CN113249325A - 食管鳞癌原代细胞的培养基及培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于体外快速扩增食管鳞癌原代细胞的培养基及培养方法及其在筛选药物中的应用。所述食管鳞癌原代细胞的培养基含有初始培养基、Rho蛋白酶抑制剂、抗生素、胰岛素、N2添加剂、胰岛素样生长因子1、非必需氨基酸、以及任选的氢化可的松、任选的谷氨酰胺、和任选的牛垂体提取物。

Description

食管鳞癌原代细胞的培养基及培养方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于体外快速扩增食管 鳞癌原代细胞的培养基及培养方法。
背景技术
食管癌是目前世界上最常见的胃肠道恶性肿瘤之一。在食管癌的 病理分型中，国外和国内有明显差别，国外90％以上食管癌是腺癌， 而国内90％以上是鳞癌，由于NCCN指南是基于国外病例研究后给出 的指导，导致用NCCN来指导国内食管癌病人用药存在一定的差异性， 因此亟需建立中国人自己的原代细胞样本库，用来体外研究食管癌发 病机制以及开发新型的治疗食管癌的药物。在这过程中，食管癌原代 细胞培养就显得尤为重要。
目前食管癌原代细胞培养中，已知有直接将肿瘤细胞分离后培养 在含有胎牛血清的培养基中进行培养的方法(非专利文献2)；近些年 还报道了使用条件重编程的方法来培养上皮来源的细胞的方法，其中 提及可以用来培养扩增食管癌原代细胞(非专利文献3)；随后有文献 报道将食管癌术中样本通过胰酶消化后，利用条件重编程方法进行培 养的方法(非专利文献4)。最近有文献报道使用商品化培养基KSFM 中添加因子进行培养的方法(非专利文献5)，也有文献使用类器官培 养的方法来进行培养(非专利文献6)。
但是，上述非专利文献2中方法不能长期稳定培养，非专利文献3 和非专利文献4方法培养周期较长，非专利文献5中方法则需要成本 比较高，非专利文献6中用于类器官培养的试剂太昂贵，培养过程中 操作复杂，不利于大范围推广应用。
并且由于国外食管癌病理类型主要是食管腺癌，国外文献中方法 基本都是基于食管腺癌进行的研究，所以不适于用来培养食管鳞癌。 因此，需要开发一种适于食管鳞癌原代细胞培养的培养基以及培养方 法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Freddie Bray,BSc,MSc,PhD；Jacques Ferlay,ME,et al.GlobalCancer Statistics 2018.CA CANCER J CLIN 2018；68:394-424；
非专利文献2：Karin J.Purdie,Celine Pourreyron,and Andrew P.South.Isolation and Culture of Squamous Cell Carcinoma lines.Cancer CellCulture:Methods and Protocols,Second Edition,Methods in Molecular Biology,vol.731,2011,151-159；
非专利文献3：Xuefeng Liu,Ewa Krawczyk,et al.Conditional reprogrammingand long-term expansion of normal and tumor cells from humanbiospecimens.Nature Protocols,VOl.12NO.2,2017,439-451；
非专利文献4：Todd J.Jensen,Christopher Foster,et al.ConditionalReprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use inTissue Engineering and Disease Investigation.Journal of VisualizedExperiments,March 2017,121,e55243；
非专利文献5：Yuta Kasagi,et al.The Esophageal Organoid System RevealsFunctional Interplay Between Notch and Cytokines in Reactive EpithelialChanges.Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology Vol.5,No.3，2018，333-352；
非专利文献6：Xiaodun Li,Hayley E.Francies,et al.Organoid culturesrecapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model forclonality studies and precision therapeutics.NATURE COMMUNICATIONS(2018)9:2983-2995。
发明内容
为了解决上述现有技术中的问题，本发明提供了一种用于体外快 速扩增食管鳞癌原代细胞的培养基及培养方法。
本发明的一个方面在于提供一种食管鳞癌原代细胞的培养基，所 述培养基包括初始培养基、以下组分(1)～(6)、以及任选的以下 组分(7)～(9)，其中，初始培养基例如可以为DMEM/F12、DMEM、 F12或RPMI-1640，优选为DMEM/F12。
(1)Rho蛋白激酶抑制剂，选自Y27632、羟基法舒地尔 (Hydroxyfasudil)和GSK429286A中的一种或多种，当选自Y27632 时，浓度范围为2.5～40μM，优选为5～20μM，更优选为10μM；当 选自羟基法舒地尔时，浓度范围为2～32μM，优选为4～16μM，更优 选为8μM；当选自GSK429286A时，浓度范围为2～32μM，优选为4～ 16μM，更优选为8μM；
(2)抗生素，选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的 一种或多种，当选自链霉素/青霉素时，链霉素浓度范围为25～400 μg/mL，优选为50～200μg/mL，更优选为200μg/m，青霉素浓度范围 为25～400U/mL，优选为50～200U/mL，更优选为200U/mL；当选 自两性霉素B时，浓度范围为0.25～4μg/mL，优选为0.5～2μg/mL， 更优选为1μg/m；当选自Primocin时，浓度范围为25～400mg/mL， 优选为50～200mg/mL，更优选为100mg/mL，所述抗生素优选为 Primocin；
(3)胰岛素，浓度范围为2.5～40μg/mL，优选为10～40μg/mL， 更优选为20μg/mL；
(4)N2添加剂，相对于培养基的体积比1:400～1:25，优选1:100～ 1:25，更优选1:50；
(5)胰岛素样生长因子1(IGF-1)，浓度范围为2.5～40ng/mL， 优选为2.5～10ng/mL，更优选为5ng/mL；
(6)非必需氨基酸，所述非必需氨基酸为选自甘氨酸、丙氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的一种或多种，非 必需氨基酸的总浓度范围为50μM～400μM，优选为100μM～400μM， 更优选为400μM；
(7)氢化可的松，浓度范围为0～1.6μg/mL，优选为0.2～0.8 μg/mL，更优选为0.4μg/mL；
(8)谷氨酰胺，浓度范围为0mM～8mM，优选为1mM～4 mM，更优选为2mM；
(9)牛垂体提取物，浓度范围为0～56μg/mL，优选为3.5～14 μg/mL，更优选为7μg/mL。
本发明的另一个方面在于提供一种食管鳞癌原代细胞的培养方 法，该培养方法中，使用上述食管鳞癌原代细胞培养基进行培养。
上述培养方法包括以下步骤：
1、食管鳞癌原代细胞的分离
1.1对组织样本、例如内镜标本，用组织清洗液冲洗后加入组织消 化酶置于恒温摇床(知楚仪器ZQLY-180N)中进行消化，例如，利用 8～14毫升、优选12毫升组织消化酶进行消化；消化温度范围为4摄 氏度～37摄氏度，优选为37摄氏度；消化转速范围为200rpm～350 rpm，优选为300rpm；
1.2消化后取出观察，若未见明显组织块即可终止消化，否则继续 消化，直至消化充分，消化时间范围为4～8小时，优选为6小时；
1.3消化完成后取出，离心后弃去上清液，加入含血清初始培养基 重悬终止消化，离心转速范围为1200～1600g，优选为1500rpm；离心 时间范围为2～5分钟，优选为3分钟，其中，含血清培养基例如可以 使用含5％胎牛血清的DMEM/F12。
2.使用本发明的食管鳞癌原代细胞培养基进行培养
将上述步骤1中获得的食管鳞癌原代细胞用本发明的食管鳞癌原 代细胞培养基重悬并计数，按照细胞密度5～10×104个/cm2种入培养 皿中，同时按照细胞密度2～3×104个/cm2加入滋养细胞，培养5～7 天后按照细胞密度0.5～1×104个/cm2补充加入滋养细胞，直至培养皿 中细胞长满85％以上可进行消化传代。
其中，步骤1中所述的组织清洗液的配方为：DMEM/F12基础培 养基含100～200mg/mL Primocin、2％青霉素/链霉素溶液双抗；步骤1 中所述的组织消化液的配制方法为：将1～2mg/mL胶原酶Ⅱ、1～2 mg/mL胶原酶Ⅳ、50～100U/mL脱氧核糖核酸Ⅰ、0.5～1mg/mL透明质酸酶、1～3mM氯化钙、1～2％牛血清白蛋白溶于体积比1:1的HBSS 和RPMI-1640中；步骤2中所述的滋养细胞例如可以为辐照后的 NIH-3T3细胞，辐照源为X射线或者γ射线，优选为γ射线，辐照剂 量为30～50Gy，优选为35Gy。
发明效果
根据本发明，通过在条件重编程技术利用改良后的食管鳞癌原代 细胞的培养基，实现了食管鳞癌组织样本在短时间内快速扩增，能够 在有效的时间内扩增得到足够数量的细胞，用于体外高通量药物敏感 实验和指导临床精准用药。
与类器官培养基相比，本发明的食管鳞癌原代细胞的培养基中不 需要加入wnt3a、RSPO1以及Noggin等昂贵因子，大大降低了培养成 本。另外，类器官培养中，类器官消化过程复杂，与此相比，本发明 的培养方法处理方式简单，能够迅速地得到大量单层细胞，满足实验 需求。与传统的条件重编程技术中所使用的培养基相比，扩增得到相 同细胞数目的周期要短，并且对于少量样本扩增也具有明显促增殖效 果。本发明的食管鳞癌原代细胞的培养基和培养方法可以明显提高食 管鳞癌组织样本体外可持续扩增的成功率，平均在85％以上。
附图说明
图1为表示食管鳞癌原代细胞培养基中因子递增对食管鳞癌原代 细胞增殖的影响的图。
图2为表示食管鳞癌原代细胞培养基中多因子组合对食管鳞癌原 代细胞增殖的影响的图。
图3为表示在本发明的食管鳞癌原代细胞培养基中添加其它因子 对食管鳞癌原代细胞增殖的影响的图。
图4A和图4B为利用显微镜观察体外培养的食管鳞癌原代细胞得 到的照片(明场)。
图5A和图5B为对体外培养后的食管鳞癌细胞进行瑞氏吉姆萨染 色鉴定的结果。
图6A和图6B为对体外培养后的食管鳞癌细胞进行免疫荧光染色 鉴定的结果。
图7为使用本发明的食管鳞癌原代细胞培养基的食管鳞癌原代细 胞首次扩增周期和细胞数统计的结果。
图8为使用本发明的食管鳞癌原代细胞培养基的食管鳞癌原代细 胞体外扩增曲线。
图9A～图9P为表示食管鳞癌原代细胞培养基中不同因子的不同 浓度对食管鳞癌原代细胞增殖的影响的图。
图10为比较现有培养基与文献中报道培养基以及商品化培养基 KSFM对细胞增殖的影响的结果。
图11A～图11D为使用本发明培养基培养食管鳞癌细胞，并将不 同代数细胞用于药物筛选的结果。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并结合附图对本发明作进一步说 明，这些实施例仅用于说明本发明，本发明的范围不限定于这些实施 例。
实施例1含不同成分的食管鳞癌原代细胞培养基的促细胞增殖作 用
(1)不同组分培养基的配制
根据表1中的成分配制不同组分培养基，考察对食管鳞癌细胞的 促增殖作用。
在DMEM/F12培养基(购自康宁公司)上添加10μM Y27632(购 自MCE公司)和100mg/mL Primocin作为基础培养基(以下有时简称 为BM)，在此基础上递增加入不同的因子。No.1培养基是在BM基 础上加入胰岛素(购自Gibco公司)得到的，No.2培养基是在No.1培养基基础上再加入氢化可的松(购自Sigma公司)得到的，No.3培养 基是在No.2培养基基础上再加入非必需氨基酸(NEAA)(购自Gibco 公司)得到的，No.4培养基是在No.3培养基基础上再加入谷氨酰胺(购 自Gibco公司)得到的，No.5培养基是在No.4培养基基础上再加入牛垂体提取物(BPE)(购自迈晨科技)得到的，No.6培养基是在No.5 培养基基础上再加入胰岛素样生长因子1(IGF-1)(购自北京义翘) 得到的，No.7培养基(以下有时简称EM)是在No.6培养基基础上再 加入N2添加剂(购自Gibco公司)得到的，No.8培养基是在No.7培 养基基础上再加入胎牛血清(FBS)(购自Gibco公司)得到的。
表1不同组分培养基的配制(浓度为终浓度)
培养基 组分
BM DMEM/F12+10μM Y27632+100mg/mL Primocin
No.1 BM+20μg/mL胰岛素
No.2 No.1+0.4μg/mL氢化可的松
No.3 No.2+400μM非必需氨基酸
No.4 No.3+2mM谷氨酰胺
No.5 No.4+7μg/mL牛垂体提取物
No.6 No.5+5ng/mL胰岛素样生长因子1
No.7 No.6+1:50N2添加剂
No.8 No.7+5％胎牛血清
(2)食管鳞癌原代细胞的获取和培养
1准备工作
将15mL无菌离心管、移液器、10mL移液管、无菌枪头等表面 消毒后放入超净工作台中紫外照射30分钟。提前30分钟从4℃冰箱 取出根据表1配制好的各培养基、根据表2配制好的组织消化液、根 据表3配制好的组织清洗液，平衡至室温。
表2组织消化液配方
组织消化液成分 添加体积(mL)
HBSS(购自Gibco公司) 250
RPMI-1640(购自Gibco公司) 250
胶原酶Ⅱ(购自Sigma公司) 1g
胶原酶Ⅳ(购自Sigma公司) 1g
脱氧核糖核酸Ⅰ(购自Sigma公司) 25000U
透明质酸酶(购自Sigma公司) 250mg
氯化钙(购自Sigma公司) 166.5mg
牛血清白蛋白(购自上海生工) 5g
总量(mL) 500
表3组织清洗液配方
组织清洗液成分 添加体积(mL)
DMEM/F12(购自康宁公司) 488
Primocin(购自Invitrogen公司) 2
青霉素/链霉素溶液双抗(购自Gibco公司) 10
总量(mL) 500
2食管鳞癌原代细胞的分离
2.1食管癌内镜组织样本来源于5例进行过说明并获得同意的食 管癌患者在进行内镜检查时获取的组织样本，它们分别是样本50、样 本51、样本52、样本53、样本54。在超净台中将内镜组织吸出并置 于15mL离心管中，加入5mL组织清洗液进行混匀，并清洗一次，以1500rpm离心4分钟。
2.2弃上清，按1:1比例加入基础培养基和组织消化液(使用量约 为每10mg组织使用5mL组织消化液)，标记样品名称及编号，封 口膜密封，以37℃、300rpm摇床消化，每间隔1h观察消化是否完 成。
2.3消化完成后，40μm滤网过滤掉未消化的组织团块，滤网上的 组织团块用组织清洗液冲洗，将残留细胞冲入离心管中，1500rpm离 心4分钟。
2.4弃上清，观察剩余细胞团是否含有血细胞，若有血细胞，加3 mL血细胞裂解液(购自Sigma公司)，混匀，4℃裂解15分钟，5 分钟摇晃混匀一次，裂解结束后取出1500rpm离心4分钟。
2.5弃上清，加入2mL基础培养基重悬细胞，备用。
3.食管鳞癌原代细胞的培养
3.1镜下观察：吸取10μL重悬细胞平铺于载玻片上中，在显微镜 (Invitrogen公司EVOS M500)下用10倍物镜观察癌细胞状态。
3.2活细胞计数：取重悬的细胞悬液10μL，与10μL台盼兰染液 (购自Invitrogen公司)充分混合后，取10μL加入流式图像计数仪(江 苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)，可以得出细胞浓度，细胞粒 径以及细胞活率。选取细胞粒径大于10微米的细胞进行计数。
3.3细胞培养：将上述3.2中计数后的分别来源于各个样本的细胞 悬液平均分成9份，1500rpm离心4分钟，离心后分别使用200微升 BM以及No.1～8号培养基重悬，分别按照活细胞密度1×104个/cm2接种于48孔板中(每孔1万细胞数)，随后按照细胞密度2×104个/cm2加入经γ射线辐照(辐照剂量35Gy)的NIH-3T3细胞，最后分别使用 对应的培养基补齐48孔板中各孔体积至500微升，充分混匀。表面消 毒后置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)培养。直至48孔板中 细胞长满85％以上，进行传代。
(3)培养结果
在培养第7天，取出48孔板，使用200微升0.25％胰蛋白酶(购 自Gibco公司)润洗1分钟，吸去后再每孔加入500微升0.05％胰蛋白 酶(购自Gibco公司)，置于37℃、5％CO2培养箱中反应10分钟， 直至显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全即终止消化，1500rpm离心4分钟后，弃上清，加入1毫升基础 培养基重悬，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司 JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数。将由分离自内镜组织样本50 的食管鳞癌原代细胞得到的结果示于图1。
根据图1的结果可知，与基础培养基相比，在使用上述No.1～No.7 培养基时，均能够不同程度地促进食管鳞癌原代细胞的增殖。在使用 含有Y27632和Primocin、胰岛素、氢化可的松、非必需氨基酸、谷氨 酰胺、牛垂体提取物、IGF1、N2添加剂的培养基(No.7培养基)培养 食管鳞癌原代细胞时，增殖效果明显提高。另外，使用No.7的培养基 的基础上加入5％胎牛血清得到的No.8培养基进行食管鳞癌原代细胞 的培养时，增殖效果与没有添加5％胎牛血清的No.7培养基相比没有 明显提高，因此，可以认为本发明的食管鳞癌原代细胞在不添加胎牛 血清时也能够使用。
实施例2食管鳞癌原代细胞培养基中多因子组合对食管鳞癌原代 细胞的增殖的影响
在实施例1的基础培养基(DMEM/F12培养基+10μM Y27632+100 mg/mL Primocin)中分别单独添加1:50比例N2添加剂、20μg/mL胰 岛素、7μg/mL牛垂体提取物、2mM谷氨酰胺、400μM非必需氨基酸、0.4μg/mL氢化可的松、5ng/mL胰岛素样生长因子1，配制本实施例的培养基。
与实施例1同样地分离内镜组织样本57、样本58、样本59、样本 60和样本61获得食管鳞癌原代细胞，并使用本实施例中所配制的各培 养基以及实施例1中的BM培养基、No.7培养基(EM)分别培养所获 得的食管鳞癌原代细胞，按照活细胞密度1×104个/cm2接种于48孔板 中(每孔1万细胞数)，按照细胞密度2×104个/cm2加入经γ射线辐 照(辐照剂量35Gy)的NIH-3T3细胞，混匀。表面消毒后置于37℃、 5％CO2培养箱(购自赛默飞)培养。在培养第7天，取出48孔板， 使用200微升0.25％胰蛋白酶(购自Gibco公司)润洗1分钟，吸去后 再每孔加入500微升0.05％胰蛋白酶(购自Gibco公司)，置于37℃、 5％CO2培养箱中反应10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全即终止消化，1500rpm离心4 分钟后，弃上清，加入1毫升基础培养基重悬，使用流式图像计数仪 (江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到细胞总数， 评价食管鳞癌原代细胞培养基中双因子组合对食管鳞癌原代细胞的增 殖的影响。将由分离自内镜组织样本57的食管鳞癌原代细胞得到的结 果示于图2。
如图2所示，在基础培养基(DMEM/F12培养基+10μM Y27632+100mg/mL Primocin)中进一步添加选自N2添加剂、胰岛素、 牛垂体提取物、谷氨酰胺、非必需氨基酸、氢化可的松、胰岛素样生 长因子1中的一种添加因子时，细胞增殖效率优于基础培养基，但是 不及实施例1中的No.7培养基(EM)。
实施例3在本发明的食管鳞癌原代细胞培养基中添加其它因子对 食管鳞癌原代细胞的增殖的影响
在实施例1的No.7培养基(EM)中分别单独添加10ng/mL成纤 维细胞生长因子2(FGF2)、10ng/mL成纤维细胞生长因子10(FGF10)、 10ng/mL成纤维细胞生长因子7(FGF7)或一并添加10ng/mL FGF2、 10ng/mL FGF10和10ng/mL FGF7，配制本实施例的培养基。
与实施例1同样地分离内镜组织样本62和样本63获得食管鳞癌 原代细胞，并使用本实施例中所配制的各培养基以及实施例1中的No.7 培养基(EM)分别培养所获得的食管鳞癌原代细胞，按照活细胞密度 1×104个/cm2接种于48孔板中(每孔1万细胞数)，按照细胞密度2 ×104个/cm2加入经γ射线辐照(辐照剂量35Gy)的NIH-3T3细胞， 混匀。表面消毒后置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)培养。 在培养第7天，取出48孔板，使用200微升0.25％胰蛋白酶(购自Gibco 公司)润洗1分钟，吸去后再每孔加入500微升0.05％胰蛋白酶(购自 Gibco公司)，置于37℃、5％CO2培养箱中反应10分钟，直至显微 镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全即终 止消化，1500rpm离心4分钟后，弃上清，加入1毫升No.7培养基(EM) 重悬，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIOFIL) 进行计数，得到细胞总数，评价在本发明的食管鳞癌原代细胞培养基 中添加其它因子对食管鳞癌原代细胞的增殖的影响。将由分离自内镜 组织样本62的食管鳞癌原代细胞得到的结果示于图3。
图3中，纵坐标比值为使用在EM培养基基础上加入不同因子得 到的培养基培养7天得到的细胞数与使用EM培养基培养7天得到的 细胞数的比，比值大于1表示在EM培养基基础上加入不同因子可以 起到更好的促增殖作用，比值小于1则表示加入不同因子没有更优于 EM培养基的作用。
如图3所示，在使用在实施例1的No.7培养基(EM)中进一步 添加FGF2或FGF7得到的培养基进行培养时，与使用EM培养基时相 比，没有进一步的增殖促进作用。而在使用在实施例1的No.7培养基 (EM)中进一步添加FGF7得到的培养基进行培养时，与使用EM培 养基时相比，食管鳞癌原代细胞的增殖反而被抑制。
实施例4食管鳞癌原代细胞培养及鉴定
与实施例1同样地分离内镜组织样本64获得食管鳞癌原代细胞， 并使用实施例1中的No.7培养基(EM)培养所获得的食管鳞癌原代 细胞，按照活细胞密度1×104个/cm2接种于12孔板中(每孔4.5万细 胞数)，按照细胞密度2×104个/cm2加入经γ射线辐照(辐照剂量35Gy) 的NIH-3T3细胞，混匀。表面消毒后置于37℃、5％CO2培养箱(购 自赛默飞)培养。
在第12天，使用显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)观察培养 得到的食管鳞癌细胞，图4A和图4B分别是4倍物镜和10倍物镜下 拍摄得到的照片，细胞在镜下呈紧密排列，形态略不规则。
接着，对所培养的细胞，使用200微升0.25％胰蛋白酶(购自Gibco 公司)润洗1分钟，吸去后再每孔加入500微升0.05％胰蛋白酶(购自 Gibco公司)，置于37℃、5％CO2培养箱中反应10分钟，直至显微 镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全即终 止消化，1500rpm离心4分钟后，弃上清，加入500微升No.7培养基 (EM)重悬，对培养得到的食管鳞癌细胞进行鉴定。
取100微升上述食管鳞癌细胞悬液涂片进行瑞氏-吉姆萨染色鉴 定。染色方法如下所述。
(1)细胞悬液涂片晾干，滴入1滴瑞氏-吉姆萨A液(购自贝索 公司)，随后滴入3滴瑞氏-吉姆萨B液(购自贝索公司)，混匀后染 色3分钟；
(2)流水冲洗，冲洗时不能先倒掉染液，应以流水冲去，以防有 沉渣沉淀在标本上；
(3)干燥，显微镜(奥林巴斯公司CX41)下观察拍照。
图5A和图5B表示体外培养后的食管鳞癌细胞进行瑞氏吉姆萨染 色鉴定的结果，分别为10倍物镜下不同视野拍照的图片，细胞核大且 深染，符合鳞癌细胞特征。
将该样本培养后的食管鳞癌细胞进行免疫荧光染色。染色方法如 下所述。
(1)爬片
将培养后的食管鳞癌细胞细胞种于细胞玻片(购自赛默飞公司) 上，置于37℃、5％CO2培养箱培养，待细胞贴壁。
(2)固定
①PBS(购自上海生工)配制4％甲醛(购自Sigma公司)，4℃ 冰箱保存备用。
②细胞贴壁后，弃培养液，4％甲醛冰上固定细胞30分钟。PBS (购自上海生工)洗5分钟x 3次。
(3)透明(避光)
①配制透明液：PBS+0.3％H2O2(购自上海生工)+0.3％Triton X-100(购自上海生工)。
②透明：弃PBS，加入透明液，避光下，摇床(100rpm左右)透 明30分钟，PBS洗5分钟x 3次。
(4)封闭
使用PBS+0.3％Triton X-100配制5％BSA(购自上海生工)用于 封闭，37℃封闭30分钟。
(5)一抗孵育
①配制PBS+0.3％Triton X-100用于稀释抗体，按照1:50比例稀 释鳞癌特异性抗体p63(购自CST公司)，弃封闭液，加入配制好的 一抗稀释液，至4℃冰箱孵育过夜。
②4℃取出，平衡至室温，37℃继续孵育1小时，PBS洗5分 钟x 3次。
(6)二抗孵育(避光)
配制PBS+0.3％Triton X-100用于二抗稀释，按照1:1000比例稀 释激发光为488且种属为兔的荧光二抗(购自赛默飞公司)，常温避 光孵育1h，PBS洗5分钟x 3次。
(7)DAPI染色(避光)
1:1000PBS稀释DAPI(购自Sigma公司)，常温避光染色5分钟， PBS洗5分钟x 3次。显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下成像， 拍照记录。
图6A和图6B为体外培养后的食管鳞癌细胞进行免疫荧光染色鉴 定的结果，分别为10倍物镜下不同视野荧光拍照的图片。如图所示， 视野内细胞在488激发光下均显示绿色，表明培养后的细胞为鳞癌细 胞，与临床病理诊断一致。
实施例6食管鳞癌初次培养周期和细胞数统计及Population Doubling(PD)值计算
按照实施例1的方法消化食管癌内镜组织样本(样本1～40号) 获得食管鳞癌原代细胞。对于所获得的食管鳞癌原代细胞，使用实施 例1中的No.7培养基，按照活细胞密度1×104个/cm2将细胞接种在 12孔板中并进行培养，待细胞扩增至85％后消化并计数，同时记录直 至消化时培养的天数，将该直至消化时培养的天数作为一个培养周期。 如图7所示，培养40例样本所得平均培养周期是10天，扩增得到的 平均细胞数是70万。
在该实验条件下持续培养样本2、样本5、样本6、样本8、样本9、 样本11、样本27、样本39和样本40总共9例样本，将扩增所得的细 胞进行不同代数扩增，每一代进行消化后计数并记录相应培养的周期， 根据公式Population Doubling(PD)＝3.32*log10(消化后细胞总数/初 始种入细胞数)计算PD，如图8所示，横坐标表示细胞培养的天数， 纵坐标是累计的细胞增殖倍数，表示细胞在培养周期内扩增的倍数， 数值越大表示细胞在一定周期内扩增的次数越多，即扩增得到的细胞 数也就越多，斜率代表的是细胞扩增的速率。
从图8可以看出，使用本发明的食管鳞癌原代细胞培养基对上述9 例样本进行培养时，扩增56天后的细胞扩增速率基本保持不变，仍具 有继续扩增的能力。
实施例7所添加的因子的浓度对食管鳞癌细胞增殖的影响
按照实施例1的方法同样地分离内镜组织样本65、样本66、样本 67、样本68和样本69获得食管鳞癌原代细胞，并使用实施例1中的 No.7培养基培养所获得的食管鳞癌原代细胞，按照活细胞密度1×104个/cm2接种于12孔板中(每孔4.5万细胞数)，按照细胞密度2×104个/cm2加入经γ射线辐照(辐照剂量35Gy)的NIH-3T3细胞，混匀。 表面消毒后置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)培养。待细胞 扩增至85％，取出12孔板，使用200微升0.25％胰蛋白酶(购自Gibco 公司)润洗1分钟，吸去后再每孔加入500微升0.05％胰蛋白酶(购自Gibco公司)，置于37℃、5％CO2培养箱中反应10分钟，直至显微 镜(Invitrogen公司EVOSM500)下能观察到细胞已经消化完全即终 止消化，1500rpm离心4分钟后，弃上清，加入1毫升基础培养基重 悬，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司JIMBIO FIL) 进行计数，得到细胞总数。所得细胞用于以下培养实验。
接着，配制以下8种配方培养基进行实验：
配方1：实施例1中的No.7培养基组分中不含N2添加剂；
配方2：实施例1中的No.7培养基组分中不含非必需氨基酸；
配方3：实施例1中的No.7培养基组分中不含谷氨酰胺；
配方4：实施例1中的No.7培养基组分中不含胰岛素；
配方5：实施例1中的No.7培养基组分中不含IGF1；
配方6：实施例1中的No.7培养基组分中不含牛垂体提取物；
配方7：实施例1中的No.7培养基组分中不含Y27632；
配方8：实施例1中的No.7培养基组分中不含氢化可的松。
分别使用上述配方1～8和实施例1中No.7培养基来稀释上述消 化后的细胞悬液，按照每孔2万细胞，500微升体积种入24孔板中。
在使用配方1的培养基时，按照终浓度分别为1:400、1:200、1:100、 1:50、1:25配制5个浓度梯度的N2添加剂，在接种有原代细胞的24 孔板中分别添加配制好的N2添加剂每孔500微升；并使用配方1的培 养基设置对照孔(BC)。
在使用配方2的培养基时，按照终浓度分别为400μM、200μM、 100μM、50μM、25μM配制5个浓度梯度的非必需氨基酸，在接种有 原代细胞的24孔板中分别添加配制好的非必需氨基酸每孔500微升； 并使用配方2的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方3的培养基时，按照终浓度分别为8mM、4mM、2mM、 1mM、0.5mM配制5个浓度梯度的谷氨酰胺，在接种有原代细胞的 24孔板中分别添加配制好的谷氨酰胺每孔500微升；并使用配方3的 培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方4的培养基时，按照终浓度分别为40μg/mL、20μg/mL、 10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL配制5个浓度梯度的胰岛素，在接种有 原代细胞的24孔板中分别添加配制好的胰岛素每孔500微升；并使用 配方4的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方5的培养基时，按照终浓度分别为40ng/mL、20ng/mL、 10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL配制5个浓度梯度的胰岛素样生长因子 1(IGF1)，在接种有原代细胞的24孔板中分别添加配制好的胰岛素 样生长因子(IGF1)每孔500微升；并使用配方5的培养基设置对照 孔(BC)。
在使用配方6的培养基时，按照终浓度分别为56μg/mL、28μg/mL、 14μg/mL、7μg/mL、3.5μg/mL配制5个浓度梯度的牛垂体提取物，在 接种有原代细胞的24孔板中分别添加配制好的牛垂体提取物每孔500 微升；并使用配方6的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方7的培养基时，按照终浓度分别为40μM、20μM、10 μM、5μM、2.5μM配制5个浓度梯度的Y27632，在接种有原代细胞 的24孔板中分别添加配制好的Y27632每孔500微升；并使用配方7 的培养基设置对照孔(BC)。
在使用配方8的培养基时，按照终浓度分别为1.6μg/mL、0.8 μg/mL、0.4μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL配制5个浓度梯度的氢化可 的松，在接种有原代细胞的24孔板中分别添加配制好的氢化可的松每 孔500微升；并使用配方8的培养基设置对照孔(BC)。
另外，使用实施例中的No.7培养基按照终浓度分别为10μM、3 μM、1μM、0.3μM、0.1μM配制5个浓度梯度的8种小分子化合物 (LDN193189、IWP2、A83-01、Forskolin、SB431542、CHIR99021、 DMH-1、DAPT；均购自MCE公司)，在接种有原代细胞的24孔板 中分别添加配制好的8种小分子化合物(LDN193189、IWP2、A83-01、 Forskolin、SB431542、CHIR99021、DMH-1、DAPT)每孔500微升； 并分别使用No.7培养基设置对照孔(BC)。
同时上述各孔加入1万个辐照后的NIH-3T3细胞作为滋养细胞。
待细胞扩增至24孔的85％左右消化计数，分别参比对照孔(BC) 细胞数计算比值，将结果分别示于图9A～9P。图9A～图9P中，比值 为使用各培养基培养一代得到的细胞数与对应的对照孔培养一代得到 的细胞数的比。比值大于1说明配制的含不同浓度因子或小分子化合 物的培养基促增殖效果优于对照孔培养基，比值小于1，则说明配制的 含不同浓度因子或小分子化合物的培养基促增殖效果较对照孔培养基 促增殖效果弱。
如图9所示，N2添加剂的浓度范围为1:400～1:25，浓度为1:50 比例加入细胞增殖效果最明显；非必需氨基酸的浓度范围为25～ 400μM，浓度为400μM加入细胞增殖效果最明显；谷氨酰胺的浓度范 围为0.5～8mM，浓度为2mM加入时细胞增殖效果最明显；胰岛素样生长因子1的浓度范围为2.5～40ng/mL，浓度为5ng/mL时细胞增殖 效果最明显；牛垂体提取物的浓度范围为3.5～56μg/mL，浓度为7 μg/mL时细胞增殖效果最明显；Y27632浓度范围为2.5～40μM，浓度 为10μM时细胞增殖效果最明显；胰岛素浓度范围为2.5～40ng/mL， 浓度为20ng/mL时细胞增殖效果最明显；氢化可的松浓度范围为0.1～ 1.6μg/mL，浓度为0.4μg/mL时细胞增殖效果最明显。其他8种小分 子化合物(LDN193189、IWP2、A83-01、Forskolin、SB431542、 CHIR99021、DMH-1、DAPT)在10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM 浓度梯度下均未表现出明显的促增殖作用。
实施例8本发明培养基与现有培养基对细胞增殖作用的比较
如表4所示，配制非专利文献2中的KM(Keratinocyte medium) 培养基。
表4 KM培养基的配制
培养基成分 添加体积(mL)
DMEM(购自康宁公司) 329.25
F12(购自康宁公司) 109.75
胰岛素(购自Gibco公司) 5
表皮生长因子(购自北京义翘) 0.5
碘塞罗宁(购自mce) 0.005
转铁蛋白(购自北京义翘) 0.5
霍乱毒素(购自sigma公司) 0.005
氢化可的松(购自mce) 5
胎牛血清(购自依科赛公司) 50
总量(mL) 500
如表5所示，配制非专利文献3中的FM培养基。
表5 FM培养基的配制
培养基成分 添加体积(mL)
DMEM(购自康宁公司) 373
F12(购自康宁公司) 125
Y27632(购自mce) 0.5
胰岛素(购自Gibco公司) 1.25
表皮生长因子(购自北京义翘) 0.02
霍乱毒素(购自sigma公司) 0.0043
两性霉素B(购自sigma公司) 0.5
氢化可的松(购自mce) 0.03
总量(mL) 500
从Stem Cell公司购入KSFM培养基。
与实施例1同样地分离内镜组织样本70、样本71和样本72得到 食管鳞癌原代细胞，分别使用EM培养基、KSFM培养基、FM培养基 和KM培养基进行培养。
下面以其中一例样本(样本70)进行说明。将得到的食管鳞癌原 代细胞分别使用1毫升EM培养基、KSFM培养基、FM培养基和KM 培养基重悬，使用流式图像计数仪(江苏卓微生物科技有限公司 JIMBIO FIL)进行计数。
按照活细胞密度1×104个/cm2分别接种于2块24孔板中(每孔2 万细胞数)，其中1块24孔板中不加入γ射线辐照的NIH-3T3细胞培 养，另外一块24孔中按照细胞密度2×104个/cm2加入经γ射线辐照(辐 照剂量35Gy)的NIH-3T3细胞，混匀。表面消毒后置于37℃、5％CO2培养箱(购自赛默飞)培养。在培养第5天，取出24孔板，使用200 微升0.25％胰蛋白酶(购自Gibco公司)润洗1分钟，吸去后再每孔加 入500微升0.05％胰蛋白酶(购自Gibco公司)，置于37℃、5％CO2培养箱中反应10分钟，直至显微镜(Invitrogen公司EVOS M500)下能观察到细胞已经消化完全即终止消化，1500rpm离心4分钟后，弃 上清，加入1毫升基础培养基重悬，使用流式图像计数仪(江苏卓微 生物科技有限公司JIMBIO FIL)进行计数，得到不同培养基培养的细 胞总数。将结果示于图11。
从图10中可以看出，EM培养基与KM培养基、FM培养基和KSFM 培养基相比，在接种同样细胞数(2万/孔)培养相同时间条件下，扩 增得到的细胞数最多，对食管鳞癌细胞促增殖作用有显著效果。并且， 从图10中还可以得出EM培养基在使用滋养细胞培养时效果优于没有 滋养细胞进行培养的情况，由此可知，本发明的食管鳞癌原代细胞培 养基在使用滋养细胞培养时对食管鳞癌细胞促增殖左右有显著效果， 缩短培养所需周期。
实施例9使用本发明培养基扩增得到的食管鳞癌原代细胞用于药 物筛选
1、细胞培养和铺板
从得到的食管鳞癌内镜样本与实施例1同样地分离得到食管鳞癌 原代细胞并使用实施例1中的No.7培养基进行培养，待细胞扩增至 85％，进行消化传代，作为一代。分别取培养第1代、第3代、第5 代、第7代、第9代细胞进行药物筛选。
按照实施例1中步骤将细胞消化计数，使用实施例1中的No.7培 养基，将细胞按照活细胞密度4×104个/mL细胞于加样槽(购自康宁 公司)中充分混匀后，在384孔不透明白色细胞培养板(购自康宁公 司)进行培养，每孔体积50μL，细胞数目为2000个/孔。从孔板边缘加入实施例1中的No.7培养基封板，板上标注样品名称及 CellTiter-Glo(购自promega公司)检测时间。表面75％酒精(购自利 尔康)消毒，置37℃、5％CO2培养箱培养，24小时后加药。
2、筛选药物配制
按照下表配制7个浓度梯度的3种药物(硼替佐米、丝裂霉素、 羟基喜树碱；均购自MCE公司)，在384孔药板(购自赛默飞公司) 每孔中添加50μL，-20℃保存待用。
表6硼替佐米、丝裂霉素、羟基喜树碱药物添加液的配制
终浓度(μM) 配制浓度(μM)
10 5000
3.33 1666.7
1.11 555.6
0.37 185.2
0.12 61.7
0.04 20.6
0.01 6.9
按照下表配制7个浓度梯度的厄洛替尼(购自MCE公司)，在 384孔药板(购自赛默飞公司)每孔中添加50μL，-20℃保存待用。
表7厄洛替尼添加液的配制
终浓度(μM) 配制浓度(μM)
40 20000
13.33 6666.7
4.44 2222.2
1.48 740.7
0.49 246.9
0.16 82.3
0.05 27.4
3、高通量加药
取出配制好的药板，置于室温，待完全融化后置于离心机(Sigma 公司3-18K)中室温1000rpm离心1分钟后取出。采用高通量自动化 加样系统(Perkin Elmer公司JANUS)进行高通量加药。对培养有食 管鳞癌细胞的384孔板在每孔加入0.1μL对应浓度的筛选药物，加药 结束后，384孔板表面消毒后移至培养箱中继续培养，72小时后测定 细胞活性。
4、细胞活性测试
4℃冰箱取出CellTiter-Glo发光试剂(购自promega公司)，取10 毫升试剂于加样槽中，培养箱中取出待检测384孔板，每孔加入10μL CellTiter-Glo发光试剂，静置10min后使用多功能酶标仪(Perkin Elmer 公司Envision)检测。
5、数据处理
按照公式细胞存活率(％)＝加药孔化学发光数值/对照孔化学 发光数值*100％，计算得到不同药物作用细胞后的细胞存活率，使用 graphpad prism软件计算药物对细胞作用的半数抑制率(IC50)。将结 果分别示于图11A～图11D。
由图11A～图11D可以确认，使用本发明的食管鳞癌原代细胞培 养基培养得到的食管鳞癌细胞进行药物筛选，相同药物对于培养的不 同代数细胞抑制效果基本保持一致(抑制曲线基本保持一致)。

Claims (6)

1.一种食管鳞癌原代细胞培养基，其特征在于，包括：
初始培养基、Rho蛋白酶抑制剂、抗生素、胰岛素、N2添加剂、胰岛素样生长因子1、非必需氨基酸、以及任选的氢化可的松、任选的谷氨酰胺和任选的牛垂体提取物，
所述初始培养基选自DMEM/F12、DMEM、F12或RPMI-1640。
2.如权利要求1所述的食管鳞癌原代细胞培养基，其特征在于：
Rho蛋白激酶抑制剂选自Y27632、羟基法舒地尔和GSK429286A中的一种或多种，当选自Y27632时，浓度范围为2.5～40μM，优选为5～20μM；当选自羟基法舒地尔时，浓度范围为2～32μM，优选为4～16μM；当选自GSK429286A时，浓度范围为2～32μM，优选为4～16μM；
抗生素选自链霉素/青霉素、两性霉素B和Primocin中的一种或多种，当选自链霉素/青霉素时，链霉素浓度范围为25～400μg/mL，优选为50～200μg/mL，更优选为200μg/m，青霉素浓度范围为25～400U/mL，优选为50～200U/mL，更优选为200U/mL；当选自两性霉素B时，浓度范围为0.25～4μg/mL，优选为0.5～2μg/mL；当选自Primocin时，浓度范围为25～400mg/mL，优选为50～200mg/mL；
胰岛素的浓度范围为2.5～40μg/mL，优选为10～40μg/mL；
N2添加剂相对于培养基的体积比1:400～1:25，优选1:100～1:25；
胰岛素样生长因子1的浓度范围为2.5～40ng/mL，优选为2.5～10ng/mL；
非必需氨基酸为选自甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的一种或多种，非必需氨基酸的总浓度范围为50μM～400μM，优选为100μM～400μM；
氢化可的松的浓度范围为0～1.6μg/mL，优选为0.2～0.8μg/mL；
谷氨酰胺的浓度范围为0mM～8mM，优选为1mM～4mM；
牛垂体提取物的浓度范围为0～56μg/mL，优选为3.5～14μg/mL。
3.一种食管鳞癌原代细胞的培养方法，其特征在于：
使用权利要求1或2所述的食管鳞癌原代细胞培养基对食管鳞癌原代细胞进行培养。
4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于：
在所述培养中，按照细胞密度2～3×104个/cm2加入滋养细胞。
5.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于：
滋养细胞为辐照后的NIH-3T3细胞，辐照源为X射线或者γ射线，辐照剂量为30～50Gy。
6.一种食管鳞癌疾病的药物筛选的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用权利要求3～5中任一项所述的食管鳞癌原代细胞的培养方法培养食管鳞癌原代细胞，用于药物筛选；
(2)选定需要检测的药物并按照所需浓度梯度进行稀释；
(3)对(1)中培养得到的细胞添加稀释后的所述药物；
(4)进行细胞活性测试。
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