JP7454290B2 - 食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地、及びその培養方法 - Google Patents

食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地、及びその培養方法 Download PDF

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Description

本発明は、生物学の技術分野に関し、特に、食道扁平上皮癌の初代細胞をin vitroで迅速に拡大させる培養培地及び培養方法に関する。
現在、中国において、都市部及び農村地域の両方で、腫瘍は主要な死因である。食道癌は、世界中で最も一般的な消化管の悪性腫瘍の1つである。国立癌センターからの最新の統計によれば、食道癌は、男性における悪性腫瘍の上位10番の中の4番目に位置し、女性においては3番目に位置している。世界の多くの地域で、局地的な発生率が増加しているが、中国は食道癌の発生率が高い地域であり、年間平均死亡者数は約150000人で、国内の癌死亡率の21.8%を占め、最も多くの死を引き起こす癌の中で4番目に位置している(非特許文献1)。食道癌の病理学的分類においては、外国と中国との間で明らかな違いがある:外国での食道癌の90%超は腺癌であるのに対して、中国では90%超が扁平上皮癌である。NCCNのガイドラインは外国の症例研究に基づいて制定されているため、国内の食道癌患者の薬物療法を指導するためのNCCNの使用には或る特定の違いがある。したがって、食道癌の病因をin vitroで研究し、食道癌の治療用の新薬を開発するのに使用される、中国人集団の初代細胞試料バンクを開設する必要がある。この過程において、食道癌の初代細胞を培養することが特に重要である。
現在、食道癌の初代細胞の培養において、腫瘍細胞を分離した後に、ウシ胎児血清を含む培地中でこれを直接培養する方法が知られており(非特許文献2)、近年、条件付きリプログラミング法を使用して上皮由来細胞を培養する方法も報告されており、そこでは、この方法を使用して、食道癌の初代細胞を培養して拡大させることができると述べられており(非特許文献3)、続いて、食道癌の術中試料をトリプシンにより消化し、条件付きリプログラミング方法により培養したことが文献において報告されている(非特許文献4)。最近では、追加の因子を含む市販の培養培地KSFMを使用する培養方法(非特許文献5)、及びオルガノイド技術を使用する培養方法(非特許文献6)が文献により報告されている。
しかしながら、非特許文献2の上記方法は、長期間の安定的な培養には使用することができず、非特許文献3及び非特許文献4の培養期間は比較的長く、非特許文献5の方法はより高いコストを必要とし、非特許文献6におけるオルガノイド培養に使用される試薬は非常に高価であり、培養過程での操作が複雑であり、これは大規模な応用には好ましくない。
さらに、外国における食道癌の病理タイプは主に食道腺癌であり、外国文献において報告されている方法は基本的に食道腺癌に基づいているため、これらの方法は、食道扁平上皮癌の培養には適していない。したがって、食道扁平上皮癌の初代細胞を培養するのに適した培養培地及び培養方法を開発する必要がある。
Freddie Bray, BSc, MSc, PhD; Jacques Ferlay, ME, et al. Global Cancer Statistics 2018. CA CANCER J CLIN 2018; 68:394-424 Karin J. Purdie, Celine Pourreyron, and Andrew P. South. Isolation and Culture of Squamous Cell Carcinoma lines. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 731, 2011, 151-159 Xuefeng Liu, Ewa Krawczyk, et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols, VOl.12 NO.2, 2017, 439-451 Todd J. Jensen, Christopher Foster, et al. Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation. Journal of Visualized Experiments, March 2017, 121, e55243 Yuta Kasagi,et al. The Esophageal Organoid System Reveals Functional Interplay Between Notch and Cytokines in Reactive Epithelial Changes. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology Vol. 5, No. 3, 2018, 333-352 Xiaodun Li, Hayley E. Francies, et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. NATURE COMMUNICATIONS (2018) 9:2983-2995
従来技術における上記の問題を解決するために、本発明は、食道扁平上皮癌の初代細胞をin vitroで迅速に拡大させる培養培地及び培養方法を提供する。
本発明の一態様は、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地であって、初期培養培地と、以下の成分(1)~成分(6)と、任意に以下の成分(7)~成分(9)とを含み、ここで、初期培養培地が、例えば、DMEM/F12、DMEM、F12、又はRPMI-1640、好ましくはDMEM/F12であり得る、培養培地を提供することである。
(1)Y27632、ヒドロキシファスジル、及びGSK429286Aの1つ以上から選択され、Y27632の場合に、2.5μM~40μM、好ましくは5μM~20μMの範囲内、より好ましくは10μMの濃度を有し、ヒドロキシファスジルの場合に、2μM~32μM、好ましくは4μM~16μMの範囲内、より好ましくは8μMの濃度を有し、GSK429286Aの場合に、2μM~32μM、好ましくは4μM~16μMの範囲内、より好ましくは8μMの濃度を有するRhoキナーゼ阻害剤、
(2)ストレプトマイシン/ペニシリン、アムホテリシンB、及びプリモシンの1つ以上から選択され、ストレプトマイシン/ペニシリンの場合に、ストレプトマイシンは25μg/mL~400μg/mL、好ましくは50μg/mL~200μg/mLの範囲内、より好ましくは200μg/mLの濃度を有し、ペニシリンは25U/mL~400U/mL、好ましくは50U/mL~200U/mLの範囲内、より好ましくは200U/mLの濃度を有し、アムホテリシンBの場合に、0.25μg/mL~4μg/mL、好ましくは0.5μg/mL~2μg/mLの範囲内、より好ましくは1μg/mLの濃度を有し、プリモシンの場合に、25mg/mL~400mg/mL、好ましくは50mg/mL~200mg/mLの範囲内、より好ましくは100mg/mLの濃度を有する抗生物質であって、好ましくはプリモシンである、抗生物質、
(3)2.5μg/mL~40μg/mL、好ましくは10μg/mL~40μg/mLの範囲内、より好ましくは20μg/mLの濃度を有するインスリン、
(4)培養培地に対して1:400~1:25、好ましくは1:100~1:25、より好ましくは1:50の容量比を有するN2添加剤、
(5)2.5ng/mL~40ng/mL、好ましくは2.5ng/mL~10ng/mLの範囲内、より好ましくは5ng/mLの濃度を有するインスリン様成長因子1(IGF-1)、
(6)グリシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、及びセリンの1つ以上から選択され、総濃度は50μM~400μM、好ましくは100μM~400μMの範囲内、より好ましくは400μMである非必須アミノ酸、
(7)0μg/mL~1.6μg/mL、好ましくは0.2μg/mL~0.8μg/mLの範囲内、より好ましくは0.4μg/mLの濃度を有するヒドロコルチゾン、
(8)0mM~8mM、好ましくは1mM~4mMの範囲内、より好ましくは2mMの濃度を有するグルタミン、
(9)0μg/mL~56μg/mL、好ましくは3.5μg/mL~14μg/mLの範囲内、より好ましくは7μg/mLの濃度を有するウシ脳下垂体抽出物。
本発明の別の態様は、食道扁平上皮癌の初代細胞の培養方法であって、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地を使用して培養する、培養方法を提供することである。
上述の培養方法は、以下の工程を含む。
1.食道扁平上皮癌の初代細胞の分離
1.1 組織洗浄溶液ですすいだ後に、内視鏡試料等の組織試料に組織消化溶液を加え、恒温振盪器(Zhichu InstrumentのZQLY-180N)中に入れて、消化させる。例えば、8ml~14ml、好ましくは12mlの組織消化酵素が消化に使用され、消化温度は4℃~37℃の範囲であり、好ましくは37℃であり、消化用の回転速度は200rpm~350rpmの範囲であり、好ましくは300rpmである。
1.2 消化後に、得られたものを取り出して観察する。明らかな組織ブロックが見られなければ、消化を終了することができ、それ以外の場合は、消化が十分になるまで消化を継続する。消化時間は4時間~8時間の範囲であり、好ましくは6時間である。
1.3 消化後に、得られたものを取り出して、遠心分離し、上清を廃棄した後に、血清を含む初期培養培地を加えて再懸濁し、消化を停止する。遠心分離用の回転速度は1200g~1600gの範囲であり、好ましくは1500rpmであり、遠心分離時間は2分~5分の範囲であり、好ましくは3分であり、血清を含む培養培地は、例えば、5%のウシ胎児血清を含むDMEM/F12であり得る。
2.本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地を使用する培養
上記工程1において得られた食道扁平上皮癌の初代細胞を、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地で再懸濁して、計数し、5×10個/cm~10×10個/cmの細胞密度で培養ディッシュに播種し、同時に、栄養膜細胞を2×10個/cm~3×10個/cmの細胞密度で培養ディッシュに加え、5日間~7日間培養した後に、栄養膜細胞を0.5×10個/cm~1×10個/cmの細胞密度で添加補充し、細胞が培養ディッシュの85%を覆うように成長したら、細胞を消化して、継代する。
具体的には、工程1において記載された組織洗浄溶液の配合物は、100mg/mL~200mg/mLのプリモシンと、2%のペニシリン/ストレプトマイシンの二重抗体溶液とを含むDMEM/F12基礎培養培地である。工程1において記載される組織消化溶液の調製方法は、1mg/mL~2mg/mLのコラゲナーゼII、1mg/mL~2mg/mLのコラゲナーゼIV、50U/mL~100U/mLのデオキシリボ核酸I、0.5mg/mL~1mg/mLのヒアルロニダーゼ、1mM~3mMの塩化カルシウム、1%~2%のウシ血清アルブミンを、1:1の容量比を有するHBSS及びRPMI-1640中に溶解することを含む。工程2において記載される栄養膜細胞は、例えば、照射されたNIH-3T3細胞であり、照射源は、30Gy~50Gy、好ましくは35Gyの照射線量を有するX線又はγ線、好ましくはγ線である。
本発明によれば、食道扁平上皮癌の初代細胞用の改良された培養培地を使用することにより、食道扁平上皮癌の組織試料を短時間で迅速に拡大させ、十分な数の細胞を有効な時間で増幅して取得することができることから、これをin vitroでのハイスループットな薬物感受性試験及び正確な臨床的薬物療法の指導に使用することができる。
オルガノイド培養培地と比較して、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地は、wnt3a、RSPO1、及びノギン等の高価な因子を加える必要がないことから、培養のコストが大幅に削減される。さらに、オルガノイド培養においては、オルガノイドの消化過程が複雑であるのに対して、本発明の培養方法は、単純な処理法を伴い、実験の要件を満たし得る多数の単層細胞を迅速に取得することができる。従来の条件付きリプログラミング技術において使用される培養培地と比較して、本発明においては増幅させて同量の細胞を取得する期間がより短く、本発明はまた、少数の試料の場合にも大きな増殖促進効果を有する。本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地及び培養方法は、食道扁平上皮癌の組織試料のin vitroでの持続的な拡大の成功率を、平均85%超で大幅に改善することができる。
食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中の因子を増やした効果を示す図である。 食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中での多数の因子の組合せの効果を示す図である。 食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地への他の因子の添加の効果を示す図である。 図4Aおよび4Bは、in vitroで培養した食道扁平上皮癌の初代細胞を顕微鏡で観察することにより得られた写真(明視野)である。 図5Aおよび5Bは、in vitroで培養した食道扁平上皮癌細胞のライトギムザ染色による識別結果である。 図6Aおよび6Bは、in vitroで培養した食道扁平上皮癌細胞の免疫蛍光染色による識別結果である。 本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地を使用した食道扁平上皮癌の初代細胞の最初の拡大期及び細胞数の統計の結果を示す図である。 本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地を使用した食道扁平上皮癌の初代細胞のin vitroでの拡大曲線である。 図9A-9Pは、食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中の様々な濃度における様々な因子の効果を示す図である。 図9A-9Pは、食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中の様々な濃度における様々な因子の効果を示す図である。 図9A-9Pは、食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中の様々な濃度における様々な因子の効果を示す図である。 細胞の増殖に対する、本培養培地と文献において報告される培地及び市販の培地KSFMとの効果の比較結果を示す図である。 図11A-11Dは、本発明の培養培地により培養した様々な世代の食道扁平上皮癌細胞を使用した薬物スクリーニングの結果を示す図である。 図11A-11Dは、本発明の培養培地により培養した様々な世代の食道扁平上皮癌細胞を使用した薬物スクリーニングの結果を示す図である。
本発明を、特定の実施形態の記載と図面とを組み合わせることにより以下で更に説明する。これらの実施形態は、本発明を例示するのに使用されるにすぎず、本発明の範囲はこれらの実施形態に限定されない。
実施例1.様々な成分を含む食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地の細胞増殖促進効果
(1)様々な成分を含む培養培地の調製
表1中の成分に従って、様々な成分を含む培養培地を調製して、食道扁平上皮癌細胞に対する増殖促進効果を調査する。
DMEM/F12培地(Corning)に、10μMのY27632(MCE)及び100mg/mLのプリモシンを加えて基礎培養培地(以下、BMと呼称することがある)とし、この基礎培養培地に様々な因子を加えた。番号1の培地は、インスリン(Gibco)をBMに加えることによって得られ、番号2の培地は、ヒドロコルチゾン(Sigma)を番号1の培地に加えることによって得られ、番号3の培地は、非必須アミノ酸(NEAA、Gibco)を番号2の培地に加えることによって得られ、番号4の培地は、グルタミン(Gibco)を番号3の培地に加えることによって得られ、番号5の培地は、ウシ脳下垂体抽出物(BPE、M&C Gene Technology)を番号4の培地に加えることによって得られ、番号6の培地は、インスリン様成長因子1(IGF-1、Sino Biological)を番号5の培地に加えることによって得られ、番号7の培地(以下、EMと呼称することがある)は、N2添加剤(Gibco)を番号6の培地に加えることによって得られ、番号8の培地は、ウシ胎児血清(FBS、Gibco)を番号7の培地に加えることによって得られる。
Figure 0007454290000001
(2)食道扁平上皮癌の初代細胞の取得及び培養
1.調製法
15mLの滅菌遠心チューブ、ピペット、10mlのトランスファーピペット、滅菌ガンヘッド等の表面を滅菌し、ウルトラクリーンワークベンチに入れて、30分間紫外線を照射した。表1に従って調製された培養培地、表2に従って調製された組織消化溶液、及び表3に従って調製された組織洗浄溶液を、30分前に4℃の冷蔵庫から取り出し、室温と等しくした。
Figure 0007454290000002
Figure 0007454290000003
2.食道扁平上皮癌の初代細胞の分離
2.1.食道癌の内視鏡組織試料を、内視鏡検査の間に十分に説明し同意を得た5人の食道癌患者の組織試料、すなわち試料50、試料51、試料52、試料53、及び試料54からそれぞれ取得した。ウルトラクリーンワークベンチ内で内視鏡組織を摘出し、15mLの遠心分離チューブに入れた後に、そこに5mLの組織洗浄溶液を加え、得られたものを混合し、1回すすいだ。得られたものを1500rpmで4分間遠心分離した。
2.2.上清を廃棄し、得られたものに基礎培養培地及び組織消化溶液の1:1の混合物を加えた(投入量は10mgの組織当たり約5mlの組織消化溶液である)。試料に名前及び番号を記入し、密封フィルムで密封した後に、振盪器において37℃及び300rpmで消化した。消化が完了したかどうかを、1時間ごとに観察によって確かめる。
2.3.消化後に、未消化の組織ブロックを40μMのフィルタースクリーンを通して濾過した。フィルタースクリーン上の組織ブロックを、組織洗浄溶液ですすいだ。残留細胞を遠心分離チューブ中に洗い流し、1500rpmで4分間遠心分離した。
2.4.上清を廃棄し、残りの細胞塊を観察して、そこに血球が含まれているかどうかを確かめた。血球が存在する場合は、3mLの血球溶解液(blood cell lysate)(Sigma)を加えた後に、それを十分に混合し、5分ごとに十分に振盪及び混合しながら4℃で15分間溶解した。溶解後に、得られたものを取り出し、1500rpmで4分間遠心分離した。
2.5.上清を廃棄し、得られたものに2mLの基礎培養培地を加えて、細胞を再懸濁して保存した。
3.食道扁平上皮癌の初代細胞の培養
3.1.顕微鏡観察:10μLの再懸濁した細胞を吸い出し、スライドガラス上に撒種し、癌細胞を顕微鏡(EVOS M500、Invitrogen)下で10倍の対物レンズを用いて観察した。
3.2.生細胞計数:10μLの再懸濁した細胞懸濁液を10μLのトリパンブルー色素(Invitrogen)と十分に混合した後に、10μLの混合物をフローイメージングカウンター(JIMBIO FIL、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.)に加えて、細胞濃度、細胞粒子サイズ、及び細胞生存率を取得した。10μmを超える粒子サイズを有する細胞を選択して、計数した。
3.3.細胞培養:上記3.2において計数された各試料からの細胞懸濁液を、それぞれ9等分し、1500rpmで4分間遠心分離し、続いてそれぞれ200μLのBM及び番号1~番号8の培地を用いて再懸濁した。得られたものを48ウェルプレートに1×10個/cmの生細胞密度(1ウェル当たり10000個の細胞)で接種した後に、プレートにγ線(照射線量35Gy)により照射されたNIH-3T3細胞を2×10個/cmの細胞密度で加えた。最後に、48ウェルプレート中の各ウェルに対応する培養培地を500μLの容量まで補充し、得られたものを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを37℃の5%のCOインキュベーター(Thermo Fisher)に入れて、培養した。48ウェルプレートの85%超を覆うように成長した後に、細胞を継代した。
(3)培養の結果
培養の7日目に、48ウェルプレートを取り出し、200μLの0.25%のトリプシン(Gibco)で1分間すすいだ。吸引により液体を除去し、500μLの0.05%のトリプシン(Gibco)を各ウェルに再び加えた。得られたものを37℃の5%のCOインキュベーターに入れて、10分間反応させ、顕微鏡(EVOS M500、Invitrogen)下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。1500rpmで4分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、1mLの基礎培養培地を加えて、再懸濁した。フローイメージングカウンター(JIMBIO FIL、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.)を用いて計数することにより、総細胞数を得た。内視鏡組織試料50から分離された食道扁平上皮癌の初代細胞から得られた結果を図1に示す。
図1において示される結果から、基礎培養培地と比較して、上記の番号1~番号7の培地の全てが、様々なレベルで食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖を促進し得ることを理解することができる。Y27632及びプリモシン、インスリン、ヒドロコルチゾン、非必須アミノ酸、グルタミン、ウシ脳下垂体抽出物、IGF1、N2添加剤を含む培地(番号7の培地)を使用して食道扁平上皮癌の初代細胞を培養した場合に、増殖効果が大幅に向上した。さらに、5%のウシ胎児血清を番号7の培地に加えることによって得られた番号8の培地を食道扁平上皮癌の初代細胞の培養に使用した場合に、5%のウシ胎児血清の添加を伴わない番号7の培地と比較して、増殖効果は大きく向上しない。したがって、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地は、ウシ胎児血清を添加せずに使用され得ると結論付けることができる。
実施例2.食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中での多数の因子の組合せの効果
実施例1の基礎培養培地(DMEM/F12培地+10μMのY27632+100mg/mLのプリモシン)に、1:50の比率のN2添加剤、20μg/mLのインスリン、7μg/mLのウシ脳下垂体抽出物、2mMのグルタミン、400μMの非必須アミノ酸、0.4μg/mLのヒドロコルチゾン、5ng/mLのインスリン様成長因子1をそれぞれ別々に加えて、この実施例の培養培地を調製した。
実施例1と同じ方法に従って、内視鏡組織試料57、試料58、試料59、試料60、及び試料61を分離して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得し、取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、この実施例において調製されたそれぞれの培養培地、並びにBM培地及び実施例1の番号7の培地(EM)を使用することによって培養した。得られたものを48ウェルプレートに1×10個/cmの生細胞密度(1ウェル当たり10000個の細胞)で接種した後に、プレートにγ線(照射線量35Gy)により照射されたNIH-3T3細胞を2×10個/cmの細胞密度で加え、次にこれを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを37℃の5%のCOインキュベーター(Thermo Fisher)に入れて、培養した。培養の7日目に、48ウェルプレートを取り出し、200μLの0.25%のトリプシン(Gibco)で1分間すすいだ。吸引により液体を除去し、500μLの0.05%のトリプシン(Gibco)を各ウェルに再び加えた。得られたものを37℃の5%のCOインキュベーターに入れて、10分間反応させ、顕微鏡(EVOS M500、Invitrogen)下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。1500rpmで4分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、1mLの基礎培養培地を加えて、再懸濁した。フローイメージングカウンター(JIMBIO FIL、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.)を用いて計数することにより、総細胞数を得た。食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中での2つの因子の組合せの効果を評価した。内視鏡組織試料57から分離された食道扁平上皮癌の初代細胞から得られた結果を図2に示す。
図2において示されるように、N2添加剤、インスリン、ウシ脳下垂体抽出物、グルタミン、非必須アミノ酸、ヒドロコルチゾン、インスリン様成長因子1から選択される因子を更に基礎培養培地(DMEM/F12培地+10μMのY27632+100mg/mLのプリモシン)に加えた場合に、細胞増殖効率は、基礎培養培地より優れていたが、実施例1における番号7の培地(EM)ほど優れていなかった。
実施例3.食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地への他の因子の添加の効果
実施例1の番号7の培地(EM)に、10ng/mlの線維芽細胞成長因子2(FGF2)、10ng/mlの線維芽細胞成長因子10(FGF10)、10ng/mlの線維芽細胞成長因子7(FGF7)、又は10ng/mlのFGF2、10ng/mlのFGF10、及び10ng/mlのFGF7の組合せをそれぞれ別々に加えて、この実施例の培地を調製した。
実施例1と同じ方法に従って、内視鏡組織試料62及び試料63を分離して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得し、取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、この実施例において調製されたそれぞれの培養培地、及び実施例1の番号7の培地(EM)を使用することによって培養した。得られたものを48ウェルプレートに1×10個/cmの細胞密度(1ウェル当たり10000個の細胞)で接種した後に、プレートにγ線(照射線量35Gy)により照射されたNIH-3T3細胞を2×10個/cmの細胞密度で加え、次にこれを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを37℃の5%のCOインキュベーター(Thermo Fisher)に入れて、培養した。培養の7日目に、48ウェルプレートを取り出し、200μLの0.25%のトリプシン(Gibco)で1分間すすいだ。吸引により液体を除去し、500μLの0.05%のトリプシン(Gibco)を各ウェルに再び加えた。得られたものを37℃の5%のCOインキュベーターに入れて、10分間反応させ、顕微鏡(EVOS M500、Invitrogen)下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。1500rpmで4分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、1mLの番号7の培地(EM)を加えて、再懸濁した。フローイメージングカウンター(JIMBIO FIL、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.)を用いて計数することにより、総細胞数を得た。食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地への他の因子の添加の効果を評価した。内視鏡組織試料62から分離された食道扁平上皮癌の初代細胞から得られた結果を図3に示す。
図3において、縦軸における比率は、EM培地及び追加の様々な因子(複数の場合もある)を含む培養培地を用いて7日間培養することにより得られた細胞数と、EM培地を用いて7日間培養することにより得られた細胞数との比率を表す。比率が1より大きければ、EM培地への様々な因子(複数の場合もある)の添加が、増殖の促進についてより優れた効果をもたらすことを示している。比率が1より小さければ、様々な因子(複数の場合もある)の添加が、EM培地よりも好ましい効果を生じないことを示している。
図3において示されるように、実施例1の番号7の培地(EM)にFGF2又はFGF10を更に加えることにより得られた培地を使用して培養した場合に、EM培地と比較して大きな増殖促進効果は見られない。実施例1の番号7の培地(EM)にFGF7を更に加えることにより得られた培地を使用して培養した場合に、食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖は、EM培地と比較してそれどころか阻害された。
実施例4.食道扁平上皮癌の初代細胞の培養及び識別
実施例1と同じ方法に従って、内視鏡組織試料64を分離して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得し、取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、実施例1の番号7の培地(EM)を使用することによって培養した。得られたものを12ウェルプレートに1×10個/cmの生細胞密度(1ウェル当たり45000個の細胞)で接種した後に、プレートにγ線(照射線量35Gy)により照射されたNIH-3T3細胞を2×10個/cmの細胞密度で加え、次にこれを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを37℃の5%のCOインキュベーター(Thermo Fisher)に入れて、培養した。
12日目に、培養した食道扁平上皮癌細胞を顕微鏡(EVOS M500、Invitrogen)下で観察した。図4A及び図4Bは、それぞれ4倍及び10倍の対物レンズの下で撮影された写真である。顕微鏡下で見ると、細胞は緊密に配列しており、形態は少しばかり不規則である。
次に、培養した細胞を、200μLの0.25%のトリプシン(Gibco)で1分間すすいだ。吸引により液体を除去し、500μLの0.05%のトリプシン(Gibco)を各ウェルに再び加えた。得られたものを37℃の5%のCOインキュベーターに入れて、10分間反応させ、顕微鏡(EVOS M500、Invitrogen)下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。1500rpmで4分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、500μLの番号7の培地(EM)を加えて、再懸濁した。培養した食道扁平上皮癌細胞を識別した。
100μLの上記食道扁平上皮癌細胞懸濁液をスライドガラス上に塗布し、ライトギムザ染色によって識別した。染色法を以下に記載する。
(1)細胞懸濁液の塗抹標本を空気乾燥させた後に、そこに1滴のライトギムザA溶液(Baso)を滴下し、続いて3滴のライトギムザB溶液(Baso)を滴下し、十分に混合して、3分間染色した。
(2)沈渣が標本に堆積するのを防ぐために、注ぎ出すのではなく水ですすぐことにより色素溶液を除去すべきであることに注意して、塗抹標本を流水ですすいだ。
(3)塗抹標本を乾燥させた後に、顕微鏡(OlympusのCX41)下で観察し、写真を撮影した。
図5A及び図5Bは、in vitroで培養した食道扁平上皮癌細胞のライトギムザ染色による識別結果を示しており、これらは、それぞれ10倍の対物レンズの下で異なる視野において撮影された写真である。核は大きくて、濃く染色されており、これらは扁平上皮癌細胞の特徴と合致している。
試料から培養された食道扁平上皮癌細胞を免疫蛍光で染色した。染色法を以下に記載する。
(1)接着
培養した食道扁平上皮癌細胞を細胞スライド(cell slides)(Thermo Fisher)上に播種し、細胞が壁に接着するまで37℃の5%のCOインキュベーターにおいて培養した。
(2)固定
(i)PBS(Shanghai Sangon Biotech)を使用して、4%のホルムアルデヒド(Sigma)を調製し、次にこれを4℃の冷蔵庫において貯蔵して、使用した。
(ii)細胞が壁に接着した後に、培養溶液を廃棄し、細胞を氷上で4%のホルムアルデヒドを用いて30分間固定した。得られたものをPBS(Shanghai Sangon Biotech)により5分間で3回洗浄した。
(3)透明化(遮光)
(i)透明化溶液の調製:PBS+0.3%のH(Shanghai Sangon Biotech)+0.3%のTriton X-100(Shanghai Sangon Biotech)。
(ii)透明化:PBSを廃棄した後に、透明化溶液を加えた。得られたものを露光せずに振盪(約100rpm)して、30分間透明化し、PBSにより5分間で3回洗浄した。
(4)ブロッキング
ブロッキングのために、PBS+0.3%のTriton X-100を使用して、5%のBSA(Shanghai Sangon Biotech)を調製し、ブロッキングを37℃で30分間行った。
(5)一次抗体のインキュベーション
(i)PBS+0.3%のTriton X-100を調製して、抗体を希釈し、ここで、扁平上皮癌特異抗体p63(CST)を1:50の比率で希釈した。ブロッキング溶液を廃棄し、調製した一次抗体希釈物を加えた。得られたものを4℃の冷蔵庫において一晩インキュベートした。
(ii)得られたものを4℃で取り出し、室温と等しくして、37℃で1時間インキュベーションを続けた後に、PBSにより5分間で3回洗浄した。
(6)二次抗体(遮光)
PBS+0.3%のTriton X-100を二次抗体希釈用に調製し、ここで、488の励起光を有するウサギ蛍光二次抗体(Thermo Fisher)を1:1000の比率で希釈した。得られたものを、室温で暗所にて1時間インキュベートした後に、PBSにより5分間で3回洗浄した。
(7)DAPI染色(遮光)
DAPI(Sigma)のPBS中での1:1000希釈液を使用して、室温で暗所にて5分間染色した。得られたものをPBSにより5分間で3回洗浄した。顕微鏡(EVOS M500、Invitrogen)下で写真を撮影して、記録した。
図6A及び図6Bは、in vitroで培養した食道扁平上皮癌細胞の免疫蛍光染色による識別結果であり、これらは、それぞれ10倍の対物レンズの下で異なる視野において撮影された蛍光写真である。図に示されるように、視野内の細胞は全て488の励起光の下で緑色を呈していることから、培養した細胞が扁平上皮癌細胞であることを示しており、これらは臨床病理診断と合致する。
実施例6.食道扁平上皮癌の最初の培養期間及び細胞数の統計並びに集団倍加(PD)値の計算
実施例1と同じ方法に従って、食道癌の内視鏡組織試料(試料1~試料40)を消化して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得した。取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、実施例1における番号7の培地を使用することにより培養した。細胞を1×10個/cmの生細胞密度で12ウェルプレートに接種して、培養した。プレートの85%を覆うように拡大させた後に、細胞を消化して、計数した。同時に、消化までの培養日数を1培養期間として見なして、それらを記録した。図7において示されるように、40個の試料の平均培養期間は10日間であり、拡大させた細胞の平均数は700000個であった。
この実験条件下で、合計9個の試料、すなわち、試料2、試料5、試料6、試料8、試料9、試料11、試料27、試料39、及び試料40を連続的に培養した。拡大させた細胞を、様々な継代において増幅させた。消化後に各継代物を計数し、対応する培養期間を記録した。PD値を、集団倍加(PD)=3.32×log10(消化後の総細胞数/接種された細胞の初期数)の式に従って計算した。図8において示されるように、そこでは、横軸は細胞培養の日数を表し、縦軸は累積細胞増殖の倍数、すなわち培養期間における細胞拡大の倍数を表す。その値が大きいほど、或る特定の期間内に細胞が拡大する倍数が大きく、つまり、より多くの細胞が拡大される。傾きは、細胞拡大の速度を表す。
図8からは、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地を使用することによって上記9個の試料を培養した場合に、56日間の増幅後も細胞拡大速度は実質的に変化せず、連続的に拡大する能力が依然として達成されたことが分かる。
実施例7.食道扁平上皮癌細胞の増殖に対する添加された因子の濃度の効果
実施例1と同じ方法に従って、内視鏡組織試料65、試料66、試料67、試料68、及び試料69を分離して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得し、取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、実施例1の番号7の培地を使用することによって培養した。得られたものを12ウェルプレートに1×10個/cmの生細胞密度(1ウェル当たり45000個の細胞)で接種した後に、プレートにγ線(照射線量35Gy)により照射されたNIH-3T3細胞を2×10個/cmの細胞密度で加え、次にこれを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを37℃の5%のCOインキュベーター(Thermo Fisher)に入れて、培養した。細胞がプレートの85%を覆うように拡大したら、12ウェルプレートを取り出し、200μLの0.25%のトリプシン(Gibco)で1分間すすいだ。吸引により液体を除去し、500μLの0.05%のトリプシン(Gibco)を各ウェルに再び加えた。得られたものを37℃の5%のCOインキュベーターに入れて、10分間反応させ、顕微鏡(EVOS M500、Invitrogen)下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。1500rpmで4分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、1mLの基礎培養培地を加えて、再懸濁した。フローイメージングカウンター(JIMBIO FIL、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.)を用いて計数することにより、総細胞数を得た。取得された細胞を以下の培養実験に使用した。
次に、様々な配合を有する以下の8種の培地を実験用に調製した:
配合物1:N2添加剤を含まない実施例1の番号7の培地、
配合物2:非必須アミノ酸を含まない実施例1の番号7の培地、
配合物3:グルタミンを含まない実施例1の番号7の培地、
配合物4:インスリンを含まない実施例1の番号7の培地、
配合物5:IGF1を含まない実施例1の番号7の培地、
配合物6:ウシ脳下垂体抽出物を含まない実施例1の番号7の培地、
配合物7:Y27632を含まない実施例1の番号7の培地、
配合物8:ヒドロコルチゾンを含まない実施例1の番号7の培地。
消化した細胞懸濁液を、上記の配合物1~配合物8及び実施例1における番号7の培地でそれぞれ希釈し、1ウェル当たり20000個の細胞及び500μLの容量で24ウェルプレートに播種した。
配合物1の培地を使用した場合に、それぞれ1:400、1:200、1:100、1:50、及び1:25の最終濃度を有する5つの濃度勾配のN2添加剤を調製し、調製されたN2添加剤を、初代細胞が接種された24ウェルプレートに1ウェル当たり500μLでそれぞれ加え、配合物1の培地をコントロール穴(BC)として使用した。
配合物2の培地を使用した場合に、それぞれ400μM、200μM、100μM、50μM、25μMの最終濃度を有する5つの濃度勾配の非必須アミノ酸を調製し、調製された非必須アミノ酸を、初代細胞が接種された24ウェルプレートに1ウェル当たり500μLでそれぞれ加え、配合物2の培地をコントロール穴(BC)として使用した。
配合物3の培地を使用した場合に、それぞれ8mM、4mM、2mM、1mM、0.5mMの最終濃度を有する5つの濃度勾配のグルタミンを調製し、調製されたグルタミンを、初代細胞が接種された24ウェルプレートに1ウェル当たり500μLでそれぞれ加え、配合物3の培地をコントロール穴(BC)として使用した。
配合物4の培地を使用した場合に、それぞれ40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mLの最終濃度を有する5つの濃度勾配のインスリンを調製し、調製されたインスリンを、初代細胞が接種された24ウェルプレートに1ウェル当たり500μLでそれぞれ加え、配合物4の培地をコントロール穴(BC)として使用した。
配合物5の培地を使用した場合に、それぞれ40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mLの最終濃度を有する5つの濃度勾配のインスリン様成長因子1(IGF1)を調製し、調製されたインスリン様成長因子1(IGF1)を、初代細胞が接種された24ウェルプレートに1ウェル当たり500μLでそれぞれ加え、配合物5の培地をコントロール穴(BC)として使用した。
配合物6の培地を使用した場合に、それぞれ56μg/mL、28μg/mL、14μg/mL、7μg/mL、3.5μg/mLの最終濃度を有する5つの濃度勾配のウシ脳下垂体抽出物を調製し、調製されたウシ脳下垂体抽出物を、初代細胞が接種された24ウェルプレートに1ウェル当たり500μLでそれぞれ加え、配合物6の培地をコントロール穴(BC)として使用した。
配合物7の培地を使用した場合に、それぞれ40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μMの最終濃度を有する5つの濃度勾配のY27632を調製し、調製されたY27632を、初代細胞が接種された24ウェルプレートに1ウェル当たり500μLでそれぞれ加え、配合物7の培地をコントロール穴(BC)として使用した。
配合物8の培地を使用した場合に、それぞれ1.6μg/mL、0.8μg/mL、0.4μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mLの最終濃度を有する5つの濃度勾配のヒドロコルチゾンを調製し、調製されたヒドロコルチゾンを、初代細胞が接種された24ウェルプレートに1ウェル当たり500μLでそれぞれ加え、配合物8の培地をコントロール穴(BC)として使用した。
さらに、5つの濃度勾配を有する8種の小分子化合物(LDN193189、IWP2、A83-01、フォルスコリン、SB431542、CHIR99021、DMH-1、DAPT;全てはMCEから購入した)を実施例の番号7の培地中で調製して、それぞれ10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μMの最終濃度を得て、調製された8種の小分子化合物(LDN193189、IWP2、A83-01、フォルスコリン、SB431542、CHIR99021、DMH-1、DAPT)を、初代細胞が接種された24ウェルプレートに1ウェル当たり500μLでそれぞれ加え、番号7の培地をそれぞれコントロール穴(BC)として使用した。
同時に、10000個の照射されたNIH-3T3細胞を、栄養膜細胞として上記の穴のそれぞれに加えた。
細胞を24ウェルの約85%まで拡大させた後に、細胞を消化して、計数し、コントロールウェル(BC)中の細胞数を参照することにより比率を計算し、結果を図9A~図9Pに示した。図9A~図9Pのそれぞれにおいて、この比率は、各培養培地を使用することによって培養された1代継代の細胞数と、対応するコントロール穴によって培養された1代継代の細胞数との比率を表す。その比率が1より大きければ、様々な濃度の因子又は小分子化合物を含む調製された培地の増殖促進効果が、コントロールウェルの培地の増殖促進効果よりも好ましいことを示し、その比率が1未満であれば、様々な濃度の因子又は小分子化合物を含む調製された培地の増殖促進効果が、コントロールウェルの培地の増殖促進効果よりも劣っていることを示している。
図9において示されるように、N2添加剤の濃度範囲は1:400~1:25であり、1:50の比率で加えると細胞増殖効果が最も大きくなり、非必須アミノ酸の濃度範囲は25μM~400μMであり、400μMの濃度で加えると細胞増殖効果が最も大きくなり、グルタミンの濃度範囲は0.5mM~8mMであり、2mMの濃度で加えると細胞増殖効果が最も大きくなり、インスリン様成長因子1の濃度範囲は2.5ng/mL~40ng/mLであり、濃度が5ng/mLである場合に細胞増殖効果が最も大きくなり、ウシ脳下垂体抽出物の濃度範囲は3.5μg/mL~56μg/mLであり、濃度が7μg/mLである場合に細胞増殖効果が最も大きくなり、Y27632の濃度範囲は2.5μM~40μMであり、濃度が10μMである場合に細胞増殖効果が最も大きくなり、インスリンの濃度範囲は2.5ng/mL~40ng/mLであり、濃度が20ng/mLである場合に細胞増殖効果が最も大きくなり、ヒドロコルチゾンの濃度範囲は0.1μg/mL~1.6μg/mLであり、濃度が0.4μg/mLである場合に細胞増殖効果が最も大きくなる。他の8種の小分子化合物(LDN193189、IWP2、A83-01、フォルスコリン、SB431542、CHIR99021、DMH-1、DAPT)は、10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μMの濃度勾配で大きな増殖促進効果を示さない。
実施例8.細胞増殖に対する本発明の培養培地及び従来技術の培地の効果の比較
非特許文献2のKM(角化細胞用培地)培地を表4のように調製した。
Figure 0007454290000004
非特許文献3のFM培地を表5のように調製した。
Figure 0007454290000005
KSFM培地をStemCellから購入した。
実施例1と同じ方法に従って、内視鏡組織試料70、試料71、及び試料72を分離して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得し、これらをEM培地、KSFM培地、FM培地、及びKM培地を使用することによってそれぞれ培養した。
試料のうちの1つ(試料70)を以下に記載する。取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、1mLのEM培地、KSFM培地、FM培地、及びKM培地でそれぞれ再懸濁し、フローイメージングカウンター(JIMBIO FIL、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.)を用いて計数した。
得られたものを2つの24ウェルプレートに、1×10個/cmの生細胞密度(1ウェル当たり20000個の細胞)でそれぞれ接種し、ここで、一方の24ウェルプレートを、γ線により照射されたNIH-3T3細胞を加えずに培養し、もう一方の24ウェルプレートにはγ線(照射線量35Gy)により照射されたNIH-3T3細胞を2×10個/cmの細胞密度で加えた後に、これを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを37℃の5%のCOインキュベーター(Thermo Fisher)に入れて、培養した。培養の5日目に、24ウェルプレートを取り出し、200μLの0.25%のトリプシン(Gibco)で1分間すすいだ。吸引により液体を除去し、500μLの0.05%のトリプシン(Gibco)を各ウェルに再び加えた。得られたものを37℃の5%のCOインキュベーターに入れて、10分間反応させ、顕微鏡(EVOS M500、Invitrogen)下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。1500rpmで4分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、1mLの基礎培養培地を加えて、再懸濁した。フローイメージングカウンター(JIMBIO FIL、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.)を用いて計数することにより、様々な培地により培養された総細胞数を得た。結果を図10に示す。
図10からは、KM培地、FM培地、及びKSFM培地と比較して、同じ細胞数(20000個/ウェル)で接種し、同じ時間にわたって培養する条件下で、EM培地が最も多くの拡大した細胞を得ることができるため、食道扁平上皮癌細胞の増殖の促進に対して大きな効果を有することが分かる。さらに、図10からは、栄養芽層細胞を使用した培養におけるEM培地の効果は、栄養芽層細胞の不存在下での効果よりも優れていることも分かる。このように、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地は、栄養芽層細胞を用いて培養した場合に、食道扁平上皮癌細胞の増殖促進に対して大きな効果を有し、培養期間を短縮することができる。
実施例9.本発明の培養培地から拡大させることによって得られた食道扁平上皮癌の初代細胞の薬物スクリーニングにおける使用
1.細胞の培養及び撒種
実施例1と同じ方法に従って、食道扁平上皮癌の初代細胞を食道扁平上皮癌の内視鏡試料から分離し、実施例1の番号7の培地を用いて培養した。細胞をプレートの85%を覆うように拡大させた後に、これらの細胞を1継代物として消化した。培養した細胞の1代継代物、3代継代物、5代継代物、7代継代物、及び9代継代物を薬物スクリーニングのために選択した。
これらの細胞を実施例1における工程に従って消化し、計数し、ローディングスロット(Corning)中で4×10個の細胞/cmの生細胞密度にて実施例1の番号7の培地と十分に混合した後に、384ウェルの乳白色の細胞培養プレート(Corning)において培養した。各ウェルの容量は50μLであり、細胞数は2000個/ウェルであった。プレートの端から実施例1の番号7の培地を加えてプレートを密封し、試料名及びCellTiter-Glo(Promega)の試験時間をプレートに記入した。75%のアルコール(LIRCON)で表面を消毒し、得られたものを37℃の5%のCOインキュベーターにおいて培養した。薬物を24時間後に加えた。
2.候補薬物の調製
7つの濃度勾配における3種の薬物(ボルテゾミブ、マイトマイシン、及びヒドロキシカンプトテシン、全てはMCEから購入した)を以下の表に従って調製し、これらを384ウェルプレート(Thermo Fisher)の各ウェルに50μLの容量でそれぞれ加え、-20℃で貯蔵して、使用した。
Figure 0007454290000006
7つの濃度勾配におけるエルロチニブ(MCE)を以下の表に従って調製し、これらを384ウェルプレート(Thermo Fisher)の各ウェルに50μLの容量でそれぞれ加え、-20℃で貯蔵して使用した。
Figure 0007454290000007
3.ハイスループットな薬物添加
調製された薬物プレートを取り出し、室温で静置した。完全に融解した後に、プレートを遠心分離機(Sigma 3-18K)に入れ、1000rpmで室温にて1分間遠心分離した。ハイスループットな自動ワークステーション(JANUS、Perkin Elmer)をハイスループットな投入に使用した。培養した食道扁平上皮癌細胞を含む384ウェルプレートの各ウェルに、対応する濃度の0.1μLの候補薬物を加えた。投入後に、384ウェルプレートの表面を消毒し、インキュベーターに移して、更に培養した。72時間後に細胞生存率を測定した。
4.細胞生存率の測定
CellTiter-Glo発光試薬(Promega)を4℃の冷蔵庫から取り出し、10mLの試薬をローディングスロット中に加え、試験用の384ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、10μLのCellTiter-Glo発光試薬を各ウェルに加えた。10分間静置した後に、試験を、多機能マイクロプレートリーダー(Envision、Perkin Elmer)を使用することにより行った。
5.データ処理
細胞生存率(%)=薬物ウェルの化学発光値/コントロールウェルの化学発光値×100%の式に従って、様々な薬物で処理された細胞の細胞生存率を計算し、グラフパッドプリズムソフトウェアを使用することによって、細胞に対する薬物の半阻害率(IC50)を計算した。結果をそれぞれ図11A~図11Dに示す。
図11A~図11Dから、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地から培養された食道扁平上皮癌細胞を薬物スクリーニングに使用した場合に、様々な継代の培養された細胞に対する同じ薬物の阻害効果は実質的に同じままである(阻害曲線は実質的に一貫している)ことを確認することができる。
本発明は、食道扁平上皮癌の初代細胞をin vitroで迅速に拡大させる培養培地及び培養方法であって、食道扁平上皮癌の組織試料の迅速な拡大を短時間で実現し、十分な量の細胞を有効な時間において増幅することができることから、in vitroでのハイスループットな薬物感受性試験及び正確な臨床的薬物療法の指導に使用することができる、培養培地及び培養方法を提供する。

Claims (5)

  1. 食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地であって、
    初期培養培地と、Rhoキナーゼ阻害剤、抗生物質、インスリン、N2添加剤、インスリン様成長因子1、非必須アミノ酸、ヒドロコルチゾン、グルタミン、及びウシ脳下垂体抽出物とを含み、
    前記初期培養培地は、DMEM/F12、DMEM、F12、又はRPMI-1640から選択され
    前記Rhoキナーゼ阻害剤は、Y27632であって、2.5μM~40μMの範囲内の濃度を有し、
    前記抗生物質は、プリモシンであって、25mg/mL~400mg/mLの範囲内の濃度を有し、
    前記インスリンは、2.5μg/mL~40μg/mLの範囲内の濃度を有し、
    前記N2添加剤は、前記培養培地に対して1:400~1:25の容量比を有し、
    前記インスリン様成長因子1は、2.5ng/mL~40ng/mLの範囲内の濃度を有し、
    前記非必須アミノ酸は、グリシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、及びセリンの1つ以上から選択され、総濃度は50μM~400μMの範囲内であり、
    前記ヒドロコルチゾンは、0.2μg/mL~1.6μg/mLの範囲内の濃度を有し、
    前記グルタミンは、1mM~8mMの範囲内の濃度を有し、
    前記ウシ脳下垂体抽出物は、3.5μg/mL~56μg/mLの範囲内の濃度を有することを特徴とする、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地。
  2. 前記Y27632は、5μM~20μMの範囲内の濃度を有し
    前記プリモシンは、50mg/mL~200mg/mLの範囲内の濃度を有し、
    前記インスリンは、10μg/mL~40μg/mLの範囲内の濃度を有し、
    前記N2添加剤は、前記培養培地に対して1:100~1:25の容量比を有し、
    前記インスリン様成長因子1は、2.5ng/mL~10ng/mLの範囲内の濃度を有し、
    前記非必須アミノ酸の総濃度は、100μM~400μMの範囲内であり、
    前記ヒドロコルチゾンは、0.2μg/mL~0.8μg/mLの範囲内の濃度を有し、
    前記グルタミンは、1mM~4mMの範囲内の濃度を有し、
    前記ウシ脳下垂体抽出物は、3.5μg/mL~14μg/mLの範囲内の濃度を有することを特徴とする、請求項1に記載の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地。
  3. 食道扁平上皮癌の初代細胞の培養方法であって、
    請求項1又は2に記載の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地を使用することによって、食道扁平上皮癌の初代細胞を培養することを特徴とする、培養方法。
  4. 培養過程において、照射されたNIH-3T3細胞を2×10個/cm~3×10個/cmの細胞密度で加えることを特徴とし、照射源は、30Gy~50Gyの照射線量を有するX線又はγ線である、請求項3に記載の培養方法。
  5. 食道扁平上皮癌用の薬物をスクリーニングする方法であって、以下の工程:
    (1)請求項3又は4に記載の食道扁平上皮癌の初代細胞の培養方法を使用することによって、薬物スクリーニング用の食道扁平上皮癌の初代細胞を培養する工程と、
    (2)試験される薬物を選択し、必要とされる濃度勾配に基づいて前記薬物を希釈する工程と、
    (3)工程(1)において培養して取得された前記細胞に希釈された前記薬物を加える工程と、
    (4)細胞生存率を測定する工程と、
    を含むことを特徴とする、方法。
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