JP7454290B2 - 食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地、及びその培養方法 - Google Patents

食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地、及びその培養方法 Download PDF

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Description

本発明は、生物学の技術分野に関し、特に、食道扁平上皮癌の初代細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで迅速に拡大させる培養培地及び培養方法に関する。
現在、中国において、都市部及び農村地域の両方で、腫瘍は主要な死因である。食道癌は、世界中で最も一般的な消化管の悪性腫瘍の１つである。国立癌センターからの最新の統計によれば、食道癌は、男性における悪性腫瘍の上位１０番の中の４番目に位置し、女性においては３番目に位置している。世界の多くの地域で、局地的な発生率が増加しているが、中国は食道癌の発生率が高い地域であり、年間平均死亡者数は約１５００００人で、国内の癌死亡率の２１．８％を占め、最も多くの死を引き起こす癌の中で４番目に位置している（非特許文献１）。食道癌の病理学的分類においては、外国と中国との間で明らかな違いがある：外国での食道癌の９０％超は腺癌であるのに対して、中国では９０％超が扁平上皮癌である。ＮＣＣＮのガイドラインは外国の症例研究に基づいて制定されているため、国内の食道癌患者の薬物療法を指導するためのＮＣＣＮの使用には或る特定の違いがある。したがって、食道癌の病因をｉｎ ｖｉｔｒｏで研究し、食道癌の治療用の新薬を開発するのに使用される、中国人集団の初代細胞試料バンクを開設する必要がある。この過程において、食道癌の初代細胞を培養することが特に重要である。
現在、食道癌の初代細胞の培養において、腫瘍細胞を分離した後に、ウシ胎児血清を含む培地中でこれを直接培養する方法が知られており（非特許文献２）、近年、条件付きリプログラミング法を使用して上皮由来細胞を培養する方法も報告されており、そこでは、この方法を使用して、食道癌の初代細胞を培養して拡大させることができると述べられており（非特許文献３）、続いて、食道癌の術中試料をトリプシンにより消化し、条件付きリプログラミング方法により培養したことが文献において報告されている（非特許文献４）。最近では、追加の因子を含む市販の培養培地ＫＳＦＭを使用する培養方法（非特許文献５）、及びオルガノイド技術を使用する培養方法（非特許文献６）が文献により報告されている。
しかしながら、非特許文献２の上記方法は、長期間の安定的な培養には使用することができず、非特許文献３及び非特許文献４の培養期間は比較的長く、非特許文献５の方法はより高いコストを必要とし、非特許文献６におけるオルガノイド培養に使用される試薬は非常に高価であり、培養過程での操作が複雑であり、これは大規模な応用には好ましくない。
さらに、外国における食道癌の病理タイプは主に食道腺癌であり、外国文献において報告されている方法は基本的に食道腺癌に基づいているため、これらの方法は、食道扁平上皮癌の培養には適していない。したがって、食道扁平上皮癌の初代細胞を培養するのに適した培養培地及び培養方法を開発する必要がある。
Freddie Bray, BSc, MSc, PhD; Jacques Ferlay, ME, et al. Global Cancer Statistics 2018. CA CANCER J CLIN 2018; 68:394-424 Karin J. Purdie, Celine Pourreyron, and Andrew P. South. Isolation and Culture of Squamous Cell Carcinoma lines. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 731, 2011, 151-159 Xuefeng Liu, Ewa Krawczyk, et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols, VOl.12 NO.2, 2017, 439-451 Todd J. Jensen, Christopher Foster, et al. Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation. Journal of Visualized Experiments, March 2017, 121, e55243 Yuta Kasagi,et al. The Esophageal Organoid System Reveals Functional Interplay Between Notch and Cytokines in Reactive Epithelial Changes. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology Vol. 5, No. 3, 2018, 333-352 Xiaodun Li, Hayley E. Francies, et al. Organoid cultures recapitulate esophageal adenocarcinoma heterogeneity providing a model for clonality studies and precision therapeutics. NATURE COMMUNICATIONS (2018) 9:2983-2995
従来技術における上記の問題を解決するために、本発明は、食道扁平上皮癌の初代細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで迅速に拡大させる培養培地及び培養方法を提供する。
本発明の一態様は、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地であって、初期培養培地と、以下の成分（１）～成分（６）と、任意に以下の成分（７）～成分（９）とを含み、ここで、初期培養培地が、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、又はＲＰＭＩ－１６４０、好ましくはＤＭＥＭ／Ｆ１２であり得る、培養培地を提供することである。
（１）Ｙ２７６３２、ヒドロキシファスジル、及びＧＳＫ４２９２８６Ａの１つ以上から選択され、Ｙ２７６３２の場合に、２．５μＭ～４０μＭ、好ましくは５μＭ～２０μＭの範囲内、より好ましくは１０μＭの濃度を有し、ヒドロキシファスジルの場合に、２μＭ～３２μＭ、好ましくは４μＭ～１６μＭの範囲内、より好ましくは８μＭの濃度を有し、ＧＳＫ４２９２８６Ａの場合に、２μＭ～３２μＭ、好ましくは４μＭ～１６μＭの範囲内、より好ましくは８μＭの濃度を有するＲｈｏキナーゼ阻害剤、
（２）ストレプトマイシン／ペニシリン、アムホテリシンＢ、及びプリモシンの１つ以上から選択され、ストレプトマイシン／ペニシリンの場合に、ストレプトマイシンは２５μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬ、好ましくは５０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは２００μｇ／ｍＬの濃度を有し、ペニシリンは２５Ｕ／ｍＬ～４００Ｕ／ｍＬ、好ましくは５０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬの範囲内、より好ましくは２００Ｕ／ｍＬの濃度を有し、アムホテリシンＢの場合に、０．２５μｇ／ｍＬ～４μｇ／ｍＬ、好ましくは０．５μｇ／ｍＬ～２μｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは１μｇ／ｍＬの濃度を有し、プリモシンの場合に、２５ｍｇ／ｍＬ～４００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは１００ｍｇ／ｍＬの濃度を有する抗生物質であって、好ましくはプリモシンである、抗生物質、
（３）２．５μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬ、好ましくは１０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは２０μｇ／ｍＬの濃度を有するインスリン、
（４）培養培地に対して１：４００～１：２５、好ましくは１：１００～１：２５、より好ましくは１：５０の容量比を有するＮ２添加剤、
（５）２．５ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２．５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは５ｎｇ／ｍＬの濃度を有するインスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、
（６）グリシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、及びセリンの１つ以上から選択され、総濃度は５０μＭ～４００μＭ、好ましくは１００μＭ～４００μＭの範囲内、より好ましくは４００μＭである非必須アミノ酸、
（７）０μｇ／ｍＬ～１．６μｇ／ｍＬ、好ましくは０．２μｇ／ｍＬ～０．８μｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは０．４μｇ／ｍＬの濃度を有するヒドロコルチゾン、
（８）０ｍＭ～８ｍＭ、好ましくは１ｍＭ～４ｍＭの範囲内、より好ましくは２ｍＭの濃度を有するグルタミン、
（９）０μｇ／ｍＬ～５６μｇ／ｍＬ、好ましくは３．５μｇ／ｍＬ～１４μｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは７μｇ／ｍＬの濃度を有するウシ脳下垂体抽出物。
本発明の別の態様は、食道扁平上皮癌の初代細胞の培養方法であって、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地を使用して培養する、培養方法を提供することである。
上述の培養方法は、以下の工程を含む。
１．食道扁平上皮癌の初代細胞の分離
１．１ 組織洗浄溶液ですすいだ後に、内視鏡試料等の組織試料に組織消化溶液を加え、恒温振盪器（Zhichu InstrumentのＺＱＬＹ－１８０Ｎ）中に入れて、消化させる。例えば、８ｍｌ～１４ｍｌ、好ましくは１２ｍｌの組織消化酵素が消化に使用され、消化温度は４℃～３７℃の範囲であり、好ましくは３７℃であり、消化用の回転速度は２００ｒｐｍ～３５０ｒｐｍの範囲であり、好ましくは３００ｒｐｍである。
１．２ 消化後に、得られたものを取り出して観察する。明らかな組織ブロックが見られなければ、消化を終了することができ、それ以外の場合は、消化が十分になるまで消化を継続する。消化時間は４時間～８時間の範囲であり、好ましくは６時間である。
１．３ 消化後に、得られたものを取り出して、遠心分離し、上清を廃棄した後に、血清を含む初期培養培地を加えて再懸濁し、消化を停止する。遠心分離用の回転速度は１２００ｇ～１６００ｇの範囲であり、好ましくは１５００ｒｐｍであり、遠心分離時間は２分～５分の範囲であり、好ましくは３分であり、血清を含む培養培地は、例えば、５％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２であり得る。
２．本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地を使用する培養
上記工程１において得られた食道扁平上皮癌の初代細胞を、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地で再懸濁して、計数し、５×１０４個／ｃｍ２～１０×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で培養ディッシュに播種し、同時に、栄養膜細胞を２×１０４個／ｃｍ２～３×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で培養ディッシュに加え、５日間～７日間培養した後に、栄養膜細胞を０．５×１０４個／ｃｍ２～１×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で添加補充し、細胞が培養ディッシュの８５％を覆うように成長したら、細胞を消化して、継代する。
具体的には、工程１において記載された組織洗浄溶液の配合物は、１００ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬのプリモシンと、２％のペニシリン／ストレプトマイシンの二重抗体溶液とを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培養培地である。工程１において記載される組織消化溶液の調製方法は、１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＩ、１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ、５０Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬのデオキシリボ核酸Ｉ、０．５ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼ、１ｍＭ～３ｍＭの塩化カルシウム、１％～２％のウシ血清アルブミンを、１：１の容量比を有するＨＢＳＳ及びＲＰＭＩ－１６４０中に溶解することを含む。工程２において記載される栄養膜細胞は、例えば、照射されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞であり、照射源は、３０Ｇｙ～５０Ｇｙ、好ましくは３５Ｇｙの照射線量を有するＸ線又はγ線、好ましくはγ線である。
本発明によれば、食道扁平上皮癌の初代細胞用の改良された培養培地を使用することにより、食道扁平上皮癌の組織試料を短時間で迅速に拡大させ、十分な数の細胞を有効な時間で増幅して取得することができることから、これをｉｎ ｖｉｔｒｏでのハイスループットな薬物感受性試験及び正確な臨床的薬物療法の指導に使用することができる。
オルガノイド培養培地と比較して、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地は、ｗｎｔ３ａ、ＲＳＰＯ１、及びノギン等の高価な因子を加える必要がないことから、培養のコストが大幅に削減される。さらに、オルガノイド培養においては、オルガノイドの消化過程が複雑であるのに対して、本発明の培養方法は、単純な処理法を伴い、実験の要件を満たし得る多数の単層細胞を迅速に取得することができる。従来の条件付きリプログラミング技術において使用される培養培地と比較して、本発明においては増幅させて同量の細胞を取得する期間がより短く、本発明はまた、少数の試料の場合にも大きな増殖促進効果を有する。本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地及び培養方法は、食道扁平上皮癌の組織試料のｉｎ ｖｉｔｒｏでの持続的な拡大の成功率を、平均８５％超で大幅に改善することができる。
食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中の因子を増やした効果を示す図である。 食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中での多数の因子の組合せの効果を示す図である。 食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地への他の因子の添加の効果を示す図である。 図４Ａおよび４Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した食道扁平上皮癌の初代細胞を顕微鏡で観察することにより得られた写真（明視野）である。 図５Ａおよび５Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した食道扁平上皮癌細胞のライトギムザ染色による識別結果である。 図６Ａおよび６Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した食道扁平上皮癌細胞の免疫蛍光染色による識別結果である。 本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地を使用した食道扁平上皮癌の初代細胞の最初の拡大期及び細胞数の統計の結果を示す図である。 本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地を使用した食道扁平上皮癌の初代細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの拡大曲線である。 図９Ａ－９Ｐは、食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中の様々な濃度における様々な因子の効果を示す図である。 図９Ａ－９Ｐは、食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中の様々な濃度における様々な因子の効果を示す図である。 図９Ａ－９Ｐは、食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中の様々な濃度における様々な因子の効果を示す図である。 細胞の増殖に対する、本培養培地と文献において報告される培地及び市販の培地ＫＳＦＭとの効果の比較結果を示す図である。 図１１Ａ－１１Ｄは、本発明の培養培地により培養した様々な世代の食道扁平上皮癌細胞を使用した薬物スクリーニングの結果を示す図である。 図１１Ａ－１１Ｄは、本発明の培養培地により培養した様々な世代の食道扁平上皮癌細胞を使用した薬物スクリーニングの結果を示す図である。
本発明を、特定の実施形態の記載と図面とを組み合わせることにより以下で更に説明する。これらの実施形態は、本発明を例示するのに使用されるにすぎず、本発明の範囲はこれらの実施形態に限定されない。
実施例１．様々な成分を含む食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地の細胞増殖促進効果
（１）様々な成分を含む培養培地の調製
表１中の成分に従って、様々な成分を含む培養培地を調製して、食道扁平上皮癌細胞に対する増殖促進効果を調査する。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Corning）に、１０μＭのＹ２７６３２（MCE）及び１００ｍｇ／ｍＬのプリモシンを加えて基礎培養培地（以下、ＢＭと呼称することがある）とし、この基礎培養培地に様々な因子を加えた。番号１の培地は、インスリン（Gibco）をＢＭに加えることによって得られ、番号２の培地は、ヒドロコルチゾン（Sigma）を番号１の培地に加えることによって得られ、番号３の培地は、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Gibco）を番号２の培地に加えることによって得られ、番号４の培地は、グルタミン（Gibco）を番号３の培地に加えることによって得られ、番号５の培地は、ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ、M&C Gene Technology）を番号４の培地に加えることによって得られ、番号６の培地は、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１、Sino Biological）を番号５の培地に加えることによって得られ、番号７の培地（以下、ＥＭと呼称することがある）は、Ｎ２添加剤（Gibco）を番号６の培地に加えることによって得られ、番号８の培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Gibco）を番号７の培地に加えることによって得られる。
Figure 0007454290000001
（２）食道扁平上皮癌の初代細胞の取得及び培養
１．調製法
１５ｍＬの滅菌遠心チューブ、ピペット、１０ｍｌのトランスファーピペット、滅菌ガンヘッド等の表面を滅菌し、ウルトラクリーンワークベンチに入れて、３０分間紫外線を照射した。表１に従って調製された培養培地、表２に従って調製された組織消化溶液、及び表３に従って調製された組織洗浄溶液を、３０分前に４℃の冷蔵庫から取り出し、室温と等しくした。
Figure 0007454290000002
Figure 0007454290000003
２．食道扁平上皮癌の初代細胞の分離
２．１．食道癌の内視鏡組織試料を、内視鏡検査の間に十分に説明し同意を得た５人の食道癌患者の組織試料、すなわち試料５０、試料５１、試料５２、試料５３、及び試料５４からそれぞれ取得した。ウルトラクリーンワークベンチ内で内視鏡組織を摘出し、１５ｍＬの遠心分離チューブに入れた後に、そこに５ｍＬの組織洗浄溶液を加え、得られたものを混合し、１回すすいだ。得られたものを１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。
２．２．上清を廃棄し、得られたものに基礎培養培地及び組織消化溶液の１：１の混合物を加えた（投入量は１０ｍｇの組織当たり約５ｍｌの組織消化溶液である）。試料に名前及び番号を記入し、密封フィルムで密封した後に、振盪器において３７℃及び３００ｒｐｍで消化した。消化が完了したかどうかを、１時間ごとに観察によって確かめる。
２．３．消化後に、未消化の組織ブロックを４０μＭのフィルタースクリーンを通して濾過した。フィルタースクリーン上の組織ブロックを、組織洗浄溶液ですすいだ。残留細胞を遠心分離チューブ中に洗い流し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。
２．４．上清を廃棄し、残りの細胞塊を観察して、そこに血球が含まれているかどうかを確かめた。血球が存在する場合は、３ｍＬの血球溶解液（blood cell lysate）（Sigma）を加えた後に、それを十分に混合し、５分ごとに十分に振盪及び混合しながら４℃で１５分間溶解した。溶解後に、得られたものを取り出し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。
２．５．上清を廃棄し、得られたものに２ｍＬの基礎培養培地を加えて、細胞を再懸濁して保存した。
３．食道扁平上皮癌の初代細胞の培養
３．１．顕微鏡観察：１０μＬの再懸濁した細胞を吸い出し、スライドガラス上に撒種し、癌細胞を顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で１０倍の対物レンズを用いて観察した。
３．２．生細胞計数：１０μＬの再懸濁した細胞懸濁液を１０μＬのトリパンブルー色素（Invitrogen）と十分に混合した後に、１０μＬの混合物をフローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）に加えて、細胞濃度、細胞粒子サイズ、及び細胞生存率を取得した。１０μｍを超える粒子サイズを有する細胞を選択して、計数した。
３．３．細胞培養：上記３．２において計数された各試料からの細胞懸濁液を、それぞれ９等分し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離し、続いてそれぞれ２００μＬのＢＭ及び番号１～番号８の培地を用いて再懸濁した。得られたものを４８ウェルプレートに１×１０４個／ｃｍ２の生細胞密度（１ウェル当たり１００００個の細胞）で接種した後に、プレートにγ線（照射線量３５Ｇｙ）により照射されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞を２×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で加えた。最後に、４８ウェルプレート中の各ウェルに対応する培養培地を５００μＬの容量まで補充し、得られたものを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを３７℃の５％のＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisher）に入れて、培養した。４８ウェルプレートの８５％超を覆うように成長した後に、細胞を継代した。
（３）培養の結果
培養の７日目に、４８ウェルプレートを取り出し、２００μＬの０．２５％のトリプシン（Gibco）で１分間すすいだ。吸引により液体を除去し、５００μＬの０．０５％のトリプシン（Gibco）を各ウェルに再び加えた。得られたものを３７℃の５％のＣＯ２インキュベーターに入れて、１０分間反応させ、顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、１ｍＬの基礎培養培地を加えて、再懸濁した。フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）を用いて計数することにより、総細胞数を得た。内視鏡組織試料５０から分離された食道扁平上皮癌の初代細胞から得られた結果を図１に示す。
図１において示される結果から、基礎培養培地と比較して、上記の番号１～番号７の培地の全てが、様々なレベルで食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖を促進し得ることを理解することができる。Ｙ２７６３２及びプリモシン、インスリン、ヒドロコルチゾン、非必須アミノ酸、グルタミン、ウシ脳下垂体抽出物、ＩＧＦ１、Ｎ２添加剤を含む培地（番号７の培地）を使用して食道扁平上皮癌の初代細胞を培養した場合に、増殖効果が大幅に向上した。さらに、５％のウシ胎児血清を番号７の培地に加えることによって得られた番号８の培地を食道扁平上皮癌の初代細胞の培養に使用した場合に、５％のウシ胎児血清の添加を伴わない番号７の培地と比較して、増殖効果は大きく向上しない。したがって、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地は、ウシ胎児血清を添加せずに使用され得ると結論付けることができる。
実施例２．食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中での多数の因子の組合せの効果
実施例１の基礎培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋１０μＭのＹ２７６３２＋１００ｍｇ／ｍＬのプリモシン）に、１：５０の比率のＮ２添加剤、２０μｇ／ｍＬのインスリン、７μｇ／ｍＬのウシ脳下垂体抽出物、２ｍＭのグルタミン、４００μＭの非必須アミノ酸、０．４μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、５ｎｇ／ｍＬのインスリン様成長因子１をそれぞれ別々に加えて、この実施例の培養培地を調製した。
実施例１と同じ方法に従って、内視鏡組織試料５７、試料５８、試料５９、試料６０、及び試料６１を分離して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得し、取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、この実施例において調製されたそれぞれの培養培地、並びにＢＭ培地及び実施例１の番号７の培地（ＥＭ）を使用することによって培養した。得られたものを４８ウェルプレートに１×１０４個／ｃｍ２の生細胞密度（１ウェル当たり１００００個の細胞）で接種した後に、プレートにγ線（照射線量３５Ｇｙ）により照射されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞を２×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で加え、次にこれを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを３７℃の５％のＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisher）に入れて、培養した。培養の７日目に、４８ウェルプレートを取り出し、２００μＬの０．２５％のトリプシン（Gibco）で１分間すすいだ。吸引により液体を除去し、５００μＬの０．０５％のトリプシン（Gibco）を各ウェルに再び加えた。得られたものを３７℃の５％のＣＯ２インキュベーターに入れて、１０分間反応させ、顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、１ｍＬの基礎培養培地を加えて、再懸濁した。フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）を用いて計数することにより、総細胞数を得た。食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地中での２つの因子の組合せの効果を評価した。内視鏡組織試料５７から分離された食道扁平上皮癌の初代細胞から得られた結果を図２に示す。
図２において示されるように、Ｎ２添加剤、インスリン、ウシ脳下垂体抽出物、グルタミン、非必須アミノ酸、ヒドロコルチゾン、インスリン様成長因子１から選択される因子を更に基礎培養培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地＋１０μＭのＹ２７６３２＋１００ｍｇ／ｍＬのプリモシン）に加えた場合に、細胞増殖効率は、基礎培養培地より優れていたが、実施例１における番号７の培地（ＥＭ）ほど優れていなかった。
実施例３．食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地への他の因子の添加の効果
実施例１の番号７の培地（ＥＭ）に、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）、１０ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ７）、又は１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ１０、及び１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ７の組合せをそれぞれ別々に加えて、この実施例の培地を調製した。
実施例１と同じ方法に従って、内視鏡組織試料６２及び試料６３を分離して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得し、取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、この実施例において調製されたそれぞれの培養培地、及び実施例１の番号７の培地（ＥＭ）を使用することによって培養した。得られたものを４８ウェルプレートに１×１０４個／ｃｍ２の細胞密度（１ウェル当たり１００００個の細胞）で接種した後に、プレートにγ線（照射線量３５Ｇｙ）により照射されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞を２×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で加え、次にこれを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを３７℃の５％のＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisher）に入れて、培養した。培養の７日目に、４８ウェルプレートを取り出し、２００μＬの０．２５％のトリプシン（Gibco）で１分間すすいだ。吸引により液体を除去し、５００μＬの０．０５％のトリプシン（Gibco）を各ウェルに再び加えた。得られたものを３７℃の５％のＣＯ２インキュベーターに入れて、１０分間反応させ、顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、１ｍＬの番号７の培地（ＥＭ）を加えて、再懸濁した。フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）を用いて計数することにより、総細胞数を得た。食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖に対する、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地への他の因子の添加の効果を評価した。内視鏡組織試料６２から分離された食道扁平上皮癌の初代細胞から得られた結果を図３に示す。
図３において、縦軸における比率は、ＥＭ培地及び追加の様々な因子（複数の場合もある）を含む培養培地を用いて７日間培養することにより得られた細胞数と、ＥＭ培地を用いて７日間培養することにより得られた細胞数との比率を表す。比率が１より大きければ、ＥＭ培地への様々な因子（複数の場合もある）の添加が、増殖の促進についてより優れた効果をもたらすことを示している。比率が１より小さければ、様々な因子（複数の場合もある）の添加が、ＥＭ培地よりも好ましい効果を生じないことを示している。
図３において示されるように、実施例１の番号７の培地（ＥＭ）にＦＧＦ２又はＦＧＦ１０を更に加えることにより得られた培地を使用して培養した場合に、ＥＭ培地と比較して大きな増殖促進効果は見られない。実施例１の番号７の培地（ＥＭ）にＦＧＦ７を更に加えることにより得られた培地を使用して培養した場合に、食道扁平上皮癌の初代細胞の増殖は、ＥＭ培地と比較してそれどころか阻害された。
実施例４．食道扁平上皮癌の初代細胞の培養及び識別
実施例１と同じ方法に従って、内視鏡組織試料６４を分離して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得し、取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、実施例１の番号７の培地（ＥＭ）を使用することによって培養した。得られたものを１２ウェルプレートに１×１０４個／ｃｍ２の生細胞密度（１ウェル当たり４５０００個の細胞）で接種した後に、プレートにγ線（照射線量３５Ｇｙ）により照射されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞を２×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で加え、次にこれを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを３７℃の５％のＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisher）に入れて、培養した。
１２日目に、培養した食道扁平上皮癌細胞を顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で観察した。図４Ａ及び図４Ｂは、それぞれ４倍及び１０倍の対物レンズの下で撮影された写真である。顕微鏡下で見ると、細胞は緊密に配列しており、形態は少しばかり不規則である。
次に、培養した細胞を、２００μＬの０．２５％のトリプシン（Gibco）で１分間すすいだ。吸引により液体を除去し、５００μＬの０．０５％のトリプシン（Gibco）を各ウェルに再び加えた。得られたものを３７℃の５％のＣＯ２インキュベーターに入れて、１０分間反応させ、顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、５００μＬの番号７の培地（ＥＭ）を加えて、再懸濁した。培養した食道扁平上皮癌細胞を識別した。
１００μＬの上記食道扁平上皮癌細胞懸濁液をスライドガラス上に塗布し、ライトギムザ染色によって識別した。染色法を以下に記載する。
（１）細胞懸濁液の塗抹標本を空気乾燥させた後に、そこに１滴のライトギムザＡ溶液（Baso）を滴下し、続いて３滴のライトギムザＢ溶液（Baso）を滴下し、十分に混合して、３分間染色した。
（２）沈渣が標本に堆積するのを防ぐために、注ぎ出すのではなく水ですすぐことにより色素溶液を除去すべきであることに注意して、塗抹標本を流水ですすいだ。
（３）塗抹標本を乾燥させた後に、顕微鏡（OlympusのＣＸ４１）下で観察し、写真を撮影した。
図５Ａ及び図５Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した食道扁平上皮癌細胞のライトギムザ染色による識別結果を示しており、これらは、それぞれ１０倍の対物レンズの下で異なる視野において撮影された写真である。核は大きくて、濃く染色されており、これらは扁平上皮癌細胞の特徴と合致している。
試料から培養された食道扁平上皮癌細胞を免疫蛍光で染色した。染色法を以下に記載する。
（１）接着
培養した食道扁平上皮癌細胞を細胞スライド（cell slides）（Thermo Fisher）上に播種し、細胞が壁に接着するまで３７℃の５％のＣＯ２インキュベーターにおいて培養した。
（２）固定
（ｉ）ＰＢＳ（Shanghai Sangon Biotech）を使用して、４％のホルムアルデヒド（Sigma）を調製し、次にこれを４℃の冷蔵庫において貯蔵して、使用した。
（ｉｉ）細胞が壁に接着した後に、培養溶液を廃棄し、細胞を氷上で４％のホルムアルデヒドを用いて３０分間固定した。得られたものをＰＢＳ（Shanghai Sangon Biotech）により５分間で３回洗浄した。
（３）透明化（遮光）
（ｉ）透明化溶液の調製：ＰＢＳ＋０．３％のＨ２Ｏ２（Shanghai Sangon Biotech）＋０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Shanghai Sangon Biotech）。
（ｉｉ）透明化：ＰＢＳを廃棄した後に、透明化溶液を加えた。得られたものを露光せずに振盪（約１００ｒｐｍ）して、３０分間透明化し、ＰＢＳにより５分間で３回洗浄した。
（４）ブロッキング
ブロッキングのために、ＰＢＳ＋０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使用して、５％のＢＳＡ（Shanghai Sangon Biotech）を調製し、ブロッキングを３７℃で３０分間行った。
（５）一次抗体のインキュベーション
（ｉ）ＰＢＳ＋０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を調製して、抗体を希釈し、ここで、扁平上皮癌特異抗体ｐ６３（CST）を１：５０の比率で希釈した。ブロッキング溶液を廃棄し、調製した一次抗体希釈物を加えた。得られたものを４℃の冷蔵庫において一晩インキュベートした。
（ｉｉ）得られたものを４℃で取り出し、室温と等しくして、３７℃で１時間インキュベーションを続けた後に、ＰＢＳにより５分間で３回洗浄した。
（６）二次抗体（遮光）
ＰＢＳ＋０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を二次抗体希釈用に調製し、ここで、４８８の励起光を有するウサギ蛍光二次抗体（Thermo Fisher）を１：１０００の比率で希釈した。得られたものを、室温で暗所にて１時間インキュベートした後に、ＰＢＳにより５分間で３回洗浄した。
（７）ＤＡＰＩ染色（遮光）
ＤＡＰＩ（Sigma）のＰＢＳ中での１：１０００希釈液を使用して、室温で暗所にて５分間染色した。得られたものをＰＢＳにより５分間で３回洗浄した。顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で写真を撮影して、記録した。
図６Ａ及び図６Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した食道扁平上皮癌細胞の免疫蛍光染色による識別結果であり、これらは、それぞれ１０倍の対物レンズの下で異なる視野において撮影された蛍光写真である。図に示されるように、視野内の細胞は全て４８８の励起光の下で緑色を呈していることから、培養した細胞が扁平上皮癌細胞であることを示しており、これらは臨床病理診断と合致する。
実施例６．食道扁平上皮癌の最初の培養期間及び細胞数の統計並びに集団倍加（ＰＤ）値の計算
実施例１と同じ方法に従って、食道癌の内視鏡組織試料（試料１～試料４０）を消化して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得した。取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、実施例１における番号７の培地を使用することにより培養した。細胞を１×１０４個／ｃｍ２の生細胞密度で１２ウェルプレートに接種して、培養した。プレートの８５％を覆うように拡大させた後に、細胞を消化して、計数した。同時に、消化までの培養日数を１培養期間として見なして、それらを記録した。図７において示されるように、４０個の試料の平均培養期間は１０日間であり、拡大させた細胞の平均数は７０００００個であった。
この実験条件下で、合計９個の試料、すなわち、試料２、試料５、試料６、試料８、試料９、試料１１、試料２７、試料３９、及び試料４０を連続的に培養した。拡大させた細胞を、様々な継代において増幅させた。消化後に各継代物を計数し、対応する培養期間を記録した。ＰＤ値を、集団倍加（ＰＤ）＝３．３２×ｌｏｇ１０（消化後の総細胞数／接種された細胞の初期数）の式に従って計算した。図８において示されるように、そこでは、横軸は細胞培養の日数を表し、縦軸は累積細胞増殖の倍数、すなわち培養期間における細胞拡大の倍数を表す。その値が大きいほど、或る特定の期間内に細胞が拡大する倍数が大きく、つまり、より多くの細胞が拡大される。傾きは、細胞拡大の速度を表す。
図８からは、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地を使用することによって上記９個の試料を培養した場合に、５６日間の増幅後も細胞拡大速度は実質的に変化せず、連続的に拡大する能力が依然として達成されたことが分かる。
実施例７．食道扁平上皮癌細胞の増殖に対する添加された因子の濃度の効果
実施例１と同じ方法に従って、内視鏡組織試料６５、試料６６、試料６７、試料６８、及び試料６９を分離して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得し、取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、実施例１の番号７の培地を使用することによって培養した。得られたものを１２ウェルプレートに１×１０４個／ｃｍ２の生細胞密度（１ウェル当たり４５０００個の細胞）で接種した後に、プレートにγ線（照射線量３５Ｇｙ）により照射されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞を２×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で加え、次にこれを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを３７℃の５％のＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisher）に入れて、培養した。細胞がプレートの８５％を覆うように拡大したら、１２ウェルプレートを取り出し、２００μＬの０．２５％のトリプシン（Gibco）で１分間すすいだ。吸引により液体を除去し、５００μＬの０．０５％のトリプシン（Gibco）を各ウェルに再び加えた。得られたものを３７℃の５％のＣＯ２インキュベーターに入れて、１０分間反応させ、顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、１ｍＬの基礎培養培地を加えて、再懸濁した。フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）を用いて計数することにより、総細胞数を得た。取得された細胞を以下の培養実験に使用した。
次に、様々な配合を有する以下の８種の培地を実験用に調製した：
配合物１：Ｎ２添加剤を含まない実施例１の番号７の培地、
配合物２：非必須アミノ酸を含まない実施例１の番号７の培地、
配合物３：グルタミンを含まない実施例１の番号７の培地、
配合物４：インスリンを含まない実施例１の番号７の培地、
配合物５：ＩＧＦ１を含まない実施例１の番号７の培地、
配合物６：ウシ脳下垂体抽出物を含まない実施例１の番号７の培地、
配合物７：Ｙ２７６３２を含まない実施例１の番号７の培地、
配合物８：ヒドロコルチゾンを含まない実施例１の番号７の培地。
消化した細胞懸濁液を、上記の配合物１～配合物８及び実施例１における番号７の培地でそれぞれ希釈し、１ウェル当たり２００００個の細胞及び５００μＬの容量で２４ウェルプレートに播種した。
配合物１の培地を使用した場合に、それぞれ１：４００、１：２００、１：１００、１：５０、及び１：２５の最終濃度を有する５つの濃度勾配のＮ２添加剤を調製し、調製されたＮ２添加剤を、初代細胞が接種された２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬでそれぞれ加え、配合物１の培地をコントロール穴（ＢＣ）として使用した。
配合物２の培地を使用した場合に、それぞれ４００μＭ、２００μＭ、１００μＭ、５０μＭ、２５μＭの最終濃度を有する５つの濃度勾配の非必須アミノ酸を調製し、調製された非必須アミノ酸を、初代細胞が接種された２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬでそれぞれ加え、配合物２の培地をコントロール穴（ＢＣ）として使用した。
配合物３の培地を使用した場合に、それぞれ８ｍＭ、４ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭの最終濃度を有する５つの濃度勾配のグルタミンを調製し、調製されたグルタミンを、初代細胞が接種された２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬでそれぞれ加え、配合物３の培地をコントロール穴（ＢＣ）として使用した。
配合物４の培地を使用した場合に、それぞれ４０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬの最終濃度を有する５つの濃度勾配のインスリンを調製し、調製されたインスリンを、初代細胞が接種された２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬでそれぞれ加え、配合物４の培地をコントロール穴（ＢＣ）として使用した。
配合物５の培地を使用した場合に、それぞれ４０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬの最終濃度を有する５つの濃度勾配のインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を調製し、調製されたインスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）を、初代細胞が接種された２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬでそれぞれ加え、配合物５の培地をコントロール穴（ＢＣ）として使用した。
配合物６の培地を使用した場合に、それぞれ５６μｇ／ｍＬ、２８μｇ／ｍＬ、１４μｇ／ｍＬ、７μｇ／ｍＬ、３．５μｇ／ｍＬの最終濃度を有する５つの濃度勾配のウシ脳下垂体抽出物を調製し、調製されたウシ脳下垂体抽出物を、初代細胞が接種された２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬでそれぞれ加え、配合物６の培地をコントロール穴（ＢＣ）として使用した。
配合物７の培地を使用した場合に、それぞれ４０μＭ、２０μＭ、１０μＭ、５μＭ、２．５μＭの最終濃度を有する５つの濃度勾配のＹ２７６３２を調製し、調製されたＹ２７６３２を、初代細胞が接種された２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬでそれぞれ加え、配合物７の培地をコントロール穴（ＢＣ）として使用した。
配合物８の培地を使用した場合に、それぞれ１．６μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬの最終濃度を有する５つの濃度勾配のヒドロコルチゾンを調製し、調製されたヒドロコルチゾンを、初代細胞が接種された２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬでそれぞれ加え、配合物８の培地をコントロール穴（ＢＣ）として使用した。
さらに、５つの濃度勾配を有する８種の小分子化合物（ＬＤＮ１９３１８９、ＩＷＰ２、Ａ８３－０１、フォルスコリン、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＤＭＨ－１、ＤＡＰＴ；全てはMCEから購入した）を実施例の番号７の培地中で調製して、それぞれ１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの最終濃度を得て、調製された８種の小分子化合物（ＬＤＮ１９３１８９、ＩＷＰ２、Ａ８３－０１、フォルスコリン、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＤＭＨ－１、ＤＡＰＴ）を、初代細胞が接種された２４ウェルプレートに１ウェル当たり５００μＬでそれぞれ加え、番号７の培地をそれぞれコントロール穴（ＢＣ）として使用した。
同時に、１００００個の照射されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞を、栄養膜細胞として上記の穴のそれぞれに加えた。
細胞を２４ウェルの約８５％まで拡大させた後に、細胞を消化して、計数し、コントロールウェル（ＢＣ）中の細胞数を参照することにより比率を計算し、結果を図９Ａ～図９Ｐに示した。図９Ａ～図９Ｐのそれぞれにおいて、この比率は、各培養培地を使用することによって培養された１代継代の細胞数と、対応するコントロール穴によって培養された１代継代の細胞数との比率を表す。その比率が１より大きければ、様々な濃度の因子又は小分子化合物を含む調製された培地の増殖促進効果が、コントロールウェルの培地の増殖促進効果よりも好ましいことを示し、その比率が１未満であれば、様々な濃度の因子又は小分子化合物を含む調製された培地の増殖促進効果が、コントロールウェルの培地の増殖促進効果よりも劣っていることを示している。
図９において示されるように、Ｎ２添加剤の濃度範囲は１：４００～１：２５であり、１：５０の比率で加えると細胞増殖効果が最も大きくなり、非必須アミノ酸の濃度範囲は２５μＭ～４００μＭであり、４００μＭの濃度で加えると細胞増殖効果が最も大きくなり、グルタミンの濃度範囲は０．５ｍＭ～８ｍＭであり、２ｍＭの濃度で加えると細胞増殖効果が最も大きくなり、インスリン様成長因子１の濃度範囲は２．５ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬであり、濃度が５ｎｇ／ｍＬである場合に細胞増殖効果が最も大きくなり、ウシ脳下垂体抽出物の濃度範囲は３．５μｇ／ｍＬ～５６μｇ／ｍＬであり、濃度が７μｇ／ｍＬである場合に細胞増殖効果が最も大きくなり、Ｙ２７６３２の濃度範囲は２．５μＭ～４０μＭであり、濃度が１０μＭである場合に細胞増殖効果が最も大きくなり、インスリンの濃度範囲は２．５ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬであり、濃度が２０ｎｇ／ｍＬである場合に細胞増殖効果が最も大きくなり、ヒドロコルチゾンの濃度範囲は０．１μｇ／ｍＬ～１．６μｇ／ｍＬであり、濃度が０．４μｇ／ｍＬである場合に細胞増殖効果が最も大きくなる。他の８種の小分子化合物（ＬＤＮ１９３１８９、ＩＷＰ２、Ａ８３－０１、フォルスコリン、ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＤＭＨ－１、ＤＡＰＴ）は、１０μＭ、３μＭ、１μＭ、０．３μＭ、０．１μＭの濃度勾配で大きな増殖促進効果を示さない。
実施例８．細胞増殖に対する本発明の培養培地及び従来技術の培地の効果の比較
非特許文献２のＫＭ（角化細胞用培地）培地を表４のように調製した。
Figure 0007454290000004
非特許文献３のＦＭ培地を表５のように調製した。
Figure 0007454290000005
ＫＳＦＭ培地をStemCellから購入した。
実施例１と同じ方法に従って、内視鏡組織試料７０、試料７１、及び試料７２を分離して、食道扁平上皮癌の初代細胞を取得し、これらをＥＭ培地、ＫＳＦＭ培地、ＦＭ培地、及びＫＭ培地を使用することによってそれぞれ培養した。
試料のうちの１つ（試料７０）を以下に記載する。取得された食道扁平上皮癌の初代細胞を、１ｍＬのＥＭ培地、ＫＳＦＭ培地、ＦＭ培地、及びＫＭ培地でそれぞれ再懸濁し、フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）を用いて計数した。
得られたものを２つの２４ウェルプレートに、１×１０４個／ｃｍ２の生細胞密度（１ウェル当たり２００００個の細胞）でそれぞれ接種し、ここで、一方の２４ウェルプレートを、γ線により照射されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞を加えずに培養し、もう一方の２４ウェルプレートにはγ線（照射線量３５Ｇｙ）により照射されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞を２×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で加えた後に、これを十分に混合した。表面消毒後に、プレートを３７℃の５％のＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisher）に入れて、培養した。培養の５日目に、２４ウェルプレートを取り出し、２００μＬの０．２５％のトリプシン（Gibco）で１分間すすいだ。吸引により液体を除去し、５００μＬの０．０５％のトリプシン（Gibco）を各ウェルに再び加えた。得られたものを３７℃の５％のＣＯ２インキュベーターに入れて、１０分間反応させ、顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）下で細胞が完全に消化されたことが観察され得るまで消化を停止することができる。１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後に、上清を廃棄し、１ｍＬの基礎培養培地を加えて、再懸濁した。フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）を用いて計数することにより、様々な培地により培養された総細胞数を得た。結果を図１０に示す。
図１０からは、ＫＭ培地、ＦＭ培地、及びＫＳＦＭ培地と比較して、同じ細胞数（２００００個／ウェル）で接種し、同じ時間にわたって培養する条件下で、ＥＭ培地が最も多くの拡大した細胞を得ることができるため、食道扁平上皮癌細胞の増殖の促進に対して大きな効果を有することが分かる。さらに、図１０からは、栄養芽層細胞を使用した培養におけるＥＭ培地の効果は、栄養芽層細胞の不存在下での効果よりも優れていることも分かる。このように、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地は、栄養芽層細胞を用いて培養した場合に、食道扁平上皮癌細胞の増殖促進に対して大きな効果を有し、培養期間を短縮することができる。
実施例９．本発明の培養培地から拡大させることによって得られた食道扁平上皮癌の初代細胞の薬物スクリーニングにおける使用
１．細胞の培養及び撒種
実施例１と同じ方法に従って、食道扁平上皮癌の初代細胞を食道扁平上皮癌の内視鏡試料から分離し、実施例１の番号７の培地を用いて培養した。細胞をプレートの８５％を覆うように拡大させた後に、これらの細胞を１継代物として消化した。培養した細胞の１代継代物、３代継代物、５代継代物、７代継代物、及び９代継代物を薬物スクリーニングのために選択した。
これらの細胞を実施例１における工程に従って消化し、計数し、ローディングスロット（Corning）中で４×１０４個の細胞／ｃｍ２の生細胞密度にて実施例１の番号７の培地と十分に混合した後に、３８４ウェルの乳白色の細胞培養プレート（Corning）において培養した。各ウェルの容量は５０μＬであり、細胞数は２０００個／ウェルであった。プレートの端から実施例１の番号７の培地を加えてプレートを密封し、試料名及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Promega）の試験時間をプレートに記入した。７５％のアルコール（LIRCON）で表面を消毒し、得られたものを３７℃の５％のＣＯ２インキュベーターにおいて培養した。薬物を２４時間後に加えた。
２．候補薬物の調製
７つの濃度勾配における３種の薬物（ボルテゾミブ、マイトマイシン、及びヒドロキシカンプトテシン、全てはMCEから購入した）を以下の表に従って調製し、これらを３８４ウェルプレート（Thermo Fisher）の各ウェルに５０μＬの容量でそれぞれ加え、－２０℃で貯蔵して、使用した。
Figure 0007454290000006
７つの濃度勾配におけるエルロチニブ（MCE）を以下の表に従って調製し、これらを３８４ウェルプレート（Thermo Fisher）の各ウェルに５０μＬの容量でそれぞれ加え、－２０℃で貯蔵して使用した。
Figure 0007454290000007
３．ハイスループットな薬物添加
調製された薬物プレートを取り出し、室温で静置した。完全に融解した後に、プレートを遠心分離機（Ｓｉｇｍａ ３－１８Ｋ）に入れ、１０００ｒｐｍで室温にて１分間遠心分離した。ハイスループットな自動ワークステーション（ＪＡＮＵＳ、Perkin Elmer）をハイスループットな投入に使用した。培養した食道扁平上皮癌細胞を含む３８４ウェルプレートの各ウェルに、対応する濃度の０．１μＬの候補薬物を加えた。投入後に、３８４ウェルプレートの表面を消毒し、インキュベーターに移して、更に培養した。７２時間後に細胞生存率を測定した。
４．細胞生存率の測定
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光試薬（Promega）を４℃の冷蔵庫から取り出し、１０ｍＬの試薬をローディングスロット中に加え、試験用の３８４ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、１０μＬのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光試薬を各ウェルに加えた。１０分間静置した後に、試験を、多機能マイクロプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Perkin Elmer）を使用することにより行った。
５．データ処理
細胞生存率（％）＝薬物ウェルの化学発光値／コントロールウェルの化学発光値×１００％の式に従って、様々な薬物で処理された細胞の細胞生存率を計算し、グラフパッドプリズムソフトウェアを使用することによって、細胞に対する薬物の半阻害率（ＩＣ５０）を計算した。結果をそれぞれ図１１Ａ～図１１Ｄに示す。
図１１Ａ～図１１Ｄから、本発明の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地から培養された食道扁平上皮癌細胞を薬物スクリーニングに使用した場合に、様々な継代の培養された細胞に対する同じ薬物の阻害効果は実質的に同じままである（阻害曲線は実質的に一貫している）ことを確認することができる。
本発明は、食道扁平上皮癌の初代細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで迅速に拡大させる培養培地及び培養方法であって、食道扁平上皮癌の組織試料の迅速な拡大を短時間で実現し、十分な量の細胞を有効な時間において増幅することができることから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのハイスループットな薬物感受性試験及び正確な臨床的薬物療法の指導に使用することができる、培養培地及び培養方法を提供する。

Claims (5)

  1. 食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地であって、
    初期培養培地と、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、抗生物質、インスリン、Ｎ２添加剤、インスリン様成長因子１、非必須アミノ酸、ヒドロコルチゾン、グルタミン、及びウシ脳下垂体抽出物とを含み、
    前記初期培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、又はＲＰＭＩ－１６４０から選択され、
    前記Ｒｈｏキナーゼ阻害剤は、Ｙ２７６３２であって、２．５μＭ～４０μＭの範囲内の濃度を有し、
    前記抗生物質は、プリモシンであって、２５ｍｇ／ｍＬ～４００ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有し、
    前記インスリンは、２．５μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有し、
    前記Ｎ２添加剤は、前記培養培地に対して１：４００～１：２５の容量比を有し、
    前記インスリン様成長因子１は、２．５ｎｇ／ｍＬ～４０ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有し、
    前記非必須アミノ酸は、グリシン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、及びセリンの１つ以上から選択され、総濃度は５０μＭ～４００μＭの範囲内であり、
    前記ヒドロコルチゾンは、０．２μｇ／ｍＬ～１．６μｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有し、
    前記グルタミンは、１ｍＭ～８ｍＭの範囲内の濃度を有し、
    前記ウシ脳下垂体抽出物は、３．５μｇ／ｍＬ～５６μｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有することを特徴とする、食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地。
  2. 前記Ｙ２７６３２は、５μＭ～２０μＭの範囲内の濃度を有し、
    前記プリモシンは、５０ｍｇ／ｍＬ～２００ｍｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有し、
    前記インスリンは、１０μｇ／ｍＬ～４０μｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有し、
    前記Ｎ２添加剤は、前記培養培地に対して１：１００～１：２５の容量比を有し、
    前記インスリン様成長因子１は、２．５ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有し、
    前記非必須アミノ酸の総濃度は、１００μＭ～４００μＭの範囲内であり、
    前記ヒドロコルチゾンは、０．２μｇ／ｍＬ～０．８μｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有し、
    前記グルタミンは、１ｍＭ～４ｍＭの範囲内の濃度を有し、
    前記ウシ脳下垂体抽出物は、３．５μｇ／ｍＬ～１４μｇ／ｍＬの範囲内の濃度を有することを特徴とする、請求項１に記載の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地。
  3. 食道扁平上皮癌の初代細胞の培養方法であって、
    請求項１又は２に記載の食道扁平上皮癌の初代細胞用の培養培地を使用することによって、食道扁平上皮癌の初代細胞を培養することを特徴とする、培養方法。
  4. 培養過程において、照射されたＮＩＨ－３Ｔ３細胞を２×１０４個／ｃｍ２～３×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で加えることを特徴とし、照射源は、３０Ｇｙ～５０Ｇｙの照射線量を有するＸ線又はγ線である、請求項３に記載の培養方法。
  5. 食道扁平上皮癌用の薬物をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
    （１）請求項３又は４に記載の食道扁平上皮癌の初代細胞の培養方法を使用することによって、薬物スクリーニング用の食道扁平上皮癌の初代細胞を培養する工程と、
    （２）試験される薬物を選択し、必要とされる濃度勾配に基づいて前記薬物を希釈する工程と、
    （３）工程（１）において培養して取得された前記細胞に希釈された前記薬物を加える工程と、
    （４）細胞生存率を測定する工程と、
    を含むことを特徴とする、方法。
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