧化还原保护剂，其可以产生协同作用，保护细胞免受氧自由基的损害，减缓细胞过度衰老及空泡化。

茴香霉素是p38和JNK信号通路激活剂，p38信号通路被抑制会引起细胞质内空泡形成，细胞快速衰老并凋亡。而茴香霉素可激活p38信号通路，防止细胞空泡化。

亚硒酸钠中的微量元素硒能消除过氧化物酶和氧自由基对细胞的损害，是细胞生长中必不可少的一种微量元素。

皮质脂酮和孕酮是类固醇激素，可促进细胞贴壁和细胞分离，促进毛囊干细胞增殖。

D-半乳糖是一种由六个碳和一个醛组成的单糖，是细胞膜糖蛋白合成所需成分之一。

乙醇胺是一种有机化合物，磷脂合成前体，可以为细胞膜质结构合成提供原料。

亚油酸亚麻酸是一类脂肪酸前体，为细胞提供膜合成和生长所需的脂质。

腐胺是细胞代谢所需的活性物质之一，具有促进细胞分裂，促进DNA、RNA及蛋白质等大分子物质合成的作用；外源补充腐胺还能调节钙和镁离子运转，维持细胞渗透压平衡的作用。

因此，化学成分明确，无外源外泌体污染，能够实现HFSCs体外快速增殖，多次传代细胞无空泡化或老化。

实施例1本发明毛囊干细胞无血清培养基的制备

本发明毛囊干细胞无血清培养基包括：体积比为1％的MEM非必需氨基酸溶液、体积比为1％的MEM维生素溶液、体积比为1％的L-谷氨酰胺溶液、1mg/L L-谷胱甘肽、0.1μg/L亚硒酸钠、0.5g/L重组人血白蛋白、1mg/L重组人胰岛素、1mg/L重组人转铁蛋白、10μg/L重组人表皮生长因子、10μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、1μg/L重组人血小板衍生生长因子-AB、1μg/L重组人上皮调节蛋白、12.5mg/L重组人过氧化氢酶、5mg/L L-抗坏血酸、5ug/L(+)-α-生育酚乙酸酯、0.05mg/L茴香霉素、0.1mg/L皮质脂酮、25mg/L左旋肉碱、0.05mg/L D-半乳糖、0.1mg/L乙醇胺、25ug/L亚油酸、25ug/L亚麻酸、0.05μg/L孕酮、50mg/L腐胺以及余量高糖DMEM基础培养基；

所述毛囊干细胞无血清培养基的制备方法，包括如下步骤：按上述毛囊干细胞无血清培养基各组分溶解特性溶解，混合均匀配制成1000×溶液，0.22m滤膜过滤除菌，-20℃以下保存备用。

实施例2本发明毛囊干细胞无血清培养基的制备

本发明毛囊干细胞无血清培养基包括：体积比为1％的MEM非必需氨基酸溶液、体积比为1％的MEM维生素溶液、体积比为1％的L-谷氨酰胺溶液、2mg/L L-谷胱甘肽、0.25μg/L亚硒酸钠、1g/L重组人血白蛋白、5mg/L重组人胰岛素、2mg/L重组人转铁蛋白、10μg/L重组人表皮生长因子、10μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、5μg/L重组人血小板衍生生长因子-AB、5μg/L重组人上皮调节蛋白、62.5mg/L重组人过氧化氢酶、10mg/L L-抗坏血酸、10ug/L(+)-α-生育酚乙酸酯、0.1mg/L茴香霉素、0.5mg/L皮质脂酮、50mg/L左旋肉碱、0.1mg/LD-半乳糖、1mg/L乙醇胺、50ug/L亚油酸、50ug/L亚麻酸、0.5μg/L孕酮、100mg/L腐胺以及余量高糖DMEM基础培养基；

实施例3本发明毛囊干细胞无血清培养基的制备

本发明毛囊干细胞无血清培养基包括：体积比为1％的MEM非必需氨基酸溶液、体积比为1％的MEM维生素溶液、体积比为1％的L-谷氨酰胺溶液、4mg/L L-谷胱甘肽、0.5μg/L亚硒酸钠、2g/L重组人血白蛋白、10mg/L重组人胰岛素、5mg/L重组人转铁蛋白、20μg/L重组人表皮生长因子、20μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、10μg/L重组人血小板衍生生长因子-AB、10μg/L重组人上皮调节蛋白、125mg/L重组人过氧化氢酶、50mg/L L-抗坏血酸、50ug/L(+)-α-生育酚乙酸酯、0.5mg/L茴香霉素、1mg/L皮质脂酮、100mg/L左旋肉碱、0.5mg/LD-半乳糖、2mg/L乙醇胺、100ug/L亚油酸、100ug/L亚麻酸、0.5μg/L孕酮、200mg/L腐胺以及余量IMDM基础培养基；

实施例4本发明毛囊干细胞无血清培养基的制备

本发明毛囊干细胞无血清培养基包括：体积比为1％的MEM非必需氨基酸溶液、体积比为1％的MEM维生素溶液、体积比为1％的L-谷氨酰胺溶液、4mg/L L-谷胱甘肽、0.5μg/L亚硒酸钠、2g/L重组人血白蛋白、10mg/L重组人胰岛素、5mg/L重组人转铁蛋白、20μg/L重组人表皮生长因子、20μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、10μg/L重组人血小板衍生生长因子-AB、20μg/L重组人上皮调节蛋白、250mg/L重组人过氧化氢酶、100mg/L L-抗坏血酸、100ug/L(+)-α-生育酚乙酸酯、1mg/L茴香霉素、2mg/L皮质脂酮、200mg/L左旋肉碱、1mg/LD-半乳糖、4mg/L乙醇胺、200ug/L亚油酸、200ug/L亚麻酸、1μg/L孕酮、200mg/L腐胺以及余量IMDM基础培养基；

实施例5本发明毛囊干细胞无血清培养基的制备

本发明毛囊干细胞无血清培养基包括：体积比为1％的MEM非必需氨基酸溶液、体积比为1％的MEM维生素溶液、体积比为1％的L-谷氨酰胺溶液、8mg/L L-谷胱甘肽、1μg/L亚硒酸钠、5g/L重组人血白蛋白、20mg/L重组人胰岛素、10mg/L重组人转铁蛋白、50μg/L重组人表皮生长因子、50μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L重组人血小板衍生生长因子-AB、50μg/L重组人上皮调节蛋白、500mg/L重组人过氧化氢酶、200mg/L L-抗坏血酸、200ug/L(+)-α-生育酚乙酸酯、5mg/L茴香霉素、10mg/L皮质脂酮、500mg/L左旋肉碱、5mg/LD-半乳糖、10mg/L乙醇胺、500ug/L亚油酸、500ug/L亚麻酸、5μg/L孕酮、500mg/L腐胺以及余量IMDM基础培养基；

实验一效果验证

将本发明实施例1-5制得的无血清培养基设为实验组，将含10％ FBS的IMDM完全培养基设为对照组1，含5％人血小板裂解液(hPL)的IMDM完全培养基设为对照组2，分别培养毛囊干细胞，选择P3代HFSCs开展实验，HFSCs按1×10⁴/cm²密度接种于6孔板中，每组设置3个重复。

置于5％ CO₂培养箱37℃培养。细胞汇合度达80％以上即可进行传代培养，连续进行至少3次传代。然后进行如下几个方面的检测：

(1)连续传代培养形态对比

对实验组1-5和对照组1-2每个培养代次的HFSCs进行图像采集。实验结果如图1-7所示，由实验结果可知，各组HFSCs均呈单层贴壁生长，大部分细胞呈长梭形，形态不规则。在连续传代过程中，对照组1没出现细胞空泡，对照组2在连续传代培养中出现细胞空泡化，实验组1与实验组5的HFSCs有逐步出现少量细胞空泡，但与对照组2比明显减少；实验组2、实验组3和实验组4的HFSCs各代次均未见空泡出现，与对照组1有血清组相似。

(2)β-半乳糖苷酶活性染色

对实验组1-5和对照组1-2连续传代培养3次以上的HFSCs进行β-半乳糖苷酶活性染色，检测HFSCs的衰老程度。HFSCs按4.5×10⁴个/孔接种于12孔板中，放入5％ CO₂培养箱37℃培养。48h后，使用β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒(购自碧云天，货号C0602)对各组HFSCs进行染色。

实验结果如图8所示，图8为各组HFSCs衰老细胞β-半乳糖苷酶活性染色结果图(40×)。由实验结果可知，对照组2有大量细胞着色，细胞衰老明显；实验组1和实验组5有少量细胞着色；对照组1和实验组2、实验组3、实验组4几乎无细胞着色，说明本发明毛囊干细胞无血清培养基能有效减缓HFSCs在连续传代过程中的衰老，维持HFSCs增殖活力与传代能力。

(3)体外增殖能力检测

选择实验组1-5和对照组1-2的P1代HFSCs开展实验，HFSCs按1×10⁵个/cm²接种于T25瓶中，放入5％ CO₂培养箱37℃培养。进行5代以上的连续传代培养，计算各组HFSCs各代次的扩增倍数。细胞培养3-4天，汇合度达80％或以上后，收集细胞，计算收获总量，其中，扩增倍数＝收获总量/接种量。

实验结果如表1和图9，结果表明，与对照组1(含血清组)和对照组2(hPL组)相比，各实验组不仅能维持HFSCs体外多代次扩增的性能，且在多次传代过程中具有更高的增殖能力。

表1各代次HFSCs扩增倍数

(4)HFSCs表面标志物检测

选择实验组1-5和对照组1-2连续传代培养3次以上的HFSCs开展实验，HFSCs按1×10⁴/cm²密度接种于T25培养瓶中，置于5％ CO₂培养箱37℃培养。3天后，0.25％胰蛋白酶溶液消化收集各组HFSCs，流式细胞仪(购自贝克曼，型号DxFLEX B75145)检测其表面marker如CD105、CD73、CD90、CD11b、CD45、HLA-DR等的表达情况。

实验结果如表2和图10-16所示，检测结果表明，实验组与对照组的HFSCs表面marker CD105、CD73、CD90阳性表达，表达率均高于95％，符合MSC参考标准(≥95.0％)；而CD11b、CD45、HLA-DR阴性表达，表达率均低于2％，符合MSC参考标准(≤2.0％)；各组之间无显著性差异。表明本发明毛囊干细胞无血清培养基的使用不影响HFSCs表面标记物的表达。

表2各组HFSCs表面marker检测结果

实验组别

CD105

CD90

CD73

CD11b

CD45

HLA-DR

对照组1

99.88％

100.00％

0.12％

0.15％

0.33％

对照组2

100.00％

0.11％

0.39％

0.13％

实验组1

99.95％

100.00％

0.00％

0.39％

0.14％

实验组2

99.97％

100.00％

0.31％

0.56％

0.45％

实验组3

100.00％

0.00％

0.03％

实验组4

99.99％

100.00％

0.07％

0.03％

0.17％

实验组5

99.99％

100.00％

0.01％

0.24％

0.16％

(5)HFSCs多向分化潜能检测

选择实验组1-5和对照组1-2连续传代培养3次以上的HFSCs开展实验，实验组2、对照组1和对照组2的HFSCs分别按1×10⁵/孔接种于6孔板中，放入5％ CO₂培养箱37℃培养。待各组HFSCs融合度达80％以上，分别设置对照孔和诱导孔，诱导HFSCs成骨和成脂分化。

7天后对成脂分化实验组细胞进行油红O染色，21天后对成骨分化实验组细胞进行茜素红染色。实验结果如图17-18所示，实验结果表明本发明提供的毛囊干细胞无血清培养基不影响HFSCs成脂分化潜能，且显著提高HFSCs成骨分化能力。

本发明提供的毛囊干细胞无血清培养基化学成分明确，无外源外泌体污染，能够实现HFSCs体外快速增殖和多次传代细胞无空泡化或老化。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种毛囊干细胞无血清培养基，其特征在于，所述毛囊干细胞无血清培养基包括：体积比为0.1-2％的MEM非必需氨基酸溶液、体积比为0.1-2％的MEM维生素溶液、体积比为0.1-2％的L-谷氨酰胺溶液、1～8mg/L L-谷胱甘肽、0.1～1μg/L亚硒酸钠、0.5～5g/L重组人血白蛋白、1～20mg/L重组人胰岛素、1～10mg/L重组人转铁蛋白、10～50μg/L重组人表皮生长因子、10～50μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、1～20μg/L重组人血小板衍生生长因子-AB、1～50μg/L重组人上皮调节蛋白、12.5～500mg/L重组人过氧化氢酶、5～200mg/LL-抗坏血酸、5～200ug/L(+)-α-生育酚乙酸酯、0.05～5mg/L茴香霉素、0.1～10mg/L皮质脂酮、25～500mg/L左旋肉碱、0.05～5mg/L D-半乳糖、0.1～10mg/L乙醇胺、25～500ug/L亚油酸、25～500ug/L亚麻酸、0.05～5μg/L孕酮、50～500mg/L腐胺以及余量基础培养基；

2.根据权利要求1所述的毛囊干细胞无血清培养基，其特征在于，所述毛囊干细胞无血清培养基包含体积比为1％的MEM非必需氨基酸溶液、体积比为1％的MEM维生素溶液、体积比为1％的L-谷氨酰胺溶液、4mg/L L-谷胱甘肽、0.5μg/L亚硒酸钠、2g/L重组人血白蛋白、10mg/L重组人胰岛素、5mg/L重组人转铁蛋白、20μg/L重组人表皮生长因子、20μg/L重组人碱性成纤维细胞生长因子、10μg/L重组人血小板衍生生长因子-AB、10μg/L重组人上皮调节蛋白、125mg/L重组人过氧化氢酶、50mg/L L-抗坏血酸、50ug/L(+)-α-生育酚乙酸酯、0.5mg/L茴香霉素、1mg/L皮质脂酮、100mg/L左旋肉碱、0.5mg/L D-半乳糖、2mg/L乙醇胺、100ug/L亚油酸、100ug/L亚麻酸、0.5μg/L孕酮、200mg/L腐胺以及余量基础培养基。

3.根据权利要求1或2所述的毛囊干细胞无血清培养基，其特征在于，所述基础培养基为无血清培养基；所述无血清培养基为IMDM或高糖DMEM基础培养基。

4.一种如权利要求1或2所述的毛囊干细胞无血清培养基在干细胞培养中的应用；其特征在于，所述干细胞为毛囊干细胞。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述毛囊干细胞无血清培养基减缓毛囊干细胞在连续传代过程中的衰老和/或维持所述毛囊干细胞增殖活力与传代能力。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述毛囊干细胞无血清培养基防止所述毛囊干细胞传代培养空泡化。

7.一种如权利要求1或2所述毛囊干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：按权利要求1所述毛囊干细胞无血清培养基各组分溶解特性溶解，混合均匀配制成1000×溶液，滤膜过滤除菌，-20～-80℃以下保存备用。

8.一种毛囊干细胞培养方法，其特征在于，所述培养方法包括如下步骤：

将干细胞接种至权利要求1或2所述无血清培养基中培养；

所述干细胞为毛囊干细胞。