CN106867964A

CN106867964A - 心肌细胞培养液及培养方法

Info

Publication number: CN106867964A
Application number: CN201611252382.2A
Authority: CN
Inventors: 高歌
Original assignee: Shanghai Aisaer Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shanghai Aisaer Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-12-30
Filing date: 2016-12-30
Publication date: 2017-06-20
Anticipated expiration: 2036-12-30
Also published as: CN106867964B

Abstract

本发明公开了一种基于外周血单核细胞培养心肌细胞的培养液，所述培养液包括：体积比为100:0.5～2的DMEM/F12基础培养基和胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐(ITS)补充液、腺苷酸环化酶激活剂、L‑抗坏血酸、L‑谷氨酰胺衍生物、钙通道激活剂、RSK 2抑制剂、GSK 3抑制剂和ALK‑4,5,7抑制剂。本发明还公开了一种基于外周血单核细胞培养心肌细胞的培养方法，使用所述培养液，可以外周血单核细胞为原料定向分化培养得到心肌细胞，取材方便，可避免道德争议。

Description

心肌细胞培养液及培养方法

技术领域

本发明属于心肌细胞培养技术领域，具体涉及一种心肌细胞的培养液及培养方法。

背景技术

心血管疾病一直是人类的重大疾病之一。心肌细胞在心血管疾病的体外疾病模型、药物筛选、药物毒理测试等方面都有应用。但是由于心肌细胞增殖能力有限、原代心肌细胞取样困难，因此体外心肌细胞模型仍然难以大规模应用。目前用于体外心肌模型的心肌细胞主要有以下几种来源：

胚胎源心肌细胞：主要是胚胎干细胞(ESCs)诱导分化得到的心肌细胞。但是人胚胎来源的心肌细胞十分有限，目前主要是从流产人胚胎组织中获取，一直受到争议。另外，免疫排斥及致癌作用一直限制其使用。因此，胚胎源心肌细胞应用于临床在来源及效果方面也有很大的障碍。

组织来源的心肌细胞：目前组织来源的心肌细胞只是用动物来源的心肌细胞，活体人心脏组织无法获得。而动物心肌细胞的研究模型与人体本身有差异，研究成果仍然难以在人类自身直接应用。

综上心肌细胞的来源往往受到现有技术或伦理的限制，从而影响心肌细胞在临床中治疗心血管疾病的应用和研究。

发明内容

因此，本发明针对现有技术中心肌细胞的来源受到限制的技术问题，目的在于提供一种更加方便取材，可避免道德争议的基于外周血单核细胞(PBMC)培养心肌细胞的定向分化培养液。

本发明的基于外周血单核细胞的心肌细胞培养液包括：体积比为100:0.5～2的DMEM/F12基础培养基和胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐(ITS)补充液(购自Sigma公司，货号I3146)、腺苷酸环化酶激活剂、L-抗坏血酸、L-谷氨酰胺、钙通道激活剂、RSK 2抑制剂、GSK3抑制剂、ALK-4,5,7抑制剂。

其中，所述腺苷酸环化酶激活剂选用毛喉素(Forskolin)，用于通透细胞，激活腺苷酸环化酶，从而升高细胞内的cAMP水平。L-抗坏血酸作为培养基中的生长因子。L-谷氨酰胺作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。所述钙通道激活剂可选用BayK 8644(中文名：1,4-二氢-2,6-二甲基-5-硝基-4-(2-[三氟甲基]苯基)吡啶-3-羧酸甲酯，CAS号：71145-03-4)；所述RSK 2抑制剂可选用AT7867(中文名：4-(4-(1氢-吡唑-4-基)苯基)-4-(4-氯苯基)哌啶，CAS号：857531-00-1)或BI-D1870(中文名：2-[(3,5-二氟-4-羟基苯基)氨基]-7,8-二氢-5,7-二甲基-8-(3-甲基丁基)-6(5H)-蝶啶酮，CAS号：501437-28-1)；所述GSK 3抑制剂可选用SB216763(中文名：3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1氢-吲哚-3-基)-1氢-吡咯-2,5-二酮，CAS号：280744-09-4)或SB415286(中文名：3-[(3-氯-4-羟苯基)氨基]-4-(2-硝苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮，CAS号：264218-23-7)；所述ALK-4,5,7抑制剂可选用SB505124(中文名：2-(5-二烷基[1,3]二氧环戊-5-基-2-叔丁基-3氢-咪唑-4-基)-6-盐酸甲基吡啶，CAS号：694433-59-5)或SB431542(中文名：4-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯酰胺水合物，CAS号：301836-41-9)。

所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为2～12μmol/L；所述L-抗坏血酸浓度为0.06～0.15mmol/L，所述L-谷氨酰胺浓度为2～20mmol/L，所述钙通道激活剂浓度为10～100nmol/L，所述RSK 2抑制剂浓度为20～150nmol/L，所述GSK 3抑制剂浓度为50～200nmol/L，所述ALK-4,5,7抑制剂浓度为50～300nmol/L。

进一步的，DMEM/F12基础培养基和ITS补充液的体积比优选100:1，所述腺苷酸环化酶激活剂浓度优选4～8μmol/L，更优选6μmol/L；所述L-抗坏血酸浓度优选0.09～0.12mmol/L，更优选0.10mmol/L；所述L-谷氨酰胺浓度优选4～15mmol/L，更优选10mmol/L；所述钙通道激活剂浓度优选20～80nmol/L，更优选50nmol/L；所述RSK 2抑制剂浓度优选30～120nmol/L，更优选80nmol/L；所述GSK 3抑制剂浓度优选60～150nmol/L，更优选100nmol/L；所述ALK-4,5,7抑制剂浓度优选80～250nmol/L，更优选150nmol/L。

本发明的一较佳实施例中，其还包括纤维母细胞生长因子(购自Gibco，货号：CTP0263)，纤维母细胞生长因子作为额外补充的生长因子，浓度范围为0.05～0.25mmol/L，优选0.10～0.20mmol/L，更优选0.15mmol/L。

本发明的另一目的在于提供一种由外周血单核细胞培养心肌细胞的方法，包括以下步骤：

1)用所述的培养液对外周血单核细胞进行培养得到原代培养物；

2)原代培养物用所述培养液进行分化培养15～20天得到心肌细胞。

本发明的一较佳实施例的所述方法中，步骤1)具体为，于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO₂条件下，用所述培养液对外周血单核细胞进行原代培养2～5天优选3天，原代培养期间不用更换培养液；

步骤2)具体为，将步骤1)得到的原代培养物消化下来，于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO₂条件下用所述培养液进行分化培养15～20天优选16天得到心肌细胞，分化培养期间每隔1～3天优选1天更换一次培养液。

所述外周血单核细胞用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离患者血样得到。

对培养得到的细胞进行细胞类型鉴定，包括心肌细胞特征性蛋白表达(免疫荧光)及细胞纯度(流式细胞仪)的鉴定，确定表达心肌细胞特异性标记物，可用于低温贮藏或者用于医学研究。

本发明的积极进步效果在于：使用本发明所述培养液，经所述培养方法，可将外周血单核细胞定向分化培养得到纯度较高的心肌细胞。一方面取材方便，所述外周血单核细胞可取自患者血液，可避免道德争议；另一方面，与现有的动物模型相比，本发明培养得到的心肌细胞提供了最接近人体的体外细胞模型，降低了或无免疫排斥反应。

附图说明

图1为外周血单核细胞的显微镜照片；

图2为实施例1培养得到的心肌细胞的显微镜照片；

图3为实施例1培养得到的心肌细胞的免疫荧光的显微镜照片；

图4为实施例2培养得到的心肌细胞的免疫荧光的显微镜照片；

图5为实施例3培养得到的心肌细胞的免疫荧光的显微镜照片；

图6为实施例4培养得到的心肌细胞的免疫荧光的显微镜照片；

图7为实施例1培养得到的心肌细胞的流式分析图谱；

图8为实施例2培养得到的心肌细胞的流式分析图谱；

图9为实施例3培养得到的心肌细胞的流式分析图谱；

图10为实施例4培养得到的心肌细胞的流式分析图谱。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1～4 利用外周血单核细胞培养心肌细胞

一、培养液

实施例1～4的培养液包括由DMEM/F12基础培养基和ITS补充液混合而成的培养基，以及添加在基础培养基中的添加剂。各实施例的DMEM/F12基础培养基和ITS补充液的混合的体积比例、添加剂及其含量如表1所示。

表1培养液的组分及含量

二、培养过程

实施例1～4分别使用表1所示的对应的培养液按照以下步骤培养心肌细胞。

1、通过Ficoll-Paque密度梯度离心法分离外周血单核细胞

通过SepMate^TM管中间小孔向管内加入3.5mL Ficoll-Paque(相对密度1.077)，液面超过管子内置管，保持SepMate^TM管直立放置于离心管架子上。

取5mL DPBS+2％FBS至于15mL离心管中，然后加入5mL外周血血样，盖好后轻轻地来回颠倒4次混匀，混匀后用移液管取10mL沿着SepMate^TM管侧壁缓慢地加在Ficoll-Paque上，1200×g离心10分钟。

外周血单核细胞位于SepMate^TM管最上层，将最上层细胞悬液缓慢倒入新的15mL离心管，向离心管中加入5mL DPBS+2％FBS，300×g离心8分钟。弃去上清，轻弹离心管底部，再加入5mL DPBS+2％FBS，300×g离心5分钟。弃去上清液，轻弹离心管底部用剩余未吸走的DPBS+2％FBS重悬细胞得到外周血单核细胞，外周血单核细胞的显微镜照片如图1所示。

2、外周血单核细胞的原代培养

将得到的外周血单核细胞平均分到一块12孔板中，并加入培养液(1mL/孔)(若培养液存放于4℃冰箱中，需提前取出室温预热20分钟)，于37℃，5％CO₂的孵箱里培养n₁天。

3、心肌细胞的分化培养

铺好三块传代用的新的12孔板，加入基质胶(BD Matrigel^TM hESC-qualifiedMatrix)(0.5mL/孔)，置于37℃孵箱中孵育1个小时备用。

取出孵箱中原代培养后的12孔板，轻轻摇晃板，吸去培养液后，每孔加入1mL的DPBS(pH 7.4)洗一次，然后每孔加入0.5mL的EDTA，37℃孵箱内消化n₂分钟后在倒置显微镜下观察，细胞群中间出现小孔即可停止消化。轻轻晃动12孔板，吸去消化液。然后加入新鲜的培养液(1mL/孔)，用1mL的移液枪尽可能的将细胞从板上吹下来。

吸取孔中培养液分配于铺好加有基质胶的12孔板，每孔的培养液分别平均分配至两个含有基质胶的孔中。分配好后左右摇板各6下使板中细胞分布均匀，然后置于37℃，5％CO₂的孵箱里培养n₃天，每隔n₄天更换一次培养液。

其中实施例1～4的培养过程中的时间参数n₁～n₄如表2所示

表2各实施例的时间参数

效果实施例1 免疫荧光法鉴定心肌细胞特征性蛋白表达

分别对实施例1～4所得的细胞按照以下步骤进行鉴定。

1)固定细胞

取培养完成的12孔板，吸去培养液后，沿12孔板板壁缓缓加入1×PBS(pH 7.4，下同，1mL/孔)，洗2次；然后沿板壁缓慢加入4％的多聚甲醛(PFA)(1mL/孔)，室温放置18分钟固定细胞，轻柔地吸去PFA，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)。

2)一抗孵育

加入0.3％Triton×100(0.5mL/孔)，于37℃孵育30分钟；再加入5％的BSA(0.5mL/孔)封闭，于37℃孵育30分钟；直接在封闭液中加入一抗，于37℃孵育1小时；加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)。

3)二抗孵育

加入用1％BSA稀释(稀释比例1:200)后的二抗(0.5mL/孔)，37℃避光孵育30分钟；吸去二抗，加入1×PBS洗3次(1mL/孔/次)，每次5分钟；然后加入用1×PBS配好的终浓度为1μg/mL的DAPI(0.5mL/孔)，染色1分钟，吸去DAPI；加入1×PBS洗2次(1mL/孔/次)；最后加入1×PBS(0.5mL/孔)，显微镜下观察并拍照处理。

步骤2)中的一抗包括MYL7(购自Santa Cruz，货号：sc-34488)和心肌肌钙蛋白T单克隆抗体(以下均用cTnT表示)(购自Thermo Scientific，货号MA5-12960)，加入后稀释比例分别为1:100和1:200；步骤3)中的二抗包括驴抗山羊二抗(对应MYL7)，驴抗老鼠二抗(对应cTnT)(以上二抗均购自life technologies)。

鉴定结果如图3～6所示，图中红色为MYL7，绿色为cTnT。由此可知以外周血血样为原料分离外周血单核细胞，再使用本发明的培养液和培养方法培养得到的细胞为心肌细胞。

效果实施例2 流式纯度分析法分析心肌细胞的纯度

分别对实施例1～4所得的细胞按照以下步骤进行纯度分析。

取培养完成的12孔板，吸去培养液后，加入无Ca²⁺和Mg²⁺的DPBS洗1次(1mL/孔)；然后加入0.25％的Trypsin-EDTA消化液(1mL/孔)，缓慢晃动12孔板，使消化液覆盖整个底部。将12孔板置于37℃、5％CO₂孵育5分钟，加入培养液(6mL/孔)终止反应。用5mL移液管轻柔吹打使细胞成单细胞。室温下200×g离心2分钟，吸去上清液，向离心管中加入2mL FACS缓冲液(pH 7.4)洗1次，室温下200×g离心2分钟，用吸引泵吸去上清液。向离心管中加入100μL用FACS缓冲液稀释好的一抗，室温孵育1小时后用2mL FACS缓冲液洗1次。室温下200×g离心2分钟，弃去上清液。向离心管中加入100μL用FACS缓冲液稀释好的二抗(二抗稀释比例为1:1000)，避光室温孵育30分钟后用2mL的FACS缓冲液洗1次。室温下200×g离心2分钟，弃去上清液。向离心管中加入400μL的FACS缓冲液，将离心管置于冰上进行流式细胞仪分析。

使用的一抗为cTnT，稀释比例分别为1:200；二抗为488抗老鼠抗体(购自lifetechnologies)。

纯度检测结果如图7～10所示，各图中前面的峰为阴性对照，后面的峰即是阳性样本。图7显示实施例1培养得到的细胞系经流式细胞仪分析表达cTnT的细胞纯度为65.93％；图8显示实施例2培养得到的细胞系经流式细胞仪分析表达cTnT的细胞纯度为55.07％；图9显示实施例3培养得到的细胞系经流式细胞仪分析表达cTnT的细胞纯度为48.15％；图10显示实施例4培养得到的细胞系经流式细胞仪分析表达cTnT的细胞纯度为48.24％。得到的心肌细胞流式分析的纯度较高，可低温贮藏或者用于医学研究。

Claims

1.一种基于外周血单核细胞的心肌细胞培养液，其特征在于，所述培养液包括：体积比为100:0.5～2的DMEM/F12基础培养基和胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐补充液、腺苷酸环化酶激活剂、L-抗坏血酸、L-谷氨酰胺、钙通道激活剂、RSK 2抑制剂、GSK 3抑制剂和ALK-4,5,7抑制剂。

2.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述腺苷酸环化酶激活剂为毛喉素；所述钙通道激活剂为Bay K 8644；所述RSK 2抑制剂为AT7867或BI-D1870；所述GSK 3抑制剂为SB216763或SB415286；所述ALK-4,5,7抑制剂为SB505124或SB431542。

3.如权利要求1所述的培养液，其特征在于，所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为2～12μmol/L；所述L-抗坏血酸浓度为0.06～0.15mmol/L，所述L-谷氨酰胺浓度为2～20mmol/L，所述钙通道激活剂浓度为10～100nmol/L，所述RSK 2抑制剂浓度为20～150nmol/L，所述GSK3抑制剂浓度为50～200nmol/L，所述ALK-4,5,7抑制剂浓度为50～300nmol/L。

4.如权利要求3所述的培养液，其特征在于，DMEM/F12基础培养基和胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐补充液的体积比为100:1；所述腺苷酸环化酶激活剂浓度为4～8μmol/L优选6μmol/L；所述L-抗坏血酸浓度为0.09～0.12mmol/L，优选0.10mmol/L；所述L-谷氨酰胺浓度为4～15mmol/L，优选10mmol/L；所述钙通道激活剂浓度为20～80nmol/L，优选50nmol/L；所述RSK2抑制剂浓度为30～120nmol/L，优选80nmol/L；所述GSK 3抑制剂浓度为60～150nmol/L，优选100nmol/L；所述ALK-4,5,7抑制剂浓度为80～250nmol/L，优选150nmol/L。

5.如权利要求3所述的培养液，其特征在于，其还包括纤维母细胞生长因子，纤维母细胞生长因子浓度为0.05～0.25mmol/L，优选0.10～0.20mmol/L，更优选0.15mmol/L。

6.一种由外周血单核细胞培养心肌细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求1～5任一项所述的培养液对外周血单核细胞进行培养得到原代培养物；

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：

步骤1)具体为，于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO₂条件下，用所述培养液对外周血单核细胞进行原代培养2～5天，优选3天，原代培养期间不用更换培养液；

步骤2)具体为，将步骤1)得到的原代培养物消化下来，于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO₂条件下用所述培养液进行分化培养15～20天得到心肌细胞，分化培养期间每隔1～3天优选1天更换一次培养液。

8.如权利要求7所述的培养方法，其特征在于，所述外周血单核细胞用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离患者血样得到。