JP7454290B2 - 食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地、及びその培養方法 - Google Patents
食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地、及びその培養方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7454290B2 JP7454290B2 JP2022548485A JP2022548485A JP7454290B2 JP 7454290 B2 JP7454290 B2 JP 7454290B2 JP 2022548485 A JP2022548485 A JP 2022548485A JP 2022548485 A JP2022548485 A JP 2022548485A JP 7454290 B2 JP7454290 B2 JP 7454290B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- concentration
- cell carcinoma
- squamous cell
- esophageal squamous
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 206010061534 Oesophageal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 title claims description 101
- 208000036765 Squamous cell carcinoma of the esophagus Diseases 0.000 title claims description 101
- 208000007276 esophageal squamous cell carcinoma Diseases 0.000 title claims description 101
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 36
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims description 19
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 24
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 18
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 17
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims description 16
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 claims description 16
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 12
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 12
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 12
- IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 4-[(1r)-1-aminoethyl]-n-pyridin-4-ylcyclohexane-1-carboxamide;dihydrochloride Chemical group Cl.Cl.C1CC([C@H](N)C)CCC1C(=O)NC1=CC=NC=C1 IDDDVXIUIXWAGJ-DDSAHXNVSA-N 0.000 claims description 11
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 11
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 11
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 claims description 11
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 claims description 11
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 11
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 9
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 9
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 claims description 7
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 6
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 claims description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 claims description 3
- 239000003590 rho kinase inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 2
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 220
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 93
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 33
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 30
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 27
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 17
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 16
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 15
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 15
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 13
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 13
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 7
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N FORSKOLIN Chemical compound O=C([C@@]12O)C[C@](C)(C=C)O[C@]1(C)[C@@H](OC(=O)C)[C@@H](O)[C@@H]1[C@]2(C)[C@@H](O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-KGGHGJDLSA-N 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 5
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 5
- -1 small molecule compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 102000004864 Fibroblast growth factor 10 Human genes 0.000 description 4
- 108090001047 Fibroblast growth factor 10 Proteins 0.000 description 4
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 4
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 4
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 4
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 229940098448 fibroblast growth factor 7 Drugs 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- HIJMSZGHKQPPJS-UHFFFAOYSA-N 3-(6-methylpyridin-2-yl)-n-phenyl-4-quinolin-4-ylpyrazole-1-carbothioamide Chemical compound CC1=CC=CC(C=2C(=CN(N=2)C(=S)NC=2C=CC=CC=2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)=N1 HIJMSZGHKQPPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]-3-pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl]quinoline Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)C=C1 CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000036764 Adenocarcinoma of the esophagus Diseases 0.000 description 3
- SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N Deoxycoleonol Natural products C12C(=O)CC(C)(C=C)OC2(C)C(OC(=O)C)C(O)C2C1(C)C(O)CCC2(C)C SUZLHDUTVMZSEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WRKPZSMRWPJJDH-UHFFFAOYSA-N N-(6-methyl-1,3-benzothiazol-2-yl)-2-[(4-oxo-3-phenyl-6,7-dihydrothieno[3,2-d]pyrimidin-2-yl)thio]acetamide Chemical compound S1C2=CC(C)=CC=C2N=C1NC(=O)CSC1=NC=2CCSC=2C(=O)N1C1=CC=CC=C1 WRKPZSMRWPJJDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010030137 Oesophageal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- FHYUGAJXYORMHI-UHFFFAOYSA-N SB 431542 Chemical compound C1=CC(C(=O)N)=CC=C1C1=NC(C=2C=C3OCOC3=CC=2)=C(C=2N=CC=CC=2)N1 FHYUGAJXYORMHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010817 Wright-Giemsa staining Methods 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 3
- OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N colforsin Natural products OC12C(=O)CC(C)(C=C)OC1(C)C(OC(=O)C)C(O)C1C2(C)C(O)CCC1(C)C OHCQJHSOBUTRHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 3
- AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N erlotinib Chemical compound C=12C=C(OCCOC)C(OCCOC)=CC2=NC=NC=1NC1=CC=CC(C#C)=C1 AAKJLRGGTJKAMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000028653 esophageal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N CT 99021 Chemical compound CC1=CNC(C=2C(=NC(NCCNC=3N=CC(=CC=3)C#N)=NC=2)C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)=N1 AQGNHMOJWBZFQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 2
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 2
- DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N DAPT Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)OC(C)(C)C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N 0.000 description 2
- JMIFGARJSWXZSH-UHFFFAOYSA-N DMH1 Chemical compound C1=CC(OC(C)C)=CC=C1C1=CN2N=CC(C=3C4=CC=CC=C4N=CC=3)=C2N=C1 JMIFGARJSWXZSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OLIIUAHHAZEXEX-UHFFFAOYSA-N N-(6-fluoro-1H-indazol-5-yl)-6-methyl-2-oxo-4-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-3,4-dihydro-1H-pyridine-5-carboxamide Chemical compound C1C(=O)NC(C)=C(C(=O)NC=2C(=CC=3NN=CC=3C=2)F)C1C1=CC=C(C(F)(F)F)C=C1 OLIIUAHHAZEXEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000007474 bm medium Substances 0.000 description 2
- 229940121657 clinical drug Drugs 0.000 description 2
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000011977 dual antiplatelet therapy Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N oxalonitrile Chemical compound N#CC#N JMANVNJQNLATNU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HAWSQZCWOQZXHI-FQEVSTJZSA-N 10-Hydroxycamptothecin Chemical compound C1=C(O)C=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 HAWSQZCWOQZXHI-FQEVSTJZSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101000825954 Homo sapiens R-spondin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 239000005551 L01XE03 - Erlotinib Substances 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 102100022762 R-spondin-1 Human genes 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N bortezomib Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)B(O)O)NC(=O)C=1N=CC=NC=1)C1=CC=CC=C1 GXJABQQUPOEUTA-RDJZCZTQSA-N 0.000 description 1
- 229960001467 bortezomib Drugs 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001839 endoscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960001433 erlotinib Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- ZAVGJDAFCZAWSZ-UHFFFAOYSA-N hydroxyfasudil Chemical compound C1=CC=C2C(O)=NC=CC2=C1S(=O)(=O)N1CCCNCC1 ZAVGJDAFCZAWSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 description 1
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 238000010827 pathological analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0679—Cells of the gastro-intestinal tract
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/70—Undefined extracts
- C12N2500/80—Undefined extracts from animals
- C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/33—Insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
- C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/02—Coculture with; Conditioned medium produced by embryonic cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
(2)ストレプトマイシン/ペニシリン、アムホテリシンB、及びプリモシンの1つ以上から選択され、ストレプトマイシン/ペニシリンの場合に、ストレプトマイシンは25μg/mL~400μg/mL、好ましくは50μg/mL~200μg/mLの範囲内、より好ましくは200μg/mLの濃度を有し、ペニシリンは25U/mL~400U/mL、好ましくは50U/mL~200U/mLの範囲内、より好ましくは200U/mLの濃度を有し、アムホテリシンBの場合に、0.25μg/mL~4μg/mL、好ましくは0.5μg/mL~2μg/mLの範囲内、より好ましくは1μg/mLの濃度を有し、プリモシンの場合に、25mg/mL~400mg/mL、好ましくは50mg/mL~200mg/mLの範囲内、より好ましくは100mg/mLの濃度を有する抗生物質であって、好ましくはプリモシンである、抗生物質、
(3)2.5μg/mL~40μg/mL、好ましくは10μg/mL~40μg/mLの範囲内、より好ましくは20μg/mLの濃度を有するインスリン、
(4)培養培地に対して1:400~1:25、好ましくは1:100~1:25、より好ましくは1:50の容量比を有するN2添加剤、
(5)2.5ng/mL~40ng/mL、好ましくは2.5ng/mL~10ng/mLの範囲内、より好ましくは5ng/mLの濃度を有するインスリン様成長因子1(IGF-1)、
(6)グリシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、及びセリンの1つ以上から選択され、総濃度は50μM~400μM、好ましくは100μM~400μMの範囲内、より好ましくは400μMである非必須アミノ酸、
(7)0μg/mL~1.6μg/mL、好ましくは0.2μg/mL~0.8μg/mLの範囲内、より好ましくは0.4μg/mLの濃度を有するヒドロコルチゾン、
(8)0mM~8mM、好ましくは1mM~4mMの範囲内、より好ましくは2mMの濃度を有するグルタミン、
(9)0μg/mL~56μg/mL、好ましくは3.5μg/mL~14μg/mLの範囲内、より好ましくは7μg/mLの濃度を有するウシ脳下垂体抽出物。
1.1 組織洗浄溶液ですすいだ後に、内視鏡試料等の組織試料に組織消化溶液を加え、恒温振盪器(Zhichu InstrumentのZQLY-180N)中に入れて、消化させる。例えば、8ml~14ml、好ましくは12mlの組織消化酵素が消化に使用され、消化温度は4℃~37℃の範囲であり、好ましくは37℃であり、消化用の回転速度は200rpm~350rpmの範囲であり、好ましくは300rpmである。
上記工程1において得られた食道扁平上皮癌の初代細胞を、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地で再懸濁して、計数し、5×104個/cm2~10×104個/cm2の細胞密度で培養ディッシュに播種し、同時に、栄養膜細胞を2×104個/cm2~3×104個/cm2の細胞密度で培養ディッシュに加え、5日間~7日間培養した後に、栄養膜細胞を0.5×104個/cm2~1×104個/cm2の細胞密度で添加補充し、細胞が培養ディッシュの85%を覆うように成長したら、細胞を消化して、継代する。
(1)様々な成分を含む培養培地の調製
表1中の成分に従って、様々な成分を含む培養培地を調製して、食道扁平上皮癌細胞に対する増殖促進効果を調査する。
1.調製法
15mLの滅菌遠心チューブ、ピペット、10mlのトランスファーピペット、滅菌ガンヘッド等の表面を滅菌し、ウルトラクリーンワークベンチに入れて、30分間紫外線を照射した。表1に従って調製された培養培地、表2に従って調製された組織消化溶液、及び表3に従って調製された組織洗浄溶液を、30分前に4℃の冷蔵庫から取り出し、室温と等しくした。
2.1.食道癌の内視鏡組織試料を、内視鏡検査の間に十分に説明し同意を得た5人の食道癌患者の組織試料、すなわち試料50、試料51、試料52、試料53、及び試料54からそれぞれ取得した。ウルトラクリーンワークベンチ内で内視鏡組織を摘出し、15mLの遠心分離チューブに入れた後に、そこに5mLの組織洗浄溶液を加え、得られたものを混合し、1回すすいだ。得られたものを1500rpmで4分間遠心分離した。
3.1.顕微鏡観察:10μLの再懸濁した細胞を吸い出し、スライドガラス上に撒種し、癌細胞を顕微鏡(EVOS M500、Invitrogen)下で10倍の対物レンズを用いて観察した。
培養の7日目に、48ウェルプレートを取り出し、200μLの0.25%のトリプシン(Gibco)で1分間すすいだ。吸引により液体を除去し、500μLの0.05%のトリプシン(Gibco)を各ウェルに再び加えた。得られたものを37℃の5%のCO2インキュベーターに入れて、10分間反応させ、顕微鏡(EVOS M500、Invitrogen)下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。1500rpmで4分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、1mLの基礎培養培地を加えて、再懸濁した。フローイメージングカウンター(JIMBIO FIL、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.)を用いて計数することにより、総細胞数を得た。内視鏡組織試料50から分離された食道扁平上皮癌の初代細胞から得られた結果を図1に示す。
実施例1の基礎培養培地(DMEM/F12培地+10μMのY27632+100mg/mLのプリモシン)に、1:50の比率のN2添加剤、20μg/mLのインスリン、7μg/mLのウシ脳下垂体抽出物、2mMのグルタミン、400μMの非必須アミノ酸、0.4μg/mLのヒドロコルチゾン、5ng/mLのインスリン様成長因子1をそれぞれ別々に加えて、この実施例の培養培地を調製した。
実施例1の番号7の培地(EM)に、10ng/mlの線維芽細胞成長因子2(FGF2)、10ng/mlの線維芽細胞成長因子10(FGF10)、10ng/mlの線維芽細胞成長因子7(FGF7)、又は10ng/mlのFGF2、10ng/mlのFGF10、及び10ng/mlのFGF7の組合せをそれぞれ別々に加えて、この実施例の培地を調製した。
実施例1と同じ方法に従って、内視鏡組織試料64を分離して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得し、取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、実施例1の番号7の培地(EM)を使用することによって培養した。得られたものを12ウェルプレートに1×104個/cm2の生細胞密度(1ウェル当たり45000個の細胞)で接種した後に、プレートにγ線(照射線量35Gy)により照射されたNIH-3T3細胞を2×104個/cm2の細胞密度で加え、次にこれを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを37℃の5%のCO2インキュベーター(Thermo Fisher)に入れて、培養した。
培養した食道扁平上皮癌細胞を細胞スライド(cell slides)(Thermo Fisher)上に播種し、細胞が壁に接着するまで37℃の5%のCO2インキュベーターにおいて培養した。
(i)PBS(Shanghai Sangon Biotech)を使用して、4%のホルムアルデヒド(Sigma)を調製し、次にこれを4℃の冷蔵庫において貯蔵して、使用した。
(i)透明化溶液の調製:PBS+0.3%のH2O2(Shanghai Sangon Biotech)+0.3%のTriton X-100(Shanghai Sangon Biotech)。
ブロッキングのために、PBS+0.3%のTriton X-100を使用して、5%のBSA(Shanghai Sangon Biotech)を調製し、ブロッキングを37℃で30分間行った。
(i)PBS+0.3%のTriton X-100を調製して、抗体を希釈し、ここで、扁平上皮癌特異抗体p63(CST)を1:50の比率で希釈した。ブロッキング溶液を廃棄し、調製した一次抗体希釈物を加えた。得られたものを4℃の冷蔵庫において一晩インキュベートした。
PBS+0.3%のTriton X-100を二次抗体希釈用に調製し、ここで、488の励起光を有するウサギ蛍光二次抗体(Thermo Fisher)を1:1000の比率で希釈した。得られたものを、室温で暗所にて1時間インキュベートした後に、PBSにより5分間で3回洗浄した。
DAPI(Sigma)のPBS中での1:1000希釈液を使用して、室温で暗所にて5分間染色した。得られたものをPBSにより5分間で3回洗浄した。顕微鏡(EVOS M500、Invitrogen)下で写真を撮影して、記録した。
実施例1と同じ方法に従って、食道癌の内視鏡組織試料(試料1~試料40)を消化して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得した。取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、実施例1における番号7の培地を使用することにより培養した。細胞を1×104個/cm2の生細胞密度で12ウェルプレートに接種して、培養した。プレートの85%を覆うように拡大させた後に、細胞を消化して、計数した。同時に、消化までの培養日数を1培養期間として見なして、それらを記録した。図7において示されるように、40個の試料の平均培養期間は10日間であり、拡大させた細胞の平均数は700000個であった。
実施例1と同じ方法に従って、内視鏡組織試料65、試料66、試料67、試料68、及び試料69を分離して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得し、取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、実施例1の番号7の培地を使用することによって培養した。得られたものを12ウェルプレートに1×104個/cm2の生細胞密度(1ウェル当たり45000個の細胞)で接種した後に、プレートにγ線(照射線量35Gy)により照射されたNIH-3T3細胞を2×104個/cm2の細胞密度で加え、次にこれを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを37℃の5%のCO2インキュベーター(Thermo Fisher)に入れて、培養した。細胞がプレートの85%を覆うように拡大したら、12ウェルプレートを取り出し、200μLの0.25%のトリプシン(Gibco)で1分間すすいだ。吸引により液体を除去し、500μLの0.05%のトリプシン(Gibco)を各ウェルに再び加えた。得られたものを37℃の5%のCO2インキュベーターに入れて、10分間反応させ、顕微鏡(EVOS M500、Invitrogen)下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。1500rpmで4分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、1mLの基礎培養培地を加えて、再懸濁した。フローイメージングカウンター(JIMBIO FIL、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.)を用いて計数することにより、総細胞数を得た。取得された細胞を以下の培養実験に使用した。
配合物1:N2添加剤を含まない実施例1の番号7の培地、
配合物2:非必須アミノ酸を含まない実施例1の番号7の培地、
配合物3:グルタミンを含まない実施例1の番号7の培地、
配合物4:インスリンを含まない実施例1の番号7の培地、
配合物5:IGF1を含まない実施例1の番号7の培地、
配合物6:ウシ脳下垂体抽出物を含まない実施例1の番号7の培地、
配合物7:Y27632を含まない実施例1の番号7の培地、
配合物8:ヒドロコルチゾンを含まない実施例1の番号7の培地。
非特許文献2のKM(角化細胞用培地)培地を表4のように調製した。
1.細胞の培養及び撒種
実施例1と同じ方法に従って、食道扁平上皮癌の初代細胞を食道扁平上皮癌の内視鏡試料から分離し、実施例1の番号7の培地を用いて培養した。細胞をプレートの85%を覆うように拡大させた後に、これらの細胞を1継代物として消化した。培養した細胞の1代継代物、3代継代物、5代継代物、7代継代物、及び9代継代物を薬物スクリーニングのために選択した。
7つの濃度勾配における3種の薬物(ボルテゾミブ、マイトマイシン、及びヒドロキシカンプトテシン、全てはMCEから購入した)を以下の表に従って調製し、これらを384ウェルプレート(Thermo Fisher)の各ウェルに50μLの容量でそれぞれ加え、-20℃で貯蔵して、使用した。
調製された薬物プレートを取り出し、室温で静置した。完全に融解した後に、プレートを遠心分離機(Sigma 3-18K)に入れ、1000rpmで室温にて1分間遠心分離した。ハイスループットな自動ワークステーション(JANUS、Perkin Elmer)をハイスループットな投入に使用した。培養した食道扁平上皮癌細胞を含む384ウェルプレートの各ウェルに、対応する濃度の0.1μLの候補薬物を加えた。投入後に、384ウェルプレートの表面を消毒し、インキュベーターに移して、更に培養した。72時間後に細胞生存率を測定した。
CellTiter-Glo発光試薬(Promega)を4℃の冷蔵庫から取り出し、10mLの試薬をローディングスロット中に加え、試験用の384ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、10μLのCellTiter-Glo発光試薬を各ウェルに加えた。10分間静置した後に、試験を、多機能マイクロプレートリーダー(Envision、Perkin Elmer)を使用することにより行った。
細胞生存率(%)=薬物ウェルの化学発光値/コントロールウェルの化学発光値×100%の式に従って、様々な薬物で処理された細胞の細胞生存率を計算し、グラフパッドプリズムソフトウェアを使用することによって、細胞に対する薬物の半阻害率(IC50)を計算した。結果をそれぞれ図11A~図11Dに示す。
Claims (5)
- 食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地であって、
初期培養培地と、Rhoキナーゼ阻害剤、抗生物質、インスリン、N2添加剤、インスリン様成長因子1、非必須アミノ酸、ヒドロコルチゾン、グルタミン、及びウシ脳下垂体抽出物とを含み、
前記初期培養培地は、DMEM/F12、DMEM、F12、又はRPMI-1640から選択され、
前記Rhoキナーゼ阻害剤は、Y27632であって、2.5μM~40μMの範囲内の濃度を有し、
前記抗生物質は、プリモシンであって、25mg/mL~400mg/mLの範囲内の濃度を有し、
前記インスリンは、2.5μg/mL~40μg/mLの範囲内の濃度を有し、
前記N2添加剤は、前記培養培地に対して1:400~1:25の容量比を有し、
前記インスリン様成長因子1は、2.5ng/mL~40ng/mLの範囲内の濃度を有し、
前記非必須アミノ酸は、グリシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、及びセリンの1つ以上から選択され、総濃度は50μM~400μMの範囲内であり、
前記ヒドロコルチゾンは、0.2μg/mL~1.6μg/mLの範囲内の濃度を有し、
前記グルタミンは、1mM~8mMの範囲内の濃度を有し、
前記ウシ脳下垂体抽出物は、3.5μg/mL~56μg/mLの範囲内の濃度を有することを特徴とする、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地。 - 前記Y27632は、5μM~20μMの範囲内の濃度を有し、
前記プリモシンは、50mg/mL~200mg/mLの範囲内の濃度を有し、
前記インスリンは、10μg/mL~40μg/mLの範囲内の濃度を有し、
前記N2添加剤は、前記培養培地に対して1:100~1:25の容量比を有し、
前記インスリン様成長因子1は、2.5ng/mL~10ng/mLの範囲内の濃度を有し、
前記非必須アミノ酸の総濃度は、100μM~400μMの範囲内であり、
前記ヒドロコルチゾンは、0.2μg/mL~0.8μg/mLの範囲内の濃度を有し、
前記グルタミンは、1mM~4mMの範囲内の濃度を有し、
前記ウシ脳下垂体抽出物は、3.5μg/mL~14μg/mLの範囲内の濃度を有することを特徴とする、請求項1に記載の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地。 - 食道扁平上皮癌の初代細胞の培養方法であって、
請求項1又は2に記載の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地を使用することによって、食道扁平上皮癌の初代細胞を培養することを特徴とする、培養方法。 - 培養過程において、照射されたNIH-3T3細胞を2×104個/cm2~3×104個/cm2の細胞密度で加えることを特徴とし、照射源は、30Gy~50Gyの照射線量を有するX線又はγ線である、請求項3に記載の培養方法。
- 食道扁平上皮癌用の薬物をスクリーニングする方法であって、以下の工程:
(1)請求項3又は4に記載の食道扁平上皮癌の初代細胞の培養方法を使用することによって、薬物スクリーニング用の食道扁平上皮癌の初代細胞を培養する工程と、
(2)試験される薬物を選択し、必要とされる濃度勾配に基づいて前記薬物を希釈する工程と、
(3)工程(1)において培養して取得された前記細胞に希釈された前記薬物を加える工程と、
(4)細胞生存率を測定する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010086392.3 | 2020-02-11 | ||
CN202010086392.3A CN113249325B (zh) | 2020-02-11 | 2020-02-11 | 食管鳞癌原代细胞的培养基及培养方法 |
PCT/CN2020/076736 WO2021159560A1 (zh) | 2020-02-11 | 2020-02-26 | 食管鳞癌原代细胞的培养基及培养方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2023513267A JP2023513267A (ja) | 2023-03-30 |
JP7454290B2 true JP7454290B2 (ja) | 2024-03-22 |
Family
ID=77219536
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022548485A Active JP7454290B2 (ja) | 2020-02-11 | 2020-02-26 | 食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地、及びその培養方法 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20230091960A1 (ja) |
EP (1) | EP4105320A4 (ja) |
JP (1) | JP7454290B2 (ja) |
CN (1) | CN113249325B (ja) |
WO (1) | WO2021159560A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115772498A (zh) * | 2021-09-08 | 2023-03-10 | 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 | 一种用于肝癌类器官培养的培养基、及其培养方法和应用 |
CN115960832A (zh) * | 2021-10-11 | 2023-04-14 | 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 | 一种肠癌原代细胞的培养基及体外培养方法和用途 |
CN115960831A (zh) * | 2021-10-11 | 2023-04-14 | 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 | 肠癌类器官的培养基及培养方法 |
CN114292805A (zh) * | 2022-01-10 | 2022-04-08 | 中国原子能科学研究院 | 充分提取贴壁细胞总蛋白的方法 |
CN114561337B (zh) * | 2022-03-09 | 2023-10-03 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种提高HepG2细胞克隆形成率的单克隆增强培养基和方法 |
CN114525252B (zh) * | 2022-03-10 | 2023-12-01 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种提高mda-mb-231单细胞克隆形成率的单克隆增强培养基与培养方法及其应用 |
CN114854690A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-08-05 | 南宁云幂方生物医药技术有限责任公司 | 用于癌细胞原代培养的添加剂及其培养基和用途 |
CN115236222B (zh) * | 2022-06-29 | 2023-12-22 | 上海市食品药品检验研究院 | 一种化妆品中人表皮生长因子的检测方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014233281A (ja) | 2013-06-05 | 2014-12-15 | 学校法人関西医科大学 | 食道上皮幹細胞の単離方法 |
CN105505860A (zh) | 2016-01-13 | 2016-04-20 | 河南科技大学第一附属医院 | 一种食管上皮干细胞的分离培养方法 |
CN106190980A (zh) | 2016-07-12 | 2016-12-07 | 张云霞 | 一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基及培养方法 |
WO2019196606A1 (en) | 2018-04-13 | 2019-10-17 | Primordial Biotech. Co. | Method for obtaining an animal model from conditionally reprogrammed cells and use of the animal model for screening anti-tumor drugs |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102766599A (zh) * | 2012-07-06 | 2012-11-07 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种食管鳞癌原代瘤株ch-h-1的应用 |
EP3822339A1 (en) * | 2015-04-03 | 2021-05-19 | Propagenix Inc. | Ex vivo proliferation of epithelial cells |
US20210139854A1 (en) * | 2017-01-06 | 2021-05-13 | The Regents Of The University Of California | Methods for Generating Skeletal Muscle Progenitor Cells |
EP3732285A1 (en) * | 2017-12-28 | 2020-11-04 | Tract Pharmaceuticals, Inc. | Stem cell culture systems for columnar epithelial stem cells, and uses related thereto |
CN108893448A (zh) * | 2018-06-08 | 2018-11-27 | 河北医科大学第医院 | 人食管癌细胞系ec-1701及其应用 |
WO2021072238A1 (en) * | 2019-10-10 | 2021-04-15 | University Of Houston System | Feeder-based and feeder-free stem cell culture systems for stratified epithelial stem cells, and uses related thereto |
-
2020
- 2020-02-11 CN CN202010086392.3A patent/CN113249325B/zh active Active
- 2020-02-26 EP EP20918987.7A patent/EP4105320A4/en active Pending
- 2020-02-26 US US17/798,640 patent/US20230091960A1/en active Pending
- 2020-02-26 WO PCT/CN2020/076736 patent/WO2021159560A1/zh unknown
- 2020-02-26 JP JP2022548485A patent/JP7454290B2/ja active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014233281A (ja) | 2013-06-05 | 2014-12-15 | 学校法人関西医科大学 | 食道上皮幹細胞の単離方法 |
CN105505860A (zh) | 2016-01-13 | 2016-04-20 | 河南科技大学第一附属医院 | 一种食管上皮干细胞的分离培养方法 |
CN106190980A (zh) | 2016-07-12 | 2016-12-07 | 张云霞 | 一种基于人食管癌组织用于体外培养食管癌肿瘤类器官的专用培养基及培养方法 |
WO2019196606A1 (en) | 2018-04-13 | 2019-10-17 | Primordial Biotech. Co. | Method for obtaining an animal model from conditionally reprogrammed cells and use of the animal model for screening anti-tumor drugs |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Anticancer Research,1991年,Vol. 11, No. 4,p.1591-p.1595 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113249325A (zh) | 2021-08-13 |
EP4105320A1 (en) | 2022-12-21 |
US20230091960A1 (en) | 2023-03-23 |
WO2021159560A1 (zh) | 2021-08-19 |
EP4105320A4 (en) | 2024-04-03 |
JP2023513267A (ja) | 2023-03-30 |
CN113249325B (zh) | 2023-02-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7454290B2 (ja) | 食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地、及びその培養方法 | |
US20230235283A1 (en) | Culture medium for esophageal squamous cell carcinoma epithelial cells, culture method, and application thereof | |
WO2021184408A1 (zh) | 胃癌原代细胞的培养基及培养方法 | |
EP4056685A1 (en) | Primary breast epithelial cell culture medium, culture method, and use thereof | |
WO2021179354A1 (zh) | 原代肝癌细胞培养基、原代肝癌细胞培养方法及其应用 | |
WO2022227110A1 (zh) | 口腔癌原代细胞的培养基及培养方法 | |
US20240319170A1 (en) | Culture medium and culture method for primary cells of intestinal cancer | |
US20240344020A1 (en) | Culture medium for lung cancer epithelial cells, culture method, and application thereof | |
RU2822035C1 (ru) | Культуральная среда для первичных клеток плоскоклеточной карциномы пищевода и способ культивирования указанных клеток | |
US20230212523A1 (en) | Culture medium for laryngeal cancer epithelial cells, culture method, and application thereof | |
CN113969262B (zh) | 一种用于肺癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用 | |
RU2814719C1 (ru) | Культуральная среда для эпителиальных клеток рака гортани, способ культивирования и их применение | |
RU2826875C1 (ru) | Среда для культивирования для первичных клеток стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта, способ их культивирования и их применение | |
US20240319169A1 (en) | Primary gastrointestinal stromal tumor cell culture medium, culture method and application thereof | |
WO2023060711A1 (zh) | 肺癌胸水来源类器官的培养基、培养方法及其应用 | |
EP4403626A1 (en) | Culture medium and culture method for lung cancer epithelial cells, and application thereof | |
CN115975936A (zh) | 宫颈癌原代细胞的培养基和培养方法 | |
WO2023060709A1 (zh) | 食管癌类器官的培养基、培养方法及其应用 | |
CN115975932A (zh) | 卵巢癌原代细胞的培养基、培养方法及其应用 | |
Gibelli et al. | Minimal tumor contamination of hematopoietic harvests from breast cancer patients can be easily detected by liquid culture assay |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20221006 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20230927 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231003 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20231227 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240213 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240304 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7454290 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |