CN111454886A - 一种增强型心肌细胞培养液及其应用 - Google Patents

一种增强型心肌细胞培养液及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强型心肌细胞培养液，属于生物医药技术领域。该培养液的组分包括KOSR、hGH、EGF、AFGF、KGF、T3、L‑肉碱、AA2P、Glutamax、NEAA、rH‑insulin、RPMI‑1640。本发明的培养液不含动物血清，成分明确，更加安全，避免引入外源因子污染风险；本发明的培养液培养的细胞具有更好的生长活力和抗凋亡能力，可保证心肌细胞的活力保持的更长久。

Description

一种增强型心肌细胞培养液及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种增强型心肌细胞培养液及其应用。
背景技术
心血管疾病是当今社会的主要健康问题和死亡的主要原因。心肌细胞无法再生或再生能力有限，当心血管疾病发生时，心肌细胞坏死，坏死的心肌细胞由纤维疤痕组织取代，幸存的心肌细胞使心肌发生重构现象，从而导致心力衰竭。因此，心力衰竭是很多心血管疾病的末期表现，例如，缺血性心脏病，风湿性心脏病。心力衰竭是在老年人中非常流行的慢性病，且它的患病率和发病率正逐年上涨。全球接近2千6百万人次正在遭受心力衰竭的痛苦，5年内的存活率少于53％。每年全球因慢性心力衰竭治疗而造成的经济负担超过1080亿美元。
传统的治疗方法能在一定程度上改善心力衰竭症状，但并不能彻底地治愈。心肌组织工程的发展，为解决这一难题开辟了一个新领域。
诱导多能干细胞分化而来的心肌细胞(iPSC-CM)，是心肌组织工程理想的种子细胞。它可来源于自体，免于免疫排斥和外源因子的感染；取材方便，外周血即可实现，不因取样而造成机体损伤。如何保持iPSC-CM在体外3D培养过程中的活性是心肌组织工程能否成功的关键。培养心肌细胞的培养基就是其中的重中之重。现有技术中，心肌细胞的3D培养过程中主要使用的培养基多含牛血清，马血清，这容易引入外源因子的感染，且血清成分不确定，对后续的应用会埋下隐患。而不使用血清的培养方案效果一般，仍未能达到理想效果，因此寻找一种成分确定，能长期维持iPSC-CM细胞活性的培养基非常重要。
发明内容
有鉴于此，本发明所要解决的技术问题，就是提出一种增强型心肌细胞培养液，其不含动物血清，成分明确，更加安全。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种增强型心肌细胞培养液，包括如下含量的组分：
名称 含量 备注
KOSR 2.5-10％v/v Knockout一种成分明确的血清替代物，GIBCO,12618013
hGH 0.1-0.3IU/mL 人生长激素
EGF 50-200IU/mL 表皮细胞生长因子
AFGF 50-200IU/mL 人酸性成纤维细胞生长因子
KGF 50-200IU/mL 角质细胞生长因子
T3 5-20μM 三碘甲状腺原氨酸,
L-肉碱 2-10μM 左旋肉碱，是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸
AA2P 100-400μg/mL l-抗坏血酸2-磷酸镁
Glutamax 1％v/v L-谷氨酰胺，72400047
NEAA 1％v/v 非必需氨基酸
rH-insulin 100-400μg/mL 重组人胰岛素
RPMI-1640 余量 基础培养基
一种增强型心肌细胞培养液，包括如下含量的组分：
Figure BDA0002488792440000021
Figure BDA0002488792440000031
本发明中，所述的心肌细胞为人心肌细胞。
本发明中，所述的心肌细胞为人诱导多能干细胞分化而来的心肌细胞。
本发明的心肌细胞3D培养液可用于培养人心肌细胞，特别是指人诱导多能干细胞分化而来的心肌细胞。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明的培养液不含动物血清，成分明确，更加安全，避免引入外源因子污染风险；本发明的培养液培养的细胞具有更好的生长活力和抗凋亡能力，可保证心肌细胞的活力保持的更长久。
附图说明
图1为本发明中不同培养基对细胞细胞3D培养的活力影响图；
图2为本发明中不同培养基对心肌细胞各基因表达的影响图。
具体实施方式
为让本领域的技术人员更加清晰直观的了解本发明，下面将结合附图，对本发明作进一步的说明。
本发明的增强型心肌细胞培养液，包括如下含量的组分：
2.5-10％v/v KOSR、0.1-0.3IU/mL hGH、50-200IU/mL EGF、50-200IU/mL AFGF、50-200IU/mL KGF、5-20μM T3、2-10μM L-肉碱、100-400μg/mL AA2P、1％v/v Glutamax、1％v/v NEAA、100-400μg/mL rH-insulin、RPMI-1640余量。
实施例
1、按表1所示配制本发明优选组分的心肌细胞培养基和对比例1和对比例2两种培养基，配制完成后至于冰水混合物中预冷。
表1不同组分的心肌细胞培养基
成分 本发明实施例 对比例1 对比例2
KOSR 3％v/v 3％v/v 3％v/v
hGH 0.16IU/mL 0 0
EGF 100IU/mL 100IU/mL 0
AFGF 100IU/mL 100IU/mL 0
KGF 100IU/mL 0 0
T3 10μM 0 0
L-肉碱 5μM 0 0
AA2P 213μg/mL 213μg/mL 0
Glutamax 1％v/v 1％v/v 1％v/v
NEAA 1％v/v 1％v/v 1％v/v
rH-insulin 200μg/mL 200μg/mL 0
RPMI-1640 余量 余量 余量
2、按常规的方案将人诱导多能干细胞DYR0100(ATCC)分化成心肌细胞，使用代谢选择法纯化，获得心肌细胞。把心肌细胞分别用步骤1中所述的三种培养基进行重悬，至于冰水混合物中预冷备用；
3、把培养容器提前预冷，将步骤2中的细胞与MatrigelTM基质混合，使最终的细胞浓度在0.5-5×105个/mL，MatrigelTM基质与培养基的比例是1:1-1:4，37℃放置30分钟成胶；
4、连续培养3天，5天，7天和21天。分别取样进行细胞活力检测；21天细胞进行细胞凋亡和增殖相关基因表达水平检测。
4.1活性检测：按说明书使用PrestoBlue细胞活性检测试剂(Invitrogen，A13261)检测心肌细胞活性。结果如图1所示。
从图1所示的结果中可看出：
培养3天、5天，实施例和对比例1，对比例2的活力差异并不明显。
培养7天，对比例2的活力明显低于实施例和对比例1(P<0.01)。
培养21天，实施例的细胞活力明显高于对比例1和对比例2(P<0.01)。
表面本发明的培养基可以保证培养的心肌细胞长时间保持细胞活力。
4.2细胞凋亡和增殖相关基因的表达水平检测：用UNLQ-10柱Trizol总RNA分离试剂盒(Sangon Biotech，B511321-0100)提取总RNA，然后用DNase I(Sangon Biotech，B618252)处理30min。mRNA使用iScript Reverse Transcription Supermix(Bio-Rad，1708841)进行逆转录。使用PikoReal-time PCR system(Thermo Fisher)和Sso AdvancedTMUniversal
Figure BDA0002488792440000051
Green SuperMix(BioRad，1725271)进行定量聚合酶链式反应。定量PCR的引物来自先前报告，具体如下(从5’到3’)：
BAX-RT-F：CAAACTGGTGCTCAAGGCCC；
BAX-RT-R：GGGCGTCCCAAAGTAGGAGA；
BCL2-RT-F：CTGGTGGACAACATCGCCCT；
BCL2-RT-R：TCTTCAGAGACAGCCAGGAGAAAT；
MKI67-RT-F：TGTGCCTGCTCGACCCTACA；
MKI67-RT-R：TGAAATAGCGATGTGACATGTGCT；
PCNA-RT-F：TTTGGTGCAGCTCACCCTG；
PCNA-RT-R：CGCGTTATCTTCGGCCCTTA；
TP53-RT-F：GCGTGTTTGTGCCTGTCCTG；
TP53-RT-R：TGGTTTCTTCTTTGGCTGGG；
GADD45A-RT-F：GATGCCCTGGAGGAAGTGCT；
GADD45A-RT-R：GAGCCACATCTCTGTCGTCGT；
GAPDH-RT-F：TGGGTGTGAACCATGAGAAG；
GAPDH-RT-R：GTGTCGCTGTTGAAGTCAGA。
作5个重复(取第1天和第21天的细胞(各5份)，按4.2进行定量PCR后，以第一天的值为对照，对BAX、BCL2、TP53、GADD45A、MKI67、PCNA各基因进行相对定量分析)，结果如图2所示。
BAX编码促凋亡蛋白，在凋亡途径中起凋亡激活剂的作用，TP53和GADD45A是细胞周期调控基因，也被报道介导细胞凋亡。从图2所示的结果中可看出，本发明在这些促进激活介导细胞凋亡的基因表达水平均上低于对比例1和对比例2。证明实施例的培养基培养的细胞与两对比例比较，更不容易引起细胞凋亡。
MKI67和PCNA是细胞增殖的标志，BCL2是一种抗凋亡分子。由结果可看出，实施例这些基因表达水平均高于对比例1和对比例2。证明实施例培养的细胞的生长活力和抗凋亡能力优于对比例1和对比例2。
综上所述，本发明的培养基能够更好的维持心肌细胞的3D培养过程中的活力。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种增强型心肌细胞培养液，其特征在于，包括如下含量的组分：
Figure FDA0002488792430000011
2.一种增强型心肌细胞培养液，其特征在于，包括如下含量的组分：
Figure FDA0002488792430000012
3.根据权利要求1或2所述的心肌细胞培养液，其特征在于，所述的心肌细胞为人心肌细胞。
4.根据权利要求1或2所述的心肌细胞培养液，其特征在于，所述的心肌细胞为人诱导多能干细胞分化而来的心肌细胞。
5.根据权利要求1或2所述的心肌细胞培养液在作为人心肌细胞的培养基中的应用。
6.根据权利要求1或2所述的心肌细胞培养液在作为人诱导多能干细胞分化而来的心肌细胞的培养基中的应用。
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